專利名稱：一種地衣芽孢桿菌菌株(b－0a12)及其制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，更確切地說，涉及用于防治植物根部病害，特別是用于大豆胞囊線蟲病和根腐病防治的地衣芽孢桿菌菌株及其制劑。
背景技術(shù)：
大豆起源于我國，隨著種植面積的擴(kuò)大，大豆重迎茬問題越來越嚴(yán)重。其中大豆胞囊線蟲病和根腐病的發(fā)病面積占大豆種植面積的70％以上，損失達(dá)10-40％，發(fā)病嚴(yán)重地塊出苗不整齊，植株矮小，黃化，俗稱“火龍秧”，甚至導(dǎo)致絕產(chǎn)，近年來發(fā)病面積有增加趨勢。
目前生產(chǎn)上對大豆胞囊線蟲和根腐病有效的化學(xué)藥物仍然采用呋喃丹和多福合劑，化學(xué)農(nóng)藥長期使用造成環(huán)境的污染，巨毒農(nóng)藥—呋喃丹已經(jīng)被國家禁止使用。因此利用生物方法防治根部病害越來越受到關(guān)注。
國內(nèi)外應(yīng)用食線蟲真菌和寄生性細(xì)菌防治植物寄生線蟲研究報(bào)道較多(林茂松，1990；劉杏忠等，1991，1992)，防治大豆胞囊線蟲的真菌Pochonia chlamydosporum，Paecilomyceslilacinus已經(jīng)進(jìn)入田間實(shí)驗(yàn)(劉杏忠，專利號(hào)ZL 951 21114.5；潘滄桑，專利號(hào)CN1149393，CN1149394；劉維志，專利號(hào)CN1225236)，但由于真菌本身的特點(diǎn)使其應(yīng)用受到限制如1)真菌制劑普遍發(fā)酵周期長，液體菌劑發(fā)酵時(shí)間通常需要5-7天，如果采用液固兩相發(fā)酵，時(shí)間將增加到10-20天(潘滄桑)，使成本增加。2)貯存期短，液體菌劑雖然利于東北大面積播種時(shí)進(jìn)行種子處理，但貯藏時(shí)間短，只有3-6個(gè)月，不利于商品化。3)液固兩相發(fā)酵，雖然可以使制劑的貯存期延長到18個(gè)月，但液固兩相發(fā)酵時(shí)間大大延長。液固兩相發(fā)酵一般為開放式淺盤培養(yǎng)，占地面積比較大，容易污染。目前真菌在劑型、大量生產(chǎn)等方面尚未取得重大突破。
而防治線蟲的寄生性細(xì)菌Pasteuria penetrans雖然研究較多，可成功的控制線蟲侵染(Stirling和Wachtel，1980)，但因其為專性寄生物，難于人工培養(yǎng)，田間應(yīng)用受到限制。根際是根防御病原侵染的第一線，因此根際細(xì)菌除了具有與根親和力強(qiáng)，能定殖于植物根際的特點(diǎn)外，還具有拮抗性強(qiáng)和易于應(yīng)用等特點(diǎn)，根際細(xì)菌能防治病原細(xì)菌和真菌，促進(jìn)植物生長(Weller，1988；李長松，1992；郭榮君，1996)，這使人們受到啟發(fā)，對根際細(xì)菌防治植物寄生線蟲進(jìn)行了探索，成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。
