專利名稱：巖藻糖基化降低的免疫球蛋白的植物生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請一般涉及在植物中產(chǎn)生免疫球蛋白組合物，其中連接到植物產(chǎn)生的免疫球蛋白上的聚糖的至少一部分缺少巖藻糖。本發(fā)明還一般涉及在植物中產(chǎn)生單體抗體組合物，其中至少一部分連接到植物產(chǎn)生的單體抗體上的聚糖缺少巖藻糖。通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的免疫球蛋白可以是任何類型(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等)或者同種型。此外，本發(fā)明還涉及在植物中產(chǎn)生單體免疫球蛋白A(單體IgA)抗體組合物，其中單體IgA抗體由于缺少抗體尾片(tail piece)而缺少巖藻糖，其中所述尾片具有通常被巖藻糖基化的唯一糖基化位點。本發(fā)明還涉及在植物中產(chǎn)生抗-單純皰疹病毒(HSV)單體免疫球蛋白A(抗-HSV單體IgA)的抗體組合物，其中由于缺少具有唯一通常被巖藻糖基化的糖基化位點的抗體尾片，連接在抗-HSV單體IgA抗體上的至少一部分聚糖缺少巖藻糖。此外，本發(fā)明還涉及在植物中產(chǎn)生單體免疫球蛋白G(單體IgG)抗體組合物。本發(fā)明還涉及在植物中產(chǎn)生抗-α-v-β3，α-v-β5(即，αVβ3和αVβ5)雙整聯(lián)蛋白IgG抗體組合物，其中連接到植物產(chǎn)生的抗體組合物上的聚糖的至少一部分缺少巖藻糖。本發(fā)明還提供了構(gòu)建體；質(zhì)粒；載體；用于產(chǎn)生所有這些免疫球蛋白和抗體的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、植物愈傷組織、植物組織、小植株、種子和全株植物；產(chǎn)生這些免疫球蛋白和抗體的方法；通過所公開的方法產(chǎn)生的免疫球蛋白和抗體；和這些免疫球蛋白和抗體的用途。
背景技術(shù)：
本文所有參考的出版物和專利申請都被并入作為參考，就像每一單獨的出版物或者專利申請都被明確和單獨地指出并入作為參考一樣。
下面的描述包括可用于理解本發(fā)明的信息。但這并不是承認(rèn)本文提供的任何信息都是現(xiàn)有技術(shù)或者與本發(fā)明有關(guān)，或者明確或隱含地參考的任何出版物都是現(xiàn)有技術(shù)。
越來越多的注意力正集中于生產(chǎn)和使用更大和更復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子作為治療劑。這些治療性蛋白的實例包括用于接種以誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和抗體的抗原。
植物具有作為宿主用于生產(chǎn)哺乳動物治療性蛋白，包括多聚體蛋白，如抗體的巨大潛力。見，例如，Hiatt，A.等人，Nature 342(6245)76-78(1989)；Hein等人，Biotechnol.Prog.7(5)455-461(1991)；Hiatt，A.，和Ma，J.K.，F(xiàn)EBS Lett 307(1)71-5(1992)；Ma等人，Eur. J.Immunol.24131-138(1994)；Ma等人，TIBTECH 13522-527(1995)；Zeitlin等人，Nature Biotechnology 16(1361-1364(1998)；Ma，H.K.-C等人，NatureMedicine 4(5)601-606(1998)；Miele，L，Trends Biotechnol.1545-50(1997)；Khoudi等人，Biotechnology and Bioengineering 64(2)135-143(1999)；和Hood，E.E.&Jilka，J.M.，Curr.Opin.Biotechnol.10382-386(1999)。使用植物生產(chǎn)抗體的益處包括大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)、維持和遞送的成本降低，以及消除所得產(chǎn)物含有可能的有害污染物的危險，所述有害污染物為諸如對人和其他哺乳動物具致病性的病毒或者朊病毒。植物，像其他異源表達(dá)系統(tǒng)(包括哺乳動物細(xì)胞、細(xì)菌、酵母和昆蟲)一樣，在糖基化方面顯示出差異。見，例如，Ma等人，Science 268716-719(1995)；Jenkins等人，Nat.Biotechnol.14975-981(1996)；和Lerouge等人，Plant Mol.Biol.3831-48(1998)。
在植物中，和在其他真核生物中一樣，在與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)結(jié)合的多聚核糖體上合成的可溶性和膜結(jié)合蛋白質(zhì)的大多數(shù)都是糖蛋白，包括后來將運輸至高爾基體、溶酶體、質(zhì)膜或者細(xì)胞外基質(zhì)的那些蛋白質(zhì)。與糖蛋白連接的聚糖含有多種糖殘基，它們以線性或分枝結(jié)構(gòu)相連，這些結(jié)構(gòu)可采取許多不同的構(gòu)象。這些聚糖可能在促進(jìn)正確的蛋白質(zhì)折疊和裝配中起基本作用并且，由此，增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。所述聚糖也可以含有靶定信息，或者可以直接參與蛋白質(zhì)識別(Maia等人，Genetics and Molecular Biology 24231-234(2001))。涉及到糖的蛋白質(zhì)的三種主要翻譯后修飾為N-和O-連接的糖基化和糖基磷脂酰肌醇錨的插入。
在進(jìn)化過程中哺乳動物和植物系統(tǒng)中的N-連接的糖基化機制被保存。然而，在高爾基體中寡糖修剪和聚糖修飾的最后步驟中觀察到差異。細(xì)菌沒有N-連接的聚糖，酵母有聚甘露糖聚糖，與細(xì)菌和酵母不同，植物產(chǎn)生糖蛋白多聚體，其具有復(fù)雜的N-連接的聚糖，該聚糖的核心被兩個N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)殘基取代。在哺乳動物中也觀察到這些糖蛋白多聚體。見，例如，Kornfeld和Kornfeld，Ann.Rev.Biochem.54631(1985)。植物和動物糖多肽多聚體含有不同的末端糖類，其直接地與所存在的寡糖外部分枝連接。動物糖多肽多聚體，包括哺乳動物糖多肽多聚體，具有作為末端糖殘基存在的唾液酸，而植物糖多肽多聚體則沒有。所述末端核心被β1，2-連接的木糖(Xyl)和α1，3-連接的核心巖藻糖(Fuc)取代，而在哺乳動物中發(fā)生的是α1，6-連接的核心巖藻糖取代。此外，植物糖蛋白多聚體缺少在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的特征性含有半乳糖(Gal)和唾液酸的復(fù)雜N-聚糖(N-乙酰神經(jīng)氨酸-α2-6/3Galβ1-4)。見，例如，Sturm等人，J.Biol.Chem26213392(1987)。發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生的具有植物-特異聚糖的鼠單克隆抗體在小鼠中不具免疫原性(Chargelegue等人，Transgenic Research 9187-194(2000))。
抗體在兩條重鏈的每一條的Fc區(qū)具有保守的N-連接的糖基化。人IgA抗體在它們的鉸鏈部分中具有O-連接的寡糖，此外，人IgA抗體還具有兩條N-連接的糖鏈；一條發(fā)生在重鏈的CH2區(qū)域中的天冬酰胺(Asn)殘基上，另一條在尾片區(qū)中的Asn殘基上。見，例如，Baenzinger，J.和Kornfield，S.J.，Biol.Chem.2497260-7269(1974)；和Torano等人，PNAS 742301-2305(1997)。從人血清分離的IgA的巖藻糖基化僅在尾片區(qū)中的Asn上發(fā)生(Tanaka等人，Glycoconj.J.10995-1000(1998))。
Hiatt等人已經(jīng)產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因植物，其表達(dá)編碼單獨的或裝配的免疫球蛋白重鏈和輕鏈免疫球蛋白多肽的核苷酸序列。每種免疫球蛋白產(chǎn)物表達(dá)為含有前導(dǎo)序列的蛋白原，該前導(dǎo)序列形成指導(dǎo)該蛋白質(zhì)進(jìn)入內(nèi)分泌途徑的序列，從而允許該抗體分子的正確裝配和糖基化。前導(dǎo)序列從成熟蛋白質(zhì)切除。見，例如，美國專利號5,202,422；5,639,947和6,417,429。已經(jīng)公開了協(xié)同表達(dá)和產(chǎn)生分泌性免疫球蛋白的方法，所述免疫球蛋白具有重鏈、輕鏈、J鏈和分泌性組分多肽，它們裝配成功能抗體。見，例如，美國專利號5,959,177；6,046,037和6,303,341。此處引用的每一篇美國專利都被完整并入作為參考。鼠免疫球蛋白跨膜序列用于植物中重組免疫球蛋白鏈的質(zhì)膜靶定(Vine等人，Plant Molecular Biology 45159-167(2001))。
發(fā)明概述本發(fā)明的重點圍繞針對植物中生產(chǎn)免疫球蛋白組合物，簡化免疫球蛋白譜。一方面，本發(fā)明提供了在植物中產(chǎn)生免疫球蛋白的材料和方法，其中至少某些附著到免疫球蛋白上的聚糖不被巖藻糖基化(即，至少一種聚糖缺少巖藻糖和/或免疫球蛋白至少部分地未被巖藻糖基化)。另一方面，本發(fā)明提供了在植物中產(chǎn)生單體免疫球蛋白的材料和方法，其中至少某些免疫球蛋白含有未被巖藻糖基化的聚糖。從而，一方面，本發(fā)明提供了在植物中產(chǎn)生IgA、IgD、IgE、IgG和IgM組合物的材料和方法，其中該組合物含有至少一種缺少巖藻糖的聚糖結(jié)構(gòu)。在另一方面，本發(fā)明提供了在植物中產(chǎn)生免疫球蛋白的材料和方法，其中免疫球蛋白的重鏈缺少尾片(tailpiece)。
一方面，可以說通過本發(fā)明的材料和方法產(chǎn)生的免疫球蛋白的混合物是少量-巖藻糖基化或者極小(deminimus)巖藻糖基化的，這表明如此產(chǎn)生的一些、多數(shù)或者所有免疫球蛋白缺少巖藻糖基化。另一方面，通過本發(fā)明的材料和方法產(chǎn)生的免疫球蛋白的混合物可直接使用或者，備選地，無巖藻糖基化的免疫球蛋白可以與免疫球蛋白混合物分離并單獨使用。
另一方面，本發(fā)明還產(chǎn)生了通過施用植物產(chǎn)生的免疫球蛋白治療單純皰疹病毒(“HSV”)或者腫瘤血管生成的材料和方法，其中該免疫球蛋白的至少一種聚糖結(jié)構(gòu)缺少巖藻糖。
在本發(fā)明的另一方面，使用含有編碼輕鏈和重鏈的核酸的單一載體完成免疫球蛋白的表達(dá)。
一方面，本發(fā)明提供了植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白的糖肽譜含有至少一種缺少巖藻糖的糖肽。另一方面，本發(fā)明提供了這樣的免疫球蛋白，其中至少一種糖肽含有天冬酰胺(Asn)殘基。
另一方面，本發(fā)明提供了植物-產(chǎn)生的免疫球蛋白的重鏈(HC)或者輕鏈(LC)，其中HC或者LC的糖肽譜含有至少一種缺少巖藻糖的糖肽。另一方面，HC具有至少一種糖肽，其含有CH2區(qū)中的天冬酰胺(Asn)殘基。
一方面，本發(fā)明提供了植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白具有如下游離的聚糖譜，該聚糖譜含有至少一種缺乏巖藻糖的聚糖。另一方面，本發(fā)明提供了這樣的免疫球蛋白，其含有天冬酰胺(Asn)殘基。
再一方面，聚糖譜與


圖12中提供的相同或者基本上相同。一方面，聚糖選自3Man，2GlcNAc，1Xyl；2Man，2GlcNAc，1Xyl；3Man，3GlcNAc，1Xyl；3Man，2GlcNAc；3Man，3GlcNAc；4Man，2GlcNAc；5Man，2GlcNAc；和6Man，2GlcNAc，其中Man＝甘露糖，GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺，Xyl＝木糖。在另一方面，聚糖選自3Man，2GlcNAc，1Xyl或2Man，2GlcNAc，1Xyl，其中Man＝甘露糖，GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺，Xyl＝木糖。
另一方面，聚糖譜和
圖16中提供的聚糖譜之一相同或者基本上相同。另一方面，聚糖選自H2N2X；H3N2；和H3N2X，其中H＝己糖，N＝HexNAc＝N-乙酰己糖，X＝木糖。在再一方面，聚糖選自N2H8；N2H3X；N2H3X；N2H4X；N2H5；N2H6；N2H7；N2H8；N3H3X；N2H4；和N2H5，其中H＝己糖，N＝HexNAc＝N-乙酰己糖，X＝木糖。在本發(fā)明的一方面，對于這些免疫球蛋白的每一種，己糖為甘露糖并且N-乙酰己糖為N-乙酰葡糖胺。
在本發(fā)明的一方面，此處詳述的免疫球蛋白可以是選自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD的任一免疫球蛋白。一方面，目標(biāo)免疫球蛋白是IgA或者IgG。例如，在本發(fā)明的一方面，免疫球蛋白是具有重鏈和輕鏈的IgA抗體。這種IgA的一個特定實例是抗-單純皰疹病毒抗體。在另一實施方案中，免疫球蛋白是具有重鏈和輕鏈的IgG抗體。這種IgG的一個特定實施是抗-雙整聯(lián)蛋白抗體，如抗-αVβ3，αVβ5雙整聯(lián)蛋白抗體。
一方面，本發(fā)明的免疫球蛋白的聚糖譜與
圖19、或圖21或圖23中提供的聚糖譜相同或者基本上相同。
一方面，本發(fā)明提供了植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其含有至少一種沒有末端巖藻糖的附著聚糖。另一方面，這種免疫球蛋白在CH2區(qū)含有天冬酰胺(Asn)殘基。
一方面，本發(fā)明提供了植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其聚糖譜含有至少一種缺少巖藻糖的聚糖，其中使用基質(zhì)-輔助的激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-Tof MS)分析從該免疫球蛋白酶促釋放的游離N-連接的聚糖來確定聚糖譜。這種免疫球蛋白的一個實例是IgA，如抗-單純皰疹病毒抗體。另一方面，這種免疫球蛋白的一個實例是IgG，如抗-雙整聯(lián)蛋白抗體。這種抗-雙整聯(lián)蛋白抗體的一個實例是抗-αVβ3，αVβ5雙整聯(lián)蛋白抗體。
一方面，本發(fā)明提供了含有本文中描述和公開的免疫球蛋白的植物細(xì)胞、植物組織、植物愈傷組織、小植株、全株植物或者種子。一方面，所述植物細(xì)胞、植物組織、植物愈傷組織或者種子是單子葉植物的。另一方面，本發(fā)明提供了植物細(xì)胞、植物組織、植物愈傷組織或者種子，其中單子葉植物是玉米植物。另一方面，本發(fā)明提供了小植株和全株植物，其中小植株或全株植物是單子葉植物的。例如，本發(fā)明的植物細(xì)胞、植物組織、植物愈傷組織或者種子可以是玉米植物的植物細(xì)胞、植物組織、植物愈傷組織或者種子。
一方面，本發(fā)明的免疫球蛋白可以位于種子的胚乳中。
一方面，本發(fā)明的免疫球蛋白可以是人免疫球蛋白。
一方面，本發(fā)明的免疫球蛋白具有缺少尾片的重鏈。一方面，這些免疫球蛋白是IgA抗體，如抗-單純皰疹病毒抗體。
一方面，本發(fā)明提供的免疫球蛋白從用于產(chǎn)生該免疫球蛋白的植物分離。
一方面，本發(fā)明提供了單體抗體組合物，其含有至少一種如
圖12中提供的具有1號結(jié)構(gòu)(3Man，2GlcNAc，1Xyl)的聚糖，其中Man＝甘露糖，GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺，Xyl＝木糖。
另一方面，本發(fā)明提供了單體抗體組合物，其含有至少一種如
圖12中提供的具有2號結(jié)構(gòu)(2Man，2GlcNAc，1Xyl)的聚糖，其中Man＝甘露糖，GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺，Xyl＝木糖。
一方面，本發(fā)明提供了植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其含有如下氨基酸片段，該氨基酸片段缺少具有巖藻糖的附著聚糖，其中當(dāng)該免疫球蛋白是哺乳動物產(chǎn)生的時候，該免疫球蛋白在相同的氨基酸片段或者基本上相同的氨基酸片段上具有帶巖藻糖的附著聚糖。
一方面，本發(fā)明提供了植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其針對特定氨基酸片段含有聚糖譜，其中當(dāng)該免疫球蛋白是哺乳動物產(chǎn)生的時候，該免疫球蛋白對于相同的氨基酸序列或者基本上相同的氨基酸片段具有相同或者基本上相同的聚糖譜。
一方面，本發(fā)明提供了植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其含有具有缺少巖藻糖的附著聚糖的氨基酸片段，其中當(dāng)該免疫球蛋白是哺乳動物產(chǎn)生的時候，該免疫球蛋白在相同的氨基酸片段或者基本上相同的氨基酸片段上也缺少具有巖藻糖的附著聚糖。
一方面，本發(fā)明提供了植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白具有如下游離聚糖譜，該聚糖譜含有缺少巖藻糖的聚糖，其中當(dāng)該免疫球蛋白是哺乳動物產(chǎn)生的時候，該免疫球蛋白的游離聚糖譜含有也缺少巖藻糖的相同聚糖。
一方面，本發(fā)明提供了這樣的免疫球蛋白，其中由哺乳動物產(chǎn)生的該免疫球蛋白在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。
一方面，本發(fā)明提供了這樣的免疫球蛋白，其中植物產(chǎn)生的該免疫球蛋白在玉米細(xì)胞中產(chǎn)生并且哺乳動物產(chǎn)生的該免疫球蛋白在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。
一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的方法，其中該轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞表達(dá)具有至少一種沒有巖藻糖的附著聚糖的免疫球蛋白，所述方法包括通過向植物細(xì)胞導(dǎo)入含有編碼該免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的核酸序列的單一載體，轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中每種核酸有效連接啟動子，并培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以產(chǎn)生表達(dá)免疫球蛋白的植物細(xì)胞，該免疫球蛋白具有至少一種缺少巖藻糖的附著聚糖。再一方面，本發(fā)明還提供了從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞分離免疫球蛋白的方法。另一方面，本發(fā)明提供了從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或者經(jīng)轉(zhuǎn)化的全株植物的方法。再一方面，本發(fā)明提供了從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或者經(jīng)轉(zhuǎn)化的全株植物分離免疫球蛋白的方法。再一方面，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中重鏈和輕鏈的序列有效連接到相同啟動子上。再一方面，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中重鏈和輕鏈的序列有效連接到不同啟動子上。一方面，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中啟動子是組成性啟動子。例如，35S CaMV啟動子或者玉米泛素-1啟動子可用于本發(fā)明的方法中。再一方面，本發(fā)明的方法利用種子-特異的啟動子。再一方面，本發(fā)明利用胚乳-特異的啟動子。
一方面，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中載體選自pDAB8505、pDAB1472、pDAB1473、pDAB1474、和pDAB1475。
一方面，本發(fā)明提供了載體pDAB8505、pDAB1472、pDAB1473、pDAB1474、和pDAB1475。
一方面，本發(fā)明提供了這樣的方法，其中用農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法或者WHISKERSTM轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生分離的單體抗-單純皰疹病毒抗體的方法，該方法包括(i)向植物細(xì)胞導(dǎo)入具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO5和SEQ ID NO9或SEQ ID NO13的核酸，每種核酸與啟動子有效連接，以產(chǎn)生經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；(ii)培養(yǎng)該經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以表達(dá)所導(dǎo)入的核酸；和(iii)分離該植物細(xì)胞產(chǎn)生的單體抗-單純皰疹病毒抗體。一方面，本發(fā)明還提供了這樣的方法，其包括從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物。
一方面，本發(fā)明提供了核酸分子，其含有選自SEQ ID NO15(pDAB635)、SEQ ID NO16(pDAB16)、SEQ ID NO17(pDAB637)、SEQID NO84(pDAB3014)、和SEQ ID NO85(pDAB8505)的核酸序列。
一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的核酸分子，其含有編碼SEQ ID NO10或SEQ ID NO14所編碼的氨基酸的核酸序列。
一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO5。
一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的核酸分子，其含有SEQ ID NO9或SEQ ID NO13。
一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的載體或者質(zhì)粒，其含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO5。
一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的核酸分子，其含有編碼SEQ ID NO2或SEQ ID NO6所編碼的氨基酸的核酸序列。
另一方面，本發(fā)明的免疫球蛋白具有含有SEQ ID NO6的氨基酸序列的重鏈。另一方面，本發(fā)明的免疫球蛋白具有含有SEQ ID NO14的氨基酸序列的輕鏈。
一方面，本發(fā)明提供了經(jīng)分離的載體或者質(zhì)粒，其含有SEQ ID NO9或SEQ ID NO13。
從上面的內(nèi)容將理解本發(fā)明的工具和方法可應(yīng)用于產(chǎn)生配子的所有植物。這些植物包括，但不限于，雙子葉植物和單子葉植物，包括草本植物、飼草、草皮草、豆科牧草(例如，紫花苜蓿)、蔬菜、農(nóng)作物植物(例如，玉米和大豆)、樹和裝飾用花。
在閱讀了本文提供了說明書和附圖后，本發(fā)明的其他目的、優(yōu)點和特征將對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
附圖簡述前面的概述以及下面的發(fā)明詳述與附圖一起閱讀后將可以更好地理解。對了闡明本發(fā)明，在附圖中顯示了本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。然而，應(yīng)該理解本發(fā)明不限于所示的精確安排和手段。
在附圖中
圖1.pDAB635(ubiH)的質(zhì)粒。(SEQ ID NO15)。
SAR核苷酸424-1589玉米泛素啟動子/內(nèi)含子 核苷酸1717-3730抗-HSV重鏈 核苷酸3732-5240(帶有大麥α淀粉酶前導(dǎo)序列)玉米per53′UTR 核苷酸5248-5612SAR核苷酸5720-6885圖2pDAB636(ubiL)的質(zhì)粒。(SEQ ID NO16)SAR核苷酸424-1589玉米泛素啟動子/內(nèi)含子 核苷酸1717-3730抗-HSV輕鏈 核苷酸3732-4448
(帶有大麥α淀粉酶前導(dǎo)序列)玉米per53′UTR 核苷酸4456-4820SAR 核苷酸4928-6093圖3pDAB637(ubiH+L)的質(zhì)粒。(SEQ ID NO17)SAR 核苷酸424-1589玉米泛素啟動子/內(nèi)含子核苷酸1709-3722抗-HSV重鏈 核苷酸724-5232(帶有大麥α淀粉酶前導(dǎo)序列)玉米per53′UTR 核苷酸5240-5604玉米泛素啟動子/內(nèi)含子核苷酸5745-7758抗-HSV輕鏈 核苷酸7760-8476(帶有大麥α淀粉酶前導(dǎo)序列)玉米per53′UTR 核苷酸8484-8848SAR 核苷酸8956-10121圖4.非變性蛋白質(zhì)印跡，使用IgAκ鏈作為檢測抗體，檢測轉(zhuǎn)基因玉米愈傷組織產(chǎn)生的泛素HSV-IgA(HC/LC)抗體的蛋白質(zhì)表達(dá)。通過PCR分析了從二方轉(zhuǎn)化(pDAB637(SEQ ID NO17)和pDAB3014(SEQ IDNO84))得到的共53個轉(zhuǎn)基因愈傷組織和從三方轉(zhuǎn)化(pDAB635(SEQ IDNO15)和pDAB3014(SEQ ID NO84))得到的23個轉(zhuǎn)基因愈傷組織以檢測轉(zhuǎn)基因的PTUs的存在。對PTU陽性和陰性的愈傷組織事件進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡和ELISA分析。用上面描述的來自泛素/HC，LC轉(zhuǎn)化的事件，產(chǎn)生蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)。實驗的目的是比較單個質(zhì)粒上HC和LC的表達(dá)效能和兩個分開的質(zhì)粒上HC和LC的表達(dá)效能。收集愈傷組織材料并在-70℃冰凍后運輸以用于蛋白質(zhì)分析。使用IgA重鏈捕獲抗體和IgAκ鏈檢測抗體在捕獲ELISA試驗中實施事件的最初篩選。僅對ELISA陽性樣品用非變性蛋白質(zhì)印跡評估，此時也使用IgAκ鏈作為檢測抗體。在通過ELISA篩選的54個事件中，26個是陽性的(表1)。泳道1分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道2重鏈IgA；泳道3來自轉(zhuǎn)基因植物的愈傷組織材料；泳道4從樣品3-006檢測的IgA(表1)；泳道5從樣品4-008檢測的IgA(表1)；泳道6-10分別從樣品21、24、25、28和29檢測的IgA(表1)。蛋白質(zhì)印跡分析條件為4-12％GEL非還原樣品緩沖液，每孔62ng總蛋白質(zhì)；1∶5000山羊抗-人κ-HRP，室溫下1小時；和5分鐘曝光時間。
圖5.pDAB8505片段(11398bp)的線性質(zhì)粒。(SEQ ID NO85)。
圖6.經(jīng)還原和烷基化的IgA-HX8(事件193self)的胰蛋白酶消化物的代表性C18-HPLC層析圖。峰的安排基于基質(zhì)-輔助的激光解析/電離飛行時間質(zhì)譜(“MALDI-Tof MS”)對HPLC級分的分析。用“L”標(biāo)記的峰相應(yīng)于從IgA-HX8的輕鏈得到的肽。用“H”標(biāo)記的峰相應(yīng)于從IgA-HX8的重鏈得到的肽。詳情參見表1和表2以及所附文本。用肽-N-糖苷酶-A(PNGase-A)進(jìn)一步處理含有糖肽的級分并通過MALDI-Tof MS分別分析所得脫糖基化的肽和釋放的聚糖。HPLCMagic C18，2×150mm。對所收集的級分實施離線MALDI MS。
圖7.通過胰蛋白酶消化經(jīng)還原和烷基化的IgA-HX8(事件193self)而產(chǎn)生的IgA-HX8重鏈的H-T13肽的糖型(glycoforms)的代表性MALDI-Tof MS。指出了糖肽的單種同位素質(zhì)量。峰上面的大個數(shù)字相應(yīng)于表8中總結(jié)的聚糖種類。單糖單位的短的縮寫如下H，己糖；N，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)；X，戊糖(木糖)。
圖8.通過聚糖的酶促釋放(PNGase-A)除去了IgA-HX8重鏈的H-T13肽的糖型(glycoforms)的異質(zhì)性。用PNGase-A處理后，相應(yīng)于H-T13肽的糖型的信號消失并且在質(zhì)譜中出現(xiàn)相應(yīng)于脫糖基化的肽H-T13的強信號。注意，在脫糖基化反應(yīng)期間PNGase-A將Asn(N)轉(zhuǎn)化成Asp(D)；相應(yīng)地，出現(xiàn)脫糖基化H-T13肽，伴有～+IDa的質(zhì)量遷移。糖肽(PNGase-A處理前)的質(zhì)譜中峰上面的大號數(shù)字相應(yīng)于表8中所列的聚糖種類。
