專利名稱：水母雪蓮毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)雪蓮多糖類有效成分的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物技術(shù)工程領(lǐng)域，具體地說涉及一種高產(chǎn)多糖的水母雪蓮毛狀根的培養(yǎng)方法，還包括多糖的分離、提取、制備工藝方法。
背景技術(shù)：
雪蓮花又名雪蓮，是我國三類珍稀植物，早在《西北域記》和《相園小識(shí)》中，就有關(guān)于雪蓮的記載，并把二者合而為一，統(tǒng)稱雪蓮花。作為雪蓮花，原生植物名稱隨產(chǎn)地而別，如西藏等地用三指雪兔子S.tridactyla Sch.Bip.；四川、云南等地用綿頭雪兔子S.lanicps Hand.-Mazz.；甘肅、青海等地用水母雪蓮S.medusa Maxim；青海也用雪兔子S.gossypiphora D.Don.；新疆用天山雪蓮(雪荷花)S.involucrata Kar.et Kir，等，但均屬于菊科風(fēng)毛菊屬Saussurea雪兔子亞屬Subgen Eriocorye植物，且一般分布于海拔4,000米以上的高山流石灘上。
雪蓮花是生長在海拔4000米以上的高山雪線附近的民間常用的一類名貴藥用植物，屬多年生草本植物。雪蓮花性溫，味微苦，入肝、脾、腎三經(jīng)。具有散寒除濕，活血通經(jīng)、強(qiáng)筋助陽、抗炎、鎮(zhèn)痛、收縮子宮等功能，民間用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，延緩衰老、動(dòng)脈硬化、終止妊娠，婦女小腹冷痛、閉經(jīng)、胎衣不下、麻疹不透、肺寒咳嗽、陽萎等癥。雪蓮多糖有清除自由基和抗疲勞的作用。雪蓮花原生植物種類較多，雖然據(jù)中藥文獻(xiàn)記載均可同等入藥，但其品質(zhì)有優(yōu)劣之分。如雪兔子為大體型的雪蓮，產(chǎn)量較大；綿頭雪兔子(又稱綿頭雪蓮花)也是一種較大體型的雪蓮，產(chǎn)量大；水母雪兔子(又稱水母雪蓮花)為一種小體型的雪蓮；三指雪兔子(又稱三指雪蓮花)也為一種小體型的雪蓮。據(jù)有關(guān)報(bào)道，在以上幾種雪蓮中銷售量最大的是新疆天山雪蓮(雪荷花)S.involucrataKar.et Kir.和水母雪蓮S.medusa Maxim。
雪蓮為多年生草本植物，自然生長緩慢，采集野生雪蓮入藥對(duì)野生資源具有嚴(yán)重的破壞而且還會(huì)造成對(duì)資源生態(tài)環(huán)境的破壞。為此，我國早已將雪蓮列為國家三級(jí)保護(hù)植物。野生雪蓮中有效成分——多糖類化合物含量低，通常只有干重的0.7％左右。為此，迫切需要解決藥用雪蓮資源問題。然而，通過人工培育解決雪蓮資源問題是一種有效的途徑，可是目前尚未見到有關(guān)用細(xì)胞培養(yǎng)高產(chǎn)雪蓮多糖類化合物這方面的報(bào)道。
現(xiàn)代生物技術(shù)的運(yùn)用使大規(guī)模生產(chǎn)植物次生代謝物成為可能。利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)植物產(chǎn)生的毛狀根具有單細(xì)胞起源性、激素自主性、生長快速性、遺傳穩(wěn)定性和次生代謝物高量積累性，使其成為成為繼植物細(xì)胞發(fā)酵培養(yǎng)后又一種更具有優(yōu)勢的工業(yè)化獲得某些有效成分開辟了新途徑。目前，國內(nèi)報(bào)道有誘導(dǎo)毛狀根成功的中草藥大約人參、西洋參、寧夏枸杞、絞股藍(lán)、蕎麥、露水草、松藍(lán)、青蒿、長春花、何首烏、丹參、恬樓、栗米草、甘草、膜莢黃芪、銀杏、龍膽、毛喉鞘蕊花、少花龍葵、紫果西番蓮、桔梗、紅豆草、墨旱蓮、紅豆杉、天山大黃、決明、天仙子、薯蕷、莨菪等23科50余種藥用植物，其具體數(shù)目正不斷增加。因此，通過毛狀根誘導(dǎo)及培養(yǎng)技術(shù)解決雪蓮資源問題是一種有效的途徑，可是目前尚未見到有關(guān)用毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)雪蓮多糖類化合物這方面的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決和克服雪蓮自然資源的匱乏和由于采集造成對(duì)自然資源的破壞。