專利名稱：花毛茛的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物的組織培養(yǎng)及繁殖方法，具體涉及花毛茛的組織培養(yǎng)和快速繁殖方法。
背景技術(shù)：
花毛茛是毛茛科，毛茛屬的多年生宿根草本植物，具多個(gè)紡錘形的塊根，莖單生或少生分枝，有毛，很少有明顯的腋芽，葉腋間生長(zhǎng)的基本為花芽。由于其花色鮮艷、色彩豐富、花型豐滿、瓶插壽命長(zhǎng)，近年來(lái)在國(guó)內(nèi)花卉市場(chǎng)上獲得了很好的效果，但目前種源仍只有依靠進(jìn)口且進(jìn)口價(jià)格昂貴。花毛茛常規(guī)的繁殖方法是采用種子和分株繁殖，但由于花毛茛是異花授粉植物，常規(guī)種子繁殖的雜種后代的分離嚴(yán)重，性狀不穩(wěn)定，所以種子繁殖主要用于花毛茛的育種工作中。分株繁殖的后代性狀穩(wěn)定，但繁殖系數(shù)低，難以進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)和優(yōu)良品種的大面積推廣。目前花毛茛的組培研究，尤其是花毛茛大規(guī)模無(wú)性繁殖的的研究報(bào)告較少，只有馮莉等人(1997)利用花毛茛的種子為外植體培養(yǎng)獲得無(wú)菌苗。從實(shí)際操作上看，花毛茛組培的難度表現(xiàn)在由于生長(zhǎng)階段無(wú)明顯的腋芽和莖尖，而剛從土內(nèi)萌發(fā)的蕖芽又嫩又臟，難于消毒和建立無(wú)菌體系，并且在無(wú)菌體系建立后增殖率低，難在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行大規(guī)模的生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種花毛茛組培快繁的方法，以便建立無(wú)菌快繁體系，并在無(wú)菌體系中提高增殖率，適宜大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)種苗。
本發(fā)明所述方法經(jīng)過(guò)下列工藝步驟(本發(fā)明所用百分比為質(zhì)量百分比)1、種球催芽種球先在清水中浸泡8-10小時(shí)，之后播種于含水量在20-30％的基質(zhì)中，在10-12℃進(jìn)行催芽培養(yǎng)，待萌芽長(zhǎng)到1-2cM的錐形并未展葉時(shí)，將芽從種球基部取下，取完芽后的種球放入基質(zhì)中繼續(xù)催芽；2、外植體滅菌將嫩芽依次在75％的酒精、0.15％的Hgcl2、1.5％的次氯酸鈉溶液中進(jìn)行消毒滅菌處理，其時(shí)間依次是消毒20-40秒，滅菌10-30分鐘，再消毒10-20分鐘，最后用無(wú)菌水漂洗至少2次；
3、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)消毒滅菌后的上述嫩芽在無(wú)菌工作環(huán)境中接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中MS培養(yǎng)基BA 0.5-2.0mg/LNAA 0.1-0.5mg/L糖 30-40g/L，瓊脂5.5g/L控制PH為6.0，光照時(shí)間10-12小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000Lx，培養(yǎng)溫度為20-22℃，待錐形芽長(zhǎng)成有葉的小苗后，將小苗去葉并在相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代轉(zhuǎn)接2-3次后，在小苗的基部和葉腋間長(zhǎng)出2-4個(gè)不定芽，繼代4-5代后可得叢生芽；4、不定芽繼代培養(yǎng)將上述叢生芽置于下列增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)MS培養(yǎng)基BA 0.2-0.8mg/LNAA 0.1-0.5mg/L，糖 30-40g/L，瓊脂5.5g/L控制PH為6.0，光照時(shí)間為10-12小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000Lx，培養(yǎng)溫度為20-22℃，每15天繼代一次，繼代5-6代；5、生根培養(yǎng)和過(guò)渡移栽將上述繼代增殖中得到的不定芽分切成單株，接種在下列生根培養(yǎng)基上MS培養(yǎng)基BA 0.1-0.4mg/L，NAA 0.1 0.4mg/L，糖 30-40g/L，瓊脂5.5g/L控制PH為6.0，光照時(shí)間為10-12小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000Lx，培養(yǎng)溫度為20-22℃，培養(yǎng)15天后，小芽苗長(zhǎng)大并生根，洗去附在生根苗上的瓊脂，放入濃度為0.2％的多菌靈溶液中消毒分鐘，直接移栽于腐殖土∶紅土＝10∶1的基質(zhì)中，待苗葉色濃綠并產(chǎn)生大量須根時(shí)，進(jìn)行移栽種植。
