專(zhuān)利名稱(chēng)：安祖花體細(xì)胞胚誘導(dǎo)快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物快速繁殖技術(shù)，具體為安祖花體細(xì)胞胚誘導(dǎo)快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
安祖花原產(chǎn)于中南美洲熱帶雨林中，是近幾年引入我國(guó)的名貴花卉。安祖花因其花形獨(dú)特、花色艷麗、瓶插壽命長(zhǎng)、周年開(kāi)花、觀賞價(jià)值高的特點(diǎn)成為倍受人們歡迎的高檔花卉。在全球熱帶花卉貿(mào)易中，安祖花的銷(xiāo)量?jī)H次于蘭花，名列第二。安祖花既可用于切花整體提高插花花藍(lán)檔次，又可用于盆花進(jìn)行裝飾。近幾年由于不斷培育出新的多花品種，其盆栽市場(chǎng)的需求量正急劇上升。
現(xiàn)有的安祖花繁殖方法主要有兩種。一種是用實(shí)生苗進(jìn)行專(zhuān)業(yè)化栽培，該方法利用常規(guī)的播種、分株法進(jìn)行安祖花繁殖，繁殖率極低，播種繁殖所需時(shí)間長(zhǎng)，且易產(chǎn)生變異。另一種方法是利用組織培養(yǎng)進(jìn)行快速繁殖，即將安祖花的外植體在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，通過(guò)誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織、發(fā)芽、生根、移植栽培等過(guò)程進(jìn)行快速繁殖。實(shí)踐證明，組培繁殖的安祖花無(wú)性系，在質(zhì)量上和數(shù)量上都大大優(yōu)于實(shí)生混合種。但由于目前安祖花組培繁殖技術(shù)是通過(guò)器官發(fā)生途徑形成再生植株，其遺傳穩(wěn)定性相對(duì)較差，再生植株變異性幾率相對(duì)較高，繁殖周期也相對(duì)較長(zhǎng)。而利用植物體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的方法進(jìn)行組培快繁具有遺傳性相對(duì)穩(wěn)定，所形成的再生植株變異性小于器官發(fā)生途徑形成的再生植株，繁殖周期短，增殖量大的特點(diǎn)。雖然體細(xì)胞胚誘導(dǎo)快速繁殖方法在其它植物上已有應(yīng)用，但在安祖花上目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)成功的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決目前尚無(wú)用體細(xì)胞胚誘導(dǎo)法快速繁殖安祖花的問(wèn)題，提供一種安祖花體細(xì)胞胚誘導(dǎo)快速繁殖方法。
本發(fā)明是采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的安祖花體細(xì)胞胚誘導(dǎo)快速繁殖方法，其包含如下步驟取安祖花幼莖并將幼莖切成3-7mm長(zhǎng)，無(wú)菌狀態(tài)下接入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，溫度25-27℃，黑暗培養(yǎng)40-50天，將誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入形態(tài)生長(zhǎng)培養(yǎng)基，溫度25-27℃，見(jiàn)光培養(yǎng)，光強(qiáng)3000Lx，12-16h/d，培養(yǎng)50-60天形成完整的植株；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為1/2MS+2.4-D1-2.5mg/L+TDZ0.05-0.5mg/L+肌醇25-100mg/L+酪蛋白25-100mg/L+蔗糖30-40g/L(2.4-D中文化學(xué)名稱(chēng)2，4-二氯苯氧乙酸，英文化學(xué)名稱(chēng)2，4-dichlorophenoxyacetic acid；TDZ中文化學(xué)名稱(chēng)塞苯隆，英文化學(xué)名稱(chēng)Thidiazuron；肌醇英文化學(xué)名稱(chēng)Inositol；酪蛋白英文化學(xué)名稱(chēng)Casein，acid hydrolysate)；所述的形態(tài)生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方為1/2MS+KT0.05-0.5mg/L+TDZ0.05-0.5mg/L(KT中文化學(xué)名稱(chēng)6-糠氨基嘌呤，英文化學(xué)名稱(chēng)6-Furfurylaminopurine)。