目前研究報(bào)道用于防治植物寄生線蟲的細(xì)菌種類有Bacillus spp.、Pseudomonas spp.、Streptomyces spp.、Clostridium spp.、Serratia sp.和Agrobac terium sp.(Becker，etal.，1988；Oostendorp & Sikora，1989；Sikora，1988；Racke & Sikora，1992；McInnis，1990；田紅林等，1995)、Gluconobacter sp.、Sporolactobacillus sp.(郭榮君等，1998)、Acinebacter sp.(田紅林等，1995)。應(yīng)用假單胞菌防治番茄、黃瓜、甜菜、棉花、花生等植物寄生線蟲—根結(jié)線蟲的研究報(bào)道比較多(Siddiqui and Malhmood，1999)，有些菌株在溫室實(shí)驗(yàn)中防效可超過60％(Sikora，1988)，甚至達(dá)到80％(田紅林等，1995)，但在非滅菌土中效果比較差，只有Oostendorp和Sikora(1989)報(bào)道假單胞菌Pseudomonas fluorescensA-59在田間對根結(jié)線蟲的防效達(dá)到75％。應(yīng)用假單胞菌防治線蟲已申請專利(專利號(hào)EP0171381)。假單胞菌是很有潛力的菌株，但在應(yīng)用于生產(chǎn)時(shí)，最方便經(jīng)濟(jì)的使用方法是進(jìn)行種子處理。假單胞菌不耐高溫、菌劑貯存時(shí)間短，所以限制了其應(yīng)用。
芽孢桿菌因?qū)Σ涣辑h(huán)境的耐受力比較好，便于加工成各種劑型而得到廣泛應(yīng)用。應(yīng)用芽孢桿菌屬的枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌防治根結(jié)線蟲的研究較多(Siddiqui and Malhmood，1999)，但不同種類線蟲侵染的植物不同，從不同植物根際分離得到的拮抗細(xì)菌種類也不同，而且這些拮抗菌對植物生理特性的反應(yīng)也不相同(Kloepper等，1992)，因此每個(gè)細(xì)菌菌株對病原的拮抗機(jī)制可能不同，涉及以下一個(gè)或多個(gè)方面如產(chǎn)生殺線物質(zhì)，產(chǎn)生水解酶類，改變根分泌物與線蟲相互作用方式(Oostendorp和Sikora，1990)，產(chǎn)生系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性(Hasky-Gunther等，1998)等。特定根圍的根際細(xì)菌，可消耗或改變根分泌物的分泌形式，從而影響根分泌物依賴型植物寄生線蟲的發(fā)育(Sikora andHoffmann-Hergarten，1993)。基于以上原理，應(yīng)針對不同植物，不同病原篩選生防菌株。而且對于大多數(shù)植物來說，菌劑與植物本身以及與土壤環(huán)境等因素相關(guān)聯(lián)，對一種病原有效的生物菌劑對另一種病原效果可能不理想，這也是植物病害生防的難點(diǎn)。應(yīng)用地衣芽孢桿菌防治根結(jié)線蟲的報(bào)道比較多，根結(jié)線蟲主要危害番茄、黃瓜、棉花等作物，危害大豆的線蟲主要是大豆胞囊線蟲，胞囊線蟲與根結(jié)線蟲的生活史不同，是兩種不同病原。因此還需要針對大豆胞囊線蟲篩選大豆根際細(xì)菌。本發(fā)明人曾報(bào)道不同根際細(xì)菌菌株對大豆根腐病和大豆胞囊線蟲病的拮抗作用(郭榮君等，1998)。目前未見應(yīng)用地衣芽孢桿菌防治大豆胞囊線蟲病和鐮刀菌引起的大豆根腐病的研究報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是基于微生態(tài)學(xué)原理，提供了一種防治大豆胞囊線蟲病和根腐病的菌株。本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用該菌株防治大豆胞囊線蟲病和根腐病的菌劑制備方法。
