專利名稱：Ace2激活用于治療心臟、肺和腎臟疾病及高血壓的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了用于診斷和治療包括高血壓、冠心病、心臟和腎衰竭、肺水腫和肺損傷(如中毒性休克或人工通氣下的肺損傷)的心臟、肺和腎臟疾病的組合物和方法。
背景技術(shù)：
心血管疾病將成為21世紀(jì)健康護(hù)理的最主要負(fù)擔(dān)，預(yù)測(cè)到2020年時(shí)將成為世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的死因。高血壓是心臟疾病的一個(gè)主要危險(xiǎn)因素。高血壓是一種既受遺傳因素又受環(huán)境因素控制的多因子數(shù)量性狀。雖然已知許多關(guān)于能導(dǎo)致高血壓的環(huán)境因素，如飲食和體力活動(dòng)，但是關(guān)于造成心血管疾病的遺傳因素知道很少。盡管證明了一些與動(dòng)物模型中高血壓相關(guān)的推定的數(shù)量性狀遺傳位點(diǎn)(QTL)，但這些位點(diǎn)沒(méi)有被翻譯成基因。因而，導(dǎo)致高血壓和其他心血管疾病的分子和遺傳機(jī)制在很大程度上仍然不清楚。
血壓穩(wěn)態(tài)的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑是腎素—血管緊張素系統(tǒng)(RAS)。蛋白酶腎素切割血管緊張素原形成非活化的十肽(decamericpeptide)血管緊張素I(AngI)。接著血管緊張素轉(zhuǎn)化酶能催化切割A(yù)ngI形成活化的八肽血管緊張素II(AngII)，其通過(guò)引起血管平滑肌收縮和腎小管鈉重吸收作用導(dǎo)致高血壓。ACE突變小鼠顯示了自發(fā)性低血壓、部分雄性不育和腎畸形。在人類中，ACE多態(tài)性與腎和心血管功能的決定因素相關(guān)，并且ACE與AngII受體的藥理學(xué)抑制能有效地降低血管壓力和減少腎臟疾病。此外，ACE和AngII受體的抑制對(duì)心力衰竭具有有益作用。
近來(lái)，一個(gè)ACE同系物，稱為ACE2，已被證實(shí)主要在腎臟和心臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。有趣地是，兩個(gè)ACE同系物也存在于蠅中。不像ACE，ACE2具有羧肽酶功能，從AngI上切割單個(gè)殘基，產(chǎn)生Ang1-9，和從AngII上切割單個(gè)殘基產(chǎn)生Ang1-7。這些體外生化數(shù)據(jù)暗示ACE2調(diào)節(jié)RAS并因此可能在血管壓力調(diào)節(jié)中扮演一個(gè)角色。ACE2在心血管系統(tǒng)和RAS中的體內(nèi)角色未知。
Acton等在美國(guó)專利6,194,556中描述了ACE2在診斷和治療ACE2相關(guān)病癥中的應(yīng)用。該專利陳述了高血壓中ACE2表達(dá)水平增加，和ACE2活性的拮抗劑或抑制劑可被用于治療增加的血管壓力或相關(guān)病癥。加拿大第2,372,387號(hào)專利申請(qǐng)?zhí)峁┝薃CE2抑制劑的具體例子，其有望被用于治療心臟疾病，如高血壓。其再一次強(qiáng)調(diào)了需要抑制，而不是增加ACE2的活性。這些僅僅基于體外試驗(yàn)數(shù)據(jù)的參考文獻(xiàn)教導(dǎo)需要抑制ACE2活性。它們沒(méi)有提供體內(nèi)數(shù)據(jù)，如敲除的哺乳動(dòng)物數(shù)據(jù)，來(lái)表征ACE2。迄今為止，沒(méi)有一種ACE2抑制劑被批準(zhǔn)可作為藥物用于治療高血壓。而且，ACE2在心血管系統(tǒng)和RAS中的體內(nèi)角色在很大程度上仍然未知。為了能設(shè)計(jì)合適的診斷測(cè)試劑和用于治療心臟和腎臟疾病的藥物，因此需要表征ACE2的功能。
發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明提供了一種用于調(diào)節(jié)腎素—血管緊張素系統(tǒng)的新范例和顯示了一種完全新的和預(yù)料不到的ACE2用法，其不同于基于體外數(shù)據(jù)的預(yù)測(cè)(Acton專利)并在現(xiàn)有技術(shù)中預(yù)料不到，即ACE2作為一種心功能和血壓控制必需的RAS的關(guān)鍵的負(fù)調(diào)節(jié)物。ACE2的激活是用于治療和預(yù)防心臟、肺和腎臟疾病的關(guān)鍵。本發(fā)明第一次證明了給動(dòng)物施用ACE2激活劑能預(yù)防和治療高血壓和心臟和腎臟疾病，和肺損傷。
附圖簡(jiǎn)述本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案將結(jié)合下列附圖描述，其中


圖1.大鼠ACE2的序列和染色體定位。
a.大鼠、小鼠和人ACE2與小鼠和人睪丸-ACE(T-ACE)的蛋白比對(duì)。黑影表示氨基酸同一性，灰影表示氨基酸相似性的程度。b.ACE和ACE2結(jié)構(gòu)域示意圖。注意ACE2僅含有一個(gè)ACE結(jié)構(gòu)域，其帶有一致鋅結(jié)合位點(diǎn)HEMGH。黑色表示催化中心，灰色表示信號(hào)肽，陰影線表示跨膜結(jié)構(gòu)域。c.小鼠和大鼠ACE2基因在不同成人組織和不同胚胎發(fā)育日(E7＝胚胎期第7天)中的表達(dá)模式。注意在小鼠中ACE2存在兩種同種型，但在大鼠或人中不存在(未顯示)，類似于在ACE中所見(jiàn)到的現(xiàn)象15。d.與在Sabra鹽敏感性動(dòng)物(SS-X)、SHRSP(BP3)和SHR大鼠(BB.Xs)中鑒定的QTL定位相比，大鼠ACE2放射性雜交定位的結(jié)果。多態(tài)性標(biāo)記的名字顯示在表意符號(hào)的左側(cè)。顯示了與ACE2連鎖的標(biāo)記的LOD得分和θ值。cR＝厘拉德。
圖2.高血壓大鼠模型中ACE2表達(dá)水平。
a.來(lái)自Sabra SBH/y和SBN/y大鼠腎臟的ACE2 mRNA的RNA印跡分析。上圖顯示了以肌動(dòng)蛋白作為對(duì)照水平的RNA印跡圖譜。下圖顯示了對(duì)于肌動(dòng)蛋白水平標(biāo)準(zhǔn)化的ace2信使的相對(duì)水平。b.來(lái)自Sabra SBH/y和它們的對(duì)照SBN/y大鼠以及SHR和SHRSP和它們的對(duì)照WKY大鼠的腎臟的ACE2蛋白水平的蛋白質(zhì)印跡分析。上圖顯示了代表性蛋白質(zhì)印跡圖譜。顯示了每種Sabra大鼠的收縮血壓(BP)，用mmHg表示。下圖顯示了對(duì)于肌動(dòng)蛋白進(jìn)行校正的ACE2蛋白相對(duì)水平。豎條顯示了平均值+/-SEM，*＝p＜0.05，**＝p＜0.01。(對(duì)于所有組，n＝4)。
圖3.通過(guò)同源重組對(duì)小鼠ACE2的靶向破壞a.基因靶向策略。顯示了鼠ace2野生型位點(diǎn)的一部分(上)。黑框表示外顯子。設(shè)計(jì)靶向載體，從而以置于反義方向的新霉素(neo)抗性基因盒置換編碼鋅結(jié)合催化結(jié)構(gòu)域外的顯子9。胸苷激酶(TK)被用作負(fù)選擇。陰影線框表示用于DNA印跡分析的3’和5’側(cè)翼探針。b.ace+/y和ace-/yES細(xì)胞的DNA印跡分析。用EcoRI消化基因組DNA并與(a)中顯示的3’和5’側(cè)翼探針雜交。c.ace2+/y和ace2-/y小鼠腎臟中ACE2蛋白表達(dá)的蛋白質(zhì)印跡分析?？?ACE2抗體與被刪除的N-端的區(qū)域反應(yīng)。d.ace2+/y和ace2-/y小鼠心臟和腎臟中ACE mRNA表達(dá)的RT-PCR分析。顯示了用于線性擴(kuò)增的不同的PCR循環(huán)和作為對(duì)照的GAPDH mRNA水平。
圖4.正常的血壓和腎功能a.在不存在(左欄)或存在ACE阻斷劑卡托普利條件下，3個(gè)月大小的ace2+/y(n＝8)和ace2-/y(n＝8)小鼠的血壓測(cè)量結(jié)果。使用尾套測(cè)定血壓并顯示了平均值+/-SD。如“方法”部分所述，在進(jìn)行血壓測(cè)量前給小鼠施用卡托普利2周。使用侵入性血液動(dòng)力學(xué)和Langendorf測(cè)量法證實(shí)上述血壓值(未顯示)。在卡托普利處理的ace2+/y和ace2-/y小鼠中的差異是明顯地不同于它們分別未處理的組(**p＜0.01)。b.在6個(gè)月大小的ace2+/y和ace2-/y小鼠中觀察到正常的腎臟組織學(xué)結(jié)果。箭頭表示腎小球。
圖5.心臟形態(tài)學(xué)a.分離自6個(gè)月大小的ace2+/y和ace2-/y小鼠的心臟H&E染色切片。在ace2-/y小鼠中觀察到擴(kuò)張的左心室(LV)和右心室(RV)。但是，兩種基因型之間的總的心臟尺寸是相當(dāng)?shù)?，且目視檢查或在分離的心肌細(xì)胞中，沒(méi)有證據(jù)表明心臟肥大。b.來(lái)自6個(gè)月大小的ace2+/y(n＝8)和ace2-/y(n＝8)小鼠的心臟/身體重量比值的測(cè)定值作為心臟肥大的指標(biāo)。應(yīng)注意在所有被分析的年齡的不同遺傳組中，身體重量、心臟重量、脛骨長(zhǎng)度和心臟重量/脛骨長(zhǎng)度比值也沒(méi)有改變(未顯示)。c.d.在ace2-/y小鼠中不存在間質(zhì)性纖維化。擴(kuò)張性心肌病的一個(gè)標(biāo)志性特征是間質(zhì)性纖維化。但是，在ace2+/y(n＝8)和ace2-/y(n＝8)小鼠之間心臟的間質(zhì)性纖維化是相當(dāng)?shù)摹?c)顯示了單個(gè)心臟的PSR染色。在野生型和突變動(dòng)物中，注意到正常的血管周圍纖維化被染成紅色。(d)在間質(zhì)中纖維化改變的定量表示。
圖6.ACE2損失導(dǎo)致嚴(yán)重收縮性心力衰竭a，在一只6個(gè)月大小的ace2+/y和兩只ace2-/y小鼠中心臟收縮的超聲心動(dòng)圖測(cè)量結(jié)果。波峰和波谷表示每一次心博的心臟收縮和心臟舒張。箭頭表示收縮期收縮(LVESD)和舒張期松弛(LVEDD)之間的距離，測(cè)定分?jǐn)?shù)縮短的百分比(％FS)。注意在ace2-/y小鼠中增加的舒張和收縮大小表示心臟擴(kuò)張。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。b.在6個(gè)月大小的ace2+/y(n＝8)和ace2-/y(n＝8)小鼠和6個(gè)月大小的ace2+/-(n＝5)和ace2-/-(n＝5)雌性小鼠中，觀察了兩個(gè)心臟收縮的標(biāo)志性參數(shù)即分?jǐn)?shù)縮短百分?jǐn)?shù)和纖維鞘(circumferetial fiber)縮短速率。通過(guò)超聲心動(dòng)描記術(shù)測(cè)定數(shù)值。顯示了平均值+/-SD。在遺傳組之間*p＜0.05和**p＜0.01。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。c，在6個(gè)月大小的ace2+/y(n＝8)和ace2-/y(n＝8)雄性小鼠和6個(gè)月大小的ace2+/-(n＝5)雌性小鼠和ace2-/-(n＝5)雌性小鼠中的血壓測(cè)量值。顯示了平均值+/-SD。使用侵入性血液動(dòng)力學(xué)測(cè)量法證實(shí)血壓值，見(jiàn)表2，*p＜0.05。
圖7.在不存在ACE2條件下，組織缺氧標(biāo)記的增量調(diào)節(jié)和增加的血管緊張素II水平a，b，6個(gè)月大小的雄性ace2+/y(n＝5)和ace2-/y(n＝5)小鼠中兩個(gè)組織缺氧誘導(dǎo)型基因即BNIP3和PAI-1 mRNA表達(dá)水平的RNA印跡分析。(a)顯示了每個(gè)RNA印跡的數(shù)據(jù)，和(b)對(duì)gapdh對(duì)照水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)后化的BNIP3和PAI-1 mRNA的相對(duì)水平。**p＜0.01。
c，在6個(gè)月大小的雄性ace2+/y(n＝8)和ace2-/y(n＝8)同窩出生小鼠的心臟和腎臟中，血管緊張素I(AngI)和血管緊張素II(AngII)肽水平。通過(guò)放射性免疫測(cè)定法測(cè)定AngI和AngII組織水平。顯示了平均肽水平+/-SD。**p＜0.01。
圖8.ACE-ACE2雙突變小鼠不發(fā)展心力衰竭。
a，在6個(gè)月大小的雄性ace2+/y(n＝8)，ace-/-(n＝8)，和ace-/-ace2-/y雙突變(n＝6)小鼠中測(cè)量血壓。顯示了平均值+/-SD。使用侵入性血液動(dòng)力學(xué)測(cè)量法證實(shí)血壓。與野生型小鼠比較，突變體的**p＜0.01。b，在6個(gè)月大小的雄性ace2+/y(n＝8)，ace2-/y(n＝8)，ace-/-(n＝8)，和ace-/-ace2-/y雙突變(n＝6)同窩出生小鼠中分?jǐn)?shù)縮短百分?jǐn)?shù)和纖維鞘縮短速率。通過(guò)超聲心動(dòng)描記術(shù)測(cè)定數(shù)值。顯示了平均值+/-SD。在遺傳組之間**p＜0.01。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。c，在6個(gè)月大小的雄性ace2+/y，ace2-/y，ace-/-，和ace-/-ace2-/y雙突變同窩出生小鼠中心臟收縮的超聲心動(dòng)圖測(cè)量值。如圖6a所示分析并標(biāo)記超聲心動(dòng)圖。注意在ace2空背景中完全除去ACE拯救了在ace2-/y單突變小鼠中觀察到的收縮性心臟缺陷。