圖9.觀察到玉米表達(dá)的IgA-HX8重鏈的H-T13肽的兩種額外的糖型附著到N269上的單和雙GlcNAc殘基。糖肽(PNGase-A處理前)的質(zhì)譜中峰上面的大號數(shù)字相應(yīng)于表8中所列的聚糖種類。用PNGase-A處理導(dǎo)致除去(GlcNAc)2和部分除去單GlcNAc殘基。用PNGase-A處理樣品后質(zhì)譜中出現(xiàn)相應(yīng)于脫糖基化的肽H-T13的峰(數(shù)據(jù)未顯示)。
圖10.從單體IgA-HX8(事件193self)酶促釋放的游離的N-連接的聚糖的代表性MALDI-Tof MS譜。峰上面的大號數(shù)字相應(yīng)于表8中概述的聚糖種類。單糖單位的短的縮寫如下H，己糖；N，N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)；X，戊糖(木糖)。由于MALDI MS難以達(dá)到低于500道爾頓(Da)的分子量區(qū)域，所以沒有檢測到作為游離聚糖的單和雙GlcNAc種類(表8中的結(jié)構(gòu)11和12)。以鈉離子形式觀察到聚糖種類。
圖11.使用胚乳來源的HX8中和HSV-2。
圖12.從植物分離的IgA聚糖的結(jié)構(gòu)。由于MALDI MS不能達(dá)到低于500道爾頓(Da)的分子量區(qū)域，所以沒有檢測到作為游離聚糖的單和雙GlcNAc種類(結(jié)構(gòu)11和12)。
圖13.單體、二聚體和分泌性抗體的圖示。
圖14.pDAB3014質(zhì)粒。(SEQ ID NO84)。
稻肌動蛋白啟動子 核苷酸1172-1724；PAT(膦絲菌素?；D(zhuǎn)移酶基因) 核苷酸1727-2281；玉米脂肪酶3’UTR 核苷酸2296-6652。
圖15.pDAB8505環(huán)狀質(zhì)粒。(SEQ ID NO85)。
SAR 核苷酸424-1589；玉米γ玉米醇溶蛋白啟動子 核苷酸1673-3175；抗-HSV重鏈基因 核苷酸3178-4668；玉米per53′UTR 核苷酸4678-5045；玉米γ玉米醇溶蛋白啟動子 核苷酸5157-6659；抗-HSV輕鏈基因 核苷酸6662-7360；玉米per53′UTR 核苷酸7370-7737；稻肌動蛋白啟動子及內(nèi)含子 核苷酸7889-9258；PAT編碼區(qū)核苷酸9260-9820；玉米脂肪酶3′UTR 核苷酸9831-10162；
SAR 核苷酸10229-11394。
注意抗-HSV重鏈基因和抗-HSV輕鏈都包括小鼠前導(dǎo)序列。
圖16A到16G對在轉(zhuǎn)基因玉米中表達(dá)的IgA-HX8(不同事件)的聚糖譜的總結(jié)。還包括所建議的聚糖結(jié)構(gòu)的圖示，其中“H”或者圓形＝己糖(Man，Gal，Glc)；“N”或者長方形＝HexNAc(GlcNAc或GalNAc)；“X”或叉形＝木糖；“F”或三角形＝巖藻糖；“P”＝磷酸(PO3)。注釋基于MALDI-質(zhì)譜中峰高度的聚糖百分?jǐn)?shù)(％)僅用于參考而不能用于準(zhǔn)確定量。
圖17A.質(zhì)粒pDAB1472(
圖17A)和pDAB1473(
圖17B)。
圖18.質(zhì)粒pDAB1474(
圖18A)和pDAB1475(
圖18B)。
圖19.就事件660對IgG觀察到的糖型。通過PNGase-A處理從糖肽除去所有聚糖。對于單個N，除去是不完全的。代碼“H”＝己糖(Man，Gal，Glc)；“N”＝HexNAc(GlcNAc或GalNAc)；“X”＝木糖；“F”＝巖藻糖。
信號強度*＝S/N＞3-5，但是＜10；**＝S/N＞10；***＝強信號，但是小于“次要的”；“顯著信號”＝“次要”和“主要”之間的強度。
圖20A.事件660的H-T27肽(重鏈的N299位點)的糖型的代表性MALDI-TOF MS譜。
圖20B.對于事件660在m/z2360.06(主要糖型，N2H3XF)的放大。
圖21.對IgG就事件661觀察到的糖型。通過PNGase-A處理從糖肽除去所有聚糖。對于單個N，除去是不完全的。代碼“H”或圖形＝己糖(Man，Gal，Glc)；“N”或長方形＝HexNAc(GlcNAc或GalNAc)；“X”或叉形＝木糖；“F”或三角形＝巖藻糖。
信號強度*＝S/N＞3-5，但是＜10；**＝S/N＞10；***＝強信號，但是小于“次要的”；
“顯著信號”＝“次要”和“主要”之間的強度。
圖22A.事件661的H-T27肽(重鏈的N299位點)的糖型的代表性MALDI-TOF MS譜。HPLC級分16。
圖22B.對于事件661在m/z2360.06(主要糖型，N2H3XF)的放大。注釋同位素分辨(isotopic resolution)。
圖22C.事件611的H-T27肽的糖型(在m/z1189.65未糖基化，在m/z1392.76為單一HexNAc，加上在更高m/z處H-T26-27肽上一些N-糖型)的代表性MALDI-TOF MS譜。HPLC級分17。
圖22D.從H-T27糖肽釋放的N-聚糖。游離聚糖的MALDI MS。該MALDI質(zhì)譜中的強度與中性N-聚糖的豐度大約成比例。注釋沒有計算單和雙GlcNAc。
圖23.對IgG就事件663觀察到的糖型。通過PNGase-A處理從糖肽除去所有聚糖。對于單個N，除去是不完全的。代碼“H”＝己糖(Man，Gal，Glc)；“N”＝HexNAc(GlcNAc或GalNAc)；“X”＝木糖；“F”＝巖藻糖。
信號強度*＝S/N＞3-5，但是＜10；**＝S/N＞10；***＝強信號，但是小于“次要的”；“顯著信號”＝“次要”和“主要”之間的強度。
圖24A.事件663的H-T27肽(重鏈的N299位點)的糖型的代表性MALDI-TOF MS譜。
圖24B.對于事件663在m/z2360.07(主要糖型，N2H3XF)的放大。注釋同位素分辨率。
圖25.對CHO-表達(dá)的IgG所觀察到的糖型。通過PNGase-A處理從糖肽除去所有聚糖。對于單個N，除去是不完全的。代碼“H”＝己糖(Man，Gal，Glc)；“N”＝HexNAc(GlcNAc或GalNAc)；“X”＝木糖；“F”＝巖藻糖。
信號強度
*＝S/N＞3-5，但是＜10；**＝S/N＞10；***＝強信號，但是小于“次要的”；“顯著信號”＝“次要”和“主要”之間的強度。
圖26A.CHO-表達(dá)的IgG的H-T27肽(重鏈的N299位點)的糖型的代表性MALDI-TOF MS譜。
圖26B.CHO-表達(dá)的IgG在m/z2633.61(主要糖型，N4H3F)的放大。注釋同位素分辨率。
發(fā)明詳述除非另外定義，本文中所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管與本文中所描述的相似或者等價的任何方法和材料都可用于實施或者檢驗本發(fā)明，但是此處描述優(yōu)選的方法和材料。
I.定義本文中，術(shù)語“無巖藻糖基化的”或者“無巖藻糖基化”指如下情況，其中附著到免疫球蛋白、免疫球蛋白的部分、抗體或者抗體的部分上的特定聚糖、聚糖級分、糖肽或者糖肽級分缺乏巖藻糖。此處術(shù)語“無巖藻糖基化的”和“無巖藻糖基化”的使用不意在暗示導(dǎo)致巖藻糖不能附著或者附著后被除去的任何特定機制、分子或者其他因素。從而，此處術(shù)語的使用不意在暗示巖藻糖通過下面的機制中任何特定的一種被除去轉(zhuǎn)錄地、翻譯地或者翻譯后地。
本文中，術(shù)語“農(nóng)作物植物”指以生產(chǎn)規(guī)模栽培的、最通常為收獲種子、青貯料或者干草飼料而栽培的任何作物植物。實例包括，但不限于玉米、大豆、黑麥、小麥、燕麥、大麥、小扁豆(lentil)、干豌豆、油菜、高梁、紫花苜蓿、黑小麥、三葉草，等等。
本文中，術(shù)語“等位基因”指基因的幾種可變形式中的任一種。
本文中，術(shù)語“氨基酸”指作為蛋白質(zhì)和肽的組分的氨基羧酸。表6和7中和本文別處所用的氨基酸的縮寫如下A(Ala) C(Cys) D(Asp) E(Glu) F(Phe)G(Gly)H(His) I(Iso) K(Lys) L(Leu) M(Met)N(Asn)P(Pro) Q(Gln) R(Arg) S(Ser) T(Thr)V(Val)W(Trp) Y(Tyr)本文中，“抗-α-v-β 3，α-v-β5雙整聯(lián)蛋白抗體”、“抗-雙整聯(lián)蛋白抗體”、“抗-雙整聯(lián)蛋白抗體部分”、“抗αvβ3，抗αvβ5”、“抗αvβ3，抗αvβ5”或者“抗-雙整聯(lián)蛋白抗體片段”和/或“抗-雙整聯(lián)蛋白抗體變體”等等包括含有如下分子的任何蛋白質(zhì)或肽，該分子含有免疫球蛋白的至少一部分，如但不限于重或者輕鏈的至少一個互補決定區(qū)(CDR)或者其配體結(jié)合部分、重鏈或輕鏈可變區(qū)、重鏈或輕鏈恒定區(qū)、構(gòu)架區(qū)，或者其任何部分，或者可以摻入本發(fā)明的抗體中的雙整聯(lián)蛋白受體或者結(jié)合蛋白的至少一部分。
本文中，術(shù)語“抗體”指對接觸識別為“非己”的病原體或者部分作出應(yīng)答而在身體(人或動物)中正常產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?？贵w(如IgG和sIgA)和抗體片段(如，F(xiàn)ab和ScFv)具有中和病原體，從而造成對該病原體的免疫力的特異能力?？贵w分子由四條多肽鏈組成兩條相同的重鏈(HC)和兩條相同的輕鏈(LC)。Y抗體構(gòu)型的每個“臂”含有一條輕鏈和一條重鏈的部分；鉸鏈區(qū)允許臂移動；兩條重鏈的剩余部分形成“莖干”(見
圖13)。Y的每個臂區(qū)作為抗原結(jié)合部位，這些結(jié)合部位與該多肽的可變區(qū)相關(guān)。HC和LC通過二硫鍵保持在一起。分泌性抗體還含有連接鏈(JC)和分泌組分(SC)。
本文中，術(shù)語“抗原”指能夠誘導(dǎo)特異免疫應(yīng)答并且能與通過該應(yīng)答產(chǎn)生的所得抗體反應(yīng)的任何物質(zhì)。
本文中，術(shù)語“抗病毒劑”指干擾病毒復(fù)制的物質(zhì)。
本文中，術(shù)語“主鏈質(zhì)?！被蛘摺爸麈溳d體”指含有表達(dá)目的基因所需的所有必要元件的質(zhì)粒，這些必要元件包括MAR序列、啟動子、3’UTR、選擇標(biāo)記基因盒和用于抗體編碼區(qū)的一步加入的獨特限制位點。主鏈載體的另一特征是存在用于有效除去抗生素抗性基因的獨特限制位點。
本文中，術(shù)語“β-葡糖醛酸糖苷酶”或者“GUS”指通常用于植物轉(zhuǎn)化研究中的來自大腸桿菌(Escherichia coli)的可篩選的標(biāo)記基因。見，例如，Jefferson，R.，等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 838447-8451(1986)；Jefferson，R.，等人，EMBO J.63901-3907(1987)；Jefferson，R.，PlantMol.Biol.Rep.5387-405(1987)；和Jefferson，R.，Plant Mol.Biol.Rep.5387-405(1988)。
本文中，術(shù)語“作物植物”指為任何商業(yè)目的而栽培的任何植物，該目的包括，但不限于下面的目的種子生產(chǎn)、干草飼料生產(chǎn)、裝飾用途、水果生產(chǎn)、漿果生產(chǎn)、蔬菜生產(chǎn)、油生產(chǎn)、蛋白質(zhì)生產(chǎn)、飼料生產(chǎn)、動物放牧、高爾夫球場、草坪、花生產(chǎn)、美化環(huán)境、控制侵蝕、綠肥、改善土壤適耕性/健康、生產(chǎn)藥物產(chǎn)品/藥物、生產(chǎn)食品添加劑、煙草產(chǎn)品、紙漿生產(chǎn)和木材生產(chǎn)。
本文中，術(shù)語“異花傳粉”或者“雜交育種”當(dāng)涉及植物時指將一株植物上的一朵花的花粉(人工或天然地)應(yīng)用于另一株植物上的花的胚珠(柱頭)的方法。
本文中，術(shù)語“栽培品種”當(dāng)指植物時表示通過園藝或農(nóng)藝技術(shù)產(chǎn)生的正常不存在于野生群體中的植物變種、株系或品種。
本文中，術(shù)語“雙子葉植物”和“雙子葉的”指開花植物，其胚胎含有兩個種子半片或者子葉。實例包括煙草；番茄；豆類，包括豌豆、紫花苜蓿、三葉草和大豆；橡樹；楓樹；玫瑰；薄荷；南瓜；雛菊；胡桃；仙人掌；紫羅蘭和毛茛。
本文中，術(shù)語“二聚體抗體”或者“dIgA”指含有通過J鏈連接的兩個單體抗體的抗體。從而，“二聚體IgA”或者“dIgA”含有通過J鏈連接的兩個單體IgA抗體(見
圖13B)；“二聚體抗-HSV IgA”或者“抗-HSVdIgA”含有通過J鏈連接的針對單純皰疹病毒的兩個單體IgA抗體。
本文中，術(shù)語“胚乳”指在許多植物種子中發(fā)現(xiàn)的三倍體結(jié)構(gòu)，其由胚囊的兩個極核和來自花粉的一個精核融合并發(fā)育產(chǎn)生。胚乳常常儲存養(yǎng)料物質(zhì)，其在萌芽期間分解。
本文中，術(shù)語“子代”指特定親代后的任何一代植物細(xì)胞、組織或者生物體。親本植物交配所得的世代是子一代(稱為“F1”或“F1”)，而F1植物雜交所得的世代是子二代(稱為“F2”或“F2”)。
術(shù)語“配子”指生殖細(xì)胞，其核(以及常常細(xì)胞質(zhì))與具有相似起源但是相反性別的另一配子融合形成合子，合子具有發(fā)育成新的單個植物的潛力。配子通常是單倍體并且區(qū)分成雄性和雌性。
術(shù)語“基因”指與生物學(xué)功能相關(guān)的任何DNA片段。從而，基因包括，但不限于，編碼序列和/或它們的表達(dá)所需的調(diào)節(jié)序列?；蜻€可以包括非表達(dá)的DNA片段，其例如，形成其他蛋白質(zhì)的識別序列?？梢詮亩喾N來源得到基因，包括從目標(biāo)來源克隆或者從已知的或者經(jīng)預(yù)測的序列信息合成，并且基因可以包括經(jīng)設(shè)計而具有所希望的參數(shù)的序列。
本文中，術(shù)語“基因型”指細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、完整生物體(例如，完整植物或動物)、或者一群完整生物體(例如，一群植物或動物)的基因組成。
本文中，術(shù)語“聚糖”與“多糖”同義，指由通過糖苷鍵相互連接的單糖(例如，葡萄糖)殘基組成的任何線性或者分枝的聚合物。聚糖的實例包括糖原、淀粉、透明質(zhì)酸、和纖維素。
本文中，術(shù)語“糖苷”指含有糖分子(糖)的任何化合物，尤其是植物中的任何這種天然產(chǎn)物，其可以通過水解切割轉(zhuǎn)化成糖和非糖組分。
本文中，術(shù)語“糖肽”指化合物或者組合物，其中糖共價連接到肽或者寡肽上。
本文中，術(shù)語“糖蛋白”指化合物或者組合物，其中糖共價連接到蛋白質(zhì)上。
本文中，術(shù)語“糖基化”指將寡糖加到蛋白質(zhì)的特定殘基上。該修飾可以共翻譯地和翻譯后地發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中?？梢詤^(qū)分三種不同形式的糖基化N-連接的寡糖、O-連接的寡糖和糖基-磷脂酰肌醇(GPI-)錨。
本文中，術(shù)語“半合子”指某一基因在基因型中僅出現(xiàn)一次的細(xì)胞、組織或者生物體，像單倍體細(xì)胞或者生物體中的基因，在異配性別中的性連鎖基因，或者在二倍體細(xì)胞或者生物中的染色體片段中的基因，其中該染色體片段的配偶體片段已經(jīng)缺失。
本文中，術(shù)語“皰疹”指由單純皰疹病毒或者水痘-帶狀皰疹病毒導(dǎo)致的炎性皮膚病。
本文中，術(shù)語“單純皰疹”指由“單純皰疹病毒1”(也稱作“HSV1”和“1型單純皰疹病毒”)和“單純皰疹病毒2”(也稱作“HSV2”和“2型單純皰疹病毒”)導(dǎo)致的各種感染，所有這些感染均涉及幾種急性、炎性病毒疾病之任一種。這些疾病的特征是通常在嘴、唇、臉和生殖器上的小水皰出疹。HSV1和HSV2導(dǎo)致的水皰的位置不是位置特異的。
本文中，術(shù)語“皰疹病毒”指屬于皰疹病毒科(Herpes viridae)的任何病毒。
本文中，術(shù)語“雜聚糖”或者“雜多糖”指由兩種或多種不同類型的單糖殘基組成的聚糖。
“異源多核苷酸”或者“異源核酸”或者“外源DNA片段”指多核苷酸、核酸或者DNA片段，其來自相對于具體宿主細(xì)胞而言外來的來源，或者如果來自相同的來源，則已被修飾而不同于其最初的形式。從而，宿主細(xì)胞中的異源基因包括此具體宿主細(xì)胞內(nèi)源的基因，但是該基因已經(jīng)被修飾。從而，該術(shù)語指這樣的DNA片段，其(i)對該細(xì)胞是外來的或者異源的，或者(ii)與該細(xì)胞同源但是其處于該宿主細(xì)胞核酸內(nèi)的位置非該元件通常所在的位置。外源DNA片段可以表達(dá)而產(chǎn)生外源多肽。
“異源性狀”指外源DNA片段、異源多核苷酸或者異源核酸賦予經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞或者轉(zhuǎn)基因生物的表型。
本文中，術(shù)語“雜合子”指在至少一個基因座上具有不同等位基因(給定基因的形式)的二倍體或者多倍體個體植物細(xì)胞或者植物。
本文中，術(shù)語“雜合的”指在特定基因座位存在不同的等位基因(給定基因的形式)。
本文中，術(shù)語“HPLC”指高效液相層析。
本文中，術(shù)語“純合子”指在一個或多個基因座上具有相同等位基因的個體植物細(xì)胞或者植物。
本文中，術(shù)語“純合的”指同源染色體片段中一個或多個基因座上存在相同的等位基因。
本文中，術(shù)語“雜種”指由一個或多個基因不同的親本之間雜交產(chǎn)生的任何細(xì)胞、組織或者完整生物體(例如，完整植物或者動物)。
本文中，術(shù)語“HX8”或者“HX-8”指IgA抗體的標(biāo)識碼，其中H＝皰疹，X＝單純的，8＝樣品號。HX8是人單克隆抗體(樣品號8)，其中和1型和2型單純皰疹病毒(HSV)并結(jié)合糖蛋白D上存在的表位，具有ATCC69522產(chǎn)生的Fab片段的結(jié)合特異性，并且其重鏈具有如美國專利號6,156,313中提出的SEQ ID NO1的CDR3，該此處引用該完整專利作為參考。HX8抗體的重鏈和輕鏈的完整核苷酸分別如SEQ ID Nos1和9所示。
本文中，術(shù)語“免疫球蛋白”或者“Ig”指在血漿或者其他體液中發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白質(zhì)產(chǎn)物或者這些蛋白質(zhì)的部分，它們具有免疫學(xué)活性并且能夠特異結(jié)合抗原。每種Ig由兩對免疫學(xué)活性部分免疫球蛋白輕鏈(LC)(κ，λ)和免疫球蛋白重鏈(HC)(γ、α、μ、δ和ε)組成(見
圖13A)?；诮Y(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性，有5大類抗體蛋白質(zhì)或者免疫球蛋白IgM、IgG、IgA、IgD、和IgE。盡管多數(shù)抗體類別作為單個分子分泌，但是IgA和IgM抗體締合成更大的聚合物，其部分地通過其他蛋白質(zhì)鏈穩(wěn)定化。
本文中，術(shù)語“免疫球蛋白產(chǎn)物”或者“Ig產(chǎn)物”指能夠與抗原特異結(jié)合的多肽、蛋白質(zhì)或者多聚體蛋白質(zhì)。示例性免疫球蛋白產(chǎn)物是免疫球蛋白重鏈、免疫球蛋白分子、基本上完整的免疫球蛋白分子、含有抗原互補位的免疫球蛋白的任何部分，包括本領(lǐng)域公知的那些部分，如Fab片段。
本文中，術(shù)語“近親交配”或者“近交系”指相對不分離的品系。
本文中，術(shù)語“整聯(lián)蛋白”指作為細(xì)胞粘著分子的受體的一個跨膜蛋白質(zhì)大家族的任何成員。整聯(lián)蛋白是異二聚體分子，其中α和β亞基非共價結(jié)合。
本文中，術(shù)語“連接鏈”、“J鏈”或者“JC”指參與免疫球蛋白的聚合和所聚合的免疫球蛋白通過上皮細(xì)胞的運輸?shù)亩嚯摹Ｒ?，例如，TheImmunoglobulin HelperThe J Chain in Immunoglobulin Genes，345頁，Academic Press(1989)。JC在五聚體IgM和二聚體IgA(見
圖13B)中發(fā)現(xiàn)并且通常通過二硫鍵連接。
本文中，術(shù)語“基因座”指任何已經(jīng)被遺傳確定的位點。基因座可以是基因、或者基因的部分，或者具有一定的調(diào)節(jié)作用的DNA序列，并且可以被不同的序列占據(jù)。
本文中，術(shù)語“MALDI”指基質(zhì)-輔助的激光解吸電離。
本文中，術(shù)語“MALDI-Tof質(zhì)譜”或者“MALDI-Tof MS”指基質(zhì)-輔助的激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜。用于確定MALDI-Tof質(zhì)譜的設(shè)備的一個實例是Applied Biosystems Voyager DE-STR MALDI飛行時間(MALDI-Tof)質(zhì)譜儀。
本文中，術(shù)語“基質(zhì)附著區(qū)”(matrix attachment region)或者“MAR”，也稱作“支架附著區(qū)”(scaffold attachment region)或者“SAR”，指特定DNA序列，在該序列處發(fā)生與核支架網(wǎng)絡(luò)的附著。關(guān)于本發(fā)明所用MAR序列的信息可在美國專利號5,773,689和6,239,328中得到，此處完整引用所述專利作為參考。
本文中，術(shù)語“混合選擇”當(dāng)用于描述植物育種方法時指一種選擇形式，其中選擇多個植物個體并從它們的種子的集合繁殖下一代。
本文中，術(shù)語“單克隆抗體”或者“Mab”指從識別特定抗原的單個抗體產(chǎn)生細(xì)胞得到的抗體。通過雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生MAb，雜交瘤細(xì)胞是產(chǎn)生該抗體的細(xì)胞和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的融合物。該骨髓瘤細(xì)胞可以持續(xù)產(chǎn)生該抗體。
本文中，術(shù)語“單子葉植物”或“單子葉的”指開花植物的一個亞類(單子葉植物綱)，該亞類中的所有植物均具有僅含有一片子葉的胚并且通常具有平行葉脈的葉子，其花瓣為三的倍數(shù)，并且在莖干和根中沒有次生生長。實例包括百合、蘭花、稻、玉米、草，如葦狀羊茅、山羊草和草地早熟禾；谷物，如小麥、燕麥和大麥；鳶尾；洋蔥和棕櫚。
本文中，術(shù)語“單體抗體”指含有通過二硫鍵相互連接的兩條輕鏈和兩條重鏈的抗體(見
圖13A)。從而，“單體IgA”或“mIgA”含有IgA抗體的兩條輕鏈和兩條重鏈；“單體HSVIgA”或者“HSVmIgA”含有針對單純皰疹病毒的IgA抗體的兩條輕鏈和兩條重鏈。
本文中，術(shù)語“多聚體蛋白質(zhì)”指球狀蛋白質(zhì)，其含有一條以上的分開的多肽或者蛋白質(zhì)鏈，這些鏈相互締合而形成一個球狀蛋白質(zhì)。異二聚體和同二聚體蛋白質(zhì)都是多聚體蛋白質(zhì)。
本文中，術(shù)語“核酸”或者“多核苷酸”指脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸和它們的單鏈或者雙鏈形式的聚合物。除非特別限制，該術(shù)語包括含有天然核苷酸的公知類似物的核酸，所述類似物具有與參比核酸相似的結(jié)合性質(zhì)并且以與天然發(fā)生的核苷酸相似的方式被代謝。特別地，通過將一個或多個所選(或者所有)密碼子的第三個位置用混合堿基和/或脫氧次黃苷殘基置換產(chǎn)生序列，可以實現(xiàn)簡并密碼子置換。見，例如，Batzer等人，Nucleic Acid Res.195081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.2602605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 891-98(1994)。術(shù)語核酸與基因、cDNA和基因編碼的mRNA可互換使用。
本文中，術(shù)語“寡糖”指含有少數(shù)(2到約20個)通過糖苷鍵連接的單糖殘基的任何分子。
本文中，DNA片段當(dāng)與另一DNA片段具有功能相關(guān)性時稱為“有效連接”。例如，如果編碼信號序列的DNA表達(dá)為參與多肽的分泌的前蛋白時，那么該編碼信號序列的DNA與編碼該多肽的DNA有效連接；如果啟動子或者增強子刺激編碼序列的轉(zhuǎn)錄，那么該啟動子或者增強子與該編碼序列有效連接。通常，有效連接的DNA序列是相鄰的，并且對于信號序列，既是相鄰的又是相同閱讀相的。然而，當(dāng)啟動子和增強子控制編碼序列的轉(zhuǎn)錄時，該啟動子和增強子不必與該編碼序列相鄰。連接可以利用方便的限制位點實現(xiàn)或者利用插入以代替所述限制位點的連接物或者接頭而實現(xiàn)。
本文中，術(shù)語“開放傳粉”當(dāng)涉及植物時指自由暴露于一定的基因流的植物群體，與近親授粉不同，在近親授粉中，存在對基因流的有效屏障。
本文中，術(shù)語“開發(fā)傳粉群體”或者“開放傳粉品種”當(dāng)涉及植物時指根據(jù)一個標(biāo)準(zhǔn)選擇的正常能夠進(jìn)行至少一定的異花受精的植物，所述植物可以表現(xiàn)出變異但是也具有一種或多種基因型或者表型特征，通過所述特征該群體或者品種可以與其他群體或品種區(qū)分開來。對異花傳粉沒有屏障的雜種是開放傳粉群體或者開放傳粉品種。
本文中，術(shù)語“胚珠”指雌性配子體，而術(shù)語“花粉”指雄性配子體。
本文中，術(shù)語“胚珠-特異的啟動子”廣義上指這樣的核酸序列，其調(diào)節(jié)核酸序列選擇性地在對胚珠形成和/或功能必需的植物細(xì)胞或組織中表達(dá)和/或使核酸序列的表達(dá)限制在植物的胚珠形成時期內(nèi)。
本文中，術(shù)語“肽”指一類低分子量化合物，這些化合物在水解時產(chǎn)生兩個或更多個氨基酸并且這些化合物形成蛋白質(zhì)的組成部分。本文中，“寡肽”指含有少數(shù)(2到約20個)通過肽鍵連接的氨基酸殘基的任何分子。
本文中，術(shù)語“肽鍵”指連接氨基酸之間COOH和NH2基團(tuán)的酰胺鍵；肽鍵是具有一定的雙鍵特征的平面鍵，因此不能自由旋轉(zhuǎn)。
本文中，術(shù)語“表型”指細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、完整生物(例如，完整植物或動物)，或者一群完整生物(例如，一群完整植物或者動物)的可觀察到的特征，該特征由細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或生物的遺傳組成(即，基因型)與環(huán)境的相互作用導(dǎo)致。
本文中，術(shù)語“植物”指全株植物和其后代、植物細(xì)胞、植物組織、植物愈傷組織、種子和花粉?？捎糜诒景l(fā)明方法中的植物的類別通常和適于接受實施轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物的類別一樣寬，包括單子葉植物和雙子葉植物。
本文中，術(shù)語“植物品系”按廣義使用，包括，但不限于，通過組織培養(yǎng)技術(shù)從單個親本植物無性繁殖的一群植物，或者一群近親交配植物，它們由于從共同的親本遺傳下來而在遺傳上非常相似。如果一種植物被說成“屬于”一個特定品系，則該植物(a)是從該品系的材料再生的原代轉(zhuǎn)化(T0)植物；(b)具有含有該品系的T0植物的系譜；或者(c)由于共同祖先(例如，通過近交或者自交)而在遺傳上非常相似。在本上下文中，術(shù)語“系譜”(pedigree)指按照例如以下有性雜交而言的植物譜系，其中該有性雜交導(dǎo)致基因或者基因的組合在雜合(半合子的)或者純合條件下對該植物賦予所希望的性狀。
本文中，術(shù)語“植物器官”指植物的任何部分。植物器官的實例包括，但不限于葉、莖、根、塊莖、種子、枝條、短柔毛、結(jié)節(jié)、葉腋、花、花粉、雄蕊、雌蕊、花瓣、花序梗、桿、柱頭、花柱、苞片、果實、樹干、心皮、萼片、花藥、胚珠、花梗、針葉、球果、根莖、匍匐莖、芽、果皮、胚乳、胎座、漿果、雄蕊，和葉鞘。
本文中，“plantibodyTM”指植物、植物器官或者植物細(xì)胞產(chǎn)生的抗體，包括單個抗體鏈、單體、二體或分泌抗體或者抗體片段。
本文中，術(shù)語“植物轉(zhuǎn)錄單位”或者“PTU”指編碼啟動子序列、編碼序列和3’末端序列的核酸序列。
本文中，術(shù)語“多肽”指通過肽鍵連接的氨基酸的線性聚合物。多肽可以短至2個氨基酸到實質(zhì)上任何長度。
本文中，術(shù)語“啟動子”指DNA序列或者一組DNA序列上的識別部位，其提供了基因的表達(dá)控制元件并且與RNA聚合酶特異結(jié)合由此啟動該基因的RNA合成(轉(zhuǎn)錄)。
本文中，術(shù)語“重組體”指經(jīng)歷重組DNA轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或者生物體。最初的重組體被稱為“R0”或者“R0”。自交R0產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的第一代，其被稱為“R1”或者“R1”。
本文中，術(shù)語“分泌組分”或者“SC”指存在于嵌合免疫球蛋白鏈的N-末端的多肽，其可用于幫助所述鏈分泌到宿主體外。
本文中，術(shù)語“分泌性IgA抗體”和(“sIg”)指由10個蛋白質(zhì)鏈組成的抗體，其中所述鏈由如下四種基因編碼重鏈(“HC”)和輕鏈(“LC”)，它們結(jié)合而形成單體IgA(“mIgA”)(見
圖13A)；連接鏈(“JC”)，其連接兩個單體的IgA單體形成二聚體IgA(“dIgA”)(見
圖13B)；和分泌組分(“SC”)，其纏繞dIgA分子(見
圖13C)。
本文中，術(shù)語“自花授粉的”或者“自花授粉”當(dāng)用于植物時指一株植物上的一朵花的花粉應(yīng)用(人工或天然地)于相同植物上相同或不同花的胚珠(柱頭)。