菌株的分離本人從安徽省宿縣大豆根腐和胞囊線蟲重病地健康植株根際采集土壤，在溫室種植大豆，大豆長出2片復(fù)葉時(shí)，取出幼苗，抖掉根際外圍松散土壤，保留緊貼于根表的土壤經(jīng)80℃水浴加熱10分鐘，然后稀釋涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，挑取不同形態(tài)的菌落，純化后保存于牛肉膏蛋白胨斜面上。根腐病菌和胞囊線蟲是兩大不同的病原，二者對大豆侵染機(jī)制不同，根際細(xì)菌對大豆胞囊線蟲和根腐病菌的拮抗機(jī)理也因菌株不同而不同。在溫室實(shí)驗(yàn)中對大豆胞囊線蟲表現(xiàn)好的菌株SY-NS對大豆根腐病沒有表現(xiàn)出拮抗作用(郭榮君等，1998)。該菌株在平板拮抗測定和對線蟲的體外抑制實(shí)驗(yàn)檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)該菌株對大豆腐病菌生長有一定的抑制作用，抑菌帶在3mm左右，對大豆胞囊線蟲二齡幼蟲致死率在76.3％。對該菌株的革蘭氏染色和顯微鏡觀察表明該菌株產(chǎn)生芽孢，是很有潛力的菌株。
該菌株的特征在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成乳白色菌落，G染色為陽性，菌體桿狀，大小0.8×2.1-0.9×3.9，產(chǎn)生芽孢，芽孢多端生，不明顯膨大，橢圓形或柱狀，厭氧生長，接觸酶陽性，在7％NaCl生長、PH5.7生長、V.P陽性、水解淀粉、還原硝酸鹽成亞硝酸鹽、利用丙酸鹽，因此鑒定為地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)。該菌株已保藏于中國科學(xué)院微生物研究所保藏，保藏號(hào)是CGMCC No.1035。
本發(fā)明人根據(jù)微生態(tài)原理，應(yīng)用所分離到的地衣芽孢桿菌經(jīng)發(fā)酵并添加復(fù)合劑處理種子，從調(diào)節(jié)植物根際微生態(tài)，提高植物本身抗病性等多方面防治大豆胞囊線蟲病和根腐病。應(yīng)用該菌株研制的菌劑對大豆胞囊線蟲病的防效達(dá)到67.2％，對大豆根腐病防效在54.9％。
從而本發(fā)明提供了一株防治大豆胞囊線蟲病和根腐病的大豆根際細(xì)菌。其名稱為地衣芽孢桿菌CGMCC No.1035。
將本發(fā)明的地衣芽孢桿菌菌株用于大量培養(yǎng)，并加入復(fù)合添加劑后，用于大豆胞囊線蟲病和根腐病的大面積防治。本發(fā)明還提供了一種用于防治大豆胞囊線蟲病和根腐病的液體制劑。其特征在于通過三級(jí)發(fā)酵工藝制成。其特征在于，用于接種的菌株為地衣芽孢桿菌CGMCC No.1035；液體發(fā)酵的溫度控制在27-35℃，優(yōu)選為28-32℃；pH控制在6.8-8.0，優(yōu)選pH7.0-7.4；所說的三級(jí)發(fā)酵，是當(dāng)芽孢菌含量達(dá)到7×108個(gè)/ml時(shí)可結(jié)束發(fā)酵。
上述三級(jí)發(fā)酵工藝是從試管原種開始，經(jīng)過搖瓶、種子罐、發(fā)酵罐的三級(jí)發(fā)酵。接種量為1-3％。發(fā)酵時(shí)間與發(fā)酵溫度、通氣量等有關(guān)，搖瓶和種子罐的發(fā)酵時(shí)間一般為36-48小時(shí)，發(fā)酵罐的發(fā)酵時(shí)間為24-48h。
培養(yǎng)基組分為培養(yǎng)基成分 含量可溶性淀粉 1-2％(W/V，下同)豆餅粉 1-2％牛肉膏 0.5-1.0％葡萄糖 0.1-0.5％NaNO30.01-0.03％Mg2SO4·7H2O 0.01-0.03％CaCO30.1-0.3％