鑒于此，本發(fā)明的目的在于建立一種雪蓮毛狀根細(xì)胞系及毛狀根培養(yǎng)方法，從而利用培養(yǎng)的高產(chǎn)多糖的雪蓮毛狀根達(dá)到生產(chǎn)雪蓮多糖類化合物的目的。該方法步驟涉及1.水母雪蓮轉(zhuǎn)化體系及毛狀根細(xì)胞系的建立水母雪蓮的無菌種子置MS培養(yǎng)基萌發(fā)。取3天苗齡的綠色子葉，留2mm左右的子葉柄，置MS+2.0mg/L BA+0.1mg/L NAA培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得叢生苗。叢生苗置MS+1.0mg/L BA+0.5mg/L IAA培養(yǎng)基，進(jìn)行單株培養(yǎng)。選用MS+1.0mg/L BA+0.2mg/L IAA+200mg/L CH+60mg/L KCl培養(yǎng)基時(shí)能使苗更健壯。單株移置誘根培養(yǎng)基1/2MS+1.0mg/L IAA+0.5mg/L NAA+60mg/L KCl，10天后即出現(xiàn)4-7條直徑為0.5-1.5mm、長0.5-2.0cm的實(shí)生根。
以在MS+1.0mg/L 2，4-D+0.2mg/L BA+1.5mg/L AgNO3中暗培養(yǎng)2-4天的葉片切段為外植體，經(jīng)在50μmol/l乙酰丁香酮和250mg/L脯氨酸培養(yǎng)過的發(fā)根農(nóng)桿菌R1601介導(dǎo)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。其外植體于含20mg/L蔗糖的1/2MS+0.5mg/L GA3+500mg/L Cef光照培養(yǎng)3-5天，弱光培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)根。10天以后有毛狀根出現(xiàn)的材料接入篩選培養(yǎng)基含20mg/L蔗糖的1/2MS+500mg/L Cef+100mg/L Km+0.5-1.0mg/L IAA+0.5mg/LNAA+0.5mg/L GA3保持弱光培養(yǎng)。兩周以后，切下2-5毫米的根尖接入篩選平板含20mg/L蔗糖的1/2MS+300mg/L Cef+80mg/L Km一周以后，切取抗Km根系根尖1-2cm用于進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng)。
2.雪蓮高產(chǎn)多糖毛狀根系懸浮液體培養(yǎng)生產(chǎn)多糖類化合物選擇抗Km且甘露堿檢測顯陽性的發(fā)根根系，切下長2.0--4.0cm根尖部分。
培養(yǎng)基液體N6培養(yǎng)基，如果有菌再生則加入200-500mg/L Cef。
培養(yǎng)條件40ml培養(yǎng)基分裝于100ml三角瓶，弱光或暗培養(yǎng)條件下，于搖床上以50-80rpm/min震蕩培養(yǎng)，25天繼代一次。
培養(yǎng)優(yōu)化蔗糖30mg/L，GA30.5mg/L，AgNO30.5-1.0mg/L，有利于發(fā)狀根的生長和多糖積累，一個(gè)周期的生長量(鮮重)為接種量的10-15倍。
3.本發(fā)明的目的還在于提供一種雪蓮毛狀根培養(yǎng)物多糖類化合物的分離、提取、制備工藝。
雪蓮細(xì)胞培養(yǎng)物置于干燥器中，60℃烘干后，用粉碎機(jī)粉碎成20目的粗粉。用石油醚進(jìn)行脫色、脫脂。然后，加入蒸餾水，98℃水浴中連續(xù)加熱浸提15h。真空抽濾，將濾液收集起來，4℃保存。
同理在濾渣中再加入0.5M的NaOH溶液，98℃水浴中繼續(xù)浸提5h，抽濾，收集濾液，4℃保存。將所得濾液減壓濃縮至原體積的1/5，加入10％醋酸鉛進(jìn)行沉淀，除去酚性物質(zhì)、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等雜質(zhì)，用10％Na2SO4除去多余的鉛離子。再加入4％活性炭(m/v)，60℃下水浴脫色1小時(shí)。加入無水乙醇、丙酮反復(fù)沉淀，離心，低溫真空干燥，得到多糖。