本文中，術(shù)語“性傳播感染”或者“STI”指一類疾病和感染，它們通過性交或者性接觸從一個人傳遞到下一個人；也稱作STDs或者性傳播疾病。
本文中，術(shù)語“信號序列”指與多肽連接的氨基酸序列(信號肽)，其使該多肽結(jié)合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)并且對于蛋白質(zhì)分泌是必需的。
本文中，術(shù)語“綜合品種”(synthetic variety)當(dāng)指植物時表示通過將特定的一組克隆或者種子繁殖品系雜交而產(chǎn)生的一組后代。綜合品種可以含有從異花受精、自花受精、同胞受精所得的種子的混合物。
本文中，術(shù)語“尾片”指重鏈的一部分，其含有通常被巖藻糖基化的Asn殘基。例如，在IgA HX8抗體中，尾片含有SEQ ID NO1的氨基酸殘基476-497。Asn殘基在HX8抗體中的484位。
本文中，術(shù)語“轉(zhuǎn)錄物”指轉(zhuǎn)錄過程的產(chǎn)物。
本文中，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”指將核酸(即，核苷酸聚合物)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中。本文中，術(shù)語“遺傳轉(zhuǎn)化”指將DNA，特別是重組DNA轉(zhuǎn)移和摻入到細(xì)胞中。
本文中，術(shù)語“轉(zhuǎn)化體”指已經(jīng)經(jīng)歷轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、組織或生物。最初的轉(zhuǎn)化體被稱為“T0”或者“T0”。自交T0產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的第一代，其被稱為“T1”或者“T1”。
本文中，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”指核酸，其以確保功能的方式插入生物體、宿主細(xì)胞或載體中。
本文中，術(shù)語“轉(zhuǎn)基因的”指已經(jīng)通過多種轉(zhuǎn)化方法之一接受了外來或者經(jīng)修飾的基因的細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、生物(例如，植物或動物)和它們的子代，其中該外來或者經(jīng)修飾的基因來自與接受該外來或者經(jīng)修飾的基因的細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、或生物相同或者不同的物種。
本文中，術(shù)語“非翻譯區(qū)”或者“UTR”指mRNA分子中不編碼蛋白質(zhì)的任一部分(例如，在真核生物中多聚(A)尾)。
本文中，術(shù)語“載體”在廣義上指編碼外源核酸的任何質(zhì)粒或者病毒。該術(shù)語也應(yīng)理解為包括促進(jìn)核酸向病毒體或者細(xì)胞轉(zhuǎn)移的非質(zhì)粒和非病毒化合物，如聚賴氨酸化合物等等。所述載體可以是適于作為遞送運載工具遞送核酸或者其突變體至細(xì)胞的病毒載體，或者該載體可以是適于相同的目的的非病毒載體。用于將DNA遞送到細(xì)胞和組織的病毒和非病毒載體的實例是本領(lǐng)域中眾所周知的并且在例如，Ma等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9412744-12746(1997)中描述。病毒載體的實例包括，但不限于，重組痘苗病毒、重組腺病毒、重組逆轉(zhuǎn)錄病毒、重組腺-相關(guān)病毒、重組禽痘病毒，等等。見，例如，Cranage等人，EMBO J.53057-3063(1986)；1994年8月18日出版的國際專利申請?zhí)朩O94/17810；和1994年10月27日出版的國際專利申請?zhí)朩O94/23744。非病毒載體的實例包括，但不限于，DNA的聚胺衍生物、脂質(zhì)體等等。
術(shù)語“病毒”指在動物中導(dǎo)致各種疾病，如麻疹、腮腺炎等等或者在植物中導(dǎo)致各種疾病，如花葉病的超顯微或者亞顯微感染物；病毒僅能依賴于活細(xì)胞而繁殖并且被認(rèn)為是活的生物和核酸的包裝物(有時涉及復(fù)雜蛋白質(zhì)、酶，等等)。
本發(fā)明包括含有無巖藻糖基化的單體抗體的植物細(xì)胞、植物愈傷組織、小植株、全株植物或者種子。在一個實施方案中，該植物是玉米植物。在另一實施方案中，該抗體位于種子的胚乳中。在不同的實施方案中，該抗體是人抗體。在優(yōu)選實施方案中，該抗體含有包含SEQ ID NO6的氨基酸序列的重鏈。在另一優(yōu)選實施方案中，該抗體含有包含SEQ ID NO14的氨基酸序列的輕鏈。在高度優(yōu)選的實施方案中，重鏈缺少尾片。在另一優(yōu)選實施方案中，該抗體是IgA抗體。在高度優(yōu)選的實施方案中，該抗體是抗-單純皰疹病毒抗體。
本發(fā)明的另一方面還包括經(jīng)分離的核酸分子，其含有編碼SEQ ID NO2或SEQ ID NO6所編碼的氨基酸序列的核酸序列；經(jīng)分離的核酸分子，其含有編碼SEQ ID NO10或SEQ ID NO14所編碼的氨基酸序列的核酸序列；含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO5的經(jīng)分離的核酸分子；和含有SEQ ID NO9或SEQ ID NO13的經(jīng)分離的核酸分子。
本發(fā)明的另一方面包括含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO5的分離的載體或者質(zhì)粒；和含有SEQ ID NO9或SEQ ID NO13的分離的載體或者質(zhì)粒。
本發(fā)明還包括抗體組合物，其含有選自
圖12中的結(jié)構(gòu)的兩種或多種不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中至少一種來自
圖12的所選的聚糖結(jié)構(gòu)無巖藻糖基化。
本發(fā)明還包括含有抗體組合物的植物材料，所述組合物含有選自
圖12中的結(jié)構(gòu)的兩種或多種不同的聚糖結(jié)構(gòu)，其中至少一種來自
圖12的所選聚糖結(jié)構(gòu)無巖藻糖基化。在一個實施方案中，該組合物從植物材料分離。在另一實施方案中，植物材料來自玉米。
本發(fā)明還包括含有至少一種具有
圖12中所列結(jié)構(gòu)1的結(jié)構(gòu)的聚糖的單體抗體組合物；含有至少一種具有
圖12中所列結(jié)構(gòu)2的結(jié)構(gòu)的聚糖的單體抗體組合物；和含有至少一種具有
圖16中所列結(jié)構(gòu)1的結(jié)構(gòu)的聚糖和至少一種具有
圖16中所列結(jié)構(gòu)2的結(jié)構(gòu)的聚糖的單體抗體組合物。
本發(fā)明還包括含有單體抗體組合物的植物愈傷組織、小植株、全株植物或者種子，其中該單體抗體組合物是含有至少一種具有
圖12中所列結(jié)構(gòu)1的結(jié)構(gòu)的聚糖的單體抗體組合物；含有至少一種具有
圖12中所列結(jié)構(gòu)2的結(jié)構(gòu)的聚糖的單體抗體組合物；或者含有至少一種具有
圖16中所列結(jié)構(gòu)1的結(jié)構(gòu)的聚糖和至少一種具有
圖16中所列結(jié)構(gòu)2的結(jié)構(gòu)的聚糖的單體抗體組合物。
本發(fā)明還包括通過如下方法產(chǎn)生的經(jīng)分離的無巖藻糖基化單體抗-單純皰疹病毒抗體，所述方法包括(i)向植物細(xì)胞導(dǎo)入具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO5和SEQ ID NO9或SEQ ID NO13的核酸，其中每一核酸都與啟動子有效連接；(ii)培養(yǎng)該植物細(xì)胞以表達(dá)所導(dǎo)入的核酸；和(iii)分離該植物細(xì)胞產(chǎn)生的無巖藻糖基化單體抗-單純皰疹病毒抗體。本發(fā)明還包括產(chǎn)生分離的無巖藻糖基化單體抗-單純皰疹病毒抗體的方法，該方法包括(i)向植物細(xì)胞導(dǎo)入具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO5和SEQ ID NO9或SEQ ID NO13的核酸，其中每一核酸都與啟動子有效連接；(ii)培養(yǎng)該植物細(xì)胞以表達(dá)所導(dǎo)入的核酸；和(iii)分離該植物細(xì)胞產(chǎn)生的無巖藻糖基化單體抗-單純皰疹病毒抗體。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案包括含有選自SEQ ID NO15(pDAB635)、SEQ ID NO16(pDAB16)、SEQ ID NO17(pDAB637)、SEQ ID NO84(pDAB3014)和SEQ ID NO85(pDAB8505)的核酸序列的核酸分子。
本發(fā)明還涉及產(chǎn)生表達(dá)無巖藻糖基化的抗體的經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的方法，該方法包括向植物細(xì)胞導(dǎo)入含有編碼免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的核酸序列的單一載體，并培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以產(chǎn)生表達(dá)無巖藻糖基化的抗體的植物。在一個實施方案中，從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物。在優(yōu)選實施方案中，載體是pDAB8505。
II.在植物中產(chǎn)生IgA的背景A.適于應(yīng)用的IgA的實例本發(fā)明的方法中可以使用任何IgA抗體。IgA是在人血漿中發(fā)現(xiàn)的免疫球蛋白。其是漿粘液分泌物中的主要免疫球蛋白并且與外部身體表面抵抗微生物侵襲的防御作用有關(guān)。
免疫球蛋白A(IgA)是眾所周知的并且已被表征，包括它們的核酸和氨基酸序列?？捎糜诒景l(fā)明的組合物和方法中的IgA免疫球蛋白的實例包括但不限于下面的識別溶組織內(nèi)阿米巴(Entamoeba histolytiea)抗原的人分泌性IgA抗體(Carrero等人，Parasitol Res.86(4)330-4(2000))；轉(zhuǎn)化生長因子-β-可誘導(dǎo)的小鼠種系Igα恒定區(qū)基因(Zhang等人，J Biol Chem.275(22)16979-85(2000))；實體器官移植物受者中針對人巨細(xì)胞病毒的免疫球蛋白A(IgA)和IgM抗體(Eing等人，Clin Diagn Lab Immunol.6(4)621-3(1999))；缺血后腎排出的分泌性IgA(Rice等人，Am J Physiol.276(5Pt 2)F666-73(1999))；Calu-3氣道上皮細(xì)胞釋放的分泌性免疫球蛋白A(Loman等人，Immunology.96(4)537-43(1999))；HBsAg慢性攜帶者的血清中特異IgA(Elsana等人，J Hum Virol.1(1)52-7(1997))；抗鼠弓形體(Toxoplasma gondii)IgA抗體(Ronday等人，Am J Ophthalmol.127(3)294-300(1999))；來自人奶的分泌性免疫球蛋白A(Kit等人，Biochemistry(Mosc).64(1)40-6(1999))；活動性結(jié)核病的診斷中的抗-Kp 90 IgA抗體(Arikan等人，Chest.114(5)1253-7(1998))；從有袋動物鼠形短尾負(fù)鼠(Monodelphis domestica)克隆的IgA(Aveskogh等人，EurJ Immunol.28(9)2738-50(1998))；腹膜B-1細(xì)胞中種系和全長IgA RNA轉(zhuǎn)錄物(deWaard等人，Dev Immunol.6(1-2)81-7(1998))；和來自有袋動物刷尾負(fù)鼠(Trichosurus vulpecula)(通常為brushtail possum)的免疫球蛋白A重鏈的恒定區(qū)(Cα)(Belov等人，Immunol Lett.60(2-3)165-70(1998).Erratum inImmunol Lett 63(3)175-6(1998))。
B.單純皰疹病毒(HSV)單純皰疹指1型(HSV1)和2型(HSV2)皰疹病毒導(dǎo)致的各種感染。單純皰疹病毒亞型1和2(HSV-1，HSV-2)是人類遇到的最通常的感染物中的皰疹病毒。1型感染最通常的標(biāo)記是在唇的唇紅緣上或者外鼻孔處長出一組或多組小皰，在生殖器上也發(fā)生損傷。2型的特征是生殖器上的這些損傷，而在唇的唇紅緣上或者外鼻孔處常常發(fā)生損傷。所述病毒常潛伏并且可以數(shù)年不表達(dá)。
這些病毒導(dǎo)致多種疾病，這些疾病從相對無關(guān)緊要的令人討厭的感染，如復(fù)發(fā)型單純皰疹唇皰疹，到嚴(yán)重的和威脅生命的疾病，如較大兒童和成年人的單純皰疹腦炎(HSE)，或者新生兒的彌散性感染。皰疹感染的臨床結(jié)果取決于早期診斷和抗病毒治療的快速啟動。然而，盡管有一些成功的治療，但是真皮和表皮病變復(fù)發(fā)，并且新生兒的HSV感染和腦的感染與高發(fā)病率和死亡率相關(guān)。非常需要改進(jìn)的治療。
單純皰疹病毒-1的示例性株系包括，但不限于HSV-1716、HSV-3410、HSV-3616、HSV-R3616、HSV-R47、HSV-G207、HSV-7020、HSV-NVR10、HSV-G92A、HSV-3616-IL-4、和HSV-hrR3。單純皰疹病毒-2的示例性株系包括，但不限于株系2701、株系2616、株系2604。美國專利號6,156,313提供了靶定并中和1型和2型單純皰疹病毒的抗體的重鏈可變區(qū)序列的氨基酸殘基序列(’313專利的SEQ ID NO2)以及編碼重鏈CDR3氨基酸序列的核酸序列(’313專利的SEQ ID NO1)。
C.抗-HSV抗體的制劑本發(fā)明的抗-HSV抗體在植物中產(chǎn)生，至少經(jīng)部分純化，并且可以制備成局部應(yīng)用制劑。本發(fā)明的抗-HSV抗體可用于治療陸生哺乳動物的皮膚，所述哺乳動物包括例如人、馴養(yǎng)的寵物、牲畜和其他農(nóng)場動物。本發(fā)明的抗-HSV抗體的優(yōu)選用途是防止HSV的傳播。
對于這種治療，可以將本發(fā)明的化合物配制以用于多種施用途徑，包括全身性和局部或者局域施用。技術(shù)和制劑通?？梢栽赗emington′sPharmaceutical Sciences，Meade Publishing Co.，Easton，PA中發(fā)現(xiàn)，此處將完整引用該文獻(xiàn)。對于全身性施用，優(yōu)選注射，包括肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)，和皮下。對于注射，本發(fā)明的化合物可以在液體溶液，優(yōu)選在生理學(xué)相容的緩沖劑如Hank氏溶液中配制(Hank氏溶液磷酸鉀0.44mM，氯化鉀5.37mM，磷酸氫二鈉0.34mM 136.89，氯化鈉mM，D-葡萄糖5.55mM。該試劑備用。經(jīng)稀釋的Hank氏鹽溶液的pH為6.7±0.2。可向該溶液加入碳酸氫鈉(0.35g/L)，可以用1N HCl或者1N NaOH調(diào)節(jié)該溶液的pH)。此外，該化合物可以配制為固體形式并且在臨使用前再溶解或者懸浮。還包括凍干的形式。
在本發(fā)明的優(yōu)選實踐中，本發(fā)明的抗-HSV抗體可以作為藥學(xué)上可接受的局部施用制劑中的活性成分施用。局部制劑(包括用于透皮藥物釋放的那些局部制劑)是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的并且適于在本發(fā)明中應(yīng)用于皮膚。適于局部或者鼻內(nèi)應(yīng)用的制劑包括含有活性成分和多種載體和賦形劑的軟膏劑、滴劑、霜劑、溶液劑、酊劑、洗劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑、氣溶膠和油。這些制劑可以含有或者不含有賦形劑或載體，盡管賦形劑或載體的使用是優(yōu)選的。用于這些制劑的適宜的載體包括石油凝膠、羊毛脂、聚乙二醇、醇和它們的組合。優(yōu)選的賦形劑是非-脂質(zhì)賦形劑，特別是水-可混溶的液體或者液體的混合物。實例為甲醇、乙醇、異丙醇、乙二醇、丙二醇，和丁二醇，和這些化合物的兩種或多種的混合物?；钚猿煞滞ǔＲ?.1到15％w/w的濃度存在于這些制劑中。
可以通過任何適宜的方法制備諸如此處討論的制劑，通常通過將活性化合物與液體或者細(xì)分的固體載體或者兩者以所需要的比例均勻并緊密混合，然后，如果需要，將所得混合物成型成所希望的性狀進(jìn)行制備。
例如，通過將含有活性成分的粉末或顆粒和一種或多種任選成分，如粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑，或者表面活性分散劑壓制成緊密混合物或者通過將粉狀活性成分和惰性液體稀釋劑的緊密混合物成型，可以制備片劑。
局部半固體軟膏制劑通常含有載體如藥用霜劑基質(zhì)中的濃度為約1到20％，例如5到10％的活性成分，但是該濃度可以在該范圍外變動。任何給定情況中的最佳量將對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的或者能夠通過常規(guī)實驗確定。
含有本發(fā)明的抗-HSV抗體的局部制劑可以被配制成洗劑、溶液劑、凝膠劑、霜劑、潤滑霜劑、油膏劑、噴霧劑或者允許局部應(yīng)用的任何其他形式。該制劑可以還含有一種或多種促進(jìn)制劑在受影響的區(qū)域擴散但是是生物學(xué)上無活性的藥劑。這些藥劑的實例為表面活性劑、保濕劑、濕潤劑、乳化劑或者拋射劑。
本發(fā)明的抗-HSV抗體還可以與其他分子、分子結(jié)構(gòu)或者化合物的混合物混合、包囊化、綴合或者結(jié)合，例如，形成脂質(zhì)體、受體靶定分子、口服、直腸、局部制劑或者其他制劑，以幫助攝入、分布和/或吸收。教導(dǎo)這種攝入、分布和/或吸收輔助制劑的制備的代表性美國專利包括，但不限于，美國專利號5,108,921、5,354,844、5,416,016、5,459,127、5,521,291、5,543,158、5,547,932、5,583,020、5,591,721、4,426,330、4,534,899、5,013,556、5,108,921、5,213,804、5,227,170、5,264,221、5,356,633、5,395,619、5,416,016、5,417,978、5,462,854、5,469,854、5,512,295、5,527,528、5,534,259、5,543,152、5,556,948、5,580,575、和5,595,756，這些專利的每一篇都在這里完整引用作為參考。
施用的最佳方法和頻率將對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的或者能夠通過常規(guī)實驗確定。通過在受侵襲的部位，或者希望實現(xiàn)所希望的效果的部位局部應(yīng)用一薄層可以在多數(shù)情況下實現(xiàn)有效結(jié)果。根據(jù)所處理的病癥、其階段或者程度，和是否為了治療或者預(yù)防原因而應(yīng)用，使用每2或3天應(yīng)用一次至每天應(yīng)用4或更多次的施用速率可以實現(xiàn)有效結(jié)果。
如果希望，組合物可以存在于包裝或者分配裝置中，其中可以含有一個或多個含有活性成分的單位劑型。該包裝可以例如含有金屬或者塑料箔，如.泡罩包裝。該包裝或者分配裝置可以附帶使用說明書。
D.抗-HSV抗體的SEQ ID Nos總結(jié)表
E.從植物分離的抗-HSV重鏈、輕鏈和單體IgA抗體的氨基酸序列本發(fā)明提供了抗-HSV抗體的重鏈、輕鏈和單體IgA的多肽，其中這些多肽從植物分離。
本文中，“蛋白質(zhì)”或者“多肽”部分地指具有SEQ ID NOs2、4、6、8、10、12、和14中描述的氨基酸序列的氨基酸。該術(shù)語還指具有與SEQID NOs2、4、6、8、10、12、和14中具體提供的氨基酸序列稍微不同的氨基酸序列的天然等位變體和蛋白質(zhì)。等位變體盡管具有與此處所述的氨基酸序列稍微不同的氨基酸序列，但是仍然具有與這些蛋白質(zhì)相同或者相似的生物學(xué)功能。
本文中，與具有SEQ ID NOs2、4、6、8、10、12、和14的氨基酸序列相關(guān)的蛋白質(zhì)家族指從人及其它生物分離的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的抗-HSV抗體多肽優(yōu)選為分離的形式。本文中，當(dāng)用物理的、機械的或者化學(xué)方法將蛋白質(zhì)從通常與該蛋白質(zhì)相關(guān)的細(xì)胞組分中分離出來時，說該多肽是分離的。技術(shù)人員可以容易地使用標(biāo)準(zhǔn)純化方法得到分離的蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)還包括SEQ ID NOs2、4、6、8、10、12、和14的插入、缺失或者保守氨基酸置換變體。本文中，保守變體指氨基酸序列中不會不利地影響該蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能的改變。當(dāng)經(jīng)改變的序列防止或者破壞與蛋白質(zhì)相關(guān)的生物學(xué)功能時，即認(rèn)為置換、插入或者缺失不利地影響該蛋白質(zhì)。例如，在某些情況中，可以改變蛋白質(zhì)的總體電荷、結(jié)構(gòu)或者疏水/親水性質(zhì)而不會不利地影響生物學(xué)活性。因此，例如，可以改變氨基酸序列以使得該肽更疏水或者親水，而不會不利地影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性。
通常，等位變體、保守置換變體、和蛋白質(zhì)家族的成員的氨基酸序列與SEQ ID NOs2、4、6、8、10、12、和14中所示序列具有至少約50％、60％、70％、或75％氨基酸序列同一性；更優(yōu)選地，至少約80％；甚至更優(yōu)選至少約90-95％；最優(yōu)選至少約99或99.5％序列同一性。關(guān)于這些序列的同一性或者同源性在本文中被定義為候選序列中與SEQ ID NOs2、4、6、8、10、12、和14相同的氨基酸殘基的百分?jǐn)?shù)，該百分?jǐn)?shù)是通過比對序列和導(dǎo)入缺口(如果需要)以實現(xiàn)最大百分?jǐn)?shù)同源性后獲得的，此時不將任何保守置換考慮為序列同一性的部分。融合蛋白、或者肽序列的N-末端、C-末端或者內(nèi)部延伸、缺失或者插入將不應(yīng)理解為影響同源性。
從而，本發(fā)明的蛋白質(zhì)包括具有SEQ ID NOs2、4、6、8、10、12、和14中公開的氨基酸序列的分子；具有這些蛋白質(zhì)的至少約3、4、5、6、10、15、20、25、30、35或更多個氨基酸殘基的連續(xù)序列片段；氨基酸序列變體，其中一個或多個氨基酸殘基已經(jīng)被插入所公開的編碼序列的N-或C-末端或者內(nèi)部；和已經(jīng)發(fā)生至少一個殘基的置換的所公開序列的氨基酸序列變體，或者它們的如上定義的片段。這些片段，也稱作肽或者多肽，可以含有抗原區(qū)，蛋白質(zhì)的功能區(qū)(被鑒定為相應(yīng)于已知蛋白質(zhì)域的氨基酸序列區(qū)域)，以及具有明顯的親水性的區(qū)域。這些區(qū)域都可以通過使用通常可得到的蛋白質(zhì)序列分析軟件，如Mac Vector(Oxford Molecular)容易地鑒定?？捎糜诒景l(fā)明的實踐中的其他蛋白質(zhì)分析軟件是本領(lǐng)域中公知的。
預(yù)期的變體還包括含有通過例如同源重組、定點誘變或者PCR誘變產(chǎn)生的預(yù)定突變的那些變體，和其他動物物種的相應(yīng)蛋白質(zhì)(所述物種包括但不限于兔、小鼠、大鼠、豬、牛、綿羊、馬和非人-靈長類物種)，以及HSV-相關(guān)蛋白質(zhì)家族的等位變體或者其他天然發(fā)生的變體；和衍生物，其中蛋白質(zhì)通過用非天然氨基酸的部分(例如，可檢測的部分，如酶或者放射性同位素)以取代方式、化學(xué)的、酶的或其它適宜的方式進(jìn)行共價修飾。
本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽和稀釋劑的組合物。適宜的稀釋劑可以是水性或非水性溶劑或者它們的組合，并且可以含有有助于該蛋白質(zhì)或者多肽的穩(wěn)定性、溶解性、活性和/或保存的額外組分，例如，水可溶的鹽或者甘油。
E.抗-HSV重鏈、輕鏈和單體IgA抗體的核酸序列本發(fā)明利用編碼抗-HSV抗體的重鏈(SEQID NOs.1和5)和輕鏈(SEQID NOs.9和13)和此處描述的相關(guān)多肽的核酸分子，該核酸分子優(yōu)選為分離的形式。
本文中，“核酸”被定義為RNA或者DNA，其編碼此處定義的蛋白質(zhì)或肽，與編碼這些肽的核酸序列互補，與SEQ ID NOs1、3、5、7、9、11和13的核酸雜交并在適宜的嚴(yán)格條件下保持與其穩(wěn)定雜交，編碼與SEQID NOs1、3、5、7、9、11和13的肽序列具有至少約50％、60％、70％或75％，優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約85％，最優(yōu)選至少約90％、95％、98％、99％、99.5％或以上的同一性的多肽，或者顯示出與SEQ ID NOs1、3、5、7、9、11和13的可讀框有至少約50％、60％、70％或75％，優(yōu)選至少約80％，更優(yōu)選至少約85％，甚至更優(yōu)選至少約90％、95％、98％、99％、99.5％或以上的核苷酸序列同一性。
本發(fā)明還包括經(jīng)分離的核酸分子，其與SEQ ID NOs1、3、5、7、9、11和13的互補序列特異雜交，尤其是與可讀框特異雜交。與SEQ ID NOs1、3、5、7、9、11和13的互補序列特異雜交的這些分子通常在嚴(yán)格雜交條件下雜交，這些條件在下面描述。
特別考慮基因組DNA、cDNA、mRNA和反義分子，以及基于可選主鏈或者包括可選堿基的核酸，而不論它們是來自天然來源的或者是合成的。
通過BLAST(基本局部比對搜索工具)分析，使用程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx所用的算法，確定核苷酸或者氨基酸序列水平上的同源性或者同一性。見，例如，Altschul等人，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997)和Karlin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268(1990)，引用這兩篇文獻(xiàn)的全文作為參考，它們適用于序列相似性搜索。BLAST程序所用的方法首先考慮查詢序列和數(shù)據(jù)庫序列之間的相似片段(有和沒有缺口)，然后評估所鑒定的所有匹配的統(tǒng)計學(xué)顯著性，最后僅總結(jié)滿足預(yù)先選擇的顯著性閾值的那些匹配。關(guān)于序列數(shù)據(jù)庫的相似性搜索的基本問題的討論，見，例如，Altschul等人，Nat.Genet.6119-129(1994)，將其完整引用作為參考。用于直方圖、描述、比對、期望值(即，用于報導(dǎo)相對于數(shù)據(jù)庫序列的匹配的統(tǒng)計學(xué)顯著性閾值)、截斷值、矩陣和過濾器(filter)(低復(fù)雜性)的檢索參數(shù)都為默認(rèn)設(shè)置。Blastp、blastx、tblastn、和tblastx的默認(rèn)得分矩陣是BLOSUM62矩陣(見，例如，Henikoff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919(1992)，將其完整并入作為參考)，BLOSUM62矩陣是對于長度超過85個核苷酸或者氨基酸的查詢序列所推薦的矩陣。
對于blastn，得分矩陣由M(即，一對匹配殘基的獎勵得分)與N(即，錯配殘基的罰分)的比值設(shè)定，其中M和N的默認(rèn)值分別是5和-4。如下調(diào)節(jié)四種blastn參數(shù)Q＝10(缺口產(chǎn)生罰分)；R＝10(缺口延伸罰分)；wink＝1(沿著查詢序列，每第winkth個位置產(chǎn)生字命中)；和gapw＝16(設(shè)定窗口寬度，在該窗口寬度內(nèi)產(chǎn)生帶缺口的比對)。等價Blastp參數(shù)設(shè)置為Q＝9；R＝2；wink＝1；和gapw＝32。序列之間的Bestfit比較(可以在GCG包版本10.0中得到)使用DNA參數(shù)GAP＝50(缺口產(chǎn)生罰分)和LEN＝3(缺口延伸罰分)并且蛋白質(zhì)比較中的等價設(shè)置為GAP＝8和LEN＝2。
“嚴(yán)格條件”為(1)用低離子強度和高溫進(jìn)行洗滌，例如，0.015MNaCl/0.0015 M檸檬酸鈉/0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)，50℃，或者(2)在雜交期間使用變性劑如甲酰胺，例如，50％(體積/體積)甲酰胺與0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液，pH6.5與750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉，42℃。另一實例是在50％甲酰胺，5x SSC溶液(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8)，0.1％焦磷酸鈉，5x Denhardt溶液(50X Denhards試劑1％(w/v)Ficoll400，1％(w/V)聚乙烯吡咯烷酮，1％(w/v)牛血清白蛋白(Sigma，F(xiàn)ractionV))，超聲處理的鮭精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸葡聚糖，42℃下雜交，42℃下在0.2×SSC溶液和0.1％SDS中洗滌。技術(shù)人員可容易地確定并適當(dāng)改變嚴(yán)格條件以得到清晰并且可以檢測的雜交信號。優(yōu)選的分子是在上面的條件下與SEQ ID NOs1、3、5、7、9、11和13的互補序列雜交并且編碼功能或者全長蛋白質(zhì)的分子。甚至更優(yōu)選的雜交分子是在上面的條件下與SEQ ID NOs1、3、5、7、9、11和13的可讀框的互補鏈雜交的那些分子。