圖9.計(jì)算一定時(shí)間內(nèi)偏離基線的彈性(elastance)變化百分?jǐn)?shù)。通過(guò)將氣管峰值壓力除以體積從而計(jì)算肺彈性。
圖10.a，人ACE2 DNA(SEQ ID NO1)。b，人ACE2多肽(SEQ IDNO2)。
圖11.a.小鼠ACE2 DNA(SEQ ID NO3)。b.小鼠ACE2多肽(SEQ IDNO4)。
圖12.ACE2核苷酸多態(tài)性和序列。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種用于RAS系統(tǒng)調(diào)節(jié)的新范例，并且顯示了ACE2是心功能和心血管功能、腎功能和肺損傷所必需的RAS的一種關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)物。在治療和預(yù)防心臟和腎臟疾病和高血壓及肺損傷中，ACE2的激活是關(guān)鍵。本發(fā)明第一次教導(dǎo)了給動(dòng)物施用ACE2激活劑預(yù)防和治療心力衰竭和高血壓、腎臟疾病以及肺損傷。
鑒于現(xiàn)有技術(shù)的參考文獻(xiàn)，如上述的美國(guó)專利6,194,556和加拿大第2,372,387號(hào)專利申請(qǐng)，教導(dǎo)應(yīng)該抑制ACE2活性來(lái)治療心臟疾病，因此本發(fā)明結(jié)果是完全預(yù)料不到的。因此令人驚奇的是，通過(guò)激活A(yù)CE2表達(dá)和/或活性實(shí)際治療了心臟疾病。
本發(fā)明包括激活劑，該激活劑包括但不限于ACE2功能和/或ACE2mRNA和ACE2蛋白表達(dá)的激活劑，本發(fā)明也包括含有該激活劑的藥物組合物。本發(fā)明也包括心臟疾病、肺病和腎病及高血壓的醫(yī)學(xué)治療方法，通過(guò)施用有效量的激活劑予需要治療的動(dòng)物而實(shí)現(xiàn)。肺病包括但不限于慢性阻塞性肺部疾病、肺炎、哮喘、慢性支氣管炎、肺氣腫、囊性纖維化、間質(zhì)性肺病、原發(fā)性肺動(dòng)脈高壓、肺栓塞、肺結(jié)節(jié)病(pulmonary sarcodosis)、結(jié)核和肺癌。
本發(fā)明也包括用于檢測(cè)ACE2激活劑的篩選檢測(cè)法，該激活劑可被用于治療心臟疾病和腎病和高血壓及肺病。這些檢測(cè)法是體外或體內(nèi)的。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種內(nèi)皮、腎、肺或心臟細(xì)胞檢測(cè)法，用于評(píng)估候選化合物是否能增加ACE2表達(dá)或活性。在存在至少一種其激活表達(dá)或活性的能力需要被測(cè)定的化合物的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，和測(cè)量該細(xì)胞的ACE2表達(dá)水平是否增加。本發(fā)明的另一個(gè)方面包括一種用于鑒定可克服ACE2損失的影響的化合物的ACE2敲除小鼠。在這些檢測(cè)法中多肽和小的有機(jī)分子被測(cè)試。本發(fā)明包括所有通過(guò)本發(fā)明的篩選方法被鑒定并適于以藥物組合物的形式施用給動(dòng)物的化合物。
本發(fā)明的另一個(gè)方面是心臟和/或腎臟疾病和/或高血壓和/或肺病的發(fā)作或風(fēng)險(xiǎn)的診斷?？赏ㄟ^(guò)測(cè)量心臟、血清或腎臟或其他組織中的ACE2水平診斷。ACE2水平少于野生型水平表示“ACE2減少狀態(tài)”，本發(fā)明顯示該狀態(tài)與心臟和/或腎臟疾病和/或高血壓、和/或肺病、或疾病風(fēng)險(xiǎn)直接相關(guān)。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，ACE2的野生型水平和減少的水平是顯而易見(jiàn)的。ACE2減少狀態(tài)也可通過(guò)如下所述的ACE2a-ACE2m多態(tài)性來(lái)指示。本發(fā)明對(duì)于治療和診斷與減少的ACE2表達(dá)或活性相關(guān)的疾病是有用的。通過(guò)與ACE2減少狀態(tài)相關(guān)的在ACE2基因中及其上游和下游的多態(tài)性的分析，診斷也可選地被完成。根據(jù)于此所述的方法，區(qū)分多態(tài)性的核苷酸的檢測(cè)所需要的所有試劑可被提供于一個(gè)單一的試劑盒中，用于分離自動(dòng)物基因組DNA的分析。為了提供用于診斷疾病的風(fēng)險(xiǎn)或發(fā)作的基因分型和表型分型，該試劑盒可含有可區(qū)分ACE2多態(tài)性的標(biāo)記探針。多態(tài)性特異的探針可被適當(dāng)?shù)貥?biāo)記并在退火條件下加入到產(chǎn)生的DNA片段中，從而只有一個(gè)多態(tài)性特異的探針雜交并能被檢測(cè)，因此鑒定特異的ACE2多態(tài)性。
治療方法如上文所述，本發(fā)明人已經(jīng)證明了在高血壓、心臟和腎臟疾病中ACE2基因表達(dá)是減量調(diào)節(jié)的。因此，本發(fā)明提供了一種治療或預(yù)防高血壓、心臟疾病、肺或腎臟疾病的方法，包含給由此需要的動(dòng)物施用有效量的能增加ACE2表達(dá)的試劑。
于此使用的術(shù)語(yǔ)“能增加ACE2表達(dá)的試劑”指與在不存在該試劑下在相同類型的細(xì)胞中ACE2基因或蛋白的水平或活性相比，能增加ACE2基因或蛋白的水平或活性的任何試劑。該試劑可以是任何類型的物質(zhì)，包括但不限于，核酸分子(包括ACE2或其片段)，蛋白(包括Ace2或其片段)，肽，糖類，小分子，或有機(jī)化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員使用已知的方法包括蛋白質(zhì)印跡SDS-PAGE，免疫化學(xué)，RT-PCR，RNA印跡和原位雜交可容易地測(cè)定ACE2基因是否增加。
于此使用的術(shù)語(yǔ)“動(dòng)物”包括動(dòng)物界的所有成員。該動(dòng)物優(yōu)選為人。
于此使用的術(shù)語(yǔ)“有效量”指在增加ACE2水平必需的劑量和時(shí)間方面有效的量。
于此使用的術(shù)語(yǔ)“治療”指一種用于獲得有益的或想要的結(jié)果包括臨床結(jié)果的方法。有益的或想要的臨床結(jié)果可包括，但不限于，一或更多種癥狀或病癥的緩和或改善，疾病程度的減小，疾病的穩(wěn)定狀態(tài)(即，不惡化)，預(yù)防疾病的擴(kuò)散，延緩或減慢疾病的進(jìn)展，疾病狀態(tài)的改善或減輕，和癥狀緩解(無(wú)論部分的或全部的)，無(wú)論可檢測(cè)的或不可檢測(cè)的?！爸委煛币部芍概c不接受治療的預(yù)期存活相比延長(zhǎng)的存活。
ACE2核酸分子的施用在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)施用包含ACE2基因或其部分的核酸，而增加ACE2基因的表達(dá)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)施用增加ACE2基因表達(dá)的試劑，包括使用本申請(qǐng)中的篩選檢測(cè)法而被鑒定的任何試劑，ACE2基因的表達(dá)可被增加。
因?yàn)榭赏ㄟ^(guò)ACE2的增量調(diào)節(jié)治療動(dòng)物患病，失調(diào)或異常身體狀態(tài)，所以增加ACE2表達(dá)的基因治療有助于減輕心或腎或肺疾病的發(fā)展/進(jìn)行本發(fā)明包括用于提供ACE2基因治療的方法和組合物，用于治療以減少的ACE2表達(dá)或ACE2多肽活性水平為特征的疾病，失調(diào)或異常身體狀態(tài)。
本發(fā)明包括用于提供編碼ACE2的核酸分子或功能等價(jià)核酸分子給動(dòng)物的細(xì)胞的方法和組合物，使得在所述細(xì)胞中ACE2的表達(dá)給那些細(xì)胞提供了ACE2多肽的生物學(xué)活性或表型。足夠量的核酸分子被施用且以足夠水平表達(dá)以給所述細(xì)胞提供ACE2多肽的生物學(xué)活性或表型。例如，所述方法可優(yōu)選包括遞送編碼ACE2的核酸分子到患有心血管、腎臟或肺疾病的動(dòng)物的細(xì)胞的方法，包含施用于患者包含編碼ACE2的DNA的載體。所述方法也可涉及一種通過(guò)施用編碼ACE2的DNA于患有心血管或腎臟、或肺疾病的動(dòng)物提供生物活性的ACE2多肽的方法。所述方法可在體內(nèi)或離體進(jìn)行(如，用心、肺、內(nèi)皮或腎干細(xì)胞、祖細(xì)胞或其他要被移植的細(xì)胞)。用于施用ACE2(包括在基因治療中)到分離的細(xì)胞或動(dòng)物中的方法和組合物被闡述于，例如美國(guó)專利第5,672,344，5,645,829，5,741,486，5,656,465，5,547,932，5,529,774，5,436,146，5,399,346，5,670,488，5,240,84，6,322,536，6,306,830和6,071,890號(hào)和美國(guó)專利申請(qǐng)第20010029040號(hào)，他們?nèi)脑诖艘徊⒁胱鳛閰⒖肌?br> 所述方法也涉及一種通過(guò)產(chǎn)生適合于基因治療的包含編碼ACE2的DNA的病毒而產(chǎn)生重組病毒品系的方法。所述方法優(yōu)選包括轉(zhuǎn)染可用于病毒復(fù)制的細(xì)胞(所述病毒含有所述核酸分子)和收集產(chǎn)生的病毒。
所述方法和組合物可用于體內(nèi)或體外。本發(fā)明也包括組合物(優(yōu)選用于基因治療的藥物組合物)。所述組合物包括含有ACE2的載體。所述載體可以是藥學(xué)上的載體或包括該載體的宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化體。本領(lǐng)域已知的載體包括但不限于反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒載體，如牛痘病毒載體，HIV和基于慢病毒的載體、或質(zhì)粒。本發(fā)明也包括產(chǎn)生所述載體所需要的包裝和輔助細(xì)胞系。產(chǎn)生所述載體的方法和使用所述載體的基因治療的方法也包括在本發(fā)明中。
本發(fā)明也包括含有所述載體和所述重組ACE2核酸分子序列的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
ACE2變體—多肽序列修飾的用途ACE2變體可被用于本發(fā)明的方法中。產(chǎn)生化學(xué)上等價(jià)的或化學(xué)上相似的氨基酸序列的改變也被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。具有與ACE2受體序列同一性的多肽被測(cè)試以確保他們適合用于本發(fā)明的方法中。本發(fā)明多肽的變體可自然地產(chǎn)生，例如，通過(guò)突變，或可被制得，例如，用多肽工程技術(shù)如定向誘變，其在本領(lǐng)域中眾所周知用于氨基酸的取代。例如，疏水殘基如甘氨酸可被用于取代另外的疏水殘基如丙氨酸。丙氨酸殘基可被更疏水的殘基如亮氨酸、纈氨酸或異亮氨酸取代。負(fù)電荷氨基酸如天冬氨酸可取代谷氨酸。正電荷氨基酸如賴氨酸可取代另一種正電荷氨基酸如精氨酸。
因此，本發(fā)明包括了在氨基酸序列中具有保守改變或取代的多肽。保守取代插入一個(gè)或多個(gè)具有與被置換的氨基酸相似的化學(xué)性質(zhì)的氨基酸。本發(fā)明包括其中產(chǎn)生的保守取代不破壞化合物活性的序列。
包含一或多個(gè)d-氨基酸的多肽被考慮于本發(fā)明中。也考慮的是其中一或多個(gè)氨基酸在N-末端被乙?；亩嚯?。本領(lǐng)域技術(shù)人員可意識(shí)到大量技術(shù)可被用于構(gòu)建多肽模擬物，其具有與本發(fā)明相應(yīng)的多肽化合物相同或相似的期望的化合物活性，但與所述多肽在溶解性、穩(wěn)定性和/或?qū)λ夂偷鞍酌附庖赘行苑矫婢哂懈己玫幕钚?。參?jiàn)，例如，Morgan和Gainor，Ann.Rep.Med.Chem.，24243-252(1989)。多肽模擬物的例子描述于美國(guó)專利第5,643,873號(hào)。其他描述如何制造和使用模擬物的專利包括，例如，5,786,322，5,767,075，5,763,571，5,753,226，5,683,983，5,677,280，5,672,584，5,668,110，5,654,276，5,643,873。也可根據(jù)本領(lǐng)域公知的其他技術(shù)制造本發(fā)明多肽的模擬物。例如，通過(guò)將本發(fā)明的多肽和一種試劑反應(yīng)，該試劑通過(guò)將氫基團(tuán)轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌鶊F(tuán)如羥基或氨基基團(tuán)而以化學(xué)方法改變側(cè)鏈基團(tuán)。模擬物優(yōu)選包括完全由氨基酸制成的序列或包括氨基酸和修飾的氨基酸或其他有機(jī)分子雜合序列。
本發(fā)明也包括雜合體和多肽，例如其中一個(gè)核苷酸序列與另一個(gè)序列結(jié)合。
本發(fā)明也包括使用ACE2多肽片段的方法，如果該片段保持活性，其可被用于賦予化合物活性。本發(fā)明也包括多肽和本發(fā)明多肽的片段，其可被用作一種研究工具來(lái)表征所述多肽或其活性。這樣的多肽優(yōu)選由至少5個(gè)氨基酸組成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，他們可由6至10，11至15，16至25，26至50，51至75，76至100或101至250或250至500個(gè)氨基酸組成。片段可包括具有一或多個(gè)氨基酸缺失的序列，例如，在化合物序列中C-末端氨基酸缺失。