所述MS培養(yǎng)基成分為下表

在研究花毛茛的組培與高效快速繁殖方法的過(guò)程中，主要解決了下列難題在外植體的選擇上根據(jù)花毛茛的特性，通過(guò)種球直接產(chǎn)生錐形芽進(jìn)行滅菌處理，并利用不同的培養(yǎng)基進(jìn)行交替培養(yǎng)，同時(shí)采取降低培養(yǎng)溫度，加快轉(zhuǎn)接速度等技術(shù)措施，獲得了花毛茛高效快速繁殖的效果。
本發(fā)明通過(guò)采取種球的相對(duì)無(wú)菌催芽、取錐形嫩芽滅菌、建立無(wú)菌體系，并進(jìn)行環(huán)境、激素、營(yíng)養(yǎng)和過(guò)渡基質(zhì)等調(diào)節(jié)，解決花毛茛無(wú)菌體系建立困難的問題，并達(dá)到了高效快速增殖的目的，實(shí)現(xiàn)了花毛茛的規(guī)?；a(chǎn)。其優(yōu)越性體現(xiàn)在1、提供花毛茛離體組培快繁的成套技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了花毛茛的規(guī)模化生產(chǎn)。
2、用種球催芽并取錐形嫩芽作為外植體，對(duì)無(wú)菌體系的建立是一種新穎而且有效的方法。
3、針對(duì)花毛茛習(xí)性，利用種球低溫催芽技術(shù)，可以分批采芽，1個(gè)種球可獲得10-15個(gè)嫩芽，結(jié)合有效的滅菌技術(shù)，每年可獲提組培苗20-30萬(wàn)株，通過(guò)培養(yǎng)基的交替使用可以保證種源在2年后還有很強(qiáng)的增殖率和較低的變異率。
4、在培養(yǎng)過(guò)程中，進(jìn)行20-22℃接近花毛茛生長(zhǎng)環(huán)境低溫培養(yǎng)，并加快轉(zhuǎn)接速度使苗的不良生長(zhǎng)情況得到改進(jìn)。
5、進(jìn)行不同培養(yǎng)階段的激素調(diào)節(jié)，采取激素混用和輪用，達(dá)到提高增殖率和減少變異的目的。
為了更好地說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，下面給出本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不僅限于這些。
實(shí)施例11、種球催芽種球先在清水中浸泡8小時(shí)，使種球充分吸水膨脹，然后播于塑料箱內(nèi)的珍珠巖中，按照隔一層珍珠巖排一層種球的順序依次播入，并用塑料薄膜進(jìn)行覆蓋保濕，基質(zhì)的含水量控制在25％。在10-12℃下進(jìn)行催芽培養(yǎng)，13天芽開始萌發(fā)，待萌芽長(zhǎng)到1CM并呈錐形但未展葉時(shí)，將芽從種球基部取下，取完芽后的種球可以繼續(xù)埋于基質(zhì)中再催芽，以便多次重復(fù)采芽；2、外植體滅菌嫩芽采取三步消毒法進(jìn)行滅菌，先將芽在75％的酒精中表面消毒30秒，然后在0.15％的Hgcl2中滅菌20分鐘，最后再在1.5％的次氯酸鈉溶液中消毒12分鐘，之后用無(wú)菌水漂洗3次；3、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)消毒滅菌后的上述嫩芽在無(wú)菌工作環(huán)境中接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中
MS培養(yǎng)基(同前)BA2.0mg/L，NAA 0.1mg/L，糖30g/L，瓊脂 5.5g/L控制PH為6.0，光照時(shí)間11小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000Lx，培養(yǎng)溫度為20-22℃，20天后，有約20％的外植體無(wú)污染，并從錐形芽長(zhǎng)成有葉的小苗，將小苗去葉后在相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代轉(zhuǎn)接3次后，在小苗的基部和葉腋間長(zhǎng)出2-4個(gè)不定芽，不定芽的發(fā)生與BA濃度呈正相關(guān)，但叢生和玻璃化的發(fā)生也隨BA濃度的增加而加劇，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代4-5代，使之達(dá)到能轉(zhuǎn)入正常生產(chǎn)時(shí)的種源基數(shù)；4、不定芽繼代培養(yǎng)①將上述叢生芽置于下列增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)MS培養(yǎng)基(同前)BA 0.2mg/LNAA 0.5mg/L糖 40g/L，瓊脂 5.5g/L控制PH為6.0，光照時(shí)間為10小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000Lx，培養(yǎng)溫度為20-22℃，每15天繼代一次，增殖率可達(dá)2倍左右，在這個(gè)培養(yǎng)基上，既可以保證較高的增殖率，又可以保證組培苗的質(zhì)量，叢生、變異和玻璃化的發(fā)生率很低，在繼代培養(yǎng)基上繼代5-6代后，取出；②置于與步驟3的誘導(dǎo)培養(yǎng)基(BA1.0+NAA0.2)相同的培養(yǎng)基上繼代1-2代；①、②交替使用，可讓一個(gè)種球一年生產(chǎn)種苗20-30萬(wàn)株5、生根培養(yǎng)和過(guò)渡移栽將上述繼代增殖中得到的不定芽分切成單株，接種在下列生根培養(yǎng)基上MS培養(yǎng)基(同前)BA0.1mg/LNAA 0.4mg/L