我們通過發(fā)根農(nóng)桿菌R1601誘導(dǎo)水母雪蓮得到的毛狀根，在25天左右能夠增殖10-25倍，干燥毛根中所測的總多糖含量最高達(dá)毛狀根干重的5--10％，比野生生藥的0.5％有顯著的提高。因此，通過毛狀根誘導(dǎo)及培養(yǎng)技術(shù)解決雪蓮資源問題是一種有效的途徑，可是目前尚未見到有關(guān)用毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)雪蓮多糖化合物這方面的報(bào)道。雪蓮為國家保護(hù)植物，利用植物毛狀根大量培養(yǎng)生產(chǎn)雪蓮多糖類化合物，走工業(yè)化生產(chǎn)的途徑，可有限地保護(hù)野生資源，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。
本發(fā)明較與已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)及積極效果(1)雪蓮為國家保護(hù)植物，利用植物細(xì)胞大量培養(yǎng)生產(chǎn)雪蓮多糖化合物，走工業(yè)化生產(chǎn)的途徑，可有限地保護(hù)野生資源，保護(hù)生態(tài)環(huán)境。
(2)應(yīng)用細(xì)胞大量培養(yǎng)生產(chǎn)多糖類化合物，與栽培和野生的植物相比，可獲得穩(wěn)定的質(zhì)量和產(chǎn)量，不受自然條件的限制的影響。
(3)不占用耕地面積，只需要占用有限的廠房和培養(yǎng)室。
(4)通過人工調(diào)節(jié)與控制細(xì)胞的生長和次生產(chǎn)物的合成；可極大地提高多糖類化合物的產(chǎn)量(5)該項(xiàng)技術(shù)，不使用光照，在暗中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，故可節(jié)省電力，減少成本價(jià)格。產(chǎn)量與含量穩(wěn)定，污染率極低。


圖1.水母雪蓮試管苗的培養(yǎng)圖2.水母雪蓮毛狀根的液體培養(yǎng)圖3.水母雪蓮毛狀根中甘露堿的紙層析檢測圖4.水母雪蓮毛狀根中rol B基因的PCR檢測圖5.R1601第二次活化生長曲線(注第2次活化接種按2％加入4℃下的保存菌液)圖6.多糖測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線(注y＝3.3607x+106.0472 R＝0.9991638；Xabsorb，Y多糖含量(μg)；測量范圍10-70μg；)具體實(shí)施方案為了更好理解本發(fā)明，通過如下實(shí)施例予以進(jìn)一步說明，但并非是對(duì)本發(fā)明的限定。
實(shí)施例中涉及的縮寫術(shù)語、培養(yǎng)基1.外植體-水母雪蓮的無菌試管苗新展開葉片，切開成1.0cm2片段2.菌種-R1000，R1601，LBA9402發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402為野生型，由清華大學(xué)郭志鋼教授惠贈(zèng)；R1000為野生型，R1601是R1000的人工改造菌株，涉及的改造為第一、農(nóng)桿堿型pRiA4質(zhì)粒的TL--DNA上插入新霉素磷酸轉(zhuǎn)移霉基因(nptII)，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞可以用卡那霉素篩選；第二、引入高毒力Ti質(zhì)粒pTiBo542的vir區(qū)域，提高了R1601的感染效率。北京大學(xué)林忠平教授贈(zèng)送R1601，R1000。
3.發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)基YEB、YMB、LB4.植物基本培養(yǎng)基MS(Murashige and Skoog，1962)；N6培養(yǎng)基(朱自清，1975)5.抗生素卡那霉素Km(kanamycin)、頭胞霉素Cef(cephamycin)6.激素2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid)、BA(benzyladenine)、GA3(gibberellic acid)、IAA(Indoleacetic acid)，NAA(Naphthaleneaceticacid)7.其他試劑乙酰丁香酮(AS，3，5-methoxy-4-hydroxyacetophenone)、脯氨酸(Pro，proline)、甘氨酸(Gly，glycin)8.標(biāo)準(zhǔn)品甘露堿(Man，mannopine)、精氨酸(Arg，arginine)實(shí)施例1建立水母雪蓮高頻再生體系1.1種子消毒處理種子來源2001年于祁連山采摘的水母雪蓮(S.medusa Maxim)干品，從花序中剝得種子清洗挑選健康飽滿，無霉變的種子，自來水沖洗4遍，室溫浸泡過夜，流水沖洗1h。