ACE2多肽活性的增強(qiáng)通過(guò)進(jìn)行選擇性定點(diǎn)誘變?cè)黾踊驕p少ACE2的活性。含有所述核酸分子或具有序列同一性的核酸分子的DNA質(zhì)粒或表達(dá)載體被優(yōu)選用于使用來(lái)自Pharmacia Biotech的U.S.E(單一位點(diǎn)消除)誘變?cè)噭┖谢蚱渌目缮虡I(yè)上獲得的誘變?cè)噭┖?，或使用PCR的這些研究。一旦突變形成及通過(guò)DNA序列分析被證實(shí)，使用表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)該突變多肽并監(jiān)測(cè)其活性。
本發(fā)明也包括使用多肽的方法，該多肽與人或小鼠ACE2(或他們的部分序列)具有至少約＞20％，＞25％，＞28％，＞30％，＞35％，＞40％，＞50％，＞60％，＞70％，＞80％或＞90％，更優(yōu)選至少約＞95％，＞99％或＞99.5％的序列一致性。修飾的多肽分子討論如下。優(yōu)選約1，2，3，4，5，6至10，10至25，26至50或51至100，或101至250個(gè)核苷酸或氨基酸被修飾。
根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法計(jì)算同一性。序列同一性最優(yōu)選通過(guò)BLAST 2.1版程序高級(jí)搜索(參數(shù)如上)估算。BLAST是一系列的程序，其可在http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST在線獲得。高級(jí)BLAST搜索(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/blast.cgi？Jform＝1)設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)(即矩陣BLOSUM62；缺口罰分(Gap existence cost)11；每一殘基缺口罰分(Per residue gap cost)1；λ比值0.85，默認(rèn)值)。
關(guān)于BLAST檢索的參考文獻(xiàn)是Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller，W.，Myers，E.W.& Lipman，D.J.(1990)″基本局部比對(duì)檢索工具″J.Mol.Biol.215403-410；Gish，W.& States，D.J.(1993)″通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)相似性搜索鑒定蛋白編碼區(qū)域″Nature Genet.3266-272；Madden，T.L.，Tatusov，R.L.& Zhang，J.(1996)″網(wǎng)絡(luò)BLAST服務(wù)器的應(yīng)用″Meth.Enzymol.266131-141；Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.& Lipman，D.J.(1997)″Gapped BLAST和PSI-BLAST新一代蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索程序″Nucleic Acids Res.253389-3402；Zhang，J.& Madden，T.L.(1997)″PowerBLAST一種新的應(yīng)用于交互式或自動(dòng)序列分析和注釋的網(wǎng)絡(luò)BLAST″Genome Res.7649-656。
優(yōu)選地約1，2，3，4，5，6至10，10至25，26至50或51至100，或101至250個(gè)核苷酸或氨基酸被修飾。本發(fā)明包括具有導(dǎo)致在不涉及提供活性的多肽的部分中的氨基酸改變或在涉及提供活性的多肽的部分中的氨基酸改變的突變，使得該突變?cè)黾踊驕p少多肽的活性。
篩選ACE2激活劑小的有機(jī)分子被篩選以確定他們是否增加ACE2表達(dá)或活性。ACE2的多肽片段和具有與ACE2序列一致性的多肽也被測(cè)試以確定他們?cè)隗w外檢測(cè)和在體內(nèi)細(xì)胞系是否增加ACE2活性。激活劑優(yōu)選作用于ACE2的特定結(jié)構(gòu)域以增加ACE2的激活作用。為獲得特異性，激活劑應(yīng)以ACE2的獨(dú)特序列作為靶標(biāo)。
本發(fā)明也包括能增加ACE2表達(dá)的物質(zhì)的分離。特別是可分離能結(jié)合ACE2基因或蛋白的配體或物質(zhì)。對(duì)于能結(jié)合ACE2基因或蛋白的物質(zhì)如蛋白，可測(cè)試生物學(xué)樣本和商業(yè)上可得到的文庫(kù)。例如，ACE2蛋白的氨基酸序列可用于探查多肽文庫(kù)，而編碼ACE2的核苷酸序列可用于探查核苷酸文庫(kù)。此外，制備的ACE2的抗體可被用于分離其他與ACE2具有親合性的多肽。例如，標(biāo)記抗體可被用于探查噬菌體展示文庫(kù)或生物學(xué)樣本。
根據(jù)一些因素，如物質(zhì)和ACE2基因或蛋白的特性和數(shù)量，可以選擇允許該物質(zhì)和ACE2基因或蛋白形成復(fù)合物的條件。物質(zhì)-蛋白或物質(zhì)-基因復(fù)合物，游離的物質(zhì)或非復(fù)合的物質(zhì)可通過(guò)常規(guī)的分離技術(shù)被分離，例如，鹽析、層析、電泳、凝膠過(guò)濾、分級(jí)、吸收、聚丙烯酰胺凝膠電泳、凝集或其組合。為便于成分的檢測(cè)，抗ACE2或該物質(zhì)的抗體，或標(biāo)記的蛋白，或標(biāo)記的物質(zhì)可被使用。如果合適，抗體、蛋白或物質(zhì)可用如下所述的可檢測(cè)的物質(zhì)標(biāo)記。
一旦潛在的結(jié)合配偶體被分離，可設(shè)計(jì)篩選方法以測(cè)定結(jié)合ACE2基因或蛋白的該物質(zhì)是否可用于本發(fā)明方法中以在細(xì)胞中提高ACE2的表達(dá)并因此在疾病治療中是有用的。
因此，本發(fā)明也提供了用于鑒定能結(jié)合ACE2基因或蛋白的物質(zhì)的方法。特別是，該方法可被用于鑒定能結(jié)合和增加或提高ACE2的表達(dá)的物質(zhì)。因此，本發(fā)明提供了一種鑒定能結(jié)合ACE2基因或蛋白的物質(zhì)的方法，包含步驟(a)在允許形成復(fù)合物的條件下，將測(cè)試物質(zhì)和ACE2基因或蛋白(優(yōu)選固定化的)進(jìn)行反應(yīng)，和(b)對(duì)復(fù)合物、游離的物質(zhì)和非復(fù)合的基因或蛋白進(jìn)行檢測(cè)分析。
任何檢測(cè)蛋白-蛋白相互作用的檢測(cè)系統(tǒng)或測(cè)試方法可被使用，包括共免疫沉淀、交聯(lián)和通過(guò)梯度或色譜柱共純化。此外，X-射線結(jié)晶學(xué)研究可被用作評(píng)估物質(zhì)和分子相互作用的手段。例如，當(dāng)以適合的形式結(jié)晶時(shí)，本發(fā)明復(fù)合物中的純化的重組分子適于通過(guò)X-射線結(jié)晶學(xué)檢測(cè)分子內(nèi)的相互作用。光譜學(xué)也可被用于檢測(cè)相互作用和特別是，Q-TOF裝置可被使用。生物學(xué)樣本和商業(yè)上可獲得的文庫(kù)可被用于ACE2結(jié)合肽的測(cè)試。另外，抗ACE2的抗體可被用于分離其他具有ACE2結(jié)合親和力的肽。例如，標(biāo)記抗體可被用于探查噬菌體展示文庫(kù)或生物學(xué)樣本。在這方面，肽可使用生物學(xué)表達(dá)系統(tǒng)而被開(kāi)發(fā)。這些系統(tǒng)的使用允許隨機(jī)肽序列大文庫(kù)的產(chǎn)生和對(duì)這些文庫(kù)篩選結(jié)合特定蛋白的肽序列。文庫(kù)可通過(guò)將編碼隨機(jī)肽序列的合成DNA克隆入合適的表達(dá)載體中而被產(chǎn)生。(參見(jiàn)，Christian等.1992，J.Mol.Biol.227711；Devlin等，1990 Science 249404；Cwirla等.1990，Proc.Natl.Acad，Sci.USA，876378)。文庫(kù)也可通過(guò)重疊肽的并行合成而被構(gòu)建(參見(jiàn)，美國(guó)專利第4,708,871號(hào))。在高血壓、心臟或腎臟疾病動(dòng)物模型中測(cè)試激活劑。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種用于評(píng)估候選化合物是否能增加ACE2表達(dá)或活性的檢測(cè)法，其通過(guò)下列來(lái)實(shí)現(xiàn)在存在至少一種其激活表達(dá)或活性的能力需要被測(cè)定的化合物的條件下，培養(yǎng)細(xì)胞(優(yōu)選腎臟或心臟細(xì)胞)，其后監(jiān)測(cè)細(xì)胞中ACE2表達(dá)水平和/或活性的增加。增加的ACE2表達(dá)和/或活性表明該候選化合物可用于治療心臟或/腎臟疾病或高血壓。
可以在本領(lǐng)域公知的易于患心臟疾病或腎臟疾病的哺乳動(dòng)物上進(jìn)行相似的篩選檢測(cè)法。候選化合物被施用于哺乳動(dòng)物和ACE2表達(dá)和/或活性被測(cè)量。增加的ACE2表達(dá)和/或活性表明該候選化合物可用于治療心臟或腎臟疾病。
一種檢測(cè)候選化合物是否增加ACE2活性(和用于治療心血管疾病和/或腎臟疾病和/或肺、和/或高血壓)的方法也包括a)將(i)ACE2、ACE2的片段或前述任一的衍生物和(ii)ACE2的底物在存在候選化合物的條件下接觸；和b)測(cè)定ACE2作用于底物的活性是否增加，從而指示該化合物增加了ACE2的活性。增加的ACE2活性表明該化合物可用于治療列于本申請(qǐng)中的心臟疾病或腎臟或肺病或高血壓。ACE2活性增加的測(cè)定優(yōu)選包括測(cè)定該化合物是否增加了ACE2蛋白水解活性(增加的底物水解)。在本發(fā)明的一個(gè)變體中，本發(fā)明的檢測(cè)法受限于下列條件候選化合物不是鹵化鈉鹽或鹵化鉀鹽，并且該檢測(cè)法不測(cè)量增加的離子濃度對(duì)ACE2蛋白質(zhì)水解的影響。ACE2底物包括AngI，AngII，des-Ang，AngII，apelin-13，強(qiáng)啡肽13，β-酪啡肽和神經(jīng)降壓素。
用于產(chǎn)生ACE2的方法描述于CA2,372,387。用于ACE2激活的體外檢測(cè)法的實(shí)例顯示于Vickers等，通過(guò)人血管緊張素轉(zhuǎn)變酶相關(guān)的羧肽酶水解生物肽，J Biol.Chem.2002，277(17)14838。其他的檢測(cè)法(以及上述檢測(cè)法的變體)從本發(fā)明和那些描述于美國(guó)專利第5,851,788，5,736,337和5,767,075號(hào)中的技術(shù)中是顯而易見(jiàn)的，其全文在此一并引入作為參考。
敲除的哺乳動(dòng)物ACE2小鼠的克隆和ACE2敲除小鼠的指導(dǎo)性實(shí)例描述于如下實(shí)施例中。術(shù)語(yǔ)“敲除”指哺乳動(dòng)物的單個(gè)細(xì)胞、被選擇的細(xì)胞或所有細(xì)胞的ACE2基因編碼的多肽的至少一部分的表達(dá)被部分或完全減少。該哺乳動(dòng)物可以是一種“雜合敲除”，其中內(nèi)源基因的一個(gè)等位基因被破壞但另一個(gè)等位基因仍然存在。ACE2位于X染色體上，因此雌性可以是雜合的。在雄性中，只有一個(gè)等位基因，因此雄性是純合的?？蛇x擇地，哺乳動(dòng)物可以是一種“純合敲除”，其中內(nèi)源基因的兩個(gè)等位基因都被破壞。
術(shù)語(yǔ)“敲除構(gòu)建體”指核苷酸序列，其被設(shè)計(jì)成減少或抑制哺乳動(dòng)物一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中內(nèi)源基因編碼的多肽的表達(dá)。被用作敲除構(gòu)建體的核苷酸序列通常由下列組成(1)來(lái)自待抑制的內(nèi)源基因某一部分(一或多個(gè)外顯子序列、內(nèi)含子序列和/或啟動(dòng)子序列)的DNA；和(2)用于檢測(cè)細(xì)胞中敲除構(gòu)建體存在的標(biāo)記序列。該敲除構(gòu)建體被插入到含有要被敲除的內(nèi)源基因的細(xì)胞中。接著該敲除構(gòu)建體能整合入一或兩個(gè)內(nèi)源ACE2基因的等位基因中，和該ACE2敲除構(gòu)建體的整合能阻止或打斷全長(zhǎng)內(nèi)源ACE2基因的轉(zhuǎn)錄。一般借助于同源重組，ACE2敲除構(gòu)建體整合入細(xì)胞染色體DNA中(即，當(dāng)該敲除構(gòu)建體被插入到該細(xì)胞中時(shí)，與內(nèi)源ACE2 DNA序列同源或互補(bǔ)的ACE2敲除構(gòu)建體區(qū)域可互相雜交；這些區(qū)域接著被重組使得該敲除構(gòu)建體被整合入內(nèi)源DNA的相應(yīng)位置)。
典型地，該敲除構(gòu)建體被插入到稱為胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)的未分化的細(xì)胞中。ES細(xì)胞通常源自胚胎或胚泡，該胚泡與其所要導(dǎo)入的發(fā)育胚胎屬于相同物種，如下所討論的。