本文中，當(dāng)核酸分子基本上與編碼其他多肽的污染性核酸分子分離時，說該核酸分子是“分離的”。
本發(fā)明還利用所公開的核酸分子的片段。本文中，核酸分子的片段指編碼或者非-編碼序列的小部分。由預(yù)期的用途確定該片段的大小。如果該片段將用作核酸探針或者PCR引物，那么選擇片段長度以在探測/引發(fā)期間得到相對小數(shù)目的假陽性。如果選擇片段以編碼所述蛋白質(zhì)的活性部分，那么該片段將足夠大以編碼該蛋白質(zhì)的功能區(qū)。例如，可以制備編碼相應(yīng)于所預(yù)測的抗原區(qū)的肽的片段。例如，本發(fā)明利用編碼(美國專利號6,156,313的SEQ ID NO1所提供的)克隆FabHSV8的重鏈CDR3區(qū)氨基酸序列的片段(本文中示為SEQ ID NO18)。此外，本發(fā)明利用如下人單克隆抗體，其能中和1型和2型HSV，結(jié)合糖蛋白D上存在的表位，具有ATCC69522產(chǎn)生的Fab片段的結(jié)合特異性，具有含美國專利號6,156,313提供的SEQ ID NO2的CDR3的重鏈(此處為SEQ ID NO19)。
用作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的特異引物或者探針或者用于合成編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因序列的本發(fā)明核酸分子的片段(即，合成的寡核苷酸)可以通過化學(xué)技術(shù)，例如，Matteucci等人(J.Am.Chem.Soc.1033185-3191(1981)的亞磷酰胺方法或者使用自動化合成方法容易地合成。此外，通過眾所周知的方法，如合成一組寡核苷酸--它們分別限定基因的多個不同模塊片段，然后連接寡核苷酸以構(gòu)建完整的經(jīng)修飾的基因，可以容易的制備更大的DNA片段。
可以進(jìn)一步修飾本發(fā)明的核酸分子以便含有用于診斷和探測目的的可檢測標(biāo)記。多種這樣的標(biāo)記是本領(lǐng)域中公知的并且可容易地用于此處描述的編碼分子。適宜的標(biāo)記包括，但不限于，生物素、放射標(biāo)記或者熒光標(biāo)記的核苷酸，等等。技術(shù)人員可以容易地使用任一種這樣的標(biāo)記以得到本發(fā)明的核酸分子的經(jīng)標(biāo)記的變體。
II.在植物中產(chǎn)生IgG的背景A.可利用的適宜的IgG的實例本發(fā)明的方法中可以使用任何IgG抗體。IgG是人血漿和其他內(nèi)部體液中的主要免疫球蛋白。其還是最通常見到的骨髓瘤蛋白質(zhì)。來自人蛋白質(zhì)的一種稱作Eu的骨髓瘤蛋白質(zhì)是被完全測序的第一個免疫球蛋白(Edelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 6378(1969))。
免疫球蛋白G(IgG)蛋白質(zhì)是眾所周知的并且已被表征，包括它們的核酸和氨基酸序列?？捎糜诒景l(fā)明的組合物和方法中的IgG免疫球蛋白的實例包括但不限于下面的與血小板和內(nèi)皮細(xì)胞的整聯(lián)蛋白β3上的不同表位反應(yīng)的人抗體(Jallu等人，Eur J Biochem.222(3)743-51(1994))；高親和性重組人IgG1抗-RhD抗體(Miescher等人，Br J Haematol.111(1)157-66(2000))；針對結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)的EF-Tu的滑液IgG(Adachi等人，J Dent Res.79(10)1752-7(2000))；結(jié)合到HIV-1感染者的內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒抗原(Lawoko等人，J Med Virol.62(4)435-44(2000))；1型人免疫缺陷病毒的免疫球蛋白G抗體(Hashinaka等人，ClinDiagn Lab Immunol.(6)967-76(2000))；重組人CCR5-特異抗體(Steinberger等人，J Biol Chem.275(46)36073-8(2000))；編碼南極硬骨魚Trematomus berncchii的免疫球蛋白重鏈的cDNA序列(Coscia等人，F(xiàn)ish Shellfish Immunol.10(4)343-57(2000))；轉(zhuǎn)染到淋巴樣細(xì)胞中的免疫球蛋白重鏈基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)(Neuberger，EMBO J.2(8)1373-8(1983))；參與Androctonus australis Hector蝎子毒液的中和的鼠單克隆IgG(Devaux等人，Eur J Biochem.268(3)694-702(2001))；人源化L243IgG1的截斷形式(Lund等人，Eur J Biochem.267(24)7246-57.(2000))；畢赤巴斯德酵母(Pichia pastoris)中單鏈Fv-Fc融合物(Powers等人，JImmunol Methods.1；251(1-2)123-35(2001))；CRMP-5特異的免疫球蛋白G(IgG)自身抗體(Yu等人，Ann Neurol.49(2)146-54(2001))；馬來布魯線蟲(Brugia malayi)感染的恒河猴中對Wolbachia表面蛋白質(zhì)特異的IgG抗體(Punkosdy等人，J Infect Dis.184(3)385-9.Epub 2001 Jul 03(2001))；人IgG單克隆抗-α(IIb)β(3)-結(jié)合片段(Jacobin等人，J.Immunol.168(4)，2035-2045(2002))；系統(tǒng)性硬化癥免疫球蛋白G自身抗體(Lunardi等人，Nat Med.6(10)1183-6(2000))；對亮氨酸-33(P1A1，HPA-la)特異的人單克隆抗體(Griffin等人，Blood.15；86(12)4430-6(1995))；人源化抗-CD18鼠免疫球蛋白G(Ipp等人，Arch BiochemBiophys.308(2)387-99(1994)；和針對GPIIbα(300-312)的抗體(Taylor等人，Proc Soc Exp Biol Med.205(1)35-43(1994))。
B.整聯(lián)蛋白整聯(lián)蛋白受體(也稱作整聯(lián)蛋白)是介導(dǎo)多種生理背景中細(xì)胞粘著細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞識別和跨膜應(yīng)答的一類分子(Clarke等人，Science 2851028-1032(1995))。已經(jīng)證明整聯(lián)蛋白αVβ3和αVβ5與新血管生長密切相關(guān)。這些整聯(lián)蛋白的每一種結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)中的特定分子αVβ3結(jié)合玻連蛋白加上其他細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)，包括血纖蛋白原；αVβ5是玻連蛋白受體。抗-整聯(lián)蛋白αVβ3/αVβ5抗體的主要醫(yī)學(xué)靶標(biāo)是腫瘤的血管募集(“腫瘤血管生成”)。在血管生成期間，血管內(nèi)皮細(xì)胞離開原來的血管并形成新的小管，其將發(fā)育成毛細(xì)管。當(dāng)該過程正常前進(jìn)時，結(jié)合血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)的αVβ5的玻連蛋白誘導(dǎo)αVβ3表達(dá)并通過信號級聯(lián)和相互作用促進(jìn)血管生成。結(jié)合內(nèi)皮αVβ3的玻連蛋白也抑制蛋白激酶A。當(dāng)抗-αVβ3阻斷了與玻連蛋白的結(jié)合時，蛋白激酶A干擾細(xì)胞從而血管發(fā)育、腫瘤細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移被抑制。在這些被抗體-阻斷的血管生成系統(tǒng)細(xì)胞中將發(fā)生細(xì)胞死亡。
針對αVβ3產(chǎn)生的抗體阻斷由堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)誘導(dǎo)的血管生成，而對αVβ5特異的抗體抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)誘導(dǎo)的血管生成(Eliceiri，等人，J.Clin.Invest.1031227-1230(1999)；Friedlander等人，Science 2701500-1502(1995))。除了上面討論的那些，可以用于本發(fā)明的組合物和方法中的整聯(lián)蛋白-相關(guān)免疫球蛋白的其他實例包括但不限于下面的針對整聯(lián)蛋白αIIbβ3(糖蛋白IIb-IHa)的配體-占據(jù)的構(gòu)象異構(gòu)體的單克隆抗體(Frelinger等人，J Biol Chem.266(26)17106-11(1991))；對血小板整聯(lián)蛋白IIb重鏈特異的人自身抗體2E7(Kunicki等人，J Autoimmun.(3)433-46(1991))；針對白細(xì)胞整聯(lián)蛋白的CD18組分的鼠單克隆抗體(Daugherty等人，Nucleic Acids Res.19(9)2471-6(1991))；抗整聯(lián)蛋白(α5β1)抗體(Fogerty等人，J Cell Biol.111(2)699-708(1990))；針對血小板GPIIb的單克隆抗體(Golino等人，JBiol Chem.265(16)9575-81(1990))；對人血小板糖蛋白IIb(整聯(lián)蛋白αIIb)特異的人單克隆自身抗體重鏈(Kunicki等人，Hum AntibodiesHybridomas1(2)83-95(1990))；對人血小板整聯(lián)蛋白gpHb/IIIa特異的人源化抗體(Co等人，J Immunol.15；152(6)2968-76(1994))；抗-整聯(lián)蛋白GPIIb-IIIa抗體中生物活性Arg-Gly-Asp構(gòu)象體(Prammer等人，Receptor.4(2)93-108(1994))；人源化抗-β1整聯(lián)蛋白鏈mAb(Poul等人，Mol Immunol.32(2)101-16(1995))；白細(xì)胞整聯(lián)蛋白淋巴細(xì)胞功能相關(guān)的抗原1(Holness等人，J Biol Chem.270(2)877-84(1995))；作為整聯(lián)蛋白的粘著配體的合成抗體(Smith等人，J Biol Chem.269(52)32788-95(1994))；血小板整聯(lián)蛋白αIIbβ3的單克隆抗體(Yano等人，J Biochem(Tokyo).116(4)778-86(1994))；對整聯(lián)蛋白αIIbβ特異的重組鼠Fab片段(Kunicki等人，J Biol Chem.270(28)16660-5(1995))；IgG抗-磷脂抗體與血小板糖蛋白IIIa(Tokita等人，Thromb Haemost.75(1)168-74(1996))；和特異結(jié)合糖蛋白IIb-IIIa上血小板HPA-1a同種抗原的人單克隆抗體Fab片段(Proulx等人，Vox Sang.72(1)52-60(1997))。
可用于本發(fā)明的組合物和方法中的抗-雙整聯(lián)蛋白抗體的實例包括但不限于美國專利申請?zhí)?003/0040044和國際公開的專利申請?zhí)朩O02/12501中公開的那些抗體。還見ATCC保藏號AX472604、AX472605、AX472606、AX472607、AX472608、和AX47209。
III.植物中產(chǎn)生IgA和IgG的一般背景A.含有核酸分子的重組DNA(rDNA)分子本發(fā)明還提供了含有編碼序列的重組DNA分子(rDNAs)。本文中，rDNA分子是已接受分子操作的DNA分子。產(chǎn)生rDNA分子的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，例如，見Sambrook等人，Molecular Cloning-ALaboratory Manual，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，NY，2001。在優(yōu)選的rDNA分子中，編碼DNA序列與表達(dá)控制序列和/或載體序列有效連接。
如本領(lǐng)域中眾所周知的，與本發(fā)明的蛋白質(zhì)家族編碼序列有效連接的載體和/或表達(dá)控制序列的選擇直接取決于所希望的功能性質(zhì)，例如，蛋白質(zhì)表達(dá)，和所要轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明所考慮的載體至少能夠指導(dǎo)rDNA分子中所包括的結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行復(fù)制或者插入宿主染色體中，和優(yōu)選地表達(dá)。
用于調(diào)節(jié)有效連接的蛋白質(zhì)編碼序列的表達(dá)的表達(dá)控制元件是本領(lǐng)域中公知的并且包括，但不限于誘導(dǎo)型啟動子、組成性啟動子、分泌信號，和其他調(diào)節(jié)元件。優(yōu)選地，誘導(dǎo)型啟動子容易受到控制，如對宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物產(chǎn)生應(yīng)答。
B.使用rDNA分子產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)本發(fā)明還提供了使用此處描述的核酸分子產(chǎn)生本發(fā)明的蛋白質(zhì)的方法。概括地，重組形式的蛋白質(zhì)的產(chǎn)生通常包括下面的步驟首先，得到編碼本發(fā)明的蛋白質(zhì)的核酸分子，如含有、組成基本為，或者組成為SEQ ID NO1或SEQ ID NO9的核酸分子。
如果編碼序列不被內(nèi)含子中斷，如這些可讀框一樣，那么該編碼序列直接適于在任何宿主中表達(dá)。
然后優(yōu)選將核酸分子與如上描述的適宜的控制序列有效連接，以形成含有蛋白質(zhì)可讀框的表達(dá)單位。用該表達(dá)單位轉(zhuǎn)化適宜的宿主并在允許產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化的宿主。任選地，從培養(yǎng)基或者細(xì)胞分離重組蛋白質(zhì)；在可以忍受一些雜質(zhì)的情況下，該蛋白質(zhì)的回收和純化可能是不必要的。
前面步驟的每一步都可以以多種方法進(jìn)行。例如，所希望的編碼序列可以從基因組片段得到并且直接用于適宜的宿主中。使用如上面提出的適宜的復(fù)制子和控制序列可以構(gòu)建在多種宿主中有效的表達(dá)載體?？刂菩蛄小⒈磉_(dá)載體、和轉(zhuǎn)化方法取決于用于表達(dá)基因的宿主細(xì)胞的類型并且在前面已詳細(xì)討論。適宜的限制位點如果不能正常得到，可以添加編碼序列的末端以便提供可切出的基因以便插入這些載體中。技術(shù)人員可容易的改造本領(lǐng)域中公知的任何宿主/表達(dá)系統(tǒng)以便適用于本發(fā)明的核酸分子以產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。
C.啟動子誘導(dǎo)型啟動子是這樣一種啟動子，其中RNA聚合酶結(jié)合和啟始的速度受到外部刺激的調(diào)節(jié)。這些刺激包括光、熱、無氧脅迫、營養(yǎng)條件的改變、代謝物的存在或不存在、配體的存在、微生物侵襲、創(chuàng)傷，等等。
病毒啟動子是具有與在病毒的5’末端發(fā)現(xiàn)的啟動子基本上相似的DNA序列的啟動子。例如，典型的病毒啟動子在編碼Huang等人，Cell27245(1981)描述的MMTV的p2I蛋白質(zhì)的基因的5’末端發(fā)現(xiàn)。
合成啟動子是化學(xué)合成而不是生物來源的啟動子。通常合成啟動子摻入序列改變，這些改變可以優(yōu)化RNA聚合酶啟動的效率。
組成性啟動子是在整個生物，如植物中啟動基因產(chǎn)物表達(dá)的啟動子。組成性啟動子的實例包括花椰菜花葉病毒35S和19S啟動子(例如，Poszkowski等人，EMBO J.32719(1989)；Odell等人，Nature 313810(1985))；和玉米泛素-1啟動子(例如，美國專利號5,510,474、5,614,399、6,020,190和6,054,574)。
時間上受調(diào)節(jié)的啟動子是這樣一種啟動子，其中RNA聚合酶結(jié)合和啟動的速度在發(fā)育期間的特定時間受到調(diào)節(jié)。時間上受調(diào)節(jié)的啟動子的實例在例如，Chua等人，Science，244174-181(1989)中給出。
空間上受調(diào)節(jié)的啟動子是這樣一種啟動子，其中RNA聚合酶結(jié)合和啟動的速度在生物的特定結(jié)構(gòu)，如葉子、莖、種子或者根中受到調(diào)節(jié)?？臻g上受調(diào)節(jié)的啟動子的實例在Chua等人，Science，244174-181(1989)中給出。這些組織特異的或者器官特異的啟動子是本領(lǐng)域中眾所周知的并且包括但不限于種子特異的啟動子、器官-原基特異的啟動子、莖-特異的啟動子、葉特異啟動子、葉肉-特異的啟動子(如光-可誘導(dǎo)的Rubisco啟動子)、根-特異的啟動子、塊莖-特異的啟動子、脈管組織特異的啟動子、雄蕊-選擇性啟動子、開裂區(qū)(dehiscence zone)特異的啟動子，等等。用于本發(fā)明的最優(yōu)選的啟動子將在種子、果實和塊莖中最具活性。
時空上受調(diào)節(jié)的啟動子是這樣一種啟動子，其中RNA聚合酶結(jié)合和啟動的速度在發(fā)育期間的特定時間在生物的特定結(jié)構(gòu)中受到調(diào)節(jié)。典型的時空上受調(diào)節(jié)的啟動子的實例是Chua等人，Science 244174-181(1989)描述的EPSP合酶-35S啟動子。
對于本發(fā)明，確定玉米胚乳是基因表達(dá)的靶標(biāo)組織，但本發(fā)明可用于在全株植物或者該植物的任何特定組織中表達(dá)所選的sIgA。玉米胚乳中基因表達(dá)確保了積累高水平的靶蛋白質(zhì)并簡化了蛋白質(zhì)的保存、運輸、提取和純化。在本發(fā)明的一個實施方案中，用胚乳-特異的啟動子驅(qū)動抗-HSV抗體的HC和LC的表達(dá)。
已經(jīng)詳細(xì)研究了種子-特異的基因的表達(dá)(見，例如，Goldberg等人，Cell 56149-160(1989)和Higgins等人，Ann.Rev.Plant Physiol.35191-221(1984)的綜述)。在Goldberg等人，Cell 56149-160(1989)和Thomas，Plant Cell 51401-1410(1993)中綜述了種子-特異的基因的啟動子分析。研究表明沒有其它植物基因比編碼種子貯藏蛋白的那些基因在空間表達(dá)上受到更密切的調(diào)節(jié)。
已經(jīng)從多種植物物種克隆了許多種子貯藏蛋白基因，并且詳細(xì)分析了它們的啟動子(Thomas，Plant Cell 51401-1410(1993))。當(dāng)前有種子貯藏蛋白基因在轉(zhuǎn)基因植物中種子-特異性表達(dá)的許多實例。見，例如，b-菜豆蛋白(Sengupta-Gopalan等人，Proc.Natl.Acad，Sci.USA 823320-3324(1985)；Hoffman等人，Plant Mol.Biol.11，717-729(1988))；蠶豆凝集素(Voelker等人，EMBO J.63571-3577(1987))；大豆凝集素(Okamuro等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 838240-8244(1986))；大豆Kunitz胰蛋白酶抑制劑(Perez-Grau等人，Plant Cell 1095-1109(1989))；大豆b-conglycinin(Beachy等人，EMBO J.43047-3053(1985)；豌豆球蛋白(Higgins等人，Plant Mol.Biol.11683-695(1988))；豌豆convicilin(Newbigin等人，Planta 180461-470(1990))；豌豆豆球蛋白(Shirsat等人，Mol.Gen.Genetics 215326-331(1989))；油籽油菜napin(Radke等人，Theor.Appl.Genet.75685-694(1988))；玉米18kD油質(zhì)蛋白(Lee等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA 8886181-6185(1991))；大麥b-大麥醇溶蛋白(Marris等人，Plant Mol.Biol.10359-366(1988)；小麥麥谷蛋白(Colot等人，EMBO J.63559-3564(1987))。關(guān)于種子特異的啟動子的其他來源，見，例如，美國專利號5,623,067；6,100,450；6,177,613；6,225,529；6,342,657和6,403,371；Knutzon等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892624(1992)；Bustos等人，EMBO J.101469(1991)，Lam和Chua，Science 248471(1991)；Stayton等人，Aust.J.Plant.Physiol.18507(1991)，完整引用這些文獻(xiàn)作為參考。此外，在嵌合基因構(gòu)建體中與異源編碼序列有效連接的種子特異的啟動子基因也在轉(zhuǎn)基因植物中保持它們的時間和空間表達(dá)模式。這些實例包括使用擬南芥(Arabidopsis thaliana)2S種子貯藏蛋白基因啟動子在擬南芥(Arabidopsis)和歐洲油菜(B.napus)種子中表達(dá)腦啡肽(見，例如，Vandekerckhove等人，Bio/Technology 7929-932(1989))；使用蠶豆凝集素和蠶豆b-菜豆蛋白啟動子表達(dá)螢光素酶(見，例如，Riggs等人，Plant Sci.6347-57(1989))；和使用小麥麥谷蛋白啟動子表達(dá)氯霉素乙?；D(zhuǎn)移酶(見，例如，Colot等人，EMBO J.63559-3564(1987))。
D.載體如本文別處提供的，本發(fā)明的一些實施方案使用表達(dá)單位(或者表達(dá)載體或者系統(tǒng))在植物中表達(dá)外源提供的核酸序列。產(chǎn)生用于植物中的表達(dá)單位/系統(tǒng)/載體的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的并且可易于改造用于本發(fā)明。技術(shù)人員按照本文中提供的概述可以容易地在本發(fā)明方法中使用任何適宜的植物/載體/表達(dá)系統(tǒng)。
使用本領(lǐng)域中公知的標(biāo)準(zhǔn)方法典型地將配子-特異啟動子、組成性啟動子(如CaMV或者Nos啟動子)、器官-特異啟動子(如來自番茄的E8啟動子)或者誘導(dǎo)型啟動子連接到蛋白質(zhì)或者反義編碼區(qū)。使用補充元件，如轉(zhuǎn)錄終止子和/或增強子元件可以進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)單位。
用于調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)表達(dá)的表達(dá)控制元件可以是通常發(fā)現(xiàn)與編碼序列相關(guān)的表達(dá)控制元件(同源表達(dá)元件)或者可以是異源表達(dá)控制元件。多種同源和異源表達(dá)控制元件是本領(lǐng)域中公知的并且可容易用于制備用于本發(fā)明的表達(dá)單位。
例如，轉(zhuǎn)錄起始區(qū)可以包括多種冠癭堿的起始區(qū)之一，如在根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefacians)的Ti質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)的章魚堿、甘露堿、胭脂堿等等。
也可以使用植物病毒啟動子，如花椰菜花葉病毒35S(CaMV 35S)啟動子，以控制植物中的基因表達(dá)。
還可以使用植物啟動子，如prolifera啟動子、果實-特異的啟動子、Ap3啟動子、熱休克啟動子、種子-特異的啟動子，等等。用于本發(fā)明的最優(yōu)選的啟動子將在種子、果實和塊莖中最具有活性。
從而，對于植物中的表達(dá)，表達(dá)單位除了含有蛋白質(zhì)序列將通常還含有植物啟動子區(qū)域、轉(zhuǎn)錄起始位點和轉(zhuǎn)錄終止序列。通常在表達(dá)單位的5’和3’末端處包括獨特限制酶位點以允許容易插入現(xiàn)有的載體。
在異源啟動子/結(jié)構(gòu)基因或翻譯組合的構(gòu)建中，啟動子距離異源轉(zhuǎn)錄起始位點的距離優(yōu)選與其在天然環(huán)境中距離轉(zhuǎn)錄起始位點的距離大約相同。然而，如本領(lǐng)域中公知的，該距離可以容許一定的變化而不造成啟動子功能喪失。
除了啟動子序列，表達(dá)盒還可以在結(jié)構(gòu)基因下游含有轉(zhuǎn)錄終止區(qū)以提供有效終止。終止區(qū)可以與啟動子序列從相同的基因得到或者可以從不同的基因得到。如果結(jié)構(gòu)基因編碼的mRNA將被有效加工，那么也通常將指導(dǎo)RNA多腺苷酸化的DNA序列加入載體構(gòu)建體中。多腺苷酸化序列包括，但不限于農(nóng)桿菌章魚堿信號(Gielen等，EMBO J 3835-846(1984))或胭脂堿合酶信號(Depicker等人，Mol.and Appl.Genet.1561-573(1982))。
所得表達(dá)單位連接到載體中或者經(jīng)構(gòu)建而包括在載體中，所述載體適于高等植物轉(zhuǎn)化。該載體典型地還含有可選擇的標(biāo)記基因，通過該標(biāo)記基因可以在培養(yǎng)中鑒定被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞?？梢允褂每股乜剐詷?biāo)記。這些標(biāo)記包括，但不限于，對G418、潮霉素、博來霉素、卡那霉素和慶大霉素的抗性。更優(yōu)選地，使用除草劑抗性標(biāo)記。見，例如，美國專利號5,879,903、5,637,489和5,276,268關(guān)于對膦絲菌素-丙氨酰-丙氨酸(PTT)的膦絲菌素(PTC)抗性。還見例如，美國專利號5,767,361、5,928,937和6,444,875關(guān)于對咪唑啉酮除草劑的乙酰羥酸合成酶(AHAS)抗性。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞后，含有載體的那些細(xì)胞將通過它們能夠在含有特定抗生素的培養(yǎng)基上生長的能力來鑒定。載體通常還包括但不限于細(xì)菌或者病毒來源的復(fù)制序列以允許載體在細(xì)菌或者噬菌體宿主中克隆，優(yōu)選包括寬宿主范圍的原核復(fù)制起點。還應(yīng)該包括用于細(xì)菌的選擇標(biāo)記以允許選擇具有所希望的構(gòu)建體的細(xì)菌細(xì)胞。適宜的原核選擇標(biāo)記還包括，但不限于，對抗生素如氨芐青霉素、卡那霉素或者四環(huán)素的抗性。
如本領(lǐng)域中公知的，載體中還可以存在編碼其它功能的其它DNA序列。例如，對于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，將還包括T-DNA序列以用于隨后轉(zhuǎn)移到植物染色體中。
本發(fā)明的序列也可以與各種其他核酸分子如已表達(dá)序列標(biāo)志(ESTs)、表位或者熒光蛋白標(biāo)記融合。
ESTs是基因片段，通常長300到400個核苷酸，從互補-DNA(cDNA)克隆的3’或者5’末端測序得到。通過法國和美國合作已經(jīng)產(chǎn)生了約30,000種擬南芥ESTs(Delseny等人，F(xiàn)EBS Lett.405(2)129-132(1997)；擬南芥數(shù)據(jù)庫，http://genome.www.stanford.edu/Arabidopsis)。關(guān)于分析從大EST數(shù)據(jù)庫獲得的基因表達(dá)模式，見，例如，M.R.Fannon，TIBTECH 14294-298(1996)的討論。
生物相容的熒光蛋白探針，尤其來自水母Aequorea victoria的自組裝綠色熒光蛋白(GFP)，已經(jīng)使細(xì)胞、分子和發(fā)育生物學(xué)中的研究發(fā)生了革命性變化，因為這些熒光蛋白探針使得可以觀察活細(xì)胞中的生物化學(xué)事件(見，例如，Murphy等人，Curr.Biol.7(11)870-876(1997)；Grebenok等人，Plant J.11(3)573-586(1997)；Chiu等人，Curr.Biol.6(3)325-330(1996)；和Plautz等人，Gene 173(1)83-87(1996)；和Sheen等人，Plant J.8(5)777-784(1995))。