消毒70％乙醇浸 30s，0.01％升汞作用10---14min，無菌水清洗4-6次。
無菌種子培養(yǎng)用無激素MS培養(yǎng)基，0.6％瓊脂。25℃，光強(qiáng)2000lux，連續(xù)光照，3天后種子陸續(xù)萌發(fā)。
1.2誘導(dǎo)子葉出叢生苗外植體處理挑選發(fā)芽3天后子葉展開，色綠的幼苗，于子葉柄處切開，子葉上留2mm左右的子葉柄。
誘導(dǎo)叢生苗培養(yǎng)基MS+2.0mg/L BA+0.1mg/L NAA培養(yǎng)25℃，光強(qiáng)2000lux，16h光照，3-7天后有子葉柄上有數(shù)個(gè)直徑1mm左右的深綠色突起出現(xiàn)，兩周后于突起上長出叢生苗(見圖1)。
1.3試管苗的繼代培養(yǎng)和誘導(dǎo)生根苗的挑選把健壯、高1cm左右的叢生苗分成單株，苗下端帶少量愈傷組織.
苗的培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L BA+0.5mg/L IAA，培養(yǎng)條件為25C，光強(qiáng)2000lux，16h光照，20天繼代一次。
壯苗培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L BA+0.2mg/L IAA+200mg/L水解酪蛋白+60mg/L KCl，培養(yǎng)條件同上。
抑制玻璃化提高瓊脂濃度到0.9-1.1％；添加活性碳0.2-0.4％；延長光照到19h。
誘根培養(yǎng)培養(yǎng)基用1/2MS+0.5mg/L IAA+0.5mg/L NAA+30mg/LKCl，16h光照，10天后插入培養(yǎng)基的苗下端出現(xiàn)4-7條直徑為0.5-1.5mm、長0.5-2.0cm的實(shí)生根。
實(shí)施例2建立水母雪蓮轉(zhuǎn)化體系2.1轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)1-確定發(fā)根農(nóng)桿菌菌種農(nóng)桿菌菌種的確定用煙草測試發(fā)根農(nóng)桿菌LBA9402，R1601，R1000的感染效果，發(fā)現(xiàn)R1601的毒性最強(qiáng)，被其感染的煙草葉片出發(fā)根所用時(shí)間最短，所誘導(dǎo)的發(fā)根有典型的發(fā)根形態(tài)特征(抗卡那霉素50mg/l，纖細(xì)，多根毛、向地性弱，沿瓶壁生長，斜向次生根)，而且已有同科植物青蒿被R1601以90％的頻率誘導(dǎo)得到發(fā)根，因此我們確定使用發(fā)根農(nóng)桿菌R1601感染水母雪蓮。
2.2轉(zhuǎn)化準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)2--確定Km篩選壓叢生苗在附加有一定濃度(20，40，60，80，100mg/L)Km的保持培養(yǎng)基中培養(yǎng)，4周后所有的苗都表現(xiàn)出黃化和生長受抑制現(xiàn)象，其中卡那霉素60mg/L可以在30天1內(nèi)完全殺死水母雪蓮幼苗。所以，確定50mg/L為Km篩選壓濃度。
2.3 R1601工程菌液的制備R1601工程菌液的制備在含100mg/L Km的YEB保持平板上挑單菌落接種于5ml含100mg/L Km的液體YEB，于恒溫?fù)u床上29℃，180r/min培養(yǎng)24h，4℃保存菌液。感染前取100μl保存菌液加入5ml新鮮含100mg/L Km的液體YEB中，培養(yǎng)條件同上，在600nm波長下測定培養(yǎng)一定時(shí)間菌液的OD值，做該條件下R1601的生長曲線(見圖5)，確定第二次活化的R1601菌液達(dá)到生長對(duì)數(shù)期所需的培養(yǎng)時(shí)間為9h左右。達(dá)對(duì)數(shù)生長期的R1601二次活化菌液用液體無激素MS(PH5.2)稀釋數(shù)倍，添加50μmol/L乙酰丁香酮和250mg/L脯氨酸，室溫誘導(dǎo)0.5-1h，作為工程菌液備用。
2.4外植體預(yù)培養(yǎng)葉片切段培養(yǎng)于MS+1.0mg/L2，4-D+0.2mg/L BA+0.5mg/LAgNO3，暗培養(yǎng)2-4天。