術(shù)語(yǔ)“基因的破壞”、“基因破壞”、“抑制表達(dá)”和“基因抑制”指ACE2核苷酸序列敲除構(gòu)建體插入到內(nèi)源ACE2基因的編碼區(qū)(通常含有一或多個(gè)外顯子)和/或該基因的啟動(dòng)子區(qū)的同源區(qū)中，以減少或阻止細(xì)胞中全長(zhǎng)ACE2分子的表達(dá)。插入通常通過(guò)同源重組來(lái)完成。作為實(shí)例，核苷酸序列敲除構(gòu)建體可制備如下將包含抗生素抗性基因的核苷酸序列插入到要被破壞的編碼ACE2的分離的核苷酸序列的一部分中。當(dāng)該敲除構(gòu)建體接著被插入到胚胎干細(xì)胞(“ES細(xì)胞”)中時(shí)，該構(gòu)建體可整合入至少一個(gè)ACE2等位基因的基因組DNA中。因而，至少在一些細(xì)胞中，許多細(xì)胞后代將不再表達(dá)ACE2，或以減少的水平和/或以截短的形式表達(dá)，因?yàn)锳CE2內(nèi)源編碼區(qū)的至少一部分被抗生素抗性基因破壞。
術(shù)語(yǔ)“標(biāo)記序列”指一段核苷酸序列，其(1)被用作更大的用來(lái)破壞ACE2表達(dá)的核苷酸序列構(gòu)建體(即，“敲除構(gòu)建體”)的一部分；和(2)被用作鑒定那些已經(jīng)整合ACE2敲除構(gòu)建體到染色體DNA中的細(xì)胞的手段。該標(biāo)記序列可以是任何適合這些目的的序列，盡管典型地其是一種編碼蛋白的序列，該蛋白賦予細(xì)胞可檢測(cè)的特性，如抗生素抗性基因或在該細(xì)胞中天然不出現(xiàn)的可檢測(cè)的酶。該標(biāo)記序列也典型地含有調(diào)節(jié)其表達(dá)的同源或異源啟動(dòng)子。
包括在本發(fā)明的范圍中的是這樣一種哺乳動(dòng)物，其中一或兩個(gè)ACE2等位基因，及一或兩個(gè)其他基因的等位基因已經(jīng)被敲除。這樣的一種哺乳動(dòng)物可產(chǎn)生如下重復(fù)于此提出的用于產(chǎn)生ACE2敲除哺乳動(dòng)物的方法但使用其他基因，或使兩種哺乳動(dòng)物互相雜交，一種哺乳動(dòng)物中一或兩個(gè)ACE2等位基因被敲除，和另一種哺乳動(dòng)物中一或兩個(gè)第二基因的等位基因被敲除，接著篩選那些具有雙敲除基因型的后代(雙雜合的或雙純合的敲除基因型，或其變體)。
可使用類似的技術(shù)制造其他敲除動(dòng)物和細(xì)胞。
藥物組合物在一種藥物組合物中，ACE2表達(dá)和活性的激活劑優(yōu)選組合其他成分，如載體。這些組合物可以可溶的形式被施用于動(dòng)物，優(yōu)選人，來(lái)預(yù)防或治療心臟疾病、腎臟疾病或高血壓。心臟疾病包括慢性心力衰竭、左心室肥大、急性心力衰竭、心肌梗塞和心肌病。腎臟疾病包括腎衰竭。ACE2激活劑可用于調(diào)節(jié)血壓和動(dòng)脈高血壓。正常血壓具有小于85mm Hg的舒張壓。高的正常血壓具有85至89mm Hg之間的舒張血壓。輕度高血壓相應(yīng)于90至104mm Hg之間的舒張血壓。中度高血壓具有105至114mm Hg之間的舒張血壓。重度高血壓具有高于115mm Hg的舒張血壓。也通過(guò)收縮血壓測(cè)定異常的血壓(當(dāng)舒張壓低于90mm Hg時(shí))。正常血壓具有小于140mm Hg的收縮血壓。臨界收縮期高血壓顯示了在140至159mm Hg之間的收縮血壓。單純收縮期高血壓具有高于160mm Hg的收縮血壓(CecilEssentials ofMeidcine，第三版，Andreoli等.W.B.Saunders Company(1993))。在大于18歲的成年人中如果在至少兩次就診中，兩次或更多次血壓測(cè)量值的平均值是90mm Hg或更高的舒張壓或140mm Hg收縮壓，則被診斷為高血壓。兒童和孕婦具有更低的血壓，所以血壓超過(guò)120/80(即，120mm Hg收縮血壓/80mm Hg舒張血壓)表示為高血壓。
通過(guò)不同的方法包括，但不限于局部給藥、口服、氣溶膠給藥、氣管內(nèi)滴注、腹膜內(nèi)注射、和靜脈內(nèi)注射，藥物組合物可被施用于人或動(dòng)物。給藥的劑量依賴于患者的需要、期望的效果和選擇的給藥途徑。使用體內(nèi)遞送載體如但不陷限于脂質(zhì)體，多肽可被導(dǎo)入細(xì)胞中。
該藥物組合物可通過(guò)已知用于藥學(xué)上可接受的可被施用于患者的組合物的制備方法而被制備，使得有效量的核酸分子或多肽與藥學(xué)上可接受的載體混合為混合物。適合的載體被描述于，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences(Remington’s PharmaceuticalSciences，Mack出版公司，Easton，Pa.，USA)。
于此基礎(chǔ)上，該藥物組合物可包括活性化合物或物質(zhì)，如核酸分子或多肽，其結(jié)合有一或多種藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，并包含于具有合適的pH的緩沖溶液中，用生理溶液等滲。將活性分子與載體組合或?qū)⑺麄兣c稀釋劑組合的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的。該組合物可包括用于遞送活性化合物到組織內(nèi)特定部位的靶向試劑。
ACE2的異源性過(guò)表達(dá)表達(dá)載體可用于提供高水平的ACE2表達(dá)。用本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)物可用作研究工具，特別是用于研究ACE2減少的狀態(tài)。本發(fā)明包括載體，其選擇性作用于通常產(chǎn)生ACE2的心臟細(xì)胞和腎臟細(xì)胞，優(yōu)選內(nèi)皮細(xì)胞。本發(fā)明也包括包含這些載體的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。適合于心臟和腎臟細(xì)胞的載體的實(shí)例被描述于，例如Rosengart等，美國(guó)專利第6,322,536號(hào)；March等.美國(guó)專利第6,224,584號(hào)；Hammond等，美國(guó)專利第6,174,871號(hào)；Wolfgang-M.Franz等.通過(guò)含有心臟特異性啟動(dòng)子的重組腺病毒進(jìn)行組織特異性基因遞送的分析。Cardiovascular Research 35(1997)560-566；Rothmann T.等，使用復(fù)制缺陷型重組腺病毒表達(dá)心肌特異性基因。Gene Ther 1996Oct；3(10)919-26；Phillips MI等，Vigilant載體用于心臟保護(hù)的腺伴隨病毒載體中的心臟特異性啟動(dòng)子。Hypertension 2002，F(xiàn)eb；39(2 Pt 2)651-5；Herold BC等.作為模式載體系統(tǒng)用于腎病基因治療的單純皰疹病毒。Kidney Int 2002 Jan；61 Suppl 13-8；Figlin RA等.技術(shù)評(píng)估白介素-2基因治療用于治療腎細(xì)胞癌。CurrOpin Mol Ther 1999 Apr；1(2)271-8；Varda-Bloom N等.定向于腫瘤血管發(fā)生的組織特異性基因治療。Gene Ther 2001Jun；8(11)819-27；Scott-Taylor TH等..腺病毒有助于親嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人細(xì)胞。Gene Ther 1998 May；5(5)621-9；Langer JC等.腺伴隨病毒基因轉(zhuǎn)移入腎臟細(xì)胞潛在地用于體內(nèi)基因遞送。ExpNephrol 1998 May-Jun；6(3)189-94；Lien YH等.腎病的基因治療。Kidney Int Suppl 1997 Oct；61S85-8；和Ohno K等.展示了蛋白A的IgG結(jié)合域的辛德比斯病毒載體的細(xì)胞特異性靶向。NatBiotechnol 1997 Aug；15(8)763-7。
根據(jù)本領(lǐng)域公知的眾多技術(shù)，細(xì)胞培養(yǎng)物，優(yōu)選心臟和腎臟細(xì)胞培養(yǎng)物和內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)物，可用于過(guò)表達(dá)和研究。例如，細(xì)胞系(永生化細(xì)胞培養(yǎng)物或原代細(xì)胞培養(yǎng)物)可被含有ACE2核酸分子(或具有序列同一性的分子)的載體轉(zhuǎn)染以測(cè)量該核酸分子的表達(dá)水平及該核酸分子和多肽的活性。該細(xì)胞也可用于鑒定能結(jié)合并激活該多肽的化合物。
測(cè)定ACE2活性和/或表達(dá)的診斷試劑盒ACE2表達(dá)或活性的測(cè)定也被用于i)心臟或腎臟疾病、肺病和/或高血壓的診斷，ii)在疾病發(fā)作前鑒定處于該疾病發(fā)作風(fēng)險(xiǎn)中的患者，iii)測(cè)量患有心臟疾病如冠心病、慢性心力衰竭或腎臟疾病和/或高血壓和/或肺損傷的患者的治療反應(yīng)和iv)測(cè)量在處于風(fēng)險(xiǎn)的這類患者中干預(yù)性疾病預(yù)防策略的成功率。本發(fā)明包括一種用于評(píng)估動(dòng)物中ACE2水平的方法，包含如下步驟(a)從動(dòng)物標(biāo)本制備心臟或腎臟或肺樣本；(b)測(cè)試在該樣本中ACE2的存在；和(c)使樣本中的ACE2水平或存在與動(dòng)物中的疾病如心臟或腎臟或肺病的存在(或風(fēng)險(xiǎn))建立相關(guān)性。ACE2水平比正常低或者低的ACE2活性表明存在或處于疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。
基于ACE2單核苷酸多態(tài)性的診斷試劑盒本發(fā)明也顯示了減少的人ACE2表達(dá)產(chǎn)生自控制ACE2基因表達(dá)的多態(tài)性。大鼠中的QTL作圖顯示了減少的ACE2表達(dá)水平與高血壓和心血管和腎臟疾病100％相關(guān)。在ACE2編碼區(qū)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何如下所述的多態(tài)性。所有如下所述的多態(tài)性都在ACE2編碼區(qū)的上游或下游。先前并不知道這些多態(tài)性或他們?cè)谛难芗膊?、腎臟疾病、肺病和高血壓中的角色。一種特定的SNP單元型與增加的疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。該單元型是一種用于評(píng)估疾病風(fēng)險(xiǎn)和用于確定適合的醫(yī)學(xué)治療方法的重要診斷工具。
多態(tài)性如下所示SNP名稱 SNP描述 非洲 亞洲人 白種人 對(duì)照裔美國(guó)人ACE2a C(C/G)60 100 70 Crs879922ACE2b T(C/T)100100 70 Trs757066ACE2c C(C/G)70 50 80 Crs714205ACE2d C(A/C)50 90 90 A/Crs329442ACE2e C(C/T)80 100 60 Crs233574ACE2f C(C/T)90 100 50 C
rs1978124ACE2g A(A/G)70 100100Ars1514282ACE2h A(A/G)20 50 30 Ars1514282-2ACE2i A(A/G)70 100100Ars1514281ACE2j A(A/G)20 50 50 Ars1514281-2ACE2k A(A/G)失敗 10070 Ars1514279ACEI C(C/T)80 10080 C2rs1514280ACE2m C(C/T)10010050 Crs233575描述于前述表格和
圖11中的控制ACE2基因表達(dá)的多態(tài)性的核苷酸數(shù)目可被本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地測(cè)定。
該表格顯示了表格中3種種群(非洲裔美國(guó)人、白種人、亞洲人)的每一種中發(fā)現(xiàn)的對(duì)照堿基的百分?jǐn)?shù)。例如，對(duì)于SNP rs233574，預(yù)期的SNP是C/T，對(duì)照峰為C。在這種情況下，非洲裔美國(guó)人等位基因頻率是80％C；亞洲人等位基因頻率是100％C(換句話說(shuō)，單態(tài)標(biāo)記)；和白種人等位基因頻率是60％C。
本發(fā)明提供了多核苷酸探針，其可被用于測(cè)定動(dòng)物基因型，即人是否對(duì)于一種或其他多態(tài)性是純合的，或是否對(duì)于這些多態(tài)性是雜合的，以及進(jìn)一步推出人的表型。該表型指示了在人細(xì)胞中ACE2表達(dá)的量。進(jìn)一步地，本發(fā)明提供了在上述的基因型和表型測(cè)定中使用上述多核苷酸的方法。根據(jù)本領(lǐng)域公知的技術(shù)(例如，見(jiàn)美國(guó)專利第5,792,851和5,851,788號(hào))，本發(fā)明的該寡核苷酸可被用作探針來(lái)檢測(cè)核酸分子。
例如，通過(guò)使用洋地黃毒苷-11-脫氧尿苷三磷酸末端標(biāo)記，本發(fā)明的多核苷酸可被改造為探針。使用堿性磷酸酶綴合的多克隆綿羊抗洋地黃毒苷F(ab)片段和作為顯色底物的具有5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸的氮藍(lán)四唑，上述探針可被免疫檢測(cè)。
因而，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了選擇性地雜交到ACE上游或下游序列的一部分上的多核苷酸探針。探針可被設(shè)計(jì)為在嚴(yán)緊條件下雜交到一種ACE2多態(tài)性上而不雜交到其它的多態(tài)性上以區(qū)分一種特定的多態(tài)性。