一般情況下，體細(xì)胞胚(胚狀體)的發(fā)育過(guò)程是細(xì)胞經(jīng)脫分化后，持續(xù)細(xì)胞分裂，形成小細(xì)胞團(tuán)，并順次經(jīng)過(guò)原胚期、球形胚期、心形胚期、梨形胚期和子葉期，進(jìn)而形成完整的植株。下面通過(guò)對(duì)安祖花體細(xì)胞胚發(fā)生過(guò)程中組織細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果進(jìn)行分析，證明本發(fā)明所述的安祖花快繁方法符合體細(xì)胞胚發(fā)育過(guò)程的一般情況，其不經(jīng)過(guò)明顯的愈傷組織形成過(guò)程，其起始方式屬于明顯的直接體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑。
(1)組織培養(yǎng)前幼莖的組織細(xì)胞學(xué)特征培養(yǎng)前幼莖橫切面由外向內(nèi)分別為第一層為表皮層，排列整齊，形狀規(guī)則，呈長(zhǎng)方形。細(xì)胞壁染色較深，可見(jiàn)明顯的細(xì)胞核。表皮內(nèi)為1-2層厚角細(xì)胞，增厚程度不明顯。皮層細(xì)胞6-10層，為薄壁細(xì)胞，體積大、形狀不規(guī)則，具較大的細(xì)胞間隙，細(xì)胞核小，分布在細(xì)胞邊緣，整個(gè)皮層區(qū)域染色較淺。皮層內(nèi)部有26個(gè)小維管束沿同心圓環(huán)狀分布，每個(gè)維管束只有20個(gè)左右細(xì)胞組成，韌皮部在外方，木質(zhì)部在內(nèi)方，屬外韌維管束。維管束中無(wú)典型的維管束鞘。韌皮部、木質(zhì)部都已發(fā)育。導(dǎo)管具雙層壁，外層壁多邊形，內(nèi)層壁近圓形。韌皮部區(qū)域可見(jiàn)明顯的較大的細(xì)胞核，且細(xì)胞質(zhì)較濃。髓部由5層薄壁細(xì)胞組成，這些細(xì)胞與皮層中細(xì)胞相似，形狀較圓(見(jiàn)圖1、圖2)。
(2)幼莖組織啟動(dòng)分裂期的組織細(xì)胞學(xué)特征對(duì)培養(yǎng)5天的幼莖觀察發(fā)現(xiàn)，維管束區(qū)域細(xì)胞核增多，核仁明顯，皮層中也出現(xiàn)一些具有明顯核仁的細(xì)胞核。
對(duì)培養(yǎng)8天的幼莖觀察發(fā)現(xiàn)，維管束區(qū)域橫切面中部細(xì)胞核較密集，細(xì)胞核明顯變大變圓，核仁位于細(xì)胞核中央。
對(duì)培養(yǎng)11天的幼莖觀察發(fā)現(xiàn)，皮層與維管束交界處大量細(xì)胞發(fā)生破裂，維管束環(huán)帶與髓部一起與皮層發(fā)生分離，貼近維管束的皮層細(xì)胞有較多的淀粉顆粒積累，完整獨(dú)立的維管束結(jié)構(gòu)已不存在(圖3、圖4)。
維管束內(nèi)篩管細(xì)胞周?chē)霈F(xiàn)許多大核細(xì)胞，主要分布在靠近皮層一側(cè)，形成胞質(zhì)濃厚的小區(qū)域，區(qū)域中篩管與這些細(xì)胞接觸緊密。這些小區(qū)域是胚性細(xì)胞的分生區(qū)，這類(lèi)細(xì)胞應(yīng)是前胚性決定細(xì)胞，可能是體細(xì)胞胚的起始細(xì)胞(圖5、圖6)。
(3)體細(xì)胞胚胎發(fā)育過(guò)程中組織與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)從培養(yǎng)后21天開(kāi)始，發(fā)現(xiàn)了不同細(xì)胞數(shù)目的多細(xì)胞原胚。原胚與周?chē)?xì)胞有明顯界限，有厚壁將原胚包圍。原胚中細(xì)胞小，但細(xì)胞核很大。原胚周?chē)募?xì)胞結(jié)構(gòu)松散，細(xì)胞體積大、無(wú)核、壁薄、胞質(zhì)稀少(圖7)。
隨著原胚細(xì)胞數(shù)目的增加，細(xì)胞的排列更加緊密，細(xì)胞的形狀由近圓形變成多邊形，該時(shí)期能夠觀察到大量的染色體行為。隨著多細(xì)胞原胚的細(xì)胞分裂，胚體逐漸擴(kuò)大為圓形，形成球形胚。
胚胎發(fā)育過(guò)程各時(shí)期的狀態(tài)可以從圖7到圖12中看到，依次為8細(xì)胞原胚、32細(xì)胞原胚、單胚柄的早期原胚、球形胚、心形胚、梨形胚、子葉胚(盾片胚)。
觀察到的體細(xì)胞胚主要是經(jīng)過(guò)內(nèi)發(fā)生途徑形成的，是由莖內(nèi)維管束中的胚性決定細(xì)胞產(chǎn)生體細(xì)胞胚。但是對(duì)培養(yǎng)34天的幼莖觀察，發(fā)現(xiàn)了由幼莖表皮層向外產(chǎn)生的一個(gè)胚狀體結(jié)構(gòu)。而在橫切面的其它部位，則保持著與原始莖相似的結(jié)構(gòu)。該胚狀體很明顯是從外植體外層細(xì)胞直接產(chǎn)生的。結(jié)果說(shuō)明，安祖花體細(xì)胞胚以?xún)?nèi)發(fā)生途徑為主要方式的同時(shí)，也不排除外發(fā)生途徑的存在(圖19)。