糖 35g/L瓊脂 5.5g/L控制PH為6.0，光照時(shí)間為12小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000Lx，培養(yǎng)溫度為20-22℃，小芽苗明顯長(zhǎng)高并生根，不僅根系分布均勻，且根的數(shù)量及根粗適中，過(guò)渡成活率高，將出瓶后的生根苗洗去瓊脂放入低濃度多菌靈溶液中消毒片刻，直接移栽于腐殖土∶紅土＝10∶1基質(zhì)中，前期注意保濕和遮陰，前7天加蓋雙層遮陰網(wǎng)，以后逐漸減少遮陰，半月后可完全去除遮陰并適當(dāng)控水，此時(shí)可適當(dāng)增加光照并輔助噴施葉面肥，待苗葉色濃綠并產(chǎn)生大量須根時(shí)，可進(jìn)行移栽種植。
實(shí)施例2除培養(yǎng)基為下列培養(yǎng)基外，其余步驟均同實(shí)施例1誘導(dǎo)培養(yǎng)基中MS培養(yǎng)基(同前)BA 0.5mg/L，NAA 0.5mg/L，糖 40g/L，瓊脂 5.5g/L增殖培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基(同前)BA 0.8mg/LNAA0.1mg/L糖 30g/L，瓊脂 5.5g/L生根培養(yǎng)基上MS培養(yǎng)基(同前)BA 0.4mg/LNAA0.1mg/L糖 30g/L瓊脂 5.5g/L。
本發(fā)明經(jīng)試驗(yàn)研究，其結(jié)果報(bào)告如下1、材料和方法 所用材料為云南省農(nóng)科院園藝所花卉研究中心進(jìn)口花毛茛品種“2059”的種球，進(jìn)行低溫種球催芽后，在不同時(shí)期進(jìn)行取材，分別用種球催芽萌發(fā)的嫩芽、栽培后的腋芽及花芽作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)。
2、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)過(guò)程等均與實(shí)施例相同，其結(jié)果見表1、表2和表3。
表1不同外植體接種及生長(zhǎng)表現(xiàn)

從表1可以看出以在無(wú)菌基質(zhì)中從種球萌發(fā)的錐形嫩芽為最佳的外植體材料。
表2不同激素濃度及配比對(duì)花毛茛誘導(dǎo)的影響

表3不同生長(zhǎng)素對(duì)花毛茛生根和成活的影響

從表2可以看出，隨BA濃度增加，增殖率逐步提高，在BA2.0時(shí)增殖率最高，但是隨培養(yǎng)代數(shù)的增加，變異明顯增加，主要表現(xiàn)為不定芽矮化、葉片不展開，皺縮及黃化。在前期的誘導(dǎo)培養(yǎng)中BA1.0+NAA0.2效果最好，是一種高效有用的誘導(dǎo)培育基，增殖率適中，變異率低。
從表3可見，在NAA0.1-1.0mg/L的培養(yǎng)基上，均會(huì)長(zhǎng)根，長(zhǎng)根時(shí)間無(wú)明顯差異，但以0.1-0.4mg/L時(shí)的生根效果較好，不僅根系分布均勻，且根的數(shù)量及根粗適中，過(guò)渡成活率高；生長(zhǎng)素濃度過(guò)高則根系短粗，易脫落，過(guò)渡成活率低。幼苗移栽以春初及秋季節(jié)最好，此時(shí)幼苗成活率高，可達(dá)到90％以上，此時(shí)氣候涼爽，苗的生長(zhǎng)良好?；⒃谙募靖邷貢r(shí)會(huì)自然休眠，夏季移栽溫度太高苗的生長(zhǎng)不良。
影響花毛茛快繁增殖的因素繼代時(shí)間在花毛茛的培養(yǎng)中，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，小苗，特別是苗上比較老的葉片會(huì)褐化死亡，且汾泌物也會(huì)使培養(yǎng)基顏色變褐，褐色物的產(chǎn)生又加劇了小苗的死亡，針對(duì)這一問題，我們進(jìn)行繼代周期試驗(yàn)，結(jié)果表明，在12-15天及時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)瓶，可以減少或減輕褐化的發(fā)生。
溫度影響花毛茛是喜歡冷涼的花卉，過(guò)高的溫度會(huì)使植株休眠，在組培中，當(dāng)溫度高時(shí)，小苗的長(zhǎng)勢(shì)差，并伴有褐化發(fā)生，在20℃左右的培養(yǎng)溫度下，有利于苗的生長(zhǎng)工，在30℃時(shí)，半數(shù)以上的苗會(huì)褐死，這與花毛茛的田間生長(zhǎng)習(xí)性相一致，田間表現(xiàn)為5月份以后花毛茛開始枯萎死休眠。