已經(jīng)用定點誘變開發(fā)了經(jīng)密碼子修飾的更可溶的GFP形式，其被稱作可溶性-修飾的GFP(smGFP)。當(dāng)導(dǎo)入擬南芥屬植物中時，當(dāng)與經(jīng)密碼子修飾的GFP相比時觀察到更強的熒光，暗示smGFP由于可以以更多的可溶性功能形式存在而更“明亮”(Davis等人，Plant Mol.Biol.36(4)521-528(1998))。通過融合編碼GFP和β-葡糖醛酸酶(GUS)的基因，研究人員能夠產(chǎn)生一組雙功能報道分子構(gòu)建體，其經(jīng)優(yōu)化而用于植物(包括擬南芥)中的瞬時和穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)中。見，例如，Quaedvlieg等人，Plant Mol.Biol.37(4)715-727(1998)。
Berger等人(Dev.Biol.194(2)226-234(1998))報導(dǎo)了用于擬南芥下胚軸表皮細(xì)胞的GFP標(biāo)記系的分離。已經(jīng)用GFP-融合蛋白定位和表征了許多擬南芥基因，包括牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)(Zhu等人，Plant Mol.Biol.35(3)331-341(1997))。
E.使基因喪失能力可能希望使某些植物基因失效以便實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和/或通過該轉(zhuǎn)基因的表達(dá)而產(chǎn)生所希望的蛋白質(zhì)。例如，在本發(fā)明中，可能希望使轉(zhuǎn)基因植物天然的某些酶，例如，一種或多種特異植物轉(zhuǎn)移酶喪失能力。使基因喪失能力的方法是本領(lǐng)域中技術(shù)人員眾所周知的。
例如，一種有效的造成基因失效的修飾是在基因的開始導(dǎo)入單個核苷酸缺失，這將產(chǎn)生翻譯讀框移位。這種移碼將使該基因失效，導(dǎo)致不可表達(dá)的基因產(chǎn)物并從而通過該基因破壞功能蛋白質(zhì)生產(chǎn)。例如，如果未經(jīng)修飾的基因編碼蛋白酶，那么當(dāng)該蛋白酶基因的調(diào)節(jié)區(qū)或者編碼區(qū)被破壞時，則可以破壞通過該基因的蛋白酶產(chǎn)生。
除了通過缺失核苷酸導(dǎo)致轉(zhuǎn)變的讀框移位而使基因喪失能力外，通過技術(shù)人員眾所周知的其他技術(shù)也可以實現(xiàn)失效修飾，所述技術(shù)包括插入、置換、倒位或者顛換該基因DNA內(nèi)的核苷酸從而有效防止DNA所編碼的蛋白質(zhì)的形成。
本領(lǐng)域技術(shù)人員使用較不特異的方法也可以使基因喪失能力。較不特異的方法的實例是使用化學(xué)誘變劑，如羥胺或者亞硝基胍，或者使用輻射誘變劑，如γ輻射或者紫外輻射以隨機突變基因。這些突變株系偶然可含有失效的基因，從而，因任何一個或多個結(jié)構(gòu)域，這些基因不再能夠產(chǎn)生功能蛋白質(zhì)。通過常規(guī)篩選技術(shù)可以鑒定所希望的失效基因的存在。關(guān)于進(jìn)一步指導(dǎo)，見，例如，美國專利號5,759,538。
F.反義編碼載體如上面所討論的，可能希望抑制某些天然植物基因，如特異植物轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)，以便得到轉(zhuǎn)基因的表達(dá)和/或得到該轉(zhuǎn)基因所編碼的希望的蛋白質(zhì)。使用反義構(gòu)建體，包括原位產(chǎn)生反義序列用于抑制植物中表達(dá)的方法是本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員眾所周知的并且在例如美國專利號5,107,065、5,254,800、5,356,799、5,728,926、和6,184,439中描述。
可用于抑制植物中內(nèi)源基因的表達(dá)的其他方法也可以用于本方法中。例如，在雙鏈體基因的必需區(qū)域形成三螺旋可以用于該目的。允許設(shè)計適當(dāng)?shù)膯捂渽⑴c者的三鏈體密碼也是本領(lǐng)域中公知的(見，例如，H.E.Moser等人，Science 238645-650(1987)和M.Cooney等人，Science 241456-459(1988))。控制序列中含有一段嘌呤堿基的區(qū)域是尤其有吸引力的靶標(biāo)。在例如D.Praseuth等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 851349-1353(1988)中描述了三螺旋形成以及光交聯(lián)。
G轉(zhuǎn)化為了通過常規(guī)方法導(dǎo)入所希望的基因或者一組基因，需要兩種品系之間的有性雜交，然后在雜種后代和親本之一間反復(fù)回交，直到得到具有所希望的特征的植物。然而，該方法局限于可以有性雜交的植物，并且除了所希望的基因之外的基因也將被轉(zhuǎn)移。
重組DNA技術(shù)通過使植物遺傳學(xué)家可以鑒定并克隆編碼所希望的性狀，如對昆蟲害蟲的抗性的特定基因，并將這些基因?qū)胍呀?jīng)有用的植物品種，而允許植物研究人員繞過上述的限制。一旦外來基因?qū)胫参镏?，該植物就可以用于常?guī)植物育種方案(例如，系譜育種、單籽后裔(single-seed-descent)育種方案、正反反復(fù)選擇(reciprocal recurrentselection))以產(chǎn)生也含有目的基因的后代。
使用同源重組，可以將基因以定點方式導(dǎo)入。同源重組允許在內(nèi)源基因中進(jìn)行位點-特異修飾，從而可以糾正所遺傳或者獲得的突變，和/或可以工程化地將新的改變引入基因組中。植物中同源重組和定點整合在例如，美國專利號5,451,513、5,501,967和5,527,695中討論。
產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物的方法是本領(lǐng)域中普通技術(shù)人員眾所周知的。現(xiàn)在通過多種不同轉(zhuǎn)化方法可以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，這些方法包括，但不限于，電穿孔；顯微注射；微粒轟擊，也稱作微粒加速或者生物轟擊；病毒-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化；和農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。見，例如，美國專利號5,405,765；5,472,869；5,538,877；5,538,880；5,550,318；5,641,664；5,736,369和5,736369；Watson等人，Recombinant DNA，Scientific American Books(1992)；Hinchee等人，Bio/Tech.6915-922(1988)；McCabe等人，Bio/Tech.6923-926(1988)；Toriyama等人，Bio/Tech.61072-1074(1988)；Fromm等人，Bio/Tech.8833-839(1990)；Mullins等人，Bio/Tech.8833-839(1990)；Hiei等人，Plant Molecular Biology 35205-218(1997)；Ishida等人，Nature Biotechnology 14745-750(1996)；Zhang等人，MolecularBiotechnology 8223-231(1997)；Ku等人，Nature Biotechnology 1776-80(1999)；和，Raineri等人，Bio/Tech.833-38(1990))，這里特別將這些文獻(xiàn)的每一篇完整并入作為參考。
根癌農(nóng)桿菌是天然發(fā)生的細(xì)菌，其能夠?qū)⑵銬NA(遺傳信息)插入植物中，導(dǎo)致對該植物的一種稱作冠癭的損傷?，F(xiàn)在使用該方法可以轉(zhuǎn)化大多數(shù)植物物種，包括紫花苜蓿。見，例如，Wang等人，Australian Journalof Plant Physiology 23(3)265-270(1996)；Hoffman等人，MolecularPlant-Microbe Interactions 10(3)307-315(1997)；和，Trieu等人，PlantCell Reports 166-11(1996)。
微粒轟擊也稱作微粒加速、生物轟擊，和基因槍(BiolisticGene Gun)?；驑層糜趯⒒?例如，編碼所希望的性狀)包被的小粒射擊到植物種子或者植物組織中以便使得該植物細(xì)胞隨后能表達(dá)該新基因?；驑屖褂谜鎸嵉恼ㄋ?.22口徑空彈(blank))推動所述材料。經(jīng)壓縮的氣體或者蒸汽也可用作發(fā)射劑。Biolistic基因槍在1983-1984年由John Sanford，EdwardWolf，和Nelson Allen在Cornell Universtty發(fā)明。其和其注冊商標(biāo)現(xiàn)在由E.I.du Pont de Nemours and Company擁有。用該方法已經(jīng)轉(zhuǎn)化了大多數(shù)植物物種，包括紫花苜蓿(美國專利號5,324,646)和三葉草(Voisey等人，Biocontrol Science and Technology 4(4)475-481(1994)；Quesbenberry等人，Crop Science 36(4)1045-1048(1996)；Khan等人，Plant Physiology105(1)81-88(1994)；和，Voisey等人，Plant Cell Reports 13(6)309-314(1994))。
WHISKERSTM由ICI Seeds Inc.(Garst Seed Company)在1993年開發(fā)，是將DNA插入植物細(xì)胞的其他方法(例如，Biolistic基因槍、根癌農(nóng)桿菌、“鳥槍”(shotgun)法，等等)的替代方法；其由碳化硅的針狀晶體(“須晶(whiskers)”)組成。將這些纖維與植物細(xì)胞置于容器中，然后高速混合，導(dǎo)致晶體刺穿植物細(xì)胞壁，形成顯微“孔”(通道)。然后加入新DNA(基因)，這導(dǎo)致DNA流入植物細(xì)胞。然后植物細(xì)胞摻入新基因；從而它們被基因工程化。
WHISKERSTM技術(shù)的本質(zhì)是小的針狀碳化硅“須晶”(直徑0.6微米，長5-80微米)，其以下面的方式使用。將容納“轉(zhuǎn)化雞尾酒”的容器在牙科用汞齊混合器(dental amalgam mixer)或者顏料振蕩器(paint shaker)上劇烈混合或振蕩，該轉(zhuǎn)化雞尾酒由DNA(例如，農(nóng)藝學(xué)基因加可選擇的標(biāo)記基因)、胚性(embryogenic)玉米組織，和碳化硅“須晶”組成。胚性玉米細(xì)胞和尖銳的碳化硅“須晶”之間的隨后碰撞導(dǎo)致在植物細(xì)胞壁中產(chǎn)生小孔，推測DNA(農(nóng)藝學(xué)基因)將通過小孔進(jìn)入細(xì)胞。然后誘導(dǎo)接受和摻入新基因的那些細(xì)胞生長并最終發(fā)育成能育的轉(zhuǎn)基因植物。
碳化硅“須晶”轉(zhuǎn)化已經(jīng)在多種植物物種如玉米(Zea mays)中產(chǎn)生了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的愈傷組織和/或植物。見，例如，美國專利號5,302,523和5,464,765，在這里將它們完整并入作為參考；Frame等人，The Plant Journal 6941-948(1994)；Kaeppler等人，Plant Cell Reports 9415-418(1990)；Kaeppler等人，Theoretical and Applied Genetics 84560-566(1992)；Petolino等人，Plant Cell Reports 19(8)781-786(2000)；Thompson等人，Euphytica 8575-80(1995)；Wang等人，In Vitro Cellular andDevelopmental Biology 31101-104(1995)；Song等人，Plant Cell Reporter20948-954(2002)；Petolino等人，Molecular Methods of Plant Analysis，In Genetic Transformation of Plants，卷23，147-158頁，Springer-Verlag，Berlin(2003)。其他實例包括多花冬麥草(Lolium multiflorum)、Loliumperenne、葦狀羊茅(Festuca arundinacea)、葡莖剪股穎(Agrostisstolonifra)(Dalton等人，Plant Science 13231-43(1997))、稻(Oryzasativa)(Nagatani等人，Biotechnology Techniques 11471-473(1997))，和普通小麥(Triticum aestivum)和煙草(Nicotiana tobacum)(Kaeppler等人，Theoretical and Applied Genetics 84560-566(1992))。甚至衣藻(見，例如，Dunahay，T.G，Biotechniques 15452-460(1993))也可以用“須晶”方法轉(zhuǎn)化。隨著其當(dāng)前應(yīng)用于高等植物，“須晶”系統(tǒng)是轉(zhuǎn)化某些植物細(xì)胞的最簡單的方法之一。
用重組DNA方法學(xué)成功導(dǎo)入植物中的基因包括但不限于，編碼下面性狀的那些基因種子貯藏蛋白，包括經(jīng)修飾的7S豆類種子貯藏蛋白(見，例如，美國專利號5,508,468、5,559,223和5,576,203)；除草劑耐受性或者抗性(見，例如，De Greef等人，Bio/Technology 761(1989)；美國專利號4,940,835；美國專利號4,769,061；美國專利號4,975,374；Marshall等人(1992)Theor.Appl.Genet.83，435；美國專利號5,489,520；美國專利號5,498,544；美國專利號5,554,798；Powell等人，Science 232738-743(1986)；Kaniewski等人，Bio/Tech.8750-754(1990))；Day等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 886721-6725(1991))；肌醇六磷酸酶(見，例如，美國專利號5,593,963)；對細(xì)菌、真菌、線蟲和昆蟲害蟲的抗性，包括Bt基因賦予的對鱗翅目昆蟲的抗性(見，例如，美國專利號5,597,945和5,597,946；Johnson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，869871-9875(1989)；Perlak等人，BiolTech.8939-943(1990))；凝集素(美國專利號5,276,269)；花顏色(Meyer等人，Nature 330677-678(1987)；Napoli等人，Plant Cell 2279-289(1990)；van der Krol等人，Plant Cell 2291-299(1990))；Bt基因(Voisey等人，如前引文)；新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(Quesbenberry等人，如前引文)；豌豆凝集素基因(Diaz等人，Plant Physiology 109(4)1167-1177(1995)；Eijsden等人，Plant Molecular Biology 29(3)431-439(1995))；生長素-應(yīng)答啟動子GH3(Larkin等人，Transgenic Research 5(5)325-335(1996))；向日葵的種子白蛋白基因(Khan等人，Transgenic Research 5(3)179-185(1996))；和編碼膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶、賦予Basta除草劑抗性的β-葡糖醛酸酶(GUS)、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶和α-淀粉酶抑制劑的基因(Khan等人，如前引文)，這些文獻(xiàn)的每一篇都被完整并入本文作為參考。
對于某些目的，可能優(yōu)選不同的抗生素或者除草劑選擇標(biāo)記。常規(guī)用于轉(zhuǎn)化的選擇性標(biāo)記包括nptII基因，其賦予對卡那霉素和相關(guān)抗生素的抗性(見，例如，Messing&Vierra，Gene 19259-268(1982)；Bevan等人，Nature 304184-187(1983))；bar基因，其賦予對除草劑膦絲菌素的抗性(White等人，Nucl Acids Res 181062(1990)，Spencer等人，Theor ApplGenet 79625-631(1990))；和dhfr基因，其賦予氨甲蝶呤抗性(Bourouis等人，EMBO J.2(7)1099-1104(1983))。
使用從紫花苜蓿和非紫花苜蓿物種分離的許多不同的基因已經(jīng)產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿植物，所述基因包括，但不限于下面的與報道基因gusA融合的早期結(jié)瘤素基因的啟動子(Bauer等人，The Plant Journal 10(1)91-105(1996))；早期結(jié)瘤素基因(Charon等人，Proc.Natl.Acad.of Sci.USA 94(16)8901-8906(1997)；Bauer等人，Molecular Plant-MicrobeInteractions 10(1)39-49(1997))；依賴NADH的谷氨酸合酶(Gantt，ThePlant Journal 8(3)345-358(1995))；三種凝集素基因的每一種的啟動子-gusA融合(Bauchrowitz等人，The Plant Journal 9(1)31-43(1996))；與CaMV啟動子融合的海洋軟珊瑚Renilla reniforms的螢光素酶(Mayerhofer等人，The Plant Journal 7(6)1031-1038(1995))；Mn-超氧化物歧化酶cDNA(McKersie等人，Plant Physiology 111(4)1177-1181(1996))；編碼蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)δ-內(nèi)毒素的合成的cryIC基因(Strizhov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(26)15012-15017(1996))；glucanse(Dixon等人，Gene 179(1)61-71(1996)；和葉衰老基因(leaf senescence gene)(美國專利號5,689,042)。
在多種飼料和草皮草物種中也報導(dǎo)了遺傳轉(zhuǎn)化(Conger B.V.，GeneticTransformation of Forage Grasses in Molecular and Cellular Technologiesfor Forage Improvement，CSSA Special Publication No.26，Crop ScienceSociety of America，Inc.E.C.Brummer等人編著1998，49-58頁)。這些草包括但不限于，鴨茅(Dactylis glomerata L.)、葦狀羊茅(Festucaarundinacea Schreb.)、紫羊茅(Festuca rubra L.)、草地羊茅(Festucapratensis Huds.)、黑麥草(Lolium perenne L.)、匍匐剪股穎(Agrostispalustris Huds.)和小糠草(Agrostis alba L.)。
轉(zhuǎn)基因植物已經(jīng)用于工業(yè)蛋白質(zhì)的分子養(yǎng)殖(“pharming”)。例如，已經(jīng)從轉(zhuǎn)基因玉米商業(yè)化生產(chǎn)了重組卵白抗生物素蛋白和細(xì)菌B-葡糖醛酸酶(GUS)，通過使用來自玉米的泛素啟動子在種子中得到了高水平表達(dá)(Hood等人，Adv Exp Med Biol 464127-147(1999))。
H.半合子性用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法形成的轉(zhuǎn)基因植物通常在一條染色體上含有單個基因，盡管多個拷貝是可能的。這些轉(zhuǎn)基因植物可以稱為所加入基因的半合子。這種植物的更準(zhǔn)確的名稱是自由分離子，因為每一經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物代表一種獨特的T-DNA整合事件(見，例如，美國專利號6,156,953)。轉(zhuǎn)基因基因座通常由存在和/或不存在轉(zhuǎn)基因來表征。其中一個等位基因相應(yīng)于缺少轉(zhuǎn)基因的雜合基因型也被稱為半合子的(見，例如，美國專利號6,008,437)。
假定正常的半合子性，自交將在第一個自交重組代中導(dǎo)致最大基因型分離，該代也稱作R1或R1代。通過最初的重組系，也稱作R0或R0代的自交產(chǎn)生R1代。因為每個插入片段作為顯性等位基因起作用，在沒有連鎖和假定對于耐受性表達(dá)僅需要一個半合子插入片段時，一個插入片段將以3∶1分離，兩個插入片段將以15∶1分離，三個插入片段將以63∶1分離，等等。因此，為了找到至少一個抗性表型，需要培養(yǎng)相對少的R1植物(見，例如，美國專利號5,436,175和5,776,760)。
如上面提到的，半合子轉(zhuǎn)基因再生植物的自花授粉將產(chǎn)生等價于F2的后代，其中約25％將是純合的轉(zhuǎn)基因植物。F2子代的自花授粉和與未轉(zhuǎn)化的對照植物的測交(test cross)可用于鑒定純合轉(zhuǎn)基因植物和保持該品系。如果對于再生植物，最初得到的子代來自異花授粉，那么純合轉(zhuǎn)基因植物的鑒定將需要額外的自花授粉代(見，例如，美國專利號5,545,545)。
I.育種方法開放傳粉群體。作物諸如黑麥，許多玉米和甜菜，草本草(herbagegrass)，豆類如紫花苜蓿和三葉草，和熱帶樹作物如可可樹、椰樹、油棕和某些橡膠樹的開放傳粉群體的改進(jìn)基本上依賴于改變基因頻率以達(dá)到有利的等位基因的固定并同時保持高(但是遠(yuǎn)未到達(dá)最大)程度的雜合性。這些群體中的一致性是不可能的，開放傳粉品種中的典型性(trueness-to-type)是作為一個整體的群體的統(tǒng)計學(xué)特征，而不是單個植物個體的特征。從而，開放傳粉群體的異質(zhì)性與近交品系、克隆和雜種的同質(zhì)性(實質(zhì)上的同質(zhì)性)對立。
群體改進(jìn)方法自然地分成兩組，基于純表型選擇的方法，通常稱為混合選擇，和基于利用子代檢驗進(jìn)行的選擇的那些方法。群體間改進(jìn)利用了開放育種群體的概念；允許基因從一個群體流到另一個群體。
一個群體中的植物(栽培品種、品系、生態(tài)型，或者任何種質(zhì)來源)天然地(例如通過風(fēng))或者手工地或者通過蜜蜂(通常意大利蜜蜂(Apismellifera L.)或苜蓿切葉蜂(Megachile rotundata F.))與來自其他群體的植物雜交。通過分離具有來自兩個來源的期望性狀的植物，進(jìn)行選擇以改進(jìn)一個(有時兩個)群體。
基本上有兩種主要的開放傳粉群體改進(jìn)方法。其一情況是，通過所選的選擇方案整體地改變?nèi)后w。結(jié)果是經(jīng)改良的群體，其通過在隔離情況下自己內(nèi)部的隨機交配而可以無限繁殖。其次，綜合品種達(dá)到和群體改良相同的最終結(jié)果但是其不能就此自我繁殖；其必須從親本品系或克隆重新構(gòu)建。用于改良開放傳粉群體的這些植物育種方法是本領(lǐng)域中技術(shù)人員眾所周知的并且在許多教材和文章中提供了常規(guī)用于改良異花傳粉植物的育種方法的全面綜述，所述教材和文章包括但不限于Allard，Principles ofPlant Breeding，John Wiley&Sons，Inc.(1960)；Simmonds，Principles ofCrop Improvement，Longman Group Limited(1979)；Hallauer和Miranda，Quantitative Genetics in Maize Breeding，Iowa State University Press(1981)；和，Jensen，Plant Breeding Methodology，John Wiley&Sons，Inc.(1988)。
混合選擇。在混合選擇中，選擇所希望的個體植物，將其收獲，混種而不檢驗子代以產(chǎn)生后代。因為選擇僅基于母本親代，而且對傳粉沒有控制，故混合選擇等于伴有選擇的隨機交配形式。如上面所陳述，混合選擇的目的是增加群體中優(yōu)良基因型的比例。
綜合品種。在所有可能的雜種組合中選擇具有良好的配合力(combining ability)的多個基因型，通過群內(nèi)雜交產(chǎn)生綜合品種，隨后通過開放傳粉維持該品種。不管親代是(或多或少近交的)種子-繁殖品系(如一些甜菜和蠶豆(Vicia))還是克隆(如草本草、三葉草和紫花苜蓿)在原則上沒有差別。根據(jù)一般配合力，有時通過測交或者頂交，更通常通過多系天然雜交，選擇親代。親代種子系可以有意地進(jìn)行近交(例如，通過自交或者同胞雜交)。然而，即使親代不有意近交，在品系保持期間在品系內(nèi)的選擇也將確保發(fā)生一定程度的近交?？寺∮H本當(dāng)然將保持不變和高度雜合。
綜合品種可以從親代種子生產(chǎn)場地直接到農(nóng)民手中或者必須首先經(jīng)歷一輪或兩輪繁殖，這取決于種子生產(chǎn)和種子所需的規(guī)模。實際上，草和三葉草通常繁殖一次或兩次并從而相當(dāng)大地脫離最初的綜合品種。
盡管有時使用混合選擇，但是對于多系天然雜交，子代檢驗通常是優(yōu)選的，因為它們操作簡單并且與目標(biāo)--即在綜合品種中開發(fā)一般配合力--明顯相關(guān)。
進(jìn)入綜合品種中的親代品系或克隆的數(shù)目變化很大。實際上，親代品系的數(shù)目從10到數(shù)百，平均100-200。預(yù)計從100或更多克隆形成的、基礎(chǔ)廣泛的綜合品種在種子繁殖期間比基礎(chǔ)窄的綜合系更穩(wěn)定。
雜種。雜種是不同基因型的親代之間雜交所得的個體植物。商業(yè)化雜種現(xiàn)在廣泛用于許多農(nóng)作物中，包括玉米、高梁、甜菜、向日葵、嫩莖花椰菜?？梢砸圆煌姆椒ㄐ纬呻s種，這些方法包括兩個親本直接雜交(單雜交雜種)，另一親本與單雜交雜種雜交(三方或三重雜交雜種)，或者兩個不同的雜種雜交(四方或者雙雜交雜種)。
嚴(yán)格說來，在遠(yuǎn)交(即，開放傳粉)群體中的多數(shù)植物個體是雜種，但是該術(shù)語通常被保留用于如下情況親代個體的基因組相互足夠不同而被識別為不同的物種或者亞種。根據(jù)兩個親本的基因組在質(zhì)和/或量上的不同，雜種可以是可育的或者不育的。雜種優(yōu)勢通常與增加的雜合性有關(guān)，該雜合性導(dǎo)致與用于形成雜種的親代品系相比，雜種的生長、生存和可育性具有增加的優(yōu)勢。通常通過將兩種遺傳上不同的、高度近親交配的品系雜交實現(xiàn)最大雜種優(yōu)勢。
雜種的生產(chǎn)是成熟的工業(yè)，包括兩親本品系和從這些品系的雜交所得的雜種的獨立生產(chǎn)。關(guān)于雜種生產(chǎn)方法的詳細(xì)討論，見，例如，Wright，H.，Commercial Hybrid Seed Production，卷8，161-176頁，《Hybridization ofCrop Plants》，如前。
實施例I.在植物中產(chǎn)生IgA的實例用兩種基本策略在玉米中產(chǎn)生抗-HSV單體IgA
IgA的組成性表達(dá)；和IgA的胚乳-特異表達(dá)。
實驗還比較了重鏈(“HC”)和輕鏈(“LC”)在單個質(zhì)粒上與HC和LC在兩個分開的質(zhì)粒上的表達(dá)效率。
實施例1.泛素/HC，LC質(zhì)粒的構(gòu)建選擇抗-HSV抗體基因的組成性表達(dá)以便能夠在愈傷組織上快速分析蛋白質(zhì)生產(chǎn)。更具體地，產(chǎn)生玉米泛素-1啟動子驅(qū)動的HSV重鏈HC和LC質(zhì)粒構(gòu)建體和轉(zhuǎn)基因事件以證明來自某些質(zhì)粒構(gòu)型的重鏈和輕鏈基因的正確裝配和積累。
例如，在美國專利號5,510,474、5,614,399、6,020,190、和6,054,574中描述了玉米泛素-1(’ubi')，這里完整引用這些專利。在美國專利號5,773,689和6,239,328中描述了MAR(基質(zhì)附著區(qū))，這里完整引用這些專利。玉米per5 UTR在美國專利號6,384,207中描述，這里將該專利完整并入。用于本實驗中的基因沒有就植物密碼子偏愛進(jìn)行重建，并且它們含有大麥-α淀粉酶前導(dǎo)序列以將蛋白質(zhì)靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
裝配了下面的載體pDAB635(MAR∷ubi/HC/per5∷MAR)(