在發(fā)酵結(jié)束后，添加大豆生長需要的一些微量元素如ZnSO450-100ppm，H3BO45-20ppm，NaMoO4.2H2O 2-10ppm。幾丁質(zhì)可作為土壤和菌劑的添加物來防治土傳病害，但幾丁質(zhì)在土壤中需要較長時(shí)間才能被微生物分解，因此在本發(fā)明的添加物中不僅添加了0.1％-0.3％(W/V)幾丁質(zhì)，還添加了0.01-0.02％(W/V)殼聚糖。殼聚糖分子量較小，可以很快被土壤中微生物利用，促進(jìn)拮抗微生物菌群的繁殖，同時(shí)提高植株本身的免疫力，隨后幾丁質(zhì)分解釋放出殺線物質(zhì)拮抗根腐病菌和線蟲，分解后產(chǎn)生的小分子物質(zhì)還可以促進(jìn)土壤中微生物和植株本身的生長。在本菌劑中還添加了0.5-1‰(W/V)腐殖酸鈉，腐殖酸鈉的添加有助于調(diào)節(jié)植物本身的生理狀態(tài)，促進(jìn)植株的生長。另外在菌液中加入0.1-0.2％(W/V)羧甲基纖維素做粘和劑，更有利于菌液包衣在大豆種子上，同時(shí)不影響種子的呼吸。
本發(fā)明的液體制劑的使用方法是每畝大豆種子(5-6Kg)加50-100ml的液體菌劑混和，待晾干后播種。優(yōu)選方案發(fā)酵液經(jīng)過過濾離心后的菌體用硅藻土或其他載體吸附，干燥制成粉劑。施用時(shí)，按比例與粘和劑混和均勻后用于種子處理。該方案的優(yōu)點(diǎn)是工藝簡單，便于貯存和包裝、運(yùn)輸，延長菌的貯存期。
發(fā)酵液經(jīng)過噴霧干燥可加工成粉劑，也可采用載體吸附，制成固體制劑或加工成顆粒劑。細(xì)菌發(fā)酵液的菌懸液比較稀，所以本發(fā)明中將吸附載體的比例進(jìn)行了改進(jìn)，利于菌劑的干燥。菌液與吸附載體的比例為1∶1-3∶1(W/W)。吸附載體可選用硅藻土、草炭、高嶺土、或其他不影響菌株活性的吸附載體以及各種載體的混合物。該種制劑可同時(shí)將菌體和發(fā)酵代謝產(chǎn)物吸附，保持菌體的活菌含量和代謝產(chǎn)物活性。
與現(xiàn)有技術(shù)的化學(xué)農(nóng)藥或類似生物農(nóng)藥相比，本發(fā)明擴(kuò)大了芽孢桿菌屬細(xì)菌防治線蟲病害的應(yīng)用范圍，本菌劑的優(yōu)點(diǎn)是1.芽孢菌發(fā)酵周期短，降低生產(chǎn)成本，節(jié)約能源。無毒、無污染。2.芽孢耐高溫和干燥，利于加工成各種劑型，便于貯存和運(yùn)輸。3.可在大豆根際定殖，拮抗大豆胞囊線蟲和根腐病菌。同時(shí)改善根際微生態(tài)環(huán)境，促進(jìn)大豆植株的生長。4.添加劑復(fù)合物可促進(jìn)種子萌發(fā)，改善植株的生理狀態(tài)，促進(jìn)大豆生長，提高植株的免疫力，復(fù)合物中有機(jī)質(zhì)在分解過程中還產(chǎn)生殺線蟲物質(zhì)。
具體實(shí)施例1采用在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)的地衣芽孢桿菌CGMCC No.1035作為種子斜面，再按搖瓶→種子罐→發(fā)酵罐的三級(jí)發(fā)酵工藝培養(yǎng)，接種量為2％，采用的培養(yǎng)基配方為培養(yǎng)基成分 含量可溶性淀粉 1％(W/V，下同)豆餅粉 1％牛肉膏 0.5％
