專利名稱：印度芥菜陽離子輸出轉(zhuǎn)運蛋白家族的基因BjCET2及其蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物金屬陽離子轉(zhuǎn)運蛋