圖1；SEQ ID NO15)；pDAB636(MAR∷ubi/LC/per5∷MAR)(圖2；SEQ ID NO16)；和pDAB637(MAR∷ubi/HC/per5∷ubi/LC/per5∷MAR)(圖3；SEQ IDNO17)。
抗體基因從來源載體上以NcoI-HpaI片段釋放并克隆到載體pDAB4005的NcoI-PmeI位點中，處于玉米泛素啟動子和玉米per53′UTR之間，置換GUS編碼區(qū)。然后以NotI片段釋放完整ubi啟動子/抗體基因/per5盒并將其插入反向MAR載體252-4的NotI位點。通過從中間載體釋放NotI片段上的ubi/HC/per5盒，并用T4聚合酶使所述片段的末端鈍化以插入到pDAB636的唯一Srf I位點中，構(gòu)建質(zhì)粒pDAB637。大量產(chǎn)生所有三種質(zhì)粒，以準(zhǔn)備與pDAB3014一起轉(zhuǎn)化玉米，pDAB3014含有選擇標(biāo)記盒稻肌動蛋白/pat/脂肪酶。
實施例2遞送多種質(zhì)粒的備選方法因為PAT質(zhì)粒(pDAB3014)和抗體質(zhì)粒之間大小的極端不同，所以所關(guān)心的問題是，使用等質(zhì)量的DNA用于共轉(zhuǎn)化將導(dǎo)致每種質(zhì)粒向玉米細(xì)胞的低效率遞送。在評估將多種質(zhì)粒遞送到玉米細(xì)胞的某些參數(shù)時，比較摩爾相等量的DNA的使用與質(zhì)量相等量的DNA的使用，以確定對于細(xì)胞接受所有必要質(zhì)粒的效率是否產(chǎn)生影響。
共106個事件可用于PCR，并且再生了經(jīng)分析為陽性的10個事件。
對于用泛素/HC，LC質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因愈傷組織事件的分析以兩個階段進(jìn)行1)PCR鑒定含有完整目標(biāo)基因的那些事件；和2)對PCR陽性事件實施蛋白質(zhì)印跡和ELISA分析以檢測蛋白質(zhì)表達(dá)和IgA裝配。圖4顯示了非變性蛋白質(zhì)印跡，其中使用IgAκ鏈作為檢測抗體以檢測轉(zhuǎn)基因玉米愈傷組織產(chǎn)生的泛素HSV-IgA(HC/LC)單體抗體的蛋白質(zhì)表達(dá)。
完整PTU(植物轉(zhuǎn)錄單位啟動子/編碼區(qū)/3’UTR)的PCR鑒定尤其具有挑戰(zhàn)性，這是因為三種質(zhì)粒內(nèi)含有重復(fù)調(diào)節(jié)元件而這又導(dǎo)致要設(shè)計能特異和準(zhǔn)確地擴增所希望的PTU的引物是困難的。試驗了幾種擴增策略、PCR系統(tǒng)和擴增條件，包括8個不同的引物組。已確定在單個PCR反應(yīng)中用單一一組引物就可以擴增HC PTU(ubi/HC/per5)和LCPTU(ubi/LC/per5)。通過在HC和LC側(cè)翼區(qū)域中利用不同的幾個堿基對，還發(fā)現(xiàn)了分別能夠識別和特異擴增HC或者LC PTU的第二和第三組引物。
對來自二方轉(zhuǎn)化(pDAB637(SEQ ID NO17)和pDAB3014(SEQ IDNO84))的共53個轉(zhuǎn)基因愈傷組織和來自三方轉(zhuǎn)化(pDAB635(SEQ IDNO15)和pDAB3014(SEQ ID NO84))的23個轉(zhuǎn)基因愈傷組織進(jìn)行PCR分析以檢測轉(zhuǎn)基因PUTs的存在。使用在單一PCR反應(yīng)中擴增HC和LC的策略。在來自二方的愈傷組織品系中，79％是PCR陽性，而來自3-方的78％的愈傷組織品系是PCR陽性的。為了驗證來自第一種擴增策略的結(jié)果，使用備選策略分析了16個樣品組成的子集，該策略可以分別擴增HC和LC的PTU。結(jié)果與在相同的PCR反應(yīng)中檢測HC和LC PTU的第一種PCR分析一致。用引物進(jìn)一步分析這16個子集樣品以僅擴增HC和LC的編碼區(qū)。盡管該擴增是成功的，但是結(jié)果未與PTU分析完全匹配。該差異可能是片段化PTU造成的，所述片段化PTUs可以通過編碼區(qū)特異的引物但不是PTU-特異的引物檢測。對PTU陽性和陰性的愈傷組織事件進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡和ELISA分析。
使用來自上述泛素/HC，LC轉(zhuǎn)化的事件，產(chǎn)生蛋白質(zhì)分析數(shù)據(jù)。該實驗的目的是比較HC和LC在單個質(zhì)粒上和HC和LC在兩個分開的質(zhì)粒上的表達(dá)效率。收集愈傷組織材料并在-70℃冰凍后轉(zhuǎn)運以進(jìn)行蛋白質(zhì)分析。用捕獲ELISA試驗使用IgA重鏈捕獲抗體和IgAκ鏈檢測抗體實施事件的初步篩選。用非變性蛋白質(zhì)印跡評估了僅ELISA陽性樣品，該非變性蛋白質(zhì)印跡也使用IgAκ鏈作為檢測抗體。
在通過ELISA篩選的54個事件中，26個是陽性(表1)。所有這些26個陽性樣品產(chǎn)生了分子量約為160,000kd的經(jīng)裝配的IgA單體。這些事件中的18個事件還包括一些未裝配的IgA。
兩種轉(zhuǎn)化方法二質(zhì)粒和三質(zhì)粒方法都產(chǎn)生了經(jīng)裝配的IgA，三方策略產(chǎn)生60％陽性，二方策略產(chǎn)生38％陽性。表達(dá)品系的頻率的不同被認(rèn)為不是質(zhì)粒構(gòu)型所致，而是由于提交用于分析的小數(shù)據(jù)組所致。
表1.Ubi/HC，LC事件的蛋白質(zhì)和PCR結(jié)果
這些實驗表明當(dāng)HC和LC在單個質(zhì)粒上或者在兩個分開的質(zhì)粒上時，在蛋白質(zhì)表達(dá)和裝配上沒有顯著差異。對于每種策略產(chǎn)生平均相同數(shù)目的事件而不管以質(zhì)量相等量還是以摩爾相等量加入DNA。此外，兩種DNA遞送策略都導(dǎo)致相同數(shù)目的含有所有目的基因的事件。基于這些結(jié)果，對于隨后的工作以質(zhì)量相等量加入DNA。
實施例3.用于植物中胚乳-特異的抗-HSV抗體表達(dá)的載體構(gòu)建下面的實施例涉及用于控制單純皰疹病毒(HSV)的單體IgA抗體。將編碼HC和LC的兩種基因在一種載體中導(dǎo)入植物以種子特異性表達(dá)具有抗HSV功能性的單體抗體。
使用類似于美國專利號5,380,831中教導(dǎo)的方法重新設(shè)計兩種抗體基因(HC和LC)以便在植物中獲得最優(yōu)表達(dá)，所述專利被完整并入本文作為參考。從而，兩種人HSV抗體基因HC(SEQ ID NO1)和LC(SEQ ID NO9)，以及核苷酸序列SEQ ID NOs3、5、7、9、11和13具有密碼子偏倚性，為了在玉米中增強基因表達(dá)，所述密碼子偏倚性更接近植物密碼子而不是人密碼子。
抗-HSY項目的質(zhì)粒構(gòu)建需要四種復(fù)雜質(zhì)粒的裝配，每種質(zhì)粒均含有MAR序列位于兩個抗體植物轉(zhuǎn)錄單位(PTU)側(cè)翼。為了胚乳特異表達(dá)，抗體基因處于玉米γ-玉米醇溶蛋白(“gz”或者“γ-玉米醇溶蛋白”)啟動子的控制下(Ueda，T.等人，Mol.Cell.Biol.14(7)4350-9(1994))并以玉米過氧化物酶3′UTR(per5)終止。
主鏈載體構(gòu)建。質(zhì)粒構(gòu)建的第一階段涉及制備主鏈載體。主鏈質(zhì)粒含有目標(biāo)基因表達(dá)必需的所有元件，這些元件包括MAR序列、啟動子、3′UTR、可選擇標(biāo)記基因盒和用于抗體編碼區(qū)的一步加入的獨特限制性位點。主鏈載體的另一特征是存在用于有效除去抗生素抗性基因的獨特限制性位點。抗體-特異的主鏈載體的另一特征是缺少可能干擾抗體基因片段克隆的位點，以備將來產(chǎn)生概念載體。
以兩個階段實施抗體載體構(gòu)建步驟1＝在γ-玉米醇溶蛋白啟動子和per53′UTR之間插入抗體基因；和步驟2＝向反向MAR載體插入γ-玉米醇溶蛋白抗體基因per5盒。對兩種主鏈載體進(jìn)行幾個修飾，以促進(jìn)可變區(qū)基序的亞克隆、使得能夠純化無氨芐青霉素的片段和支持DNA印跡分析和PTU鑒定。通過用T4聚合酶除去核苷酸的方式，從“步驟1”載體除去AvrII位點。此外，通過將現(xiàn)有的per5片段用已去除PmeI位點的類似片段置換從“步驟1”載體除去PmeI位點。通過向唯一的SapI位點中加入合成的銜接子，向“步驟2”MAR載體加入FspI位點。最后，通過從pDAB4005除去泛素啟動子并將其用從W22基因組DNA PCR擴增的γ-玉米醇溶蛋白啟動子置換，將γ-玉米醇溶蛋白啟動子插入“步驟1”載體。對經(jīng)修飾的主鏈載體測序以驗證這些改變。此外，完成對γ-玉米醇溶蛋白啟動子的完全測序以確保沒有PCR導(dǎo)致的錯誤。
表2列出了已經(jīng)構(gòu)建的主鏈載體和為了容納抗體基因而實施的修飾。
表2主鏈載體
主鏈載體的更詳細(xì)的描述和用于構(gòu)建它們的策略如下。
pDAB8506是經(jīng)修飾的pDAB4005載體(pDAB4005被設(shè)計為標(biāo)準(zhǔn)檢驗載體)。其含有玉米ubi/GUS/per5盒并且是隨后的主鏈載體的基礎(chǔ)。使用T4 DNA聚合酶從pDAB4005除去AvrII位點。
pDAB634含有玉米γ-玉米醇溶蛋白-啟動子/GUS/per5(′gz/GUS/per5′)盒。通過用HindIII-NcoI片段上的γ-玉米醇溶蛋白啟動子置換DAB 8506的泛素啟動子產(chǎn)生該質(zhì)粒。使用基于GenBank登錄號#MZEZEIN27設(shè)計的引物從W22基因組DNA PCR擴增γ-玉米醇溶蛋白啟動子。
pDAB1416是pDAB634的修飾，其中通過從SacI-FseI片段除去現(xiàn)有的per53′UTR以缺失PmeI位點。使用經(jīng)設(shè)計以除去PmeI位點的引物通過PCR擴增從per53′UTR除去PmeI位點。PmeI位于per5功能序列的外部，因此除去該位點將不會干擾該元件的功能性。
pDAB8504是MAR載體p254-3的修飾載體，p254-3含有相互反向的Rb7MAR，位于稻肌動蛋白/PAT/脂肪酶3′UTR盒的側(cè)翼，并且還含有多克隆區(qū)用于插入目標(biāo)基因。質(zhì)粒pDAB8504基本上為p254-3，只是在該質(zhì)粒的主鏈中加入FspI位點。將含有FspI位點的一個9-bp銜接子插入MAR載體中的SapI位點中并導(dǎo)致在MAR載體的主鏈區(qū)中加入三個FspI位點。這些FspI位點將用于在轉(zhuǎn)化前從大量質(zhì)粒制備物中除去氨芐青霉素抗性基因。
pDAB1414是pDAB8504的經(jīng)修飾的形式，其中通過用PmeI消化，已經(jīng)除去了稻肌動蛋白/PAT/脂肪酶盒以缺失此PTU。
抗體載體構(gòu)建。為了完成最終抗體質(zhì)粒的裝配，需要三個克隆步驟和制備兩種中間載體。三個克隆步驟如下1.在γ-玉米醇溶蛋白啟動子和per53′UTR之間亞克隆抗體基因以產(chǎn)生“γ-玉米醇溶蛋白/抗體盒”(步驟1載體)。
2.將含有抗體基因#1的“γ-玉米醇溶蛋白/抗體盒”亞克隆到含有MAR序列的載體(步驟2載體)中。
3.將含有抗體基因#2的“γ-玉米醇溶蛋白盒”亞克隆到步驟#2中產(chǎn)生的MAR載體內(nèi)。(步驟3載體＝最終載體)。
如前面討論的，抗體裝配起始于產(chǎn)生HC和LC的密碼子-優(yōu)化的基因。大量制備所有這些載體并獨立地克隆到主鏈質(zhì)粒pDAB1416中。向這些中間載體的每一種分配新的質(zhì)粒編號(表3)。
表3.中間和最終抗體構(gòu)建體
質(zhì)粒pDAB8505(
圖15)含有g(shù)z/HC/per5::gz/LC/per5表達(dá)盒，該盒側(cè)翼是反向MAR序列(Rb7)，質(zhì)粒pDAB2101含有MAR::gz/LC/per5::gz/HC/perS::MAR。質(zhì)粒pDAB8505用于共轉(zhuǎn)化和雜交策略中。載體構(gòu)建的細(xì)節(jié)如下描述pDAB1415具有含有g(shù)z/LC/per5的盒。為了構(gòu)建該構(gòu)建體，將pDAB1416中的GUS基因用NcoI和SacI切除并用LC基因置換，LC基因是用NcoI和SacI從其供體載體切出的。
pDAB1417具有含gz/LC/nosA的盒。為了構(gòu)建該構(gòu)建體，將pDAB1416中的GUS基因用NcoI和SacI切除并用LC基因置換，該LC基因也是用NcoI和SacI從其供體載體切出的。
pDAB8501具有含gz/HC/per5的盒。為了構(gòu)建該構(gòu)建體，將pDAB1416中的GUS基因用NcoI和SacI切除并用HC基因置換，該HC基因也是用NcoI和SacI從其供體載體切出的。
pDAB8502具有含gz/HC/nosA的盒。為了構(gòu)建該構(gòu)建體，將pDAB1417中的LC基因用NcoI和SacI切除并用HC基因置換，該HC基因也是用NcoI和SacI從其供體載體切出的。
pDAB8503具有含MAR/gz/LC/per5::稻肌動蛋白/PAT/脂肪酶::MAR的盒。為了構(gòu)建該構(gòu)建體，將來自pDAB1415的gz/LC/per5盒用NotI切出并插入到pDAB8504的NotI位點中。
pDAB8505(圖5)是兩種最終載體之一。其具有含MAR::gz/HC/per5::gz/LC/per5::稻肌動蛋白/PAT/脂肪酶::MAR的盒。為了構(gòu)建該構(gòu)建體，將pDAB8501的gz/HC/per5盒用NotI切出，然后用T4 DNA聚合酶處理產(chǎn)生鈍端并最終連接到pDAB8503的SrfI位點中。
最終質(zhì)粒經(jīng)歷大規(guī)模DNA純化和片段純化以除去氨芐青霉素基因。獲得約15mg每種最終質(zhì)粒(沒有amp片段)用于轉(zhuǎn)化。
通過制備不包括尾部的編碼區(qū)的載體也可以得到無尾重鏈抗體。
實施例4.植物轉(zhuǎn)化載體的大規(guī)模DNA片段純化以除去氨芐青霉素抗性基因如前面描述的，從植物轉(zhuǎn)化載體除去質(zhì)粒主鏈序列，對于確保經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物材料沒有任何污染性抗生素抗性基因是必要的。用于大規(guī)模除去DNA片段的基于凝膠的策略是產(chǎn)生轉(zhuǎn)化-質(zhì)量的片段的有效方法，然而，該方法不僅費力而且耗時。
分離中的第一步是使用限制酶從所述載體切除基因構(gòu)建片段并使不想要的DNA片段降低為可能的最小單位。用Fsp除去Amp片段。使用該策略，可以將含有氨芐青霉素抗性基因的區(qū)域降解成分別為1023和1236bp的兩個片段。
總共產(chǎn)生了34.8mg以上的無amp的pDAB8505。對所產(chǎn)生的每批DNA片段進(jìn)行限制性消化以實施質(zhì)量控制來確保在制備物中沒有剩余親本質(zhì)粒或者部分消化的片段。遞送前用PCR擴增確定所處理的DNA片段的純度?？偟募兌葹榧s98％到約99.5％。在多數(shù)情況中，實現(xiàn)了約99％或者更高的純度。基于FPLC的技術(shù)比凝膠純化方案更劃算。
使用FPLC-Sephacryl S-1000填充柱的大規(guī)模DNA片段分離方法。使用FPLC系統(tǒng)以恒定速度用Sephacryl S-1000填充2.6/100cm柱。補加150mM NaCl的TE緩沖液用于過濾介質(zhì)的預(yù)洗滌和柱填充以及DNA洗脫。將2毫克(1mg/mL)FspI-消化的pDAB3016 DNA加至柱子。以8mL/收集管共收集了500mL洗脫液。在260、280和320nm監(jiān)視洗脫過程。為了檢查分離結(jié)果，將來自每個收集管的20μL等分試樣加至瓊脂糖凝膠后電泳。
試驗了1kb plus DNA序列梯，其含有大小為100bp到12kb的DNA片段。結(jié)果表明用當(dāng)前的方法可以將7kb或者更大的DNA片段與1.0和1.2kb氨芐青霉素抗性片段分離。
為了提高可重復(fù)性和進(jìn)一步增強分離效率，研究了幾種因素，包括DNA預(yù)熱溫度和持續(xù)時間，每次加樣的DNA的量和連續(xù)使用后柱性能的穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)在55℃預(yù)處理15-20分鐘是最佳分辨(即，最佳分離效率)所最希望的。此外，確定柱子在連續(xù)使用3-4次后應(yīng)該被重調(diào)節(jié)。盡管可以向柱子加載高達(dá)25ml(25mg)，但是隨著DNA上樣量的增加，片段回收效率降低。用2mg DNA上樣量可以回收約95％以上的DNA片段。然而，當(dāng)上樣的DNA的量增加到5mg時該回收率下降到約70％(表4)。3mg上樣水平是通常所用的規(guī)模，其在第一輪柱純化中具有約85％的平均回收率。結(jié)果表明FPLC柱層析是在玉米轉(zhuǎn)化前從質(zhì)粒除去氨芐青霉素基因片段的有效技術(shù)。
表4.使用基于FPCL-的柱純化的平均DNA片段回收率
實施例5.通過定量實時PCR(qRT-PCR)估計轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)大多數(shù)通過直接-DNA遞送方法產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因事件顯示出復(fù)雜的插入模式。這些多拷貝插入使得育種日益困難并且還導(dǎo)致沉默事件頻率的增加。從而，應(yīng)該在轉(zhuǎn)化過程的早期階段消除這些多拷貝插入。通常通過Southern印跡分析確定轉(zhuǎn)基因插入模式。然而，該方法相當(dāng)費力、費時并且不可能適用于高通量分析方法。為了克服這些問題，用可以快速估計拷貝數(shù)的技術(shù)在轉(zhuǎn)化過程的早期辨別待丟棄的事件。已經(jīng)開發(fā)并實施了定量實時PCR(qRT-PCR)以預(yù)測HSV構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。
定量實時PCR(qRT-PCR)。已經(jīng)證明定量實時PCR(qRT-PCR)是估計轉(zhuǎn)基因玉米愈傷組織的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的有效方法。
用AO和IMT基因?qū)υ摷夹g(shù)的驗證表明通過qRT-PCR估計的拷貝數(shù)和通過DNA印跡分析確定的插入帶非常接近并且高度相關(guān)。
用pDAB8505(HC+LC+PAT)驗證qRT-PCR分析。為兩種基因，即HC和LC的每一種，設(shè)計了兩對引物并用常規(guī)PCR和qRT-PCR檢驗。為了估計HSV轉(zhuǎn)基因玉米愈傷組織中轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)，對于pDAB8505事件僅分析了LC。
還研究了qRT-PCR的可重復(fù)性。發(fā)現(xiàn)該方法是高度可重復(fù)的。由不同研究人員或者由一名研究人員在不同時間所得的估計拷貝數(shù)非常接近并且高度相關(guān)。因此，除非觀察到不尋常的數(shù)據(jù)，沒有發(fā)現(xiàn)重復(fù)分析的必要性。此外，觀察到具有低拷貝數(shù)和高拷貝數(shù)的事件的不均勻分布。在一些行中(in some orders)發(fā)現(xiàn)簡單事件區(qū)與復(fù)雜事件區(qū)。這表明克隆的事件可能以多種分離物形式存在。
實施例6.為了在玉米種子中產(chǎn)生單體IgA的轉(zhuǎn)化通過pDAB8505的直接DNA遞送使用WHISKERSTM轉(zhuǎn)化方法(Song等人，Plant Cell Reporter 20948-954(2002))處理玉米近交系“HiII”的植物細(xì)胞。所用的“小規(guī)?！盬HISKERSTM方法能夠一次處理約2ml壓緊的植物細(xì)胞。在所分析的541個愈傷組織事件中，約67％(360/541)具有5份以上的轉(zhuǎn)錄物拷貝；約5％(29/541)具有5份拷貝；約5％(27/541)具有4份拷貝；約6％(33/541)具有3份拷貝；約8％(45/541)具有2份拷貝；約7％(36/541)具有1份拷貝；約2％(11/541)具有0份拷貝。再生了代表126個事件的共871株植物并將其轉(zhuǎn)移到溫室，生長到成熟。
種子生產(chǎn)。將抗-HSV轉(zhuǎn)化的植物種植在5加侖盆中并通過近交玉米系“OQ414”傳粉以產(chǎn)生子代種子，在該種子上分析抗體產(chǎn)生。
除草劑抗性，作為體外選擇性標(biāo)記，是大田研究和植物中(in planta)性狀漸滲活動的重要工具。植物種植在5-加侖盆中后，對每株植物和陽性對照(4XH753)和陰性對照(Hi II F1)進(jìn)行除草劑耐受性的葉子涂抹試驗。該方案包括自葉尖向上20cm應(yīng)用10μL 2.0％Finale溶液(1”平方)于每株植物。結(jié)果表明4XH753植物明顯敏感而HiIIF1植物表現(xiàn)出對該除草劑的耐受性。除了一株之外，所有抗-HSV轉(zhuǎn)化的植物都具有抗性。
總之，用2％Finale涂抹被認(rèn)為已轉(zhuǎn)化的植物并且選擇具有該除草劑抗性的植物用于進(jìn)一步繁殖和表征。還收集每株抗-HSV植物的葉子樣品以用于DNA印跡分析。
實施例7.玉米胚乳中蛋白質(zhì)分析HC/LC轉(zhuǎn)化體。通過ELISA和SDS非還原蛋白質(zhì)印跡，分析T1種子的γ-玉米醇溶蛋白/HC/LC構(gòu)建體(pDAB8505)。該方法還需要確定樣品重量和提取物中的總的可提取的蛋白質(zhì)。如果事件產(chǎn)生了至少25粒種子則選擇該事件用于分析--對于低和高種子計數(shù)事件，分別檢測10和20粒玉米粒。從一個或兩個穗系(ear family)選擇玉米粒用于試驗。穗系是單個授粉的穗的子代。
非破壞性地從種子削下樣品，保留萌發(fā)陽性種子的可能性。設(shè)計ELISA用以捕獲重鏈和檢測IgA單體的輕鏈。用于所有這些事件的標(biāo)準(zhǔn)是sIgA抗體(來自U.S.Biological的I1890-10)。
蛋白質(zhì)印跡分析表明所有表達(dá)事件均產(chǎn)生了裝配的IgA單體以及未裝配的或者降解的重鏈和輕鏈。如果ELISA和蛋白質(zhì)印跡分析都產(chǎn)生陽性結(jié)果，則認(rèn)為種子是陽性的?；诘鞍踪|(zhì)表達(dá)和在受試的玉米粒內(nèi)觀察到的分離比例，推薦事件進(jìn)入大田。
對于pDAB8505構(gòu)建體共分析了930粒單獨的種子，代表具有足夠高的種子數(shù)而用于試驗的66個事件?？傊?，基于有利的表達(dá)和分離數(shù)據(jù)提出33個事件(50％)；對另外8個事件(12％)發(fā)現(xiàn)表達(dá)存在問題，如不好的分離數(shù)據(jù)；發(fā)現(xiàn)25個事件(38％)不表達(dá)IgA。
實施例8.通過MALDI-TOF MS確定玉米中表達(dá)的單體IgA-HX8的Asn-269(α重鏈的CH2區(qū))的寡糖譜下面描述用于單體IgA-HX8的聚糖分析的典型方法。
還原/烷基化的IgA-HX8的胰蛋白酶消化。將100μg親和-純化的IgA-HX8置于微量離心管(0.6mL，低蛋白質(zhì)結(jié)合)中在離心蒸發(fā)器中干燥。將沉淀重懸浮在100μL蛋白質(zhì)溶解緩沖液中，該緩沖液含有6M鹽酸胍和0.4M碳酸氫銨。通過加入10μL 0.1M DTT并在65℃孵育1小時還原樣品。還原后，通過加入20μL 0.2M碘乙酰胺并在室溫黑暗中孵育2小時使蛋白質(zhì)樣品烷基化。通過加入40μL 0.1M DTT并在室溫孵育30分鐘淬滅烷基化反應(yīng)。然后用反相柱體(Protein Macro Trap，MichromBioresources)根據(jù)生產(chǎn)商的方法將蛋白質(zhì)脫鹽并用150μL 80％乙腈/0.2％TFA，然后用100％乙腈/0.2％TFA洗脫，并將洗脫的蛋白質(zhì)在離心蒸發(fā)器中干燥。將經(jīng)脫鹽的還原/烷基化蛋白質(zhì)重懸浮在50μL消化緩沖液(100mM Tris-HCl，pH8.5)中并以1∶100的胰蛋白酶∶蛋白質(zhì)比例加入胰蛋白酶(測序級，Roche)溶液。將樣品在37℃孵育16小時。然后在實施進(jìn)一步步驟前將胰蛋白酶消化液在-20℃保存。
(備選地)通過SDS-PAGE分離的IgA-HX8重鏈的凝膠中胰蛋白酶消化。將70-100μg IgA-HX8在離心蒸發(fā)器中干燥，將沉淀重懸浮在含有1∶19v/vμ-巰基乙醇的120μL Laemmli樣品緩沖液(Bio-Rad)中并將所得溶液在95℃加熱10分鐘。將所得經(jīng)還原和變性的IgA-HX8樣品加至4-20％SDS-PAGE凝膠(Bio-Rad)(6泳道，20μg/泳道)并將凝膠在60mA恒定電流下運行約1小時。用考馬斯藍(lán)染料對凝膠染色。將相應(yīng)于～50kDa的IgA-HX8重鏈的帶從凝膠中切下并用脫色緩沖液(50％乙腈，50％碳酸氫銨緩沖液，pH8.5)脫色。經(jīng)脫色的凝膠塊在離心蒸發(fā)器中干燥并用胰蛋白酶(溶于25mM碳酸氫銨中，31.25μg/mL，pH8.5)溶液再水合。樣品在37℃孵育16小時。用400μL 50％乙腈/1％TFA，然后用400μl的70％乙腈/25％25mM碳酸氫銨緩沖液/5％甲酸從凝膠提取經(jīng)胰蛋白酶解的肽。將提取液合并、過濾并在離心蒸發(fā)器中干燥。所得經(jīng)分離的胰蛋白解肽經(jīng)C18柱體(Peptide Macro Trap，Michrom Bioresources)脫鹽并在用肽-N-聚糖酶A(PNGase A)消化前在離心蒸發(fā)器中干燥。
(備選地)用胃蛋白酶消化IgA-HX8。將25μg親和-純化的IgA-HX8重懸浮在200μL 20mM乙酸銨緩沖液，pH3.5中。向蛋白質(zhì)樣品加入10μL胃蛋白酶(Roche)溶液(2mg/mL，溶于10mM HCl)并將樣品在37℃孵育16小時。通過加入5μL 1M NaOH淬滅反應(yīng)并將樣品在95℃加熱30分鐘使胃蛋白酶完全失活。樣品在離心蒸發(fā)器中干燥并在加入PNGase A之前重新溶解在50μL 20mM乙酸銨緩沖液(pH5.0)中。
N-連接的寡糖的酶促釋放。將蛋白水解肽(用胰蛋白酶或胃蛋白酶消化后的整個消化液，或者通過RP-HPLC分離的經(jīng)胰蛋白酶解的糖肽)溶解在5-50μL 20mM乙酸銨緩沖液(pH5.0)中，并加入5-10μL肽-N-糖苷酶A溶液(PNGase A，Roche)。樣品在37℃孵育16小時。
從蛋白水解肽分離釋放的寡糖。使蛋白水解/PNGase-A消化液通過C18柱體(Peptide Macro Trap，Michrom Bioresources；根據(jù)生產(chǎn)商的方法預(yù)先調(diào)節(jié)(recondition))，并收集直流級分(flow-through fraction)。用0.5mL0.1％水性TFA洗滌柱體并將洗出液與第一直流級分合并。這些級分(含有釋放的寡糖)用多孔石墨炭柱體(PGC)(GlycoClean-H，Glyko)根據(jù)生產(chǎn)商的方法進(jìn)一步純化。用50％乙腈/0.1％TFA從PGC柱體洗脫寡糖并將其在離心蒸發(fā)器中完全干燥。將聚糖樣品重新溶解在2.5μL高純度水中并通過C18 Zip Tips(Millipore)。該C18 Zip Tips根據(jù)生產(chǎn)商的方法預(yù)先調(diào)節(jié)。然后經(jīng)純化的聚糖樣品可用于MALDI-Tof MS分析。
胰蛋白酶解肽的液相層析分離。通過反相C18層析分離從約100μg親和-純化的IgA-HX8得到的胰蛋白酶解肽。Magic C18，2mmID×150mm長(Michrom Bioresources)和Perkin Elmer 200 LC系統(tǒng)用于分離。分離使用0.5ml/分鐘的恒定流速。注射100-120μL胰蛋白酶消化混合物。用下面的梯度完成肽的分離100％溶劑A(3％乙腈/0.06％TFA)等度10分鐘，0到50％溶劑B(80％乙腈/0.05％TFA)165分鐘，50到100％溶劑B10分鐘。之后將柱子用100％溶劑B洗滌2分鐘，然后在100％溶劑A中重新平衡并用100％溶劑A洗滌5分鐘。在室溫下實施分離。通過205nm下的紫外吸收監(jiān)視肽的洗脫。在經(jīng)硅化的微量離心管中收集2-ml級分并且分離后將級分在離心蒸發(fā)器中干燥。通過MALDI-Tof MS分析前，用C18Zip Tips(Millipore)根據(jù)生產(chǎn)商的方法對頭四個級分脫鹽。將剩下的級分重新溶解在2μL 50％乙腈/0.1％TFA中并通過MALDI-Tof MS檢查每個級分中的1μL物質(zhì)。
所釋放的N-連接的寡糖的MALDI-Tof MS。使用以reflectron模式操作的Voyager DE-STR(Applied BioSystems)MALDI-Tof質(zhì)譜儀。加速電壓設(shè)為20kV。柵壓設(shè)為加速電壓的69％。延遲時間設(shè)為215nsec。激光設(shè)置(laser setting)為約3000。每個光譜中對500個采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行平均。用下面的標(biāo)準(zhǔn)寡糖校準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)度(GlcNAc)2(Man)5，m/z(MNa+)＝1257.46；(GlcNAc)4(Man)3(Fuc)，m/z(MNa+)＝1485.56；(Gal)(GlcNAc)4(Man)3(Fuc)，m/z(MNa+)＝1647.62；(Gal)2(GlcNAc)4(Man)3(Fuc)，m/z(MNa+)＝1809.68。將1μL經(jīng)純化的聚糖沉積在MALDI樣品板上，用1μL sDHB基質(zhì)(66％乙腈中的18mg/mL 2，5-二羥基苯甲酸和66％乙腈中的15mg/mL 2-羥基-5-甲氧基苯甲酸的9∶1 v/v混合物)覆蓋并空氣干燥。