本發(fā)明的多態(tài)性特異的多核苷酸雜交探針可包含，例如，基因組DNA或合成DNA。上述的寡核苷酸探針可通過(guò)自動(dòng)合成法被合成和優(yōu)選含有約10-30個(gè)堿基，盡管在寡核苷酸探針雜交分析領(lǐng)域可理解，8至約50個(gè)核苷酸也是有用的，其依賴于在探針中與靶序列可能的錯(cuò)配所處的位置，探針上的標(biāo)記可能干擾雜交的程度，和探針和靶序列的雜交進(jìn)行的物理?xiàng)l件(如，溫度、pH、離子強(qiáng)度)。根據(jù)常規(guī)的方法，根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸探針的設(shè)計(jì)優(yōu)選包含調(diào)節(jié)探針的長(zhǎng)度以適合雜交條件(溫度、離子強(qiáng)度、暴露時(shí)間)，同時(shí)保證多態(tài)性特異性。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于基因分型的測(cè)試試劑盒，包含(a)用于擴(kuò)增核酸的手段，該核酸包含ACE2 5’或3’區(qū)域的至少一部分，其中所述部分包括相應(yīng)于ACE2a-ACE2m之一的核苷酸；和(b)本發(fā)明的多核苷酸探針，用于區(qū)分ACE2多態(tài)性與其他多態(tài)性。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地理解，“用于擴(kuò)增的手段”依賴于要被使用的擴(kuò)增方法。因而，例如，如果通過(guò)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，這些手段可以包括適合的引物，適合的DNA聚合酶，和四種2′-脫氧核糖核苷三磷酸(dA，dC，dG，dT)。在其他的實(shí)施例中，如果該擴(kuò)增通過(guò)依賴于轉(zhuǎn)錄的方法如3SR法進(jìn)行，該手段將包括兩種引物(當(dāng)形成雙鏈時(shí)，其中的至少一種將提供啟動(dòng)子)，能從該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶，在引物起始的DNA指導(dǎo)的和RNA指導(dǎo)的DNA聚合反應(yīng)中起作用的反轉(zhuǎn)錄酶(也可能參與RNA的RNAse H降解以將DNA鏈從RNA/RNA雜交體中釋放出來(lái))，四種核糖核苷三磷酸(A，C，G和U)，和四種2′-脫氧核糖核苷三磷酸。在另一個(gè)實(shí)施例中，如果通過(guò)連接酶鏈反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增，該手段將包括兩種寡核苷酸(DNAs)和適合的DNA連接酶，其中如果靶標(biāo)(在該靶標(biāo)上所述兩種寡核苷酸能以可連接的方向互相鄰接并與靶標(biāo)雜交)存在，則該DNA連接酶將所述兩種寡核苷酸連接。
本發(fā)明的寡核苷酸探針優(yōu)選被標(biāo)記。該標(biāo)記可以是任何本領(lǐng)域中可用于該探針的各種標(biāo)記，包括但不限于32P；35S；生物素(在其上可以復(fù)合信號(hào)發(fā)生部分，該信號(hào)發(fā)生部分結(jié)合到或復(fù)合到抗生物素蛋白上)；熒光部分；酶如堿性磷酸酶(其能催化顯色反應(yīng))；如上所述的洋地黃毒苷；等。
RFLP分析，電泳SSCP分析或測(cè)序分析也可用于檢測(cè)ACE2多態(tài)性。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，這里也提供了一種在來(lái)自動(dòng)物的ACE2核酸中對(duì)ACE2多態(tài)性特異靶序列進(jìn)行分型的方法，包含如下步驟，(a)通過(guò)對(duì)來(lái)自心臟或腎臟的DNA進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增方法，獲得可檢測(cè)量的擴(kuò)增的核酸，該核酸具有ACE2的上游或下游區(qū)域的亞序列(或亞序列的互補(bǔ)鏈)，所述亞序列包括其中ACE2多態(tài)性可能出現(xiàn)的核苷酸；和(b)分析(如，在使用根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸探針的核酸探針雜交檢測(cè)法中)獲得自步驟(a)的擴(kuò)增的核酸分子以測(cè)定多態(tài)性位點(diǎn)的堿基。
在本發(fā)明的分型方法的一種應(yīng)用中，所述方法被用于個(gè)體以測(cè)定該個(gè)體是否處于發(fā)展心臟或腎臟疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。
患有冠心病和/或接著進(jìn)行外科分流術(shù)的病人具有心臟組織缺氧。其也已知為心臟抑頓(cardiac stunning)或心臟冬眠。這些患者顯示了在心臟中很少的結(jié)構(gòu)改變但具有降低的心功能。在缺少結(jié)構(gòu)改變的條件下具有改變的心功能是十分罕見(jiàn)的。在心臟抑頓或缺氧的小鼠模型中，該動(dòng)物具有非常類似于ACE2小鼠的表型。另外，我們已經(jīng)證實(shí)了在ACE2缺陷小鼠中缺氧標(biāo)記被誘導(dǎo)。綜合我們的數(shù)據(jù)證明了由于長(zhǎng)期的缺氧這些小鼠具有降低的心功能，因此它們是冠心病模型。因而，多態(tài)性和/或減少的ACE2表達(dá)或活性可被用于診斷人類中的這種狀態(tài)。另一個(gè)實(shí)施例是要測(cè)試在患有擴(kuò)張性心肌病患者心臟中是否具有這種機(jī)能和是否顯示了該病癥的結(jié)果與ACE2多態(tài)性相關(guān)。增加的ACE2表達(dá)和活性可被用于治療該癥狀。
ACE2作為RAS負(fù)調(diào)節(jié)物的表征在3種高血壓大鼠模型中ACE2定位于與高血壓相關(guān)的QTL，且在所有這些高血壓大鼠品系中ACE2水平是減少的。在小鼠中，使用同源重組對(duì)ACE2的遺傳失活導(dǎo)致了在組織中增加的AngII肽水平，在心臟中缺氧基因的增量調(diào)節(jié)，和嚴(yán)重的心功能障礙。在ace2缺陷背景上ACE表達(dá)的除去完全消除了ace2單敲除小鼠的心力衰竭表型。這些數(shù)據(jù)提供了用于RAS調(diào)節(jié)的新范例，并鑒定ACE2為控制心功能的RAS的負(fù)調(diào)節(jié)物。
ACE2和血壓控制大多數(shù)心血管疾病是既受遺傳因素又受環(huán)境因素控制的多因子數(shù)量性狀。對(duì)于心血管疾病而言一個(gè)主要的因素是RAS。與廣泛表達(dá)的ACE形成對(duì)比，近來(lái)鑒定的ACE2顯示了組織特異性的表達(dá)。通過(guò)與ACE競(jìng)爭(zhēng)其AngI底物和/或通過(guò)切割A(yù)ngII產(chǎn)生Ang1-7，ACE2調(diào)節(jié)內(nèi)源AngII水平。在本發(fā)明之前，沒(méi)有人知道心血管系統(tǒng)中ACE2在體內(nèi)的角色。ACE2調(diào)節(jié)內(nèi)源AngII水平。其也行使RAS負(fù)調(diào)節(jié)物的功能。
在三種不同的自發(fā)性或飲食誘導(dǎo)的高血壓和心血管疾病的大鼠品系中，ACE2定位在X染色體上的確定的QTL中。在所有這些高血壓易感的大鼠品系中，ACE2 mRNA和蛋白水平是減量調(diào)節(jié)的。在Sabra大鼠的QTL分析中鑒定的SS-X基因座也被鑒定為一種對(duì)鹽負(fù)荷賦予抗性的基因座。在鹽敏感品系中ACE2的減少和在抗性品系中其表達(dá)缺乏任何改變顯示了ACE2對(duì)飲食誘導(dǎo)的血壓改變賦予了抗性。
作圖定位和減少的表達(dá)顯示了ACE2是對(duì)X染色體上的高血壓QTL起作用的基因。而且，在ace2基因敲除小鼠中增加的AngI和AngII表達(dá)證實(shí)了ACE2是一種RAS系統(tǒng)的體內(nèi)調(diào)節(jié)物。然而，在我們小鼠中ACE2的丟失并不導(dǎo)致血壓任何直接的改變，即使當(dāng)ACE功能被阻斷時(shí)。血壓改變僅僅發(fā)生在當(dāng)深度心臟機(jī)能障礙存在于年長(zhǎng)的雄性小鼠中時(shí)。對(duì)高血壓起作用的遺傳因素自身不改變血壓。反而，這些QTL定義了血壓的單一決定因素，其與其他的遺傳多態(tài)性一樣促進(jìn)了血壓的改變。我們鑒定了人群中ACE2多態(tài)性和高血壓之間的關(guān)系。重要地是，我們的數(shù)據(jù)顯示了ACE2作為一種增加的血壓的負(fù)調(diào)節(jié)物的功能。
ACE2和心功能的控制出乎意料地，小鼠中ACE2的丟失導(dǎo)致了深度收縮性機(jī)能障礙，引起在年長(zhǎng)的小鼠中全身血壓的劇烈減少。重要地是，通過(guò)破壞ACE，該心臟機(jī)能障礙完全地逆轉(zhuǎn)了，暗示在缺乏ACE2的條件下ACE的催化產(chǎn)物引發(fā)了收縮損傷。因?yàn)檫@些收縮損傷能發(fā)生在缺乏肥大或任何可檢測(cè)到的血壓改變的條件下，我們的數(shù)據(jù)也提供了遺傳學(xué)證據(jù)，即RAS調(diào)節(jié)的心臟疾病表型能在遺傳學(xué)上與其對(duì)血壓和心臟肥大的作用分開(kāi)。
ACE抑制劑和AngII受體阻斷劑已被證實(shí)在人心力衰竭中具有一種心臟保護(hù)的作用，因此暗示了AngII與心臟疾病相關(guān)。在我們的ace/ace2雙突變小鼠中心臟機(jī)能障礙的完全消失證明了RAS直接控制心功能和ACE2是一種關(guān)鍵的抗RAS和心力衰竭的負(fù)調(diào)節(jié)物。我們的遺傳拯救實(shí)驗(yàn)強(qiáng)烈地顯示，事實(shí)上是ACE的產(chǎn)物導(dǎo)致心力衰竭，即，在ace2基因敲除小鼠的心臟中看到的AngII的增加是導(dǎo)致心臟機(jī)能障礙的原因。AngII受體的藥理學(xué)抑制作用是否拯救了ace2突變小鼠的心臟表型則需要被測(cè)定。令人感興趣地是，我們?cè)谏n蠅中的結(jié)果顯示了與ACE同系物ACER相關(guān)的P-因子突變導(dǎo)致了心臟形態(tài)發(fā)生的嚴(yán)重和致命的缺陷(數(shù)據(jù)未顯示)，表明在心臟中ACE/ACE2的功能在進(jìn)化中是保守的。
ace2突變心臟中的缺陷其特征為嚴(yán)重的收縮性機(jī)能障礙，組織缺氧調(diào)節(jié)的基因的增量調(diào)節(jié)(在年長(zhǎng)的小鼠中只具有輕微的重構(gòu))，沒(méi)有肥大和沒(méi)有肌細(xì)胞損失的證據(jù)。ace2突變小鼠中衰竭心臟的這些表型和分子參數(shù)不同于肥大和擴(kuò)張性心肌病。更引起興趣的是，ace2突變心臟類似于在人冠心病病例中和在外科分流術(shù)情況下發(fā)現(xiàn)的心臟抑頓和冬眠。在這些心臟抑頓/冬眠的人類疾病和動(dòng)物模型中，慢性缺氧狀況導(dǎo)致了肌細(xì)胞新陳代謝中補(bǔ)償性的改變，缺氧誘導(dǎo)基因的增量調(diào)節(jié)，和心功能的降低。因?yàn)樵谘軆?nèi)皮細(xì)胞中ACE2被表達(dá)，和在心肌細(xì)胞中不表達(dá)，所以很可能ACE2的作用被限制在脈管系統(tǒng)中。例如，AngII的局部增加能導(dǎo)致血管收縮，產(chǎn)生血流灌注不足和缺氧。通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，AngII也被證實(shí)能導(dǎo)致內(nèi)皮機(jī)能障礙。ACE2的損失能導(dǎo)致缺氧誘導(dǎo)基因的增量調(diào)節(jié)的機(jī)制需要被測(cè)定。重要地是，我們的數(shù)據(jù)表明了ACE2多態(tài)性導(dǎo)致人冠心病的病理學(xué)。
實(shí)施例在3種高血壓大鼠品系中ACE2定位于X染色體上的QTL在自然界中高血壓和許多心血管疾病是多因子的且疾病發(fā)病機(jī)理受多個(gè)遺傳易感性位點(diǎn)的影響。在不同的重組大鼠模型中，高血壓的多個(gè)QTL已被鑒定。因?yàn)樵谌祟愔蠥CE2定位于X染色體及在一些高血壓大鼠模型中QTL已定位于X染色體，并且其至今沒(méi)有候選基因，所以ACE2應(yīng)該是該QTL的一個(gè)候選基因。為便于大鼠ACE2的染色體定位，通過(guò)篩選大鼠腎臟cDNA文庫(kù)克隆了全長(zhǎng)的大鼠ACE2 cDNA。大鼠ACE2與人ACE2高度同源，且與人和小鼠ACE具有32％同一性和42％相似性(
圖1a)。類似于人ACE2，大鼠基因由帶有保守的鋅結(jié)合位點(diǎn)的單ACE結(jié)構(gòu)域，信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域構(gòu)成(
圖1b)。類似于人，小鼠和大鼠中ACE2主要表達(dá)于腎臟和心臟中，在肺和肝臟中弱表達(dá)(
圖1c)。
放射雜交圖譜顯示了大鼠ACE2基因定位于X染色體上，與標(biāo)記DXRat9，DXWox14，DXWox15和DXRat42具有顯著的LOD分值，將ace2置于DXRat9和DXRat42之間(
圖1d)。比較圖譜顯示了ace2圖譜位置與在Sabra鹽敏感性大鼠中對(duì)高血壓鑒定的QTL間隔區(qū)交迭，該間隔區(qū)發(fā)現(xiàn)位于標(biāo)記DXMgh12和DXRat8(SS-X)之間。此外，染色體的ace2區(qū)域定位于中風(fēng)易感性自發(fā)性高血壓大鼠(SHRSP)中定義的BP3QTL間隔區(qū)，和通過(guò)同類系分析先前鑒定于自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)的X染色體上的高血壓BB.Xs QTL(