權(quán)利要求
1.一種花毛茛的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于經(jīng)過(guò)下列工藝步驟A、種球催芽種球先在清水中浸泡8-10小時(shí)，之后播種于含水量在20-30％的基質(zhì)中，在10-12℃進(jìn)行催芽培養(yǎng)，待萌芽長(zhǎng)到1-2cM的錐形并未展葉時(shí)，將芽從種球基部取下，取完芽后的種球放入基質(zhì)中繼續(xù)催芽；B、外植體滅菌將嫩芽依次在75％的酒精、0.15％的Hgcl2、1.5％的次氯酸鈉溶液中進(jìn)行消毒滅菌處理，其時(shí)間依次是消毒20-40秒，滅菌10-30分鐘，再消毒10-20分鐘，最后用無(wú)菌水漂洗至少2次；C、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)將經(jīng)過(guò)消毒滅菌后的上述嫩芽在無(wú)菌工作環(huán)境中接種于下列誘導(dǎo)培養(yǎng)基中MS培養(yǎng)基BA 0.5-2.0mg/LNAA 0.1-0.5mg/L糖 30-40g/L，瓊脂5.5g/L控制PH為6.0，光照時(shí)間10-12小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000Lx，培養(yǎng)溫度為20-22℃，待錐形芽長(zhǎng)成有葉的小苗后，將小苗去葉并在相同的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代轉(zhuǎn)接2-3次后，在小苗的基部和葉腋間長(zhǎng)出2-4個(gè)不定芽，繼代4-5代后可得叢生芽；D、不定芽繼代培養(yǎng)將上述叢生芽置于下列增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)MS培養(yǎng)基BA0.2-0.8mg/LNAA 0.1-0.5mg/L，糖30-40g/L，瓊脂 5.5g/L控制PH為6.0，光照時(shí)間為10-12小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000Lx，培養(yǎng)溫度為20-22℃，每15天繼代一次，繼代5-6代；E、生根培養(yǎng)和過(guò)渡移栽將上述繼代增殖中得到的不定芽分切成單株，接種在下列生根培養(yǎng)基上MS培養(yǎng)基BA 0.1-0.4mg/L，NAA 0.1-0.4mg/L，糖 30-40g/L，瓊脂 5.5g/L控制PH為6.0，光照時(shí)間為10-12小時(shí)，光照強(qiáng)度為2000Lx，培養(yǎng)溫度為20-22℃，培養(yǎng)15天后，小芽苗長(zhǎng)大并生根，洗去附在生根苗上的瓊脂，放入濃度為0.2％的多菌靈溶液中消毒分鐘，直接移栽于腐殖土∶紅土＝10∶1的基質(zhì)中，待苗葉色濃綠并產(chǎn)生大量須根時(shí)，進(jìn)行移栽種植。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟4的不定芽繼代培養(yǎng)過(guò)程中，先在繼代培養(yǎng)基上繼代5-6代后，再在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上繼代1-2代，如此交替使用。
全文摘要
本發(fā)明提供一種花毛茛的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，它采用種球催芽、外植體滅菌、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)、不定芽繼代培養(yǎng)、生根培養(yǎng)和過(guò)渡移栽等工藝步驟，并在所對(duì)應(yīng)的各培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，直至長(zhǎng)成生根苗后直接移栽即可。該方法解決了花毛茛無(wú)菌體系建立的關(guān)鍵技術(shù)，同時(shí)通過(guò)激素、營(yíng)養(yǎng)、培養(yǎng)環(huán)境的綜合調(diào)節(jié)，達(dá)到了進(jìn)種效率高，增殖速度快，生產(chǎn)技術(shù)穩(wěn)定目的。實(shí)現(xiàn)了花毛茛優(yōu)良品種的規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1613298SQ20031011091
公開日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2003年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月7日
發(fā)明者吳麗芳, 熊麗, 屈云慧, 王祥寧, 張素芳, 楊春梅, 蔣亞蓮 申請(qǐng)人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝作物研究所