肽的MALDI-Tof MS。使用以reflectron模式操作的Voyager DE-STR(Applied BioSystems)MALDI-Tof質(zhì)譜儀。加速電壓設(shè)為20kV。柵壓設(shè)為加速電壓的66％。延遲時間在215到350nsec之間變動。激光設(shè)置(lasersetting)在2200到2500之間變動。每個光譜中對500個采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行平均。用下面的標(biāo)準(zhǔn)肽(Applied BioSystems)校準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)度脫-Arg1-緩激肽，m/z904.4；血管緊張肽I，m/z1，296.6；Glu1-血-纖肽B，m/z1570.6；神經(jīng)降壓肽，m/z1672.9；ACTH(clip 1-17)，m/z2093.0；ACTH(clip 18-39)，m/z2465.1；ACTH(clip 7-38)，m/z5730.6。將1μL經(jīng)純化的肽樣品沉積在MALDI樣品板上，用1μL CHCA基質(zhì)(α-氰基-羥基肉桂酸)覆蓋并空氣干燥。
MALDI-Tof MS數(shù)據(jù)的分析。用Data Explorer v4.0軟件(AppliedBioSystems)分析MS數(shù)據(jù)。肽和糖肽使用MassLynx v3.4軟件(Micromass)將分子量和氨基酸序列歸于IgA-HX8的序列。寡糖用自編軟件(The DowChemical Company)解釋寡糖的質(zhì)譜。
實施例9.通過ESI-MS確定玉米HX8事件81(self) N269(IgAα重鏈的CH2區(qū)域)的聚糖譜玉米HX8的純化。
步驟1.得到玉米胚乳的粉末產(chǎn)物1.玉米胚乳粉末步驟2.1×PBS，室溫下攪拌1小時產(chǎn)物2.提取漿液步驟3.離心，5000×g，15分鐘產(chǎn)物3.粗玉米提取物步驟4.0.22μm CA微濾產(chǎn)物4.經(jīng)過濾的玉米提取液步驟5.親和純化(檢查溢流(overflow)，如果沒有，那么丟棄)產(chǎn)物5.經(jīng)純化的HX8-IgA抗體親和柱制備-抗體固定在POROS基質(zhì)上。
通過在15ml錐形管中混合2ml POROS 20樹脂(Applied Biosystems)制備柱子。將樹脂用緩沖液(10mM磷酸鹽，0.15M NaCl，pH7.2)洗并加入多克隆IgG山羊抗人IgA和多克隆IgG山羊抗人κ(都來自SouthernBiotech)各8mg并允許在室溫反應(yīng)30分鐘。然后用15ml 1×PBS(磷酸緩沖鹽溶液137mM NaCl；2.7mM KCl；10mM Na2HPO4；2mM KH2PO4；pH7.4))洗滌Ab-樹脂混合物。通過加入15ml交聯(lián)溶液(10ml 100mM三乙醇胺，pH8.5和117mg庚二亞氨酸二甲酯(dimethyl pimelimidate))并且緩慢搖動下孵育1小時，將抗-IgA抗體與樹脂交聯(lián)。通過離心除去交聯(lián)溶液。通過加入5ml單乙醇胺(100mM，pH9.0)然后輕柔搖動下在室溫孵育30分鐘，淬滅反應(yīng)。然后用15ml 1×PBS反復(fù)洗滌漿液。然后將親和樹脂通過重力填充到柱子(2.1×75mM)中。
轉(zhuǎn)基因玉米的提取。將去胚(degermed)并碾磨成平均顆粒大小150μm的5克玉米粒加入50ml 1×PBS中。在室溫下緩慢攪拌提取漿液1小時。然后離心(5000×g，15分鐘)漿液并回收上清液。親和純化前過濾(0.22μm)上清液。
親和柱純化條件。用1×PBS(pH7.4)以1ml/分鐘預(yù)平衡抗-α/抗-β親和柱直到觀察到在紫外280nm處監(jiān)測到穩(wěn)定的基線。將含有抗體的上清液(45ml)以0.5ml/分鐘的流速應(yīng)用于柱子。然后用10個柱體積的1×PBS洗滌柱子，其中再次觀察到穩(wěn)定的基線。用12柱體積甘氨酸(100mM，pH2.5)從柱子洗脫IgA，收集5ml級分。洗脫步驟前，每個級分管含有500μl中和緩沖液(1M TRIS-HCL，pH9.0)。然后用10個柱體積1×PBS再平衡柱子。通過280nm處的紫外吸收定量含有IgA的級分。
HX8的順次胰蛋白酶和天冬氨酸-N消化。將250μl中的50μg親和純化的IgA在離心管(1.7ml低蛋白質(zhì)結(jié)合緩沖液)中離心真空干燥。將沉淀重懸浮在35μl蛋白質(zhì)溶解緩沖液(7.5ml 8M鹽酸胍，316mg碳酸氫銨，調(diào)節(jié)到pH7.8，用水稀釋到10ml終體積)中。通過加入1.75μl DTT(1M)并在75℃孵育40分鐘還原重懸浮的樣品。還原后，讓管冷卻到室溫。通過加入4.2μl碘乙酸(1M，在1N NaOH中制備)烷基化樣品。烷基化反應(yīng)在黑暗中室溫進(jìn)行40分鐘。通過加入1μl DDT(1M)淬滅烷基化反應(yīng)。樣品在C18柱體(Michrom Protein Macro Trap，Michrom Bioresources，Inc.)上脫鹽并用250μl洗脫緩沖液(乙腈，0.1％TFA)洗脫。所洗脫的還原-烷基化樣品通過離心真空干燥。將所得沉淀重懸浮在20μl胰蛋白酶消化緩沖液(100mM TRIS-HCL，pH8.1，10mM CaCl2)中。以1∶100(胰蛋白酶∶樣品)的比例加入胰蛋白酶(測序級，Promega)并在37℃孵育16小時。將混合物在95℃加熱3分鐘終止反應(yīng)。取10微升胰蛋白酶消化液用于隨后以天冬氨酸-N蛋白酶(1∶100比例，酶∶底物，Roche)消化。將Asp-N反應(yīng)混合物在30℃孵育20小時。
胰蛋白酶和胰蛋白酶+Asp-N消化的肽的液相層析和納米電噴霧電離離子阱質(zhì)譜。通過反向C18層析(Magic C18，0.02ID×150mm長，Michrom Bioresources)分離約16pmol(1μl)胰蛋白酶或者胰蛋白酶+Asp-N肽片段。使用毛細(xì)管HPLC(Agilent)進(jìn)行分離，該毛細(xì)管HPLC應(yīng)用50μm ID垂直管并且以流速0.3μl/分鐘運行。用0％溶劑A(0.05％TFA)等度洗脫10分鐘，然后使用165分鐘梯度至40％溶劑B(乙腈+0.04％TFA)，實施肽的分離。然后在15分鐘內(nèi)將梯度增加到50％溶劑B并保持在50％20分鐘進(jìn)行柱清潔。柱溫度保持在35℃并通過215nm處的吸收和電噴霧電離質(zhì)譜儀監(jiān)測肽。
在安裝納米噴霧離子源(New Obiective Jnc.，Woburn，MA)的FinniganLCQTMDeca離子阱質(zhì)譜儀(San Jose，CA)上進(jìn)行納米噴霧離子質(zhì)譜(NESI)。針對流速3μl/分鐘，電噴霧離子源以1.3-1.8kV的電勢差運行。NSI源以毛細(xì)管溫度135℃運行，毛細(xì)管電壓為42伏特，管透鏡偏置(tubelens offset)在10伏特。自動增益控制設(shè)為全MS靶8×107，Msn靶6×107，放大靶(zoom target)3×107。LC NESI-MS和LC NESI-MS/MS以自動LC/MS-LC/MS/MS模式運行，監(jiān)視信號閾值并且當(dāng)超過閾值標(biāo)準(zhǔn)時在基峰上進(jìn)行MS/MS。如下使用離子阱參數(shù)。對所有實驗使用自動增益控制運行離子阱。在該模式中，系統(tǒng)自動選擇捕獲參數(shù)以保持阱中存在的離子為恒定的預(yù)設(shè)值。對于全MS和MS/MS，所收集的“微掃描”(microscans)的數(shù)目分別為3和2。對于MS/MS信號，標(biāo)準(zhǔn)化的碰撞能力設(shè)為35％，活化Q(activation Q)為0.250。
肽和糖肽分配。使用GPMAW(Light House Data，版本5.01)，和BioWorks軟件(隨LCQ Deca提供)將分子量和氨基酸序列歸于HX8 IgA的序列。
N269(單一同位素的)的胰蛋白酶+Asp-N肽的序列。
MH+ 1948.01M2H+974.51M3H+650.01
序列DLLLGSEANLTCTLTGLR(SEQID NO20)表5.糖肽的單一同位素質(zhì)量與理論質(zhì)量
實施例10.植物中產(chǎn)生的IgA抗-HSV抗體的聚糖結(jié)構(gòu)圖6提供了經(jīng)還原和烷基化的IgA-HX8的胰蛋白酶消化液的代表性C18-HPLC層析圖。圖7提供了通過胰蛋白酶消化經(jīng)還原和烷基化的IgA-HX8產(chǎn)生的IgA-HX8 HC的HC-T13肽的糖型的代表性MALDI-Tof質(zhì)譜。通過聚糖的酶促釋放(PNGase-A)除去了IgA-HX8 HC的HC-T13肽的糖型的異質(zhì)性(圖8)。如圖9中所示，觀察到玉米表達(dá)的IgA-HX8 HC的HC-T13肽的兩種額外的糖型。
圖10提供了從IgA-HX8酶促釋放的游離N-連接的聚糖的代表性MALDI-Tof MS譜。
表6提供了利用MALDI-Tof MS對玉米中表達(dá)的IgA-HX8的輕鏈所觀察到的肽胰蛋白酶片段?？偟碾馁|(zhì)量覆蓋率為100％。“L”＝LC。
表6.所觀察的IgA-HX8輕鏈的肽胰蛋白酶片段(IgA-HX8LC，事件193，的代表性肽圖)
表7提供了通過MALDI-Tof質(zhì)譜對玉米(事件193self)中表達(dá)的IgA-HX8的重鏈所觀察到的肽胰蛋白酶解片段。總的肽質(zhì)量覆蓋率為93.8％。包括所觀察的糖肽?！癗D”＝未檢測到，“H”＝HC。
表7.所觀察的IgA-HX8重鏈的肽胰蛋白酶解片段(IgA-HX8HC，事件193，的代表性肽圖)
ND＝未檢測
圖12提供了基于MALDI-Tof質(zhì)譜結(jié)果提出的、在轉(zhuǎn)基因玉米表達(dá)的IgA-HX8上鑒定到的推定聚糖結(jié)構(gòu)。用從IgA-HX8酶促還原的游離聚糖的MALDI-Tof質(zhì)譜中相應(yīng)離子的強度，估計了聚糖種類的豐度。
圖16總結(jié)了轉(zhuǎn)基因玉米(不同的事件)中表達(dá)的IgA-HX8的聚糖譜。
實施例11.通過胚乳來源的HX8中和HSV-2碾磨轉(zhuǎn)基因玉米種子以分離胚乳。將胚乳碾磨成細(xì)小粉末并將抗體溶解于0.15MPBS中。通過低速離心使含有HX8的粗胚乳提取物澄清并且用山羊抗-人IgA親和柱進(jìn)行親和純化。試驗胚乳提取物中和HSV-2的能力。
以96孔形式將190噬斑形成單位/孔HSV-2病毒原液與胚乳來源的人單克隆抗體HX8的連續(xù)稀釋液在37℃，5％CO2中孵育1小時。用pre-CPE測定法，使用可以通過商業(yè)途徑從Diagnostic Hybrids，Inc.，Athens，Ohio得到的ELVIS HSV細(xì)胞，測量HX8抗體的中和活性。該細(xì)胞系來源于幼倉鼠腎細(xì)胞(BHK)，所述細(xì)胞經(jīng)含有G418抗生素抗性標(biāo)記的質(zhì)粒和另一質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，所述另一質(zhì)粒含有置于來自HSV-1UL39基因的誘導(dǎo)型HSV啟動子后面的大腸桿菌lacZ基因，HSV-1UL39基因編碼ICP6，其是HSV核糖核苷酸還原酶的大亞基(E.C.Stabell和P.D.Olivo，“分離細(xì)胞系用于檢測單純皰疹病毒的快速和靈敏的組織化學(xué)測定法中”，J.VirologicalMethods 38195-204(1992))。將ELVIS HSV細(xì)胞單層以96孔形式鋪板并用抗體-病毒接種物在37℃，5％CO2中感染24小時。除去上清液并用從Diagnostic Hybrids，Inc.，Athens，Ohio購買的ELVIRA裂解緩沖液裂解細(xì)胞。通過加入從Diagnostic Hybrids，Inc.，Athens，Ohio購買的ELVIRA檢測緩沖液檢測β-半乳糖苷酶活性。通過分光光度計在OD570檢測β-半乳糖苷酶濃度，其相應(yīng)于HSV感染水平。將HX8中和的病毒百分?jǐn)?shù)計算為抗體減去陰性對照的百分?jǐn)?shù)。用該測定法所得的結(jié)果也包括在
圖11中，該結(jié)果表明在給定病毒濃度下，該抗體在1μg/ml下完全中和該病毒。
II.抗-雙整聯(lián)蛋白抗體的植物生產(chǎn)的實例除了此處描述的，使用上面詳述的所有基本實驗方案，包括與質(zhì)粒構(gòu)建(實施例1和2)、載體構(gòu)建(實施例3和4)和轉(zhuǎn)化和再生(實施例6)有關(guān)的那些方案，在植物細(xì)胞、植物愈傷組織和全株植物中產(chǎn)生IgG抗體。使用這些方法產(chǎn)生的IgG抗體根據(jù)實施例5和7-11中提供的基本方案進(jìn)行分子和生物化學(xué)分析。
實施例12.用于產(chǎn)生IgG的質(zhì)粒和載體用于這些實驗中的特異IgG是針對整聯(lián)蛋白受體αVβ3和αVβ5的IgG(也稱作抗-αVβ3，αVβ5雙整聯(lián)蛋白抗體)。
使用下面的質(zhì)粒(“HC”＝重鏈；“LC”＝輕鏈)
實施例13.IgG的植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化和再生使用WHISKERSTM轉(zhuǎn)化方法通過pDAB1472、pDAB1473、pDAB1474或pDAB1475直接-DNA遞送，處理玉米近交系“HiII”的植物細(xì)胞。這些質(zhì)粒在用于驅(qū)動編碼抗體的基因表達(dá)的調(diào)節(jié)元件上不同，以作為一項“試驗”來了解哪種元件組合將導(dǎo)致抗體的最高表達(dá)水平和積累。
“大規(guī)?！盬HISKERSTM方法每次利用約18ml壓緊的植物細(xì)胞(Petolino等人，植物分析的分子方法，Genetic Transformation of Plants，卷23，147-158頁，Springer-Verlag，Berlin(2003))。種植抗-雙整聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)化植物并通過近交玉米系“5XH751”傳粉以便產(chǎn)生子代種子，分析子代種子的抗體生產(chǎn)。
實施例14.估計IgG的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)用Third Wave Molecular Diagnostics的Invader試驗平臺預(yù)測抗-雙整聯(lián)蛋白構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)。該方法不像用于上面討論的IgA方案的方法，是基于雜交試驗而不是聚合酶的方法。將具有轉(zhuǎn)錄物的1-2份拷貝的植物細(xì)胞再生用于進(jìn)一步試驗。
實施例15.經(jīng)純化的IgG的還原和羧甲基化，然后蛋白水解取25μL樣品等分，通過MALDI MS測量“完整”蛋白質(zhì)的質(zhì)量。使用離心蒸發(fā)器將剩余的蛋白質(zhì)溶液在硅化微量離心管中完全干燥。向干燥蛋白質(zhì)加入180μL蛋白質(zhì)溶解緩沖液(6M鹽酸胍/0.4M碳酸氫銨，pH7.8)并通過抽吸動作混合樣品以實現(xiàn)充分溶解。向管中加入20μL 100mMDTT(還原試劑)。
將管密封、渦旋，并在65℃孵育1小時。然后讓管冷卻到室溫，離心30秒，并向管中加入40μL 200mM IAA(烷基化劑)溶液。將管在黑暗中室溫下孵育1小時。加入60μL DTT溶液以消耗未反應(yīng)的IAA，并允許管在室溫靜置30分鐘。
如下進(jìn)行經(jīng)還原/烷基化的蛋白質(zhì)樣品的脫鹽。將蛋白質(zhì)捕獲柱體(Michrom BioResources，目錄號004-25108-53)用2×500μL 100％乙腈(“ACN”)/0.1％TFA洗滌并用500μL 2％ACN/0.1％TFA平衡。向還原/烷基化的蛋白質(zhì)溶液加入4μL ACN和0.25μL TFA(至終濃度為2％ACN和0.2％TFA)并將該溶液上樣至蛋白質(zhì)捕獲柱體。將含有還原/烷基化的蛋白質(zhì)的管用100μL 2％ACN/0.1％TFA沖洗并將沖洗液上樣至柱體。用500μL 2％ACN/0.1％TFA洗滌結(jié)合蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)捕獲柱體。將經(jīng)脫鹽的蛋白質(zhì)用400μL 80％ACN/0.1％TFA洗脫到0.6mL硅化微量離心管中。
如下用胰蛋白酶消化經(jīng)脫鹽的蛋白質(zhì)樣品。將樣品在離心蒸發(fā)器中完全干燥，并重新溶解在100μL 100mM Tris緩沖液(pH8-8.5)中。向管中加入50μL胰蛋白酶溶液(Roche，目錄號1-418-025；臨消化步驟前將25μg溶于0.5ml 25mM碳酸氫銨緩沖液中)，并將樣品在37℃孵育16小時。消化后，在HPLC分離和/或MALDI MS分析前將樣品在-20℃保存。
實施例16.IgG胰蛋白酶消化物的HPLC分級分離系統(tǒng)設(shè)置
HPLC系統(tǒng)Hitachi LC(L-7100泵，L-7200自動進(jìn)樣器，L-7420UV/Vis檢測器)。
柱Magic C18，2.0mm(ID)×150mm(Michrom BioResources，目錄號901-61221-00)。
紫外檢測205nm。
自動注射使用200μL樣品環(huán)；注射體積100μL流速0.5mL/分鐘，恒速。
反壓讀數(shù)應(yīng)該為約2050-2100psi(在100％A)。
流動相A3％ACN，97％Milli-Q水，0.06％TFA。
B80％ACN，20％Milli-Q水，0.05％TFA。
方法
在硅化的微量離心管中收集1ml級分并將級分于分離后在離心蒸發(fā)器中干燥。用Gilson FC-203級分收集器收集級分。
實施例17.酶促去糖基化(PNGase-A步驟)在經(jīng)分離的胰蛋白酶消化液中，通過MALDI MS鑒定含有糖肽的級分。將這些級分中的剩余物質(zhì)(～50％)合并，在離心蒸發(fā)器中干燥，并重新溶解在10μL 20mM乙酸銨緩沖液(pH5.0)中。加入10μL肽-N-糖苷酶A(PNGase-A)溶液(Roche，目錄號1-642-995)，并將管在37℃孵育16小時。
實施例18.釋放的N-聚糖的純化使蛋白水解/PNGase-A消化液通過C18柱體(Peptide Macro Trap，Michrom Bioresources(目錄號004-25108-52)，根據(jù)生產(chǎn)商的方法預(yù)先調(diào)節(jié))并收集直流級分。用0.5mL 0.1％水性TFA洗滌柱體并將洗滌液與第一直流級分合并。這些級分含有釋放的寡糖，用E-柱體(QA-Bio，目錄號CE001，批號A2AA-01)根據(jù)生產(chǎn)商的方法進(jìn)一步純化這些級分。用50％乙腈/0.1％TFA從E-柱體洗脫寡糖并將其在離心蒸發(fā)器中完全干燥。將聚糖樣品重新溶解在2.5μL高純度Milli-Q水中并根據(jù)生產(chǎn)商的方法通過C18 Zip Tips(Millipore)。經(jīng)純化的聚糖樣品可用于MALDI MS分析。
用100％ACN/0.1％TFA洗脫C18柱體上捕獲的脫糖基化的肽，將其在離心蒸發(fā)器中濃縮，并通過MALDI MS檢查。
實施例19.MALDI MS和PSD以正reflectron模式運行的Voyager DE-STR(Applied BioSystems，serial no.4260)MALDI-Tof質(zhì)譜儀被用于得到肽和寡糖(聚糖)的數(shù)據(jù)。儀器以正線性模式運行以得到完整蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)。
將分離的胰蛋白酶消化液的頭4個HPLC級分(在層析圖前面洗脫并含有鹽的級分)溶解在10μL 0.1％TFA中并合并；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案用C18 ziptips對肽脫鹽。將剩余的HPLC級分溶解在3μL 50％ACN/0.1％TFA中，并合并一些級分。將每種級分(合并后)之50％沉積在MALDI板(1.5μL)上，用1μL CHCA基質(zhì)溶液覆蓋并空氣干燥。對發(fā)現(xiàn)含有糖肽的級分，剩余的50％用上面描述的PNGase-A進(jìn)一步處理。
用于得到肽的MALDI譜的設(shè)置。加速電壓設(shè)為20kV。柵壓設(shè)為加速電壓的66％。延遲時間在215到350nsec之間變動。激光設(shè)置在2200到3000之間變動。每個光譜中對500個采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行平均。用下面的標(biāo)準(zhǔn)肽(Applied BioSystems)校準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)度脫-Arg1-緩激肽，m/z904.4；血管緊張肽I，m/z1，296.6；Glu1-血纖肽B，m/z1570.6；神經(jīng)降壓肽，m/z1672.9；ACTH(clip1-17)，m/z2093.0；ACTH(clip18-39)，m/z2465.1；ACTH(clip7-38)，m/z5730.6。
用鏡面電壓比(mirror voltage ratio)1.12記錄MALDI-PSD譜；使用下面的鏡面比(mirror ratio)1、0.85、0.75、0.65、0.55、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05。
用于得到寡糖(聚糖)的MALDI譜的設(shè)置。加速電壓設(shè)為20kV。柵壓設(shè)為加速電壓的69％。延遲時間設(shè)為215nsec。激光設(shè)置為約3000。每個光譜中對500個采集的數(shù)據(jù)進(jìn)行平均。用下面的標(biāo)準(zhǔn)寡糖校準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)度(GlcNAc)2(Man)5，m/z(MNa+)＝1257.46；(GlcNAc)4(Man)3(Fuc)，m/z(MNa+)＝1485.56；(Gal)(GlcNAc)4(Man)3(Fuc)，m/z(MNa+)＝1647.62；(Gal)2(GlcNAc)4(Man)3(Fuc)，m/z(MNa+)＝1809.68。將1μL經(jīng)純化的聚糖樣品沉積在MALDI樣品板上，用1μL sDHB基質(zhì)(66％乙腈中的18mg/mL2，5-二羥基苯甲酸和66％乙腈中的15mg/mL2-羥基-5-甲氧基苯甲酸的9∶1 v/v混合物)覆蓋并空氣干燥。
用于得到完整蛋白質(zhì)的MALDI譜的條件。儀器以正線性模式運行。加速電壓設(shè)為25kV。柵壓設(shè)為加速電壓的89％。延遲時間為750到1500nsec。激光設(shè)置為約3300。低質(zhì)量閾(mass gate)設(shè)為5000Da。在每一光譜中對兩組各500個采集數(shù)據(jù)進(jìn)行平均。用下面的標(biāo)準(zhǔn)(Sequazyme IgG1，APPlied BioSystems，目錄號GEN602151)校準(zhǔn)質(zhì)量標(biāo)度m/z74249，雙帶電的Sequazyme IgG1單體；m/z148500，單帶電的Sequazyme IgG1單體。
用下面的方法進(jìn)行質(zhì)譜前的蛋白質(zhì)樣品脫鹽。將C4 zip-tip(Millipore)先用50％CAN處理，然后用0.1％TFA平衡；使蛋白質(zhì)樣品的等分試樣通過zip-tip 10次，然后用過的溶液返回到最初的小瓶中；將結(jié)合蛋白質(zhì)的zip-tip用0.1％TFA洗滌并用3μL 80％ACN/0.1％TFA將蛋白質(zhì)直接洗脫到MALDI板上(逐滴地)。將經(jīng)脫鹽的蛋白質(zhì)樣品用1μL基質(zhì)(芥子酸，來自Sequazyme試劑盒，Applied BioSystems，目錄號P2-3143-00)覆蓋并空氣干燥。
MALDI MS數(shù)據(jù)的分析。用Data Explorer v4.0軟件(AppliedBioSystems)分析MALDI MS和MALDI-PSD數(shù)據(jù)。使用MassLynx v3.4軟件(Micromass)將肽和糖肽的分子量和氨基酸序列歸于IgG樣品的序列。
實施例20.完整IgG的MALDI MS針對三個獨立轉(zhuǎn)化事件(即，事件660、661和663)(從玉米表達(dá)的IgG)和CHO-表達(dá)的IgG(數(shù)據(jù)未顯示)，用“完整”親和-純化的IgG蛋白質(zhì)的樣品進(jìn)行MALDI MS實驗。
測定的抗體輕鏈(LC)質(zhì)量在理論平均質(zhì)量(M＝23486 Da)的～1.0％以內(nèi)。完整裝配的抗體的測定質(zhì)量比預(yù)計的理論平均質(zhì)量(對于未糖基化蛋白質(zhì)，M＝145612 Da)高約1.7到2.0％。該差異可能通過重鏈的糖基化來解釋。
總的說來，所有四個“完整”抗體樣品(三個玉米表達(dá)的和一個CHO-表達(dá)的)的MALDI質(zhì)譜是裝配的IgG的典型質(zhì)譜。
實施例21.肽作圖結(jié)果針對所有三種玉米表達(dá)的IgG樣品和一種CHO-表達(dá)的IgG樣品(數(shù)據(jù)未顯示)得到肽作圖結(jié)果。針對所有樣品還得到了序列質(zhì)量覆蓋度(組合的胰蛋白酶和Asp-N肽圖)和胰蛋白酶肽圖(數(shù)據(jù)未顯示)。簡言之，對于所有抗體樣品中的重鏈和輕鏈，總體序列質(zhì)量覆蓋度為約90％到約100％。檢測了所有重鏈和輕鏈的N-末端片段。在所有樣品中，重鏈的N-末端片段含有pyro-Glu作為N-末端殘基，其是抗體中典型的翻譯后修飾。還檢測到與痕量未加工的N-末端重鏈片段(含有Gln作為N-末端殘基)一致的弱信號。在所有樣品中檢測了輕鏈的C-末端片段。在事件660和663的玉米-表達(dá)的抗體樣品中，重鏈的C-末端片段由完全大小的C-末端片段(以Lys449作為C-末端殘基)和Lys449缺失的C-末端片段(“無K”)的混合物代表。在C1-661樣品中僅檢測到C-末端重鏈片段的截斷(“無K”，即沒有Lys 449)的形式。在CHO-表達(dá)的抗體中僅檢測到C-末端重鏈片段的截斷(“無K”，即沒有Lys 449)的形式。通過MALDI-PSD實驗證實了所有N-末端胰蛋白酶消化片段和重鏈C-末端片段的序列。
實施例22.糖基化譜制作檢查了三種玉米表達(dá)的和一種CHO-表達(dá)的IgG抗體的一級結(jié)構(gòu)和糖基化并相互比較。在
圖19(事件660)、圖21(事件661)、圖23(事件663)和圖25(CHO-表達(dá))中提供了抗體樣品中觀察到的N-連接的聚糖(作為糖肽)的完整譜。如上面討論的，巖藻糖基化對于哺乳動物產(chǎn)生的糖蛋白為α1，6，對于植物產(chǎn)生的糖蛋白是α1，3。
在圖20A-B中(為事件660)，圖22A-C中(為事件661)，圖24A-B中(為事件663)，圖26A-B中(為CHO表達(dá))提供了代表性MALDI-TOF MS譜。圖22D提供了從H-T27糖肽釋放的N-聚糖的質(zhì)譜結(jié)果。該MALDI質(zhì)譜中的強度與中性N-聚糖的豐度基本上成比例。所有的完整抗體樣品的MALDI質(zhì)譜均是裝配的IgG的典型質(zhì)譜。
在玉米表達(dá)的重鏈樣品的Asn299上觀察到的兩種最豐富的聚糖具有組成HexNAc2-Hex2-Xyl-Fuc(或N2H2XF)和HexNAc2-Hex3-XyI-Fuc(或N2H3XF)，而CHO-表達(dá)的重鏈樣品中最豐富的聚糖具有組成HexNAc4-Hex3-Fuc(或N4H3F)和HexNAc4-Hex4-Fuc(或N4H4F)。由單一HexNAc單糖修飾的重鏈的水平看起來在玉米表達(dá)的抗體樣品中比在CHO-表達(dá)的抗體樣品中更高。CHO-表達(dá)的樣品中的N-糖基化似乎比玉米表達(dá)的抗體樣品中的糖基化具有更大異質(zhì)性(多樣性)。
通過對該工作中檢查的所有抗體樣品的MALDI-PSD實驗，證實了H-T27重鏈胰蛋白酶解片段(即，含有Asn299糖基化位點的片段)和其變體(用單一HexNac單糖修飾的變體)的序列。然而，作為游離N-聚糖觀察到的糖型的信號強度與作為糖肽觀察到的信號強度稍有不同。在H-T27肽糖型的MALDI質(zhì)譜中，具有聚糖HexNAc2-Hex2-Xyl-Fuc(或N2H2XF)和HexNAc2-Hex3-Xyl-Fuc(或N2H3XF)的糖肽產(chǎn)生最強的信號。相比，在酶促釋放的游離寡糖的MALDI質(zhì)譜中，聚糖HexNAc2-Hex3-Xyl(或N2H3X)、HexNAc2-Hex3-Xyl-Fuc(或N2H3XF)和HexNAc2-Hex5(或N2H5)表現(xiàn)為主要種類。根據(jù)文獻(xiàn)報導(dǎo)(D.Harvey，Mass Spectrometry Reviews 18349-451(1999))和我們自己的發(fā)現(xiàn)，游離聚糖的MALDI MS應(yīng)該給出N-聚糖的相對量的通常更準(zhǔn)確的估計。在任一情況中，通過兩種方法(即，糖肽和游離聚糖)，均觀察到N-聚糖HexNAc2-Hex3-Xyl-Fuc(或N2H3XF)是最豐富的種類。
在本工作中檢查的抗體樣品中沒有發(fā)現(xiàn)O-連接的糖基化證據(jù)。
僅僅為了清楚地理解而給出了前面的詳細(xì)描述，并且不應(yīng)將所述描述理解為不必要的限制，因為修飾對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
盡管本發(fā)明已經(jīng)聯(lián)系其特定實施方案進(jìn)行了描述，但是應(yīng)該理解能夠進(jìn)行其它修飾并且本申請旨在覆蓋一般性地按照本發(fā)明的原則對本發(fā)明作出的任何改變、應(yīng)用或者改編，并且所述改變、應(yīng)用或者改編包括與本公開的偏離，所述偏離在本發(fā)明所屬領(lǐng)域的公知和或者常規(guī)實踐的范圍內(nèi)并且可應(yīng)用于此前提出的基本特征并且落入所附權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