圖1d)。因而，在3種獨(dú)立的自發(fā)性和飲食誘導(dǎo)的高血壓模型中，ACE2定位于大鼠X染色體上的QTL。
在高血壓大鼠中ACE2表達(dá)的減量調(diào)節(jié)因?yàn)槟I臟是血壓調(diào)節(jié)的一個(gè)主要場(chǎng)所，所以測(cè)定了這3種高血壓大鼠品系的腎臟中的ACE2的表達(dá)水平。最初，測(cè)量了鹽敏感型Sabra高血壓(SBH/y)大鼠和對(duì)照的抗鹽型Sabra正常血壓(SBN/y)大鼠腎臟中ACE2的mRNA水平。在血壓正常的SBN/y大鼠中，鹽負(fù)荷(DOCA鹽)不影響ACE2 mRNA的表達(dá)。令人興趣地，在SBH/y大鼠中，鹽負(fù)荷和高血壓的發(fā)展與和血壓正常的SBN/y大鼠相比的ACE2mRNA表達(dá)明顯減少相關(guān)(圖2a)。注意的是，當(dāng)與喂以常規(guī)飲食的SBN/y對(duì)照相比時(shí)，喂以常規(guī)飲食的SBH/y的ACE2 mRNA也更低。后一發(fā)現(xiàn)與在喂以常規(guī)飲食的SBH/y和SBN/y大鼠之間觀察到的10-20mmHg血壓差異是一致的。
為測(cè)量ACE2蛋白水平，產(chǎn)生了一種ACE2(小鼠ACE2的aa206-aa225)特異性兔抗血清，其和大鼠及人ACE2都有交叉反應(yīng)(未顯示)。與減少的ACE2 mRNA表達(dá)相一致，在正常飲食喂養(yǎng)的SBH/y動(dòng)物中ACE2蛋白表達(dá)也明顯地減少(圖.2b)。在4周的DOCA-鹽的飲食后，SBH/y大鼠血壓的增加與ACE2蛋白水平的進(jìn)一步減少相關(guān)(圖.2b)。在抗鹽型SBN/y對(duì)照大鼠中，鹽負(fù)荷不引發(fā)血壓增加也不改變ACE2表達(dá)(圖.2b)。與他們的WKY對(duì)照相比，自發(fā)性高血壓SHRSP和SHR動(dòng)物腎臟中ACE2蛋白水平也明顯地減少了(圖.2b)。此外，在高血壓SHRSP和SHR大鼠中ACE2 mRNA的水平明顯地減少(未顯示)。在高血壓大鼠品系中ACE2編碼區(qū)的克隆和測(cè)序沒(méi)有顯示任何序列改變，表明減少的ACE2表達(dá)很可能是由控制ACE2基因表達(dá)的多態(tài)性導(dǎo)致的。在3個(gè)不同的大鼠品系中圖譜位置和減少的ACE2表達(dá)表明了，ace2是X染色體上的高血壓QTL的強(qiáng)候選基因。此外，在所有3種高血壓大鼠品系中減少的ACE2表達(dá)暗示了該酶行使負(fù)調(diào)節(jié)物的功能。
克隆小鼠ACE2和ACE2敲除小鼠的產(chǎn)生為證實(shí)ACE2作為QTL候選物的資格和為測(cè)試在心血管生理學(xué)和心血管疾病的發(fā)病機(jī)理中ACE2是否真正是一種必需的角色，克隆了小鼠ACE2基因(圖.1a)。類似于大鼠和人ACE2，鼠ACE2也定位于X染色體(未顯示)，含有單ACE-結(jié)構(gòu)域(圖.1b)，和主要表達(dá)于腎臟和心臟中(圖.1c)。感興趣地是，在小鼠中兩種ACE2的同種型在所有的陽(yáng)性組織中被觀察到。在COS細(xì)胞中鼠ACE2過(guò)表達(dá)顯示了ACE2切割A(yù)ngI形成Ang1-9(未顯示)，表明鼠ACE2與人ACE2具有同樣的生物化學(xué)特異性。為測(cè)定ACE2的體內(nèi)角色，在小鼠中ace2基因被破壞，即用新霉素抗性基因取代了外顯子9，有效地刪除了鋅結(jié)合催化結(jié)構(gòu)域(參見(jiàn)方法部分和圖.3a)。兩種在ace2基因座突變的ES細(xì)胞系被用于產(chǎn)生嵌合小鼠，其與C57BL/6回交以獲得種系轉(zhuǎn)移(germtransmission)。這兩種小鼠品系顯示了相同的表型。通過(guò)DNA印跡分析證實(shí)了ace2突變的轉(zhuǎn)移(圖.3b)。通過(guò)在RNA印跡(未顯示)和蛋白質(zhì)印跡分析(圖.3c)中ace2 mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和蛋白質(zhì)的缺失，證實(shí)了ace2基因的完全突變。ace2突變小鼠中，腎臟和心臟的ACEmRNA表達(dá)沒(méi)有改變(圖3d)。
因?yàn)锳CE2基因定位于X染色體，所有的雄性后代不是完全敲除突變型(ace2-/y)就是ACE2野生型(ace2+/y)，而就ace2突變而言，雌性不是野生型(ace2+/+)、雜合子(ace2+/-)就是純合子(ace2-/-)。應(yīng)注意的是在所有下述試驗(yàn)中，ace2+/-雌性的表現(xiàn)類似于ace2+/+雌性和ace2+/y雄性，表明了ace2雜合性沒(méi)有產(chǎn)生明顯的作用。ACE2無(wú)效敲除小鼠以預(yù)期的孟德?tīng)柋嚷食錾?，看起?lái)健康，并在所有被分析的器官中不顯示任何可檢測(cè)到的總的改變。此外，與ace-/-雄性小鼠(其顯示了明顯減少的生育力)相反，雄性和雌性ace2完全敲除小鼠都是能育的。
ace2突變小鼠的血壓先前已經(jīng)證實(shí)了ace2突變小鼠顯示減少的血壓和腎臟病變。因此，首先測(cè)試ACE2表達(dá)的損失是否影響血壓穩(wěn)態(tài)和/或腎臟發(fā)育或功能。引起興趣的是，與他們的對(duì)照同窩小鼠相比，在3個(gè)月大小的ace2-/y雄性(圖.4a)或ace2-/-雌性小鼠(未顯示)中ACE2的損失不導(dǎo)致血壓的改變。由于可能是ACE能補(bǔ)償ACE2的損失，我們用能阻斷ACE但不阻斷ACE2功能的卡托普利處理了ace2缺陷型小鼠。然而，用卡托普利體內(nèi)抑制ACE減少了ace-/y雄性小鼠的血壓，其減少的程度與在卡托普利處理的野生型同窩小鼠中觀察到的程度相似(圖.4a)。因而，即使在ACE抑制的情況下，在此定義的小鼠背景中ACE2的損失沒(méi)有明顯地直接影響血壓穩(wěn)態(tài)?；谖覀兊腞AS QTL數(shù)據(jù)，我們將我們的突變小鼠和其他背景小鼠回交，顯示了ACE2在血壓控制中的角色類似于在人類中的遺傳背景。
ace2突變小鼠的受損的腎功能因?yàn)锳CE2在腎臟中高表達(dá)，我們研究了腎臟形態(tài)學(xué)和功能。所有的3個(gè)月大小和6個(gè)月大小的ace2-/y雄性和ace2-/-雌性小鼠顯示了正常的腎臟形態(tài)學(xué)，并且在任何的腎臟超微結(jié)構(gòu)中沒(méi)有明顯的改變(圖4b)。通過(guò)使用連續(xù)切片形態(tài)測(cè)定法也證實(shí)了正常的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和導(dǎo)管系統(tǒng)和腎小球的腎臟結(jié)構(gòu)。
使用光學(xué)(PAS-染色)和電子顯微鏡(TEM)檢測(cè)了來(lái)自3和12月大小的ace2缺陷型小鼠和年齡相一致的同窩對(duì)照小鼠的腎臟。在雙盲方式(blinded manner)對(duì)每一個(gè)腎小球硬化癥的嚴(yán)重程度從0至4+進(jìn)行分級(jí)如下0代表沒(méi)有病灶、1+代表＜25％的腎小球硬化，而2+，3+，和4+分別代表25至50％，50至75％，和＞75％的腎小球硬化。在3個(gè)月大小時(shí)，在來(lái)自ace2缺陷型小鼠的腎臟中沒(méi)有明顯的病理變化。然而在12個(gè)月大小時(shí)，光學(xué)顯微鏡揭示了增加的腎小球硬化/損傷1.45±0.2對(duì)0.25±0.06；n＝6；p＜0.01。電子顯微鏡顯示了在腎血管系膜中增加的膠原纖維的沉積及增厚的基底膜。慢性接觸提高的AngII水平引發(fā)了ace2缺陷型小鼠腎臟中的缺氧和氧化應(yīng)激。蛋白質(zhì)印跡分析揭示了ace2缺陷型小鼠腎臟中增加的缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF1-α)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)。脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物的測(cè)定顯示了在6個(gè)月大小的ace2缺陷型小鼠中氧化應(yīng)激程度的增加己醛(1001±161對(duì)115±13nmol/g；n＝5；p＜0.01)和丙二醛(48±6.4對(duì)24.3±2.8nmol/g；n＝5；p＜0.01)。
這些結(jié)果證明了ACE2的損失導(dǎo)致了以組織特異性方式增強(qiáng)的血管緊張素II信號(hào)傳導(dǎo)，最終在ace2缺陷型小鼠腎臟中介導(dǎo)了有害效應(yīng)。減少的ACE2表達(dá)在腎病中扮演了一個(gè)重要的病理學(xué)角色。
ACE2的損失導(dǎo)致心功能嚴(yán)重缺陷ACE或AngII受體的藥理學(xué)抑制暗示了RAS在心功能和心臟肥大的調(diào)節(jié)中的角色。然而，ace完全敲除小鼠或血管緊張素原完全敲除小鼠都不發(fā)展明顯的心臟疾病。因?yàn)锳CE2在心臟血管系統(tǒng)的高度表達(dá)，所以分析了ace2缺陷型小鼠的心臟。ace2突變小鼠的心臟顯示了左心室壁輕微變薄及增加的室維度(圖5a)。在ace2缺陷型心臟中左心室前壁(AW)變薄和左心室舒張末期維度(LVEDD)的增加也可通過(guò)超聲心動(dòng)描記術(shù)觀察(表1)。這些結(jié)構(gòu)的改變主要在6個(gè)月大小的雄性小鼠中觀察到。然而，在年齡匹配的3個(gè)月大小(未顯示)和6個(gè)月大小的ace2-/y和ace2+/y小鼠之間心臟/身體重量比值是相當(dāng)?shù)?圖5a，b)。超聲心動(dòng)描記術(shù)也顯示了左心室質(zhì)量(LVM)和LVM/身體重量比值是正常的(表1)。沒(méi)有觀察到擴(kuò)張性心肌病的特性性結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)改變，因?yàn)闆](méi)有間質(zhì)性心臟纖維化的跡象(圖5c，d)，在ANF，BNP，a-MHC，b-MHC，和骨骼肌肌動(dòng)蛋白基因表達(dá)中也沒(méi)有原型改變(未顯示)。另外，ACE2無(wú)效敲除小鼠個(gè)體心肌細(xì)胞沒(méi)有顯示肥大的證據(jù)，并且當(dāng)通過(guò)TUNEL染色檢測(cè)(未顯示)時(shí)我們?cè)贏CE2無(wú)效敲除小鼠中沒(méi)有觀察到任何心肌細(xì)胞凋亡改變的證據(jù)。因此，盡管在6個(gè)月大小的ACE2無(wú)效敲除小鼠中心臟輕微地?cái)U(kuò)張，但是沒(méi)有心臟肥大或擴(kuò)張性心肌病的證據(jù)。
有趣地是，通過(guò)超聲心動(dòng)描記術(shù)評(píng)估心功能揭示了所有的ace2-/y雄性和ace2-/-雌性小鼠(通過(guò)減少的分?jǐn)?shù)縮短(FS)和減少的纖維鞘收縮速度(表1和圖6a，b)來(lái)確定)顯示了嚴(yán)重的收縮性心力衰竭。與年齡匹配的3個(gè)月大小的小鼠相比，在6個(gè)月大小的雄性和雌性小鼠中發(fā)現(xiàn)功能減少更劇烈，暗示了表型的進(jìn)展(表1)。與減少的心臟收縮性一致的是，6個(gè)月大小的ace2-/y小鼠顯示了降低的血壓(圖6c)，在年齡匹配的ace2-/-雌性和3個(gè)月大小的雄性中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該特征，暗示了血壓的降低可能是嚴(yán)重的心臟機(jī)能障礙所致，而不是ACE2損失對(duì)全身血壓的直接效果。這些令人驚奇的結(jié)果表明ACE2是一種關(guān)鍵的心臟收縮的負(fù)調(diào)節(jié)物。
為確證在心功能中超聲心動(dòng)圖缺陷，在ace2無(wú)效敲除小鼠中進(jìn)行侵入性血液動(dòng)力學(xué)測(cè)定。重要地是，侵入性血液動(dòng)力學(xué)測(cè)定顯示了在ace2突變小鼠中dP/dT-max和dP/dT-min都明顯地減少(表2)，表明了心臟收縮功能的嚴(yán)重?fù)p傷。ACE2的損失也導(dǎo)致了主動(dòng)脈壓和心室壓的明顯減少，與所觀察到的心臟收縮性減少是一致的(表2)。引人注目地，該數(shù)據(jù)證實(shí)了ace2突變小鼠的心臟收縮性的缺陷發(fā)生在不存在任何明顯的心臟肥大的條件下，并且可以與血壓改變?cè)谶z傳學(xué)上分離。
在ace2無(wú)效敲除的小鼠中缺氧誘導(dǎo)基因的增量調(diào)節(jié)ace2無(wú)效敲除小鼠中在不存在肥大或心臟纖維化下的嚴(yán)重的收縮機(jī)能障礙和輕微擴(kuò)張類似于在人和動(dòng)物模型中的心臟抑頓/冬眠。心臟抑頓和冬眠是對(duì)慢性缺氧如冠心病或其后的外科分流術(shù)的適應(yīng)性反應(yīng)。因?yàn)锳CE2在血管內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)，但收縮性是通過(guò)心肌細(xì)胞控制，所以推測(cè)ACE2的損失能導(dǎo)致心臟缺氧。因此通過(guò)RNA印跡分析了缺氧誘導(dǎo)基因如BNIP325和PAI-1的表達(dá)水平的變化。與他們的野生型同窩鼠相比，在所有被分析的ace2無(wú)效敲除小鼠的心臟中BNIP3和PAI-1的mRNA表達(dá)明顯地被增量調(diào)節(jié)(圖7a)。因此，ACE2的損失產(chǎn)生了缺氧調(diào)節(jié)基因表達(dá)模式的誘導(dǎo)。