2.5感染預(yù)培養(yǎng)后葉片切段浸泡于備用的工程菌液3-10min。
2.6共培養(yǎng)取出感染后的葉片用無菌吸水紙吸去多余的菌液，放回原培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)1-2天。
2.7除菌當(dāng)共培養(yǎng)的葉片周圍出現(xiàn)明顯菌斑時(shí)取出葉片用無菌水清洗4-6次，然后用液體無激素MS+500mg/L Cef培養(yǎng)基浸泡20-45min，其間輕微搖動(dòng)。
2.8誘導(dǎo)毛根
除菌后葉片培養(yǎng)于含20mg/L蔗糖的1/2MS+0.5mg/L GA3+500mg/L Cef，光照培養(yǎng)3-5天，然后進(jìn)行弱光培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)根，5-7天更換一次培養(yǎng)基。7-15天后有發(fā)根于葉片切口處出現(xiàn)。
實(shí)施例3毛狀根的篩選延遲篩選把長出發(fā)根的葉片接入含20mg/L蔗糖的1/2MS+500mg/LCef+0.5-1.0mg/L IAA+0.5mg/L NAA+0.5mg/L GA3的延遲篩選培養(yǎng)基，保持弱光培養(yǎng)5-8天，以促進(jìn)發(fā)根的誘導(dǎo)和生長。
Km篩選切下所有根的1.0-2.5cm長的根尖接入含20mg/L蔗糖的1/2MS+300mg/L Cef+50mg/L Km的篩選培養(yǎng)基，弱光培養(yǎng)，10天以后切取抗Km根系的1.0-2.5cm根尖進(jìn)行液體培養(yǎng)。
實(shí)施例4毛狀根的檢測甘露堿的紙層析檢測(見圖3)4.1材料樣品新誘導(dǎo)出的水母雪蓮發(fā)根(NTR)；經(jīng)過繼代培養(yǎng)的發(fā)根(TR)；水母雪蓮的器官根(NR)、葉片或愈傷細(xì)胞(L/C)；R1601菌液(AR)4.2試劑1.提取液0.1M HCl2.標(biāo)準(zhǔn)品1mg/ml精氨酸水溶液；1mg/ml甘露堿水溶液3.展層系統(tǒng)正丁醇∶乙酸∶水＝9∶2∶54.顯色液0.2％AgNO3丙酮液1％NaOH甲醇液5％硫代硫酸鈉(Na2S2O3·5H2O)水溶液4.3操作1.農(nóng)桿堿的提取取1g樣品加1ml 0.1N HCl研磨，12,000rpm 5min，取上清液10μl點(diǎn)樣。
2.層析層析濾紙的制備將層析濾紙裁成8×8(cm×cm)規(guī)格，浸泡于0.4MHCl溶液中24h，然后用蒸餾水淋洗，再依次用乙醇、乙醚洗滌后，平放在托盤上，30℃下涼干，備用。
樣品點(diǎn)樣距邊1-1.5cm處劃一直線，鉛筆標(biāo)記出等距離的點(diǎn)樣點(diǎn)。以微量進(jìn)樣器點(diǎn)上5μl樣品，邊滴加邊吹干。
層析展開干燥濾紙垂直置入密閉的已飽和層析罐，待液體上限距上邊緣2-4cm時(shí)取出。
3.顯色將濾紙吹干后，浸入0.2％AgNO3丙酮液1min，取出風(fēng)干；然后浸入1％NaOH甲醇液2～3min；最后5％硫代硫酸鈉液固定；觀察并攝影。
實(shí)施例5水母雪蓮毛狀根RolB基因的PCR檢測5.1材料樣品R1601菌體；水母雪蓮的葉片外植體(Leaf)；繼代后擴(kuò)大培養(yǎng)的水母雪蓮發(fā)根(Hr)。
5.2試劑1.R1601質(zhì)粒提取試劑STE0.1mol/L NaCl 10mol/L Tris-HCl(pH8.0)1mmol/LEDTA(pH8.0)；Solution I4mg/ml溶菌酶，50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA，25mmol/L Tris-HCl pH8.0；Solution II3％SDS，0.2mol/L NaOH；Solution III5mol/L NaAC 60ml，冰乙酸11.5ml，超純水28.5ml，pH4.8；TE buffer1mmol/L EDTA，10mmol/L Tris-HCl pH8.0；2.雪蓮基因組DNA提取試劑2×CTAB2％CTAB，100mmol/L Tris-HCl pH8.0，1.4mol/L NaCl，20mmol/L EDTA pH8.0，室溫下放置；Rnase使用前，在100℃下處理10min徹底使殘留的Dnase失活，用高壓滅菌過的超純水配成200μg/ml，備用。