(4)關(guān)于胚體分化特征在胚體分化期，胚體中有的部位細(xì)胞分裂迅速，形成突起，成為盾片胚。此時(shí)胚根區(qū)胚體與周?chē)?xì)胞間出現(xiàn)較大空隙而處于孤立狀態(tài)(圖13)。胚中的組織已開(kāi)始分化，胚根區(qū)形成原表皮層，其細(xì)胞形狀規(guī)則、排列整齊，易與其它組織區(qū)別(圖14)，其內(nèi)為基本分生組織之間的細(xì)胞群，細(xì)胞核分布較松散。子葉中有原形成層，其細(xì)胞作縱向伸長(zhǎng)，從子葉走向胚軸，有形成連續(xù)系統(tǒng)的趨勢(shì)，這部分區(qū)域胞質(zhì)很濃。胚軸到胚根之間也有縱向伸長(zhǎng)的細(xì)胞(圖15)，與子葉中的原形成層相似。隨著胚的進(jìn)一步發(fā)育，子葉繼續(xù)伸長(zhǎng)，在高倍鏡下可看到子葉區(qū)已有導(dǎo)管出現(xiàn)(圖16)。
(5)形態(tài)建成期特征成熟胚繼續(xù)發(fā)育，形成植株雛形并長(zhǎng)成完整植株(圖17，圖18)。
本發(fā)明所述的安祖花體細(xì)胞胚誘導(dǎo)快速繁殖方法具有遺傳性相對(duì)穩(wěn)定，所形成的再生植株變異性小于器官發(fā)生途徑形成的再生植株，繁殖周期短，增殖量大的特點(diǎn)，該方法進(jìn)行快繁比器官發(fā)生可以縮短時(shí)間50天。在理論上具有重演受精卵形態(tài)發(fā)生的特性，對(duì)于揭示細(xì)胞分化、發(fā)育、形態(tài)發(fā)生與合子胚發(fā)育等重大理論問(wèn)題的機(jī)制以及真核細(xì)胞中基因表達(dá)和調(diào)控具有十分重要的意義。為安祖花改良、轉(zhuǎn)基因受體和突變體篩選等提供良好的無(wú)性繁殖實(shí)驗(yàn)體系。


圖1為組織培養(yǎng)前幼莖的橫切光學(xué)顯微照片；圖2為組織培養(yǎng)前幼莖維管束光學(xué)顯微照片圖3為培養(yǎng)11天后的幼莖光學(xué)顯微照片圖4為維管束細(xì)胞開(kāi)始分裂光學(xué)顯微照片圖5為篩管周?chē)拇蠛思?xì)胞 光學(xué)顯微照片圖6為胚胎發(fā)生起始細(xì)胞光學(xué)顯微照片圖7為8細(xì)胞原胚光學(xué)顯微照片圖8為32細(xì)胞原胚胎光學(xué)顯微照片圖9為早期原胚光學(xué)顯微照片圖10為球形胚光學(xué)顯微照片圖11為梨形胚光學(xué)顯微照片圖12為盾形胚光學(xué)顯微照片圖13為胚根結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微照片圖14為胚根原表皮層光學(xué)顯微照片圖15為子葉區(qū)原形成層光學(xué)顯微照片圖16為子葉區(qū)導(dǎo)管光學(xué)顯微照片圖17為成熟胚狀體光學(xué)顯微照片圖18為形態(tài)發(fā)生光學(xué)顯微照片圖19為外發(fā)生的胚狀體光學(xué)顯微照片具體實(shí)施方式
實(shí)施例1安祖花體細(xì)胞胚誘導(dǎo)快速繁殖方法，其包含如下步驟取安祖花幼莖并將幼莖切成3mm長(zhǎng)，無(wú)菌狀態(tài)下接入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，溫度25℃，黑暗培養(yǎng)40天，將誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入形態(tài)生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方，溫度25-27℃，見(jiàn)光培養(yǎng)，光強(qiáng)3000Lx，12h/d，培養(yǎng)50天形成完整的植株；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為1/2MS+2.4-D1mg/L+TDZ0.05mg/L+肌醇25mg/L+酪蛋白25mg/L+蔗糖30g/L；所述的形態(tài)生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方1/2MS+KT0.05mg/L+TDZ0.05mg/L。
誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚可以從幼莖上切下轉(zhuǎn)入形態(tài)生長(zhǎng)培養(yǎng)基；通過(guò)幼莖切片上誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚較少，可將整個(gè)幼莖切片轉(zhuǎn)入形態(tài)生長(zhǎng)培養(yǎng)基。