ace2無(wú)效敲除小鼠的組織中增加的血管緊張素II水平由于ACE2具有羧肽酶的功能，從AngI上切割下單個(gè)殘基產(chǎn)生Ang1-9，和從AngII上切割下單個(gè)殘基產(chǎn)生Ang1-7，因此假設(shè)ACE2通過(guò)與ACE競(jìng)爭(zhēng)底物AngI和/或切割并失活A(yù)ngII，而作為一種RAS的負(fù)調(diào)節(jié)物。如果該假設(shè)是正確的，則ACE2的損失可增加體內(nèi)AngII水平。使用放射性免疫測(cè)定法，在ace2突變小鼠腎臟和心臟中確實(shí)發(fā)現(xiàn)AngII水平明顯地增加(圖7b)。此外，也觀察到了AngI的增加(圖7b)，這與AngI在體內(nèi)是ACE2作用的底物相一致。與對(duì)照相比在ace2突變小鼠的心臟和腎臟中ACE mRNA水平?jīng)]有發(fā)現(xiàn)有差異，表明了增加的AngII組織水平并不是由于ACE表達(dá)的增加(圖3d)。這些數(shù)據(jù)表明了ACE2作為一種RAS的負(fù)調(diào)節(jié)物并控制AngII的內(nèi)源性水平。
在ace2-缺陷型小鼠中除去ACE表達(dá)拯救了心力衰竭如果ace2突變小鼠心臟中的表型是由于AngII水平的增加，那么在遺傳學(xué)上除去ACE并破壞ACE2可能減少AngII水平并拯救在ACE2突變小鼠中觀察到的表型。為檢驗(yàn)這種觀點(diǎn)，產(chǎn)生ace/ace2雙突變小鼠。這些雙突變小鼠以預(yù)期的孟德?tīng)柋嚷食錾?，并看起?lái)健康。在該ace-ace2無(wú)效雙敲除小鼠中血壓(圖8)和腎臟缺陷(未顯示)類似于ace單突變小鼠。ace-ace2雙突變小鼠的生育力沒(méi)有被論述。因此，除在ace單突變小鼠中看到疾病的外，ACE和ACE2的損失也不能導(dǎo)致任何明顯的其它疾病。
因?yàn)橄惹皼](méi)有報(bào)道ACE敲除小鼠的心功能，因此在這些小鼠中的心臟參數(shù)首次被分析。在ace-/-小鼠中，心臟在組織學(xué)上是正常的(未顯示)，在6個(gè)月年齡時(shí)沒(méi)有可被檢測(cè)到的心功能缺陷(圖8b，c)。重要地是，ace2突變背景中ACE表達(dá)的除去完全地消除了ace2單敲除小鼠的心力衰竭表型(圖8b，c)。此外，使用超聲心動(dòng)描記術(shù)，6個(gè)月大小的，年齡匹配的ace-ace2雙突變小鼠與他們的ace單突變和野生型同窩鼠的所有心功能(表1)都是相當(dāng)?shù)?。雄性和雌性ace-ace2雙突變小鼠中都出現(xiàn)心功能的恢復(fù)。這些遺傳學(xué)的數(shù)據(jù)顯示了ACE表達(dá)是必需的，在不存在ACE2的情況下是引發(fā)收縮性心力衰竭必需的。重要地是，在ace和ace/ace2敲除小鼠之間血壓也沒(méi)有差異(圖8a)，進(jìn)一步暗示了在年長(zhǎng)的雄性ace2小鼠中降低的血壓是由于心功能的急劇降低。
ACE2對(duì)肺損傷的負(fù)控制成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)是一種嚴(yán)重的急性肺損傷，以及即使進(jìn)行精心護(hù)理，仍具有40-70％的死亡率。創(chuàng)傷、嚴(yán)重的膿毒癥(全身性感染)、彌漫型肺炎和休克是引發(fā)ARDS的最主要原因，在他們中酸誘導(dǎo)的肺損傷是最普遍的原因之一。導(dǎo)致酸吸入相關(guān)的肺損傷的潛在機(jī)理包括HCl誘導(dǎo)的對(duì)肺泡-毛細(xì)血管膜的損傷，和多形核中性粒細(xì)胞(PMN)粘附、激活和隔離，它們導(dǎo)致了肺水腫和氣體交換的衰退。ARDS的療法包括機(jī)械通氣和沉淀性疾病或損傷的持續(xù)療法。使用新藥(保護(hù)肺免受進(jìn)一步的肺泡-毛細(xì)血管膜損傷)的支持性療法將保留ARDS病人的肺功能以便治療該沉淀性疾病或損傷，使得ARDS的死亡率降低。
因?yàn)锳CE2在肺中表達(dá)，我們?cè)u(píng)估了在急性肺損傷中ACE2的損失是否扮演某種角色。圖9顯示了在HCl處理和對(duì)照小鼠中3小時(shí)后肺彈性(EL)的變化。施用HCl后，野生型小鼠存活超過(guò)4個(gè)小時(shí)，而ACE2敲除小鼠在2-3小時(shí)內(nèi)死亡。ACE2敲除小鼠顯示了比野生型小鼠明顯更嚴(yán)重的肺彈性響應(yīng)，反映了生存率的不同。因此，ACE2在保護(hù)肺免受急性酸誘導(dǎo)損傷中扮演了一個(gè)重要角色。因此，增強(qiáng)ACE2功能和/或表達(dá)是一種用于治療ARDS和肺病的新的和出乎意料的目標(biāo)。
方法克隆小鼠和大鼠ACE2及染色體QTL定位。鼠ACE2被克隆自一個(gè)非免費(fèi)的EST數(shù)據(jù)庫(kù)。使用小鼠ACE2探針，我們篩選大鼠腎臟cDNA(Invitrogen)以獲得全長(zhǎng)的大鼠cDNA，其通過(guò)DNA序列分析而確定。為進(jìn)行染色體定位，大鼠ACE2 cDNA特異性探針被用于篩選大鼠PAC文庫(kù)(RPCI-31，Research Genetics)，鑒定出兩種陽(yáng)性克隆(6M6和125K9)。測(cè)定這些克隆的末端序列并設(shè)計(jì)大鼠特異性引物(mc2L5’-TCAATTTACTGCTGAGGGGG-3’，mc2R5’-GAGGGATAACCCAGTGCAAA-3’)，通過(guò)篩選放射性雜交組(RH07.5，Research Genetics)以確定大鼠中ACE2的染色體圖譜位置。SHR和對(duì)照WKY大鼠獲得自Harlan，并根據(jù)研究所的指導(dǎo)方針飼養(yǎng)在Ontario癌癥研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中。SHRSP大鼠組織是由德國(guó)Detlev Ganten博士友情提供的。繁殖抗鹽型和鹽敏感型Sabra大鼠并飼養(yǎng)在以色列Ben-Gurion University Barzilai Medical Center的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中。Doca-鹽處理如前所述。
表達(dá)分析。使用tri-reagent制備大鼠腎臟總RNA。20毫克RNA在0.8％甲酰胺凝膠上進(jìn)行分析。轉(zhuǎn)印到尼龍膜(Amersham)，并用部分大鼠ACE2 cDNA克隆進(jìn)行探查(9-1)。β-肌動(dòng)蛋白探針和MultipleTissure Northern Blots購(gòu)自Clontech。為進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析，腎臟被勻漿于補(bǔ)充有“Complete”蛋白酶抑制劑混合物(Roche)和1mMNa3VO4的裂解緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.4，20mM EDTA，和1％triton-X 100)中。通過(guò)SDS-PAGE于8％tris-甘氨酸凝膠中分析100毫克蛋白質(zhì)。ACE2免疫血清獲得自用小鼠特異性ACE2肽DYEAEGADGYNYNRNQLIED免疫的兔中。血清通過(guò)使用sulpho-link試劑盒(Pierce)用所述免疫肽親和純化。商業(yè)上可獲得的β-肌動(dòng)蛋白抗體被用作為上樣對(duì)照(Santa Cruz)。
ACE2突變小鼠的產(chǎn)生。使用pKO Scrambler NTKV-1907載體(Stratagene)構(gòu)建靶向載體(短臂559個(gè)堿基對(duì)，長(zhǎng)臂8.1千個(gè)堿基對(duì))。用新霉素抗性盒以反義方向置換含有核苷酸+1069至+1299的ace2基因組DNA部分。該靶向構(gòu)建體被電穿孔入E14K ES細(xì)胞，并通過(guò)雜交有5’和3’側(cè)翼探針的EcoRI消化的基因組DNA的DNA印跡進(jìn)行陽(yáng)性同源重組ES克隆的篩選。兩種獨(dú)立的ace-/yES細(xì)胞株被注射到C57BL/6起源的胚泡中以產(chǎn)生嵌合小鼠，其與C57BL/6小鼠回交。兩種ES細(xì)胞株進(jìn)行獨(dú)立的種系遺傳。在該手稿中報(bào)道的數(shù)據(jù)在兩種突變小鼠系之間是一致的。通過(guò)RT-PCR、RNA印跡和蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)了ACE2表達(dá)的消除。只有同窩出生鼠被用于所有的試驗(yàn)中。所有組織的組織學(xué)、細(xì)胞凋亡分析、血清學(xué)和腎臟形態(tài)測(cè)量學(xué)按所描述的進(jìn)行31。完全ACE突變小鼠已在先前被描述8，并獲得自Jackson實(shí)驗(yàn)室。根據(jù)研究所的指導(dǎo)方針，小鼠飼養(yǎng)在Ontario Cancer Institute動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中。
心臟形態(tài)測(cè)定法，超聲心動(dòng)描記術(shù)，血液動(dòng)力學(xué)和血壓測(cè)量方法。為進(jìn)行心臟形態(tài)測(cè)定法，心臟用10％緩沖的福爾馬林在60mmHg下灌注并隨后埋入石蠟中。通過(guò)使用了減色電腦輔助圖象分析定量形態(tài)測(cè)定法測(cè)定心肌間質(zhì)性纖維化，其中使用了Image Processing Tool Kit2.5版和Photoshop 6.0軟件。Picro-Sirius紅染色切片被用于計(jì)算間質(zhì)纖維化，以陽(yáng)性PSR染色的面積與完整視野的比值表示。按照描述的方法32，使用野生型和突變同窩出生鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)描記術(shù)評(píng)估。小鼠用異氟烷/氧氣進(jìn)行麻醉，并通過(guò)使用裝備有15MHz線性傳感器的Acuson Sequoia C256的經(jīng)胸壁超聲心動(dòng)描記術(shù)進(jìn)行檢查。FS被計(jì)算如下FS＝[(EDD-ESD)/EDD]*100。Vcfc被計(jì)算為對(duì)心率經(jīng)過(guò)校正的FS/射血時(shí)間。血液動(dòng)力學(xué)測(cè)量描述如下。簡(jiǎn)單地說(shuō)，小鼠被麻醉，右側(cè)頸動(dòng)脈被分離并插入連接到放大器(TCP-500，Millar Inc.)的1.4 French Millar導(dǎo)管(Millar Inc.，Houston)。在導(dǎo)管插入到頸動(dòng)脈后，導(dǎo)管被推進(jìn)到主動(dòng)脈中并接著推進(jìn)到左心室中以記錄主動(dòng)脈壓和心室壓。測(cè)量和分析的參數(shù)是心率、主動(dòng)脈壓、左心室(LV)收縮壓、LV舒張壓和LV壓一次導(dǎo)數(shù)的最大值和最小值(分別是+dP/dtmax和dP/dtmax)。使用了Visitech Systems(Apex，NC)制造的Visitech BP-2000血壓分析系統(tǒng)進(jìn)行尾套血壓測(cè)量。為進(jìn)行卡托普利處理，在血壓測(cè)量前飲用水被添加有400mg/L卡托普利(Sigma)達(dá)兩周。
組織血管緊張素肽水平。心臟和腎臟在冰上于含有如前所述的肽酶抑制劑包括苯甲基磺酰氟(PMSF，100μM)的80％乙醇/0.1N HCl中被均漿化。蛋白勻漿在30,000g下離心20分鐘，輕輕倒出上清液，并用1％(v/v)七氟丁酸(HFBA，Pierce，Rockford，IL)酸化。在Savant真空離心機(jī)(Savant，F(xiàn)armingdale，NY)中該上清液被濃縮到5ml，且濃縮的抽提物被加到活化的Sep-Paks上，用0.1％HFBA洗滌，并用5ml 80％甲醇/0.1％HFBA洗脫。進(jìn)行了來(lái)自心臟和腎臟組織的抽提物中血管緊張素肽內(nèi)容物的放射性免疫測(cè)定分析。AngII和AngIRIAS的檢測(cè)限度分別是0.5fmol/管和AngI 5fmol/管。
急性肺損傷模型。ACE2敲除小鼠和他們的同窩出生小鼠(8-12周大)被用于本研究中。在吸入刺激前1分鐘，進(jìn)行兩口深吸氣(3倍潮氣體積)以使體積史標(biāo)準(zhǔn)化，并進(jìn)行測(cè)量以作為基線。在麻醉和機(jī)械通氣小鼠氣管內(nèi)注入2mL/kg HCl(pH＝1.5)，接著推注空氣。在對(duì)照組中，小鼠注射生理鹽水或不進(jìn)行注射。在所有組中，測(cè)量以30分鐘間隔進(jìn)行持續(xù)3小時(shí)。為評(píng)估生理性肺損傷，通過(guò)測(cè)量氣管峰值壓力、流量和體積來(lái)評(píng)估肺彈性(EL；肺順應(yīng)性的倒數(shù))。通過(guò)將氣管峰值壓力除以體積計(jì)算EL。EL的改變反映了肺薄壁組織的改變和肺硬化。
本發(fā)明已被詳細(xì)描述并結(jié)合參考文獻(xiàn)描述了優(yōu)選的實(shí)施方案；然而，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解可進(jìn)行不背離本發(fā)明精神和范圍的改變。例如，當(dāng)本申請(qǐng)涉及蛋白質(zhì)時(shí)，很清楚肽和多肽通常也可被使用。同樣地，在描述基因時(shí)，很清楚核酸分子或基因片段通常也可被使用。