5.3操作1.R1601質(zhì)粒的提取
1)挑取R1601單菌落于10mlYEB培養(yǎng)基中，28℃，180rpm，過夜培養(yǎng)。
2)吸取8ml培養(yǎng)好的菌液，加入10ml離心管中，4,000rpm，離心5min。傾去培養(yǎng)液，加入2ml預(yù)冷的STE，重新懸浮細(xì)胞。分別吸取1ml菌懸液，加入1.5mlEppendorf管中，12,000rpm離心2min，傾去培養(yǎng)液，獲得適量的菌體細(xì)胞。
3)加入200μl冰浴過的Solution I，渦旋振蕩使細(xì)胞均勻分布，室溫下放置10min。
4)加入400μl新鮮配置好的Solution II，輕輕顛倒混勻，冰與5min。
5)加入300μl Solution III，反復(fù)顛倒數(shù)次，使溶液在粘稠的菌體裂解物中分散均勻，然后置冰上5min；6)12,000rpm離心10min，小心吸取上清液加入1.5mlEppendorf管中。
7)加入等體積的飽和酚氯仿，通過劇烈振蕩混合有機(jī)相和水相，12,000rpm離心5min。
8)小心吸取上清液加入一新的1.5mlEppendorf管中，用等體積的氯仿重新抽提一次；9)小心吸取上清液加入一新的1.5mlEppendorf管中，加入2倍體積的無水乙醇，1/10體積的3mol/LnaAC，冰浴30min，12,000rpm，離心10min。傾去上清液，倒置在吸水紙上，使溶液流盡。
10)加入1ml70％乙醇洗滌兩次，12,000rpm離心5min，收集沉淀；11)傾去洗滌液，倒置于吸水紙上吸干殘余的溶液，在超凈工作臺(tái)上吹干。
12)加入50μlTE重懸，備用。
2.CTAB法提取水母雪蓮基因組DNA1)取280mg經(jīng)繼代培養(yǎng)的水母雪蓮的毛狀根在液氮中充分研磨至粉狀；2)用藥匙小心轉(zhuǎn)移至1.5mlEppendorff管中，加入65℃預(yù)熱的600μl 2×CTAB，在65℃下水浴60min，每隔5-10min輕輕振蕩一次；3)取出Eppendorff管冷卻至室溫，加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1)，混勻后，12,000rpm，離心10min；4)用一只剪去前端的槍頭，小心將上清液移入一只新的Eppendorf管中，并加入兩倍體積的-20℃預(yù)冷的無水乙醇，即見到絲狀沉淀，-20℃下放置30min，10,000rpm離心5min，得到淡黃色的沉淀；5)傾去上清液，并用吸水紙吸凈殘余溶液，加入300μl超純水重新溶解，在加入600μl-20℃預(yù)冷的無水乙醇，沉淀過夜；6)12,000rpm，離心10min，得到白色的膠狀沉淀。傾去上清液，并用吸水紙吸凈殘余溶液，加入800μl 70％乙醇洗滌沉淀2～3次；7)吸凈殘余溶液，置超凈工作臺(tái)中吹干(約需10～15min)；8)加入40～60μl超純水，溶解沉淀，加入3μlRnase，室溫放置30min后，于-20℃下保存。
3.PCR檢測PCR引物根據(jù)Slightom等RiA4baTL-DNA序列分析結(jié)果設(shè)計(jì)Rol B基因的上下游引物Primer15’TACTGCAGCAGGCTTCATGCA 3’Primer225’GCTTTCCCGACCAGAGACTG 3因?yàn)镽olB基因存在于Ri質(zhì)粒的TL-DNA中，而且該基因在發(fā)根農(nóng)桿菌感染植物產(chǎn)生毛狀根表型中起到關(guān)鍵性作用，如果能夠從水母雪蓮毛狀根中擴(kuò)增出862bp的條帶，而對(duì)照未受感染的水母雪蓮?fù)庵搀w中不能擴(kuò)出該條帶，就可以證明R1601質(zhì)粒的TL-DNA已經(jīng)整合在了水母雪蓮的基因組內(nèi)。
1)PCR反應(yīng)體系PCR反應(yīng)體系 單位μl10×PCR buffer 2.5dNTP 0.5K623580.5K623590.5Model 1Taq酶 1UH2O 20
2)PCR反應(yīng)條件1.94℃，預(yù)變性，4min；2.94℃，熱變性，1min；55℃，退火，1min；72℃，延伸，1min；35cycles；3.72℃，延伸，5min。
4.結(jié)果分析(見圖4)1為R1601菌體；2為水母雪蓮的葉片外植體(Leaf)；3為繼代后擴(kuò)大培養(yǎng)的水母雪蓮發(fā)根(Hr)。