序列表<110>陶氏化學(xué)公司(The Dow Chemical Company)美國陶氏益農(nóng)公司(Dow Agrosciences，LLC)<120>巖藻糖基化降低的免疫球蛋白的植物生產(chǎn)<130>038136-5001-CA<150>US60/429,385<151>2002-11-27<150>PCT/US03/037905<151>2003-11-28<160>85<170>PatentIn version3.1<210>1<211>1494<212>DNA<213>單純皰疹病毒<220>
<221>CDS<222>(1)..(1494)<220>
<221>misc_feature<223>HSV重鏈序列<400>1atg gga tgg agc tgg atc ttt ctc ttc ctc ctg tca gga gct gca ggt 48Met Gly Trp Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Ala Ala Gly1 5 10 15gtc cat tgc cag gtt cag ctc gtg cag tca ggt gct gag gtg aag aag 96Val His Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30cct ggc tcc tcg gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggt tcc ttc144Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Ser Phe35 40 45agc tcc tat gct atc aac tgg gtg agg caa gct cct gga caa ggg crt192Ser Ser Tyr Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60gag tgg atg gga ggg ctc atg cct atc ttt ggg aca aca aac tac gcg240Glu Trp Met Gly Gly Leu Met Pro Ile Phe Gly Thr Thr Asn Tyr Ala65 70 75 80cag aag ttc cag gac agg ctc acg att acc gcg gac gta tcc acg agt288Gln Lys Phe Gln Asp Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Val Ser Thr Ser85 90 95aca gcc tac atg caa ctg agc ggc ctg aca tat gaa gac acg gcc atg336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Tyr Glu Asp Thr Ala Met
100 105 110tat tac tgt gcg aga gtt gcc tac atg ctt gaa cct acc gtc act gca 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Ala Tyr Met Leu Glu Pro Thr Val Thr Ala115 120 125ggt ggt ttg gac gtc tgg ggc caa ggg acc ttg gtc acc gtc tcc tcc 432Gly Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser130 135 140gca tcc ccg acc agc ccg aag gtc ttc ccg ctg agc ctc tgt agc acc 480Ala Ser Pro Thr Ser Pro Lys Val Phe Pro Leu Ser Leu Cys Ser Thr145 150 155 160cag cca gat ggg aac gtg gtc atc gcc tgc ctg gtc cag ggc ttc ttc 528Gln Pro Asp Gly Asn Val Val Ile Ala Cys Leu Val Gln Gly Phe Phe165 170 175cct cag gag cca ctc agt gtg acc tgg agc gaa agc gga cag ggc gtg 576Pro Gln Glu Pro Leu Ser Val Thr Trp Ser Glu Ser Gly Gln Gly Val180 185 190acc gcc agg aac ttc cca ccc agc cag gat gcc tcc gga gac ctg tac 624Thr Ala Arg Asn Phe Pro Pro Ser Gln Asp Ala Ser Gly Asp Leu Tyr195 200 205acc acg tcc agc cag ctg acc ctt ccg gcc aca cag tgc cta gcg ggc 672Thr Thr Ser Ser Gln Leu Thr Leu Pro Ala Thr Gln Cys Leu Ala Gly210 215 220aag tcc gtg aca tgc cac gtg aag cac tac acg aat ccc agc cag gat 720Lys Ser Val Thr Cys His Val Lys His Tyr Thr Asn Pro Ser Gln Asp225 230 235 240gtg act gtg ccc tgc cca gtt ccc tca act cca cct acc cca tct ccc 768Val Thr Val Pro Cys Pro Val Pro Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro245 250 255tcg act cca cct acc cca tct ccc tca tgc tgc cac ccc agg ctg tca 816Ser Thr Pro Pro Thr Pro Ser Pro Ser Cys Cys His Pro Arg Leu Ser260 265 270ctg cac agg cct gcc ctc gag gac ctg ctc tta ggt tcg gaa gcg aac 864Leu His Arg Pro Ala Leu Glu Asp Leu Leu Leu Gly Ser Glu Ala Asn275 280 285ctc acg tgc aca ctc acc ggc ctg aga gat gcg tca ggt gtc acc ttc 912Leu Thr Cys Thr Leu Thr Gly Leu Arg Asp Ala Ser Gly Val Thr Phe290 295 300acc tgg acg ccc tca agt ggt aag agc gct gtt caa ggc cca cct gag 960Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu305 310 315 320cgt gac ctc tgt ggc tgc tac agc gtg tcc agt gtc ctt ccg ggc tgt 1008Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys325 330 335gcc gag cct tgg aat cat ggg aag acc ttc act tgc act gct gcc tac 1056Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr340 345 350
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Thr Trp Thr Pro Ser Ser Gly Lys Ser Ala Val Gln Gly Pro Pro Glu305 310 315 320Arg Asp Leu Cys Gly Cys Tyr Ser Val Ser Ser Val Leu Pro Gly Cys325 330 335Ala Glu Pro Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr340 345 350Pro Glu Ser Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn355 360 365Thr Phe Arg Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu370 375 380Ala Leu Asn Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser385 390 395 400Pro Lys Asp Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro405 410 415Arg Glu Lys Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly420 425 430Thr Thr Thr Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp435 440 445Trp Lys Lys Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu450 455 460Pro Leu Ala Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg Leu Ala Gly Lys Pro465 470 475 480Thr His Val Asn Val Ser Val Val Met Ala Glu Val Asp Gly Thr Cys485 490 495Tyr<210>3<211>57<212>DNA<213>人工序列<220>
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tgg aat cat ggg aag acc ttc act tgc act gct gcc tac ccc gag agc 1008Trp Asn His Gly Lys Thr Phe Thr Cys Thr Ala Ala Tyr Pro Glu Ser325 330 335aag acc ccg cta acc gcc acc ctc tcg aaa tcc ggc aac aca ttc cgg 1056Lys Thr Pro Leu Thr Ala Thr Leu Ser Lys Ser Gly Asn Thr Phe Arg340 345 350ccc gag gtc cac ctg ctg ccg ccg ccg tcg gag gag ctg gcc ctg aac 1104Pro Glu Val His Leu Leu Pro Pro Pro Ser Glu Glu Leu Ala Leu Asn355 360 365gag ctg gtg acg ctg acg tgc ctg gcg cgc ggc ttc agc ccc aag gac 1152Glu Leu Val Thr Leu Thr Cys Leu Ala Arg Gly Phe Ser Pro Lys Asp370 375 380gtg ctg gtt cgc tgg ctg cag ggc tca cag gag ctg cct agg gag aag 1200Val Leu Val Arg Trp Leu Gln Gly Ser Gln Glu Leu Pro Arg Glu Lys385 390 395 400tac ctg act tgg gca tcc cgg cag gag ccc agc caa ggc acc acc acc 1248Tyr Leu Thr Trp Ala Ser Arg Gln Glu Pro Ser Gln Gly Thr Thr Thr405 410 415ttc gct gtg acc tcg ata ctg cgc gtg gca gcc gag gac tgg aag aag 1296Phe Ala Val Thr Ser Ile Leu Arg Val Ala Ala Glu Asp Trp Lys Lys420 425 430ggt gac acc ttc tcc tgc atg gtg ggc cac gag gcc ctt ccg ctg gcc 1344Gly Asp Thr Phe Ser Cys Met Val Gly His Glu Ala Leu Pro Leu Ala435 440 445ttc aca cag aag acc atc gac cgc 1368Phe Thr Gln Lys Thr Ile Asp Arg450 455<210>6<211>456<212>PRT<213>人工序列<220>
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權(quán)利要求
1.植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白具有含至少一種缺少巖藻糖的糖肽的糖肽譜。
2.權(quán)利要求1的免疫球蛋白，其中所述至少一種糖肽含有天冬酰胺(Asn)殘基。
3.植物產(chǎn)生的免疫球蛋白的重鏈(HC)或者輕鏈(LC)，其中HC或者LC具有含至少一種缺少巖藻糖的糖肽的糖肽譜。
4.權(quán)利要求3的HC，其中所述至少一種糖肽含有CH2區(qū)域中的天冬酰胺(Asn)殘基。
5.植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白具有含至少一種缺少巖藻糖的聚糖的游離聚糖譜。
6.權(quán)利要求5的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白含有天冬酰胺(Asn)殘基。
7.權(quán)利要求5的免疫球蛋白，其中所述聚糖譜與
圖12中提供的聚糖譜相同或者基本上相同。
8.權(quán)利要求5的免疫球蛋白，其中所述聚糖選自3Man，2GlcNAc，1Xyl；2Man，2GlcNAc，1Xyl；3Man，3GlcNAc，1Xyl；3Man，2GlcNAc；3Man，3GlcNAc；4Man，2GlcNAc；5Man，2GlcNAc；和6Man，2GlcNAc，其中Man＝甘露糖，GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺，Xyl＝木糖。
9.權(quán)利要求5的免疫球蛋白，其中所述聚糖為3Man，2GlcNAc，1Xyl或2Man，2GlcNAc，1Xyl，其中Man＝甘露糖，GlcNAc＝N-乙酰葡糖胺，Xyl＝木糖。
10.權(quán)利要求5的免疫球蛋白，其中所述聚糖譜與
圖16中提供的聚糖譜之一相同或者基本上相同。
11.權(quán)利要求5的免疫球蛋白，其中所述聚糖選自H2N2X；H3N2；和H3N2X，其中H＝己糖，N＝HexNAc＝N-乙酰己糖，X＝木糖。
12.權(quán)利要求5的免疫球蛋白，其中所述聚糖選自N2H8；N2H3X；N2H3X；N2H4X；N2H5；N2H6；N2H7；N2H8；N3H3X；N2H4；和N2H5，其中H＝己糖，N＝HexNAc＝N-乙酰己糖，X＝木糖。
13.權(quán)利要求11或權(quán)利要求12的免疫球蛋白，其中己糖為甘露糖，N-乙酰己糖為N-乙酰葡糖胺。
14.權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白選自IgG、IgA、IgM、IgE和IgD。
15.權(quán)利要求14的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是IgA或者IgG。
16.權(quán)利要求14的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是具有重鏈和輕鏈的IgA抗體。
17.權(quán)利要求16的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是抗單純皰疹病毒抗體。
18.權(quán)利要求14的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是具有重鏈和輕鏈的IgG抗體。
19.權(quán)利要求18的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是抗-雙整聯(lián)蛋白抗體。
20.權(quán)利要求19的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是抗-αVβ3，αVβ5雙整聯(lián)蛋白抗體。
21.權(quán)利要求5的免疫球蛋白，其中所述聚糖譜與
圖19中提供的聚糖譜相同或者基本上相同。
22.權(quán)利要求5的免疫球蛋白，其中所述聚糖譜與圖21中提供的聚糖譜相同或者基本上相同。
23.權(quán)利要求5的免疫球蛋白，其中所述聚糖譜與圖23中提供的聚糖譜相同或者基本上相同。
24.植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其含有至少一種沒有末端巖藻糖的附著聚糖。
25.權(quán)利要求24的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白在CH2區(qū)域中含有天冬酰胺(Asn)殘基。
26.植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其具有含至少一種缺少巖藻糖的聚糖的聚糖譜，其中使用基質(zhì)-輔助的激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TofMS)分析從該免疫球蛋白酶促釋放的游離N-連接的聚糖來確定該聚糖譜。
27.權(quán)利要求26的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是IgA。
28.權(quán)利要求27的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是抗-單純皰疹病毒抗體。
29.權(quán)利要求26的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是IgG。
30.權(quán)利要求29的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是抗-雙整聯(lián)蛋白抗體。
31.權(quán)利要求30的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是抗-αVβ3，αVβ5雙整聯(lián)蛋白抗體。
32.含有權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫球蛋白的植物細(xì)胞、植物組織、植物愈傷組織、小植株、全株植物或者種子。
33.權(quán)利要求32的植物細(xì)胞、植物組織、植物愈傷組織、或者種子，其中該細(xì)胞、組織、愈傷組織或者種子是單子葉植物的細(xì)胞、組織、愈傷組織或者種子。
34.權(quán)利要求33的植物細(xì)胞、植物組織、植物愈傷組織、或者種子，其中該單子葉植物是玉米植物。
35.權(quán)利要求32的小植株或者全株植物，其中該小植株或者全株植物是單子葉植物的。
36.權(quán)利要求35的植物細(xì)胞、植物組織、植物愈傷組織、或者種子，其中該單子葉植物是玉米植物。
37.權(quán)利要求32的種子，其中免疫球蛋白位于種子的胚乳中。
38.權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是人免疫球蛋白。
39.權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白含有缺少尾片的重鏈。
40.權(quán)利要求39的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是IgA抗體。
41.權(quán)利要求39的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是抗-單純皰疹病毒抗體。
42.權(quán)利要求3的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白的重鏈缺少尾片。
43.權(quán)利要求42的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是IgA抗體。
44.權(quán)利要求43的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白是抗-單純皰疹病毒抗體。
45.權(quán)利要求1或權(quán)利要求5的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白從用于生產(chǎn)該免疫球蛋白的植物分離。
46.單體抗體組合物，其含有至少一種具有如
圖12中提供的結(jié)構(gòu)1(3Man，2GlcNAc，1Xyl)的聚糖，其中Man＝甘露糖，GlcNAc＝乙酰葡糖胺，Xyl＝木糖。
47.單體抗體組合物，其含有至少一種具有如
圖12中提供的結(jié)構(gòu)2(2Man，2GlcNAc，1Xyl)的聚糖，其中Man＝甘露糖，GlcNAc＝乙酰葡糖胺，Xyl＝木糖。
48.植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其含有缺少附著的具有巖藻糖的聚糖的氨基酸片段，其中當(dāng)該免疫球蛋白是哺乳動物產(chǎn)生的時候，該免疫球蛋白在相同的氨基酸片段或者基本上相同的氨基酸片段上具有附著的帶巖藻糖的聚糖。
49.植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其中對于特定氨基酸片段，其含有聚糖譜，其中當(dāng)該免疫球蛋白是哺乳動物產(chǎn)生的時候，對于相同的氨基酸序列或者基本上相同的氨基酸片段，該免疫球蛋白具有相同或者基本上相同的聚糖譜。
50.植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其包含具有缺少巖藻糖的附著聚糖的氨基酸片段，其中當(dāng)該免疫球蛋白是哺乳動物產(chǎn)生的時候，該免疫球蛋白在相同的氨基酸片段或者基本上相同的氨基酸片段上也缺少具有巖藻糖的附著聚糖。
51.植物產(chǎn)生的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白具有游離聚糖譜，該聚糖譜含有缺少巖藻糖的聚糖，其中當(dāng)該免疫球蛋白是哺乳動物產(chǎn)生的時候，該免疫球蛋白具有含相同的也缺少巖藻糖的聚糖的游離聚糖譜。
52.權(quán)利要求48、權(quán)利要求49、權(quán)利要求50、或權(quán)利要求51的免疫球蛋白，其中所述哺乳動物產(chǎn)生的免疫球蛋白在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。
53.權(quán)利要求48、權(quán)利要求49、權(quán)利要求50、或權(quán)利要求51的免疫球蛋白，其中所述植物產(chǎn)生的免疫球蛋白在玉米細(xì)胞中產(chǎn)生并且所述哺乳動物產(chǎn)生的免疫球蛋白在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生。
54.產(chǎn)生表達(dá)免疫球蛋白的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法，其中所述免疫球蛋白具有至少一種沒有巖藻糖的附著聚糖，所述方法包括通過向植物細(xì)胞導(dǎo)入含有編碼該免疫球蛋白的重鏈和輕鏈的核酸序列的單一載體，轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中每種核酸有效連接啟動子；和培養(yǎng)經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以產(chǎn)生表達(dá)免疫球蛋白的植物細(xì)胞，其中該免疫球蛋白具有至少一種沒有巖藻糖的附著聚糖。
55.權(quán)利要求54的方法，其還包括從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞分離免疫球蛋白。
56.權(quán)利要求54的方法，其還包括從經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或者轉(zhuǎn)化的全株植物。
57.權(quán)利要求56的方法，其還包括從轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或者轉(zhuǎn)化的全株植物分離免疫球蛋白。
58.權(quán)利要求54的方法，其中重鏈和輕鏈的序列有效連接到相同啟動子上。
59.權(quán)利要求54的方法，其中重鏈和輕鏈的序列有效連接到不同啟動子上。
60.權(quán)利要求54的方法，其中啟動子是組成性啟動子。
61.權(quán)利要求60的方法，其中組成性啟動子是35S CaMV啟動子或者玉米泛素-1啟動子。
62.權(quán)利要求54的方法，其中啟動子是種子-特異啟動子。
63.權(quán)利要求54的方法，其中啟動子是胚乳-特異的啟動子。
64.權(quán)利要求54的方法，其中載體選自pDAB8505、pDAB1472、pDAB1473、pDAB1474、和pDAB1475。
65.選自pDAB8505、pDAB1472、pDAB1473、pDAB1474、和pDAB1475的載體。
66.權(quán)利要求54的方法，其中用農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法或者WHISKERSTM轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。
67.產(chǎn)生分離的單體抗-單純皰疹病毒抗體的方法，該方法包括(i)向植物細(xì)胞中導(dǎo)入具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO5和SEQ ID NO9或SEQ ID NO13的核酸--每種核酸均與啟動子有效連接，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；(ii)培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞以表達(dá)所導(dǎo)入的核酸；和(iii)分離該植物細(xì)胞產(chǎn)生的單體抗-單純皰疹病毒抗體。
68.權(quán)利要求67的方法，其還包括從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再生轉(zhuǎn)化的植物。
69.含有選自SEQ ID NO15(pDAB635)、SEQ ID NO16(pDAB16)、SEQ ID NO17(pDAB637)、SEQ ID NO84(pDAB3014)、和SEQ ID NO85(pDAB8505)的核酸序列的核酸分子。
70.含有編碼SEQ ID NO10或SEQ ID NO14所編碼的氨基酸的核酸序列的經(jīng)分離的核酸分子。
71.含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO5的經(jīng)分離的核酸分子。
72.含有SEQ ID NO9或SEQ ID NO13的經(jīng)分離的核酸分子。
73.含有SEQ ID NO1或SEQ ID NO5的經(jīng)分離的載體或者質(zhì)粒。
74.含有編碼SEQ ID NO2或SEQ ID NO6所編碼的氨基酸的核酸序列的經(jīng)分離的核酸分子。
75.權(quán)利要求1的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白含有包含SEQ IDNO6的氨基酸序列的重鏈。
76.權(quán)利要求1的免疫球蛋白，其中該免疫球蛋白含有包含SEQ IDNO14的氨基酸序列的輕鏈。
77.含有SEQ ID NO9或SEQ ID NO13的分離的載體或者質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫球蛋白的植物生產(chǎn)，其中附著到該免疫球蛋白上的至少一部分聚糖缺少巖藻糖。本發(fā)明還提供了用于產(chǎn)生這些免疫球蛋白的構(gòu)建體、質(zhì)粒、載體、經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織、經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物組織(例如，葉子、種子、塊莖，等等)和經(jīng)轉(zhuǎn)化的全株植物；還提供了產(chǎn)生免疫球蛋白的方法、通過所公開的方法產(chǎn)生的免疫球蛋白，和這些免疫球蛋白的用途。
文檔編號A01H1/00GK1984993SQ200380109232
公開日2007年6月20日 申請日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月27日
發(fā)明者K·布里格斯, T·格蘭茨, M·B·海因, A·C·希亞特, A·S·卡諾烏普, W·H·K·安德遜, D·帕雷蒂, J·佩托利洛, B·魯賓－威爾遜, D·泰勒, J·L·羅伯茨 申請人:陶氏化學(xué)公司, 美國陶氏益農(nóng)公司