所有的出版物(包括Genbank條目)，專利和專利申請(qǐng)都以其整體引入作為參考，如同每一個(gè)獨(dú)立的出版物，專利或?qū)＠暾?qǐng)被明確地和單獨(dú)地指出全文引入作為參考一樣。
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表1.ace2無(wú)效敲除小鼠的心臟功能
*p＜0.05ace2-/y對(duì)ace2+/y或ace2-/-對(duì)ace2+/-**p＜0.01ace2-/y對(duì)ace2+/y或ace2-/-對(duì)ace2+/-Bpm＝每分鐘心跳；AW＝前壁厚度；LVEDD＝左心室舒張末期維度；LVESD＝左心室收縮末期維度；％FS＝分?jǐn)?shù)縮短百分?jǐn)?shù)；PAV＝主動(dòng)脈流出速度峰值；Vcfc＝纖維鞘縮短速度；LVM＝計(jì)算的左心室質(zhì)量；BW＝身體重量。
表2.6個(gè)月大小ace2-/y小鼠的侵入性血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)
**p＜0.01ace2-/y對(duì)ace2+/ySBP＝收縮血壓；DBP＝舒張血壓；MBP＝平均動(dòng)脈血壓；LVSBP＝左心室收縮血壓；LVEDBP＝左心室末期舒張血壓；dP/dT max＝左心室壓/時(shí)間改變的一次導(dǎo)數(shù)的最大值；dP/dTmin＝左心室壓/時(shí)間改變的一次導(dǎo)數(shù)的最小值。
表3.6個(gè)月大小ace和ace/ace2無(wú)效敲除小鼠的心功能
AW＝前壁厚度；LVEDD＝左心室舒張末期維度；LVESD＝左心室收縮末期維度；％FS＝分?jǐn)?shù)縮短百分?jǐn)?shù)；PAV＝主動(dòng)脈流出速度峰值；Vcfc＝纖維鞘縮短速度。
權(quán)利要求
1.一種治療ACE2減少狀態(tài)的方法，包含給具有該狀態(tài)的哺乳動(dòng)物施用治療有效量的ACE2激動(dòng)劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述哺乳動(dòng)物是人。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中減少的ACE2狀態(tài)與選自高血壓、充血性心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、心肌梗塞、動(dòng)脈粥樣硬化和腎衰竭及肺疾病的病癥相關(guān)。
4.一種ACE2減少狀態(tài)的基因治療方法，包含遞送有效量的轉(zhuǎn)基因編碼區(qū)到器官。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中受影響的器官是心臟或腎臟或肺或血管。
6.權(quán)利要求4或5的方法，其中ACE2轉(zhuǎn)基因以基因治療載體的形式被施用于患者。
7.權(quán)利要求6的方法，其中基因治療載體包含病毒載體。
8.權(quán)利要求4-7任一項(xiàng)的方法，其中患者是人。
9.權(quán)利要求4-8任一項(xiàng)的方法，其中ACE2減少狀態(tài)與選自高血壓、充血性心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、心肌梗塞、動(dòng)脈粥樣硬化和腎衰竭及肺疾病的病癥相關(guān)。
10.一種包含ACE2基因的非人哺乳動(dòng)物，其中該基因的一個(gè)等位基因已經(jīng)被破壞。
11.一種包含編碼ACE2的基因的非人哺乳動(dòng)物，其中該基因的兩個(gè)等位基因都已經(jīng)被破壞。
12.一種包含破壞型ACE2突變的非人哺乳動(dòng)物，其中破壞導(dǎo)致編碼ACE2的基因的無(wú)效突變。
13.權(quán)利要求10到12任一項(xiàng)的非人哺乳動(dòng)物，其是嚙齒類動(dòng)物。
14.權(quán)利要求13的非人哺乳動(dòng)物，其是小鼠。
15.權(quán)利要求10到14的非人哺乳動(dòng)物，其特征在于高血壓或心收縮缺陷或腎缺陷或?qū)Ψ螕p傷增加的敏感性。
16.一種包含ACE2敲除構(gòu)建體的核酸。
17.一種包含權(quán)利要求16的核酸的載體。
18.一種包含權(quán)利要求17的核酸的鼠胚胎干細(xì)胞系。
19.一種篩選調(diào)節(jié)高血壓、心臟收縮及腎衰竭和肺損傷的化合物的方法，包含將化合物引入權(quán)利要求11到14任一項(xiàng)的非人哺乳動(dòng)物中，并測(cè)定血壓和/或心臟收縮和/或腎功能和/或肺感染的增加或減少。
20.一種篩選是ACE2活性的激動(dòng)劑的化合物的方法，包含a.提供i)包含ACE2的純化的制劑，ii)底物，和iii)測(cè)試化合物；b.在所述ACE2能作用于所述底物以產(chǎn)生產(chǎn)物的條件下混合所述ACE2和所述底物，其中所述混合在存在和不存在所述測(cè)試化合物的條件下進(jìn)行；和c.直接或間接測(cè)量在存在或不存在所述測(cè)試化合物的條件下產(chǎn)生的所述產(chǎn)物的量。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述底物是血管緊張素I或血管緊張素II。
22.權(quán)利要求20的方法，其中所述產(chǎn)物包含Ang1-9或Ang1-7。
23.根據(jù)權(quán)利要求20到22分離的化合物。
24.ACE2激活劑的作為藥物的應(yīng)用。
25.ACE2激動(dòng)劑用于治療心血管疾病或腎臟疾病或肺疾病的應(yīng)用。
26.ACE2激動(dòng)劑用于制備治療心血管疾病或腎臟疾病或肺疾病的藥物的應(yīng)用。
27.哺乳動(dòng)物中心血管疾病或腎臟疾病或肺疾病的醫(yī)學(xué)治療方法，包含對(duì)需要治療的哺乳動(dòng)物施用有效量的ACE2激動(dòng)劑。
28.權(quán)利要求27的方法，其中ACE2激動(dòng)劑與ACE抑制劑共同施用。
29.一種分離的編碼ACE2多肽的核酸分子，所述核酸分子包含ACE2核酸編碼區(qū)上游或下游的核苷酸多態(tài)性，其中相對(duì)于野生型ACE2，所述多態(tài)性減少了ACE2的表達(dá)量。
30.根據(jù)權(quán)利要求1的分離的核酸分子，其中所述多態(tài)性選自ACE2a-ACE2m中的至少一個(gè)。
31.一種檢測(cè)動(dòng)物中ACE2減少狀態(tài)的方法，包括從所述動(dòng)物獲得DNA樣本和在所述DNA樣本中鑒定權(quán)利要求29或30的核酸。
32.一種在動(dòng)物中用于診斷以ACE2減少狀態(tài)為特征的疾病或疾病傾向的方法，包括在來(lái)自所述動(dòng)物的DNA樣本中鑒定權(quán)利要求29或30的核酸。
33.根據(jù)權(quán)利要求31或32的方法，包括測(cè)定所述動(dòng)物對(duì)于所述核苷酸多態(tài)性是純合還或雜合的。
34.權(quán)利要求31到33任一項(xiàng)的方法，其中所述ACE2減少狀態(tài)與選自高血壓、充血性心力衰竭、慢性心力衰竭、急性心力衰竭、心肌梗塞、動(dòng)脈粥樣硬化和腎衰竭的心血管疾病或腎臟疾病或肺疾病相關(guān)。
35.一種多核苷酸，包含特異性結(jié)合(i)ACE2核酸編碼區(qū)的上游或下游區(qū)域的序列，其中所述區(qū)域緊接減少ACE2表達(dá)的核苷酸多態(tài)性。
36.權(quán)利要求35的多核苷酸，包含8至10，8至15，8至20，8至25，25，25至50，50至75，50至100，100至200，200至500或500至1000個(gè)核苷酸。
37.權(quán)利要求35或36的多核苷酸，其中所述核酸在高度嚴(yán)緊雜交條件下特異性結(jié)合緊接ACE2a-ACE2m之一的。
38.權(quán)利要求37的多核苷酸，其中所述嚴(yán)緊雜交條件包含0.1XSSC，0.1％SDS，在65℃。
39.權(quán)利要求35的多核苷酸，包含與ACE2多態(tài)性互補(bǔ)的序列。
40.權(quán)利要求39的多核苷酸，包含選自下面的序列a.緊接核苷酸多態(tài)性的ACE2上游或下游區(qū)域的8-50個(gè)核苷酸，其中所述序列包括ACE2a-ACE2m之一并包含
圖11中所示序列之一的全部或部分b.與(a)中所述的序列互補(bǔ)的序列；和c.與(a)或(b)中的序列具有至少70％序列一致性的序列，其中所述具有一致性的序列在高度嚴(yán)緊雜交條件下能和ACE2雜交。
41.權(quán)利要求35的多核苷酸，其中所述核酸在雜交檢測(cè)法中能作為探針。
42.權(quán)利要求41的多核苷酸，其中所述核酸序列被可檢測(cè)地標(biāo)記。
43.權(quán)利要求42的多核苷酸，其中所述可檢測(cè)的標(biāo)記包括a.熒光染料；和/或b.生物素化修飾；和/或c.放射性標(biāo)記。
44.一種ACE2基因分型試劑盒，包含用于檢測(cè)來(lái)自動(dòng)物的核酸樣本中的ACE2多態(tài)性存在的檢測(cè)試劑。
45.權(quán)利要求44的試劑盒，其中所述檢測(cè)試劑包含核酸和/或限制性內(nèi)切酶。
46.權(quán)利要求44的試劑盒，進(jìn)一步包含用于容納所述檢測(cè)試劑的生物樣品容器。
47.權(quán)利要求44的試劑盒，進(jìn)一步包含具有多孔的平板，該平板上結(jié)合有探針，所述探針具有特異性結(jié)合包括ACE2多態(tài)性的ACE2序列的核酸序列。
48.權(quán)利要求44的試劑盒，進(jìn)一步包含用于擴(kuò)增所述核酸的擴(kuò)增試劑。
49.權(quán)利要求48的試劑盒，其中所述擴(kuò)增試劑擴(kuò)增緊接選自ACE2a-ACE2m的ACE2單核苷酸多態(tài)性的ACE2核苷酸區(qū)域。
50.權(quán)利要求48的試劑盒，其中所述擴(kuò)增試劑包含引物組，其中每一引物是特異性結(jié)合緊接ACE2a-ACE2m之一的位置的核酸，和/或使延伸穿過(guò)ACE2a-ACE2m之一的核酸。
51.權(quán)利要求144的試劑盒，用于檢測(cè)動(dòng)物患有或處于ACE2減少狀態(tài)的疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。
52.權(quán)利要求51的試劑盒，其中所述疾病包括心血管疾病或腎臟疾病或肺疾病或影響血管。
53.權(quán)利要求52的試劑盒，其中所述疾病選自高血壓，充血性和擴(kuò)張性慢性心力衰竭，急性心力衰竭，心肌梗塞，冠心病，動(dòng)脈粥樣硬化，和腎衰竭及肺疾病。
54.一種對(duì)動(dòng)物進(jìn)行ACE2基因分型的方法，包括a.獲得來(lái)自所述動(dòng)物的ACE2核酸樣本，該ACE2核酸樣本包含ACE2編碼區(qū)的上游和下游區(qū)域；和b.檢測(cè)包含ACE2單核苷酸多態(tài)性的ACE2核酸的區(qū)域。
55.權(quán)利要求54的方法，其中所述核苷酸多態(tài)性選擇ACE2a-ACE2m。
56.權(quán)利要求55的方法，包括確定所述動(dòng)物對(duì)于ACE2多態(tài)性是純合的還或雜合的。
57.權(quán)利要求56的方法，其中所述動(dòng)物是人，并且所述ACE2基因型被用于確定所述動(dòng)物是否患有ACE2減少狀態(tài)的疾病或處于ACE2減少狀態(tài)的疾病的風(fēng)險(xiǎn)中。
58.權(quán)利要求57的方法，其中所述疾病包含心血管疾病或腎臟疾病或肺疾病或影響血管。
59.權(quán)利要求54的方法，其中通過(guò)擴(kuò)增來(lái)自動(dòng)物的核酸來(lái)獲得所述核酸。
60.權(quán)利要求59的方法，其中通過(guò)用權(quán)利要求7到15任一項(xiàng)的多核苷酸的全部或部分進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)獲得所述核酸。
61.權(quán)利要求54的方法，其中所述檢測(cè)步驟包括確定ACE2核酸的核苷酸序列。
62.權(quán)利要求54的方法，其中所述檢測(cè)步驟包括在高度嚴(yán)緊條件下使所述核酸和權(quán)利要求7到15任一項(xiàng)的多核苷酸接觸。
63.權(quán)利要求62的方法，其中所述多核苷酸選擇地與緊接(i)包含不同于ACE2多態(tài)性的單多態(tài)性的ACE2核酸區(qū)域的位置選擇性雜交。
64.權(quán)利要求54的方法，其中所述檢測(cè)步驟包括a.進(jìn)行所述核酸的限制性內(nèi)切酶消化，從而提供核酸消化物；和b.將消化物與所述多核苷酸接觸。
65.權(quán)利要求64的方法，其中雜交發(fā)生在PCR擴(kuò)增中或之后，并且通過(guò)“實(shí)時(shí)”P(pán)CR分析或熒光測(cè)定分析進(jìn)行所述分析。
66.權(quán)利要求64的方法，其中所述檢測(cè)步驟包括核酸的大小分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和治療心血管疾病、腎臟疾病、肺疾病和高血壓的ACE2激活化合物。本發(fā)明也包括通過(guò)測(cè)量ACE2表達(dá)或核苷酸多態(tài)性分析診斷心血管疾病、腎臟疾病、肺疾病和高血壓的方法。
文檔編號(hào)A01K67/027GK1671425SQ03818359
公開(kāi)日2005年9月21日 申請(qǐng)日期2003年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月19日
發(fā)明者J·M·彭寧格爾, M·A·克拉科維爾 申請(qǐng)人:大學(xué)保健網(wǎng)