實(shí)施例6水母雪蓮毛狀根的培養(yǎng)材料選擇抗Km且甘露堿檢測顯陽性的發(fā)根根系，切下長2.0--4.0cm根尖部分。
培養(yǎng)基液體N6培養(yǎng)基，如果有菌再生則加入Cef200-500mg/L。
培養(yǎng)條件40ml培養(yǎng)基分裝于100ml三角瓶，弱光或暗培養(yǎng)條件下，于搖床上以50-80rpm/min震蕩培養(yǎng)，25天繼代一次(見圖2)。
培養(yǎng)優(yōu)化蔗糖30mg/L，GA30.5mg/L，AgNO30.5-1.0mg/L，有利于發(fā)狀根的生長和多糖積累，一個(gè)周期的生長量(鮮重)為接種量的10-15倍。
實(shí)施例7雪蓮毛狀根多糖類化合物的分離提取工藝取雪蓮毛狀根培養(yǎng)物于空氣循環(huán)干燥器60℃烘干后，以粉碎機(jī)粉碎成20目的粗粉，用石油醚進(jìn)行脫色、脫脂。然后以1∶30(g∶ml)的比例加入蒸餾水，98℃水浴中連續(xù)加熱浸提15h。反復(fù)提取至無水溶性多糖為止，過程中用Molisch反應(yīng)檢測提取的完全程度。同理用0.5MNaOH溶液在98℃水浴中繼續(xù)浸提5h，反復(fù)提取至無堿溶性多糖為止，過程中用Molisch反應(yīng)檢測提取的完全程度。將所得兩部分濾液分別減壓濃縮至原體積的1/5，加入等體積的Sevag試劑(氯仿∶正丁醇＝5∶1)去除游離的蛋白。再加入4％活性炭(w/v)，60℃下水浴脫色1小時(shí)。先后加入7倍體積的無水乙醇、丙酮反復(fù)沉淀，離心。低溫真空干燥，得到總多糖。多糖含量用α-萘酚-----濃硫酸法測定。
實(shí)驗(yàn)證明在液體懸浮培養(yǎng)條件下，用本發(fā)明提供的細(xì)胞系和培養(yǎng)基，其細(xì)胞生長速率可達(dá)18～25g干重/升，多糖類化合物的含量可達(dá)培養(yǎng)物干重的5～10％，其中水溶性多糖2.453％；堿溶性多糖3.391％(多糖測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖6)。
權(quán)利要求
1.一種利用培育高產(chǎn)多糖的水母雪蓮毛狀根細(xì)胞系及液體培養(yǎng)毛狀根生產(chǎn)雪蓮多糖類化合物的方法，該方法涉及如下步驟萌發(fā)水母雪蓮的無菌種子，取其萌發(fā)3天苗齡的綠色子葉取子葉柄置于誘導(dǎo)叢生苗培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得叢生苗；叢生苗置于苗生長和壯苗培養(yǎng)基，進(jìn)行單株培養(yǎng)；單株移置于誘根培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得苗下端長有實(shí)生根；葉片切段為外植體置于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)，經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌R1601介導(dǎo)的進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其外植體于弱光培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)根，毛狀根出現(xiàn)的葉片接入延遲篩選和篩選培養(yǎng)基上再培養(yǎng)，選擇抗Km且甘露堿檢測顯陽性的發(fā)根根系，切取根尖1-2cm用于進(jìn)行液體擴(kuò)大培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的誘導(dǎo)叢生苗培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)是指用MS+2.0mg/L BA+0.1mg/L NAA培養(yǎng)基，在25℃，光強(qiáng)2000lux，16h光照下培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的苗生長培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L BA+0.5mg/L IAA和壯苗培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L BA+0.2mg/L IAA+200mg/L水解酪蛋白+60mg/L KCl，進(jìn)行單株培養(yǎng)培養(yǎng)條件為25℃，光強(qiáng)2000lux，16h光照，20天繼代一次。