葡萄糖 0.3％NaNO30.01％Mg2SO4·7H2O 0.02％CaCO30.2％PH 7.0-7.2控制發(fā)酵溫度在28-30℃，pH7.0-7.4，二級(jí)發(fā)酵時(shí)間定為20-24h，三級(jí)發(fā)酵時(shí)間定為發(fā)酵液中細(xì)菌數(shù)量達(dá)到7.0×108個(gè)/ml，整個(gè)發(fā)酵時(shí)間為60-72h。在該發(fā)酵液中加入0.5％(V/V)微量元素母液(ZnSO41％(W/V)，H3BO40.1％(W/V)，NaMoO4.2H2O 0.05％(W/V)，0.01％(W/V)殼聚糖，0.3％(W/V)幾丁質(zhì)，0.5‰(W/V)腐殖酸鈉，0.2％(W/V)羧甲基纖維素，混合均勻后按每100ml制劑與5公斤大豆種子混合拌種，進(jìn)行防病實(shí)驗(yàn)。以不做任何處理的大豆做對照。4片復(fù)葉期調(diào)查大豆胞囊線蟲病和根腐病的病情指數(shù)，結(jié)果見附表-1。
附表-1 菌劑處理對大豆根腐病菌和大豆胞囊線蟲防治效果處理 大豆根腐病防效％ 大豆胞囊線蟲病防效％病情指數(shù)％ 病情指數(shù)％B-0A12 23.8 54.9 12.6 67.2CK 52.8 38.4大豆根腐病的病情指數(shù)為23.8％，空白對照的病情指數(shù)為52.8％，防效在54.9％。大豆胞囊線蟲病的病情指數(shù)降低到12.6％，對照病情指數(shù)為38.4％，防效在67.2％。
權(quán)利要求
1.一種用于防治大豆胞囊線蟲病和根腐病的微生物純培養(yǎng)物，其特征在于，它是地衣芽孢桿菌(CGMCC No.1035)。
2.一種用于防治大豆胞囊線蟲病和根腐病的地衣芽孢桿菌(CGMCC No.1035)純培養(yǎng)物，經(jīng)大量培養(yǎng)并添加復(fù)合物后制成液體制劑或?qū)⒁后w制劑用常用的固體載體吸附后制成固體制劑。
3.如權(quán)利要求2所述的地衣芽孢桿菌大量培養(yǎng)方法，其特征在于，在制備該菌劑時(shí)的發(fā)酵過程中使用的培養(yǎng)基組合物的成分如下培養(yǎng)基成分 含量可溶性淀粉 1-2％(W/V，下同)豆餅粉 1-2％牛肉膏 0.5-1.0％葡萄糖 0.1-0.5％NaNO30.01-0.03％Mg2SO4·7H2O 0.01-0.03％CaCO30.1-0.3％
4.如權(quán)利要求2所述的地衣芽孢桿菌液體或固體制劑，其特征在于，在該菌劑添加復(fù)合物中還含有大豆生長需要的微量元素ZnSO450-100ppm，H3BO45-20ppm，NaMoO4·2H2O 2-10ppm。0.1％-0.3％(W/V)幾丁質(zhì)，0.01-0.02％(W/V)殼聚糖和0.5-1.0‰(W/V)腐殖酸鈉。
5.如權(quán)利要求2所述的菌株固體制劑，其特征在于，其中所說的菌株發(fā)酵液也可以經(jīng)過過濾離心后，菌體用硅藻土或硼潤土吸附，干燥制成粉劑。施用時(shí)，按比例與粘和劑混合均勻后用于包衣。
全文摘要
一種用于防治大豆胞囊線蟲病和鐮刀菌引起的根腐病的菌株，名稱為地衣芽孢桿菌CGMCC No.1035。用于防治大豆胞囊線蟲病和鐮刀菌引起的根腐病的細(xì)菌液體菌劑，用上述菌株接種，經(jīng)發(fā)酵并加入復(fù)合添加劑而制成。發(fā)酵過程溫度為27－35℃；pH值為6.8－8.0；發(fā)酵結(jié)束的時(shí)間條件為細(xì)菌含量在7×10
文檔編號(hào)A01N63/00GK1621514SQ20031011553
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月28日
發(fā)明者郭榮君, 李世東, 劉杏忠, 孫漫紅, 繆作清, 張擁華, 楊懷文 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物防治研究所