實(shí)施例2安祖花體細(xì)胞胚誘導(dǎo)快速繁殖方法，其包含如下步驟取安祖花幼莖并將幼莖切成7mm長(zhǎng)，無(wú)菌狀態(tài)下接入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，溫度27℃，黑暗培養(yǎng)50天，將誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入形態(tài)生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方，溫度27℃，見(jiàn)光培養(yǎng)，光強(qiáng)3000Lx，16h/d，培養(yǎng)60天形成完整的植株；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為1/2MS+2.4-D2.5mg/L+TDZ0.5mg/L+肌醇100mg/L+酪蛋白100mg/L+蔗糖40g/L；所述的形態(tài)生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方1/2MS+KT0.5mg/L+TDZ 0.5mg/L。
實(shí)施例3安祖花體細(xì)胞胚誘導(dǎo)快速繁殖方法，其包含如下步驟取安祖花幼莖并將幼莖切成5mm長(zhǎng)，無(wú)菌狀態(tài)下接入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，溫度26℃，黑暗培養(yǎng)45天，將誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入形態(tài)生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方，溫度26℃，見(jiàn)光培養(yǎng)，光強(qiáng)3000Lx，14h/d，培養(yǎng)55天形成完整的植株；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為1/2MS+2.4-D1.8mg/L+TDZ0.27mg/L+肌醇65mg/L+酪蛋白65mg/L+蔗糖35g/L；所述的形態(tài)生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方1/2MS+KT0.27mg/L+TDZ0.27mg/L。
權(quán)利要求
1.一種安祖花體細(xì)胞胚誘導(dǎo)快速繁殖方法，其特征為其包含如下步驟取安祖花幼莖并將幼莖切成3-7mm長(zhǎng)，無(wú)菌狀態(tài)下接入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，溫度25-27℃，黑暗培養(yǎng)40-50天，將誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入形態(tài)生長(zhǎng)培養(yǎng)基，溫度25-27℃，見(jiàn)光培養(yǎng)，光強(qiáng)3000Lx，12-16h/d，培養(yǎng)50-60天形成完整的植株；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為1/2MS+2.4-D1-2.5mg/L+TDZ0.05-0.5mg/L+肌醇25-100mg/L+酪蛋白25-100mg/L+蔗糖30-40g/L；所述的形態(tài)生長(zhǎng)培養(yǎng)基配方為1/2MS+KT0.05-0.5mg/L+TDZ0.05-0.5mg/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物快速繁殖技術(shù)，具體為安祖花體細(xì)胞胚誘導(dǎo)快速繁殖方法。包含如下步驟取安祖花幼莖并將幼莖切成3－7mm長(zhǎng)，無(wú)菌狀態(tài)下接入到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，溫度25－27℃，黑暗培養(yǎng)40－50天，將誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)入形態(tài)生長(zhǎng)培養(yǎng)基，溫度25－27℃，，見(jiàn)光培養(yǎng)，光強(qiáng)3000Lx，12－16h/d，培養(yǎng)50－60天形成完整的植株；本發(fā)明所述的安祖花體細(xì)胞胚誘導(dǎo)快速繁殖方法具有遺傳性相對(duì)穩(wěn)定，所形成的再生植株變異性小于器官發(fā)生途徑形成的再生植株，繁殖周期短，增殖量大的特點(diǎn)，該方法進(jìn)行快繁比器官發(fā)生可以縮短時(shí)間50天。本發(fā)明為安祖花改良、轉(zhuǎn)基因受體和突變體篩選等提供良好的無(wú)性繁殖實(shí)驗(yàn)體系。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1552199SQ20031010971
公開(kāi)日2004年12月8日 申請(qǐng)日期2003年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
發(fā)明者康黎芳, 曲復(fù)寧, 王云山, 柳亞林, 曹冬梅, 郭建民, 劉琛彬, 張超 申請(qǐng)人:山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所