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的誘根培養(yǎng)基培養(yǎng)是用1/2MS+1.0mg/L IAA+0.5mg/L NAA+60mg/L KCl的培養(yǎng)基，經(jīng)10天后即出現(xiàn)4-7條直徑為0.5-1.5mm、長0.5-2.0cm的實(shí)生根。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的發(fā)根農(nóng)桿菌R1601介導(dǎo)的進(jìn)行轉(zhuǎn)化是指在MS+1.0mg/L 2，4-D+0.2mg/L BA+1.5mg/L AgNO3中暗培養(yǎng)2-4天的葉片切段為外植體，經(jīng)在50μmol/L乙酰丁香酮和250mg/L脯氨酸培養(yǎng)過的發(fā)根農(nóng)桿菌R1601介導(dǎo)，進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其葉片切段為外植體置于預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)是指在預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 2，4-D+0.2mg/LBA+0.5mg/L AgNO3上暗培養(yǎng)2-4天。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)根是指除菌后葉片培養(yǎng)于含蔗糖20mg/L的1/2MS+0.5mg/L GA3+500mg/LCef，光照培養(yǎng)3-5天，然后進(jìn)行弱光培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)根。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其延遲篩選培養(yǎng)基為含蔗糖20mg/L的1/2MS+500mg/L Cef+ +0.5-1.0mg/L IAA+0.5mg/L NAA+0.5mg/LGA3，篩選培養(yǎng)基為含蔗糖20mg/L的1/2MS+300mg/L Cef+50mg/LKm。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其毛狀根液體擴(kuò)大培養(yǎng)采用液體N6培養(yǎng)基，有菌再生則加入Cef200-500mg/L，培養(yǎng)優(yōu)化蔗糖30mg/L，GA30.5mg/L，AgNO30.5-1.0mg/L。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法生產(chǎn)的雪蓮毛狀根培養(yǎng)物多糖類化合物的分離、提取制備工藝如下取雪蓮毛狀根培養(yǎng)物于空氣循環(huán)干燥器60℃烘干，干粉以粉碎機(jī)粉碎成20目的粗粉，用蒸餾水、石油醚進(jìn)行脫色、脫脂，然后，加入蒸餾水和0.5M NaOH溶液進(jìn)行總多糖類物質(zhì)的提取，真空抽濾，將濾液收集起來，4℃保存。
全文摘要
一種水母雪蓮總多糖的毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)方法，該方法步驟涉及采用水母雪蓮的無菌試管苗，用菌種－R1000，R1601，LBA9402感染，獲得的雪蓮毛狀根用于生產(chǎn)雪蓮多糖；生產(chǎn)水母雪蓮多糖的毛狀根的懸浮培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基是1/2MS培養(yǎng)基試驗(yàn)證明用本方法其毛狀根培養(yǎng)物中總多糖類化合物的含量為毛狀根干重的5－10％，總多糖生產(chǎn)率為1～2g/L。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1625940SQ200310121348
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
發(fā)明者趙德修, 楊睿, 付春祥 申請人:中國科學(xué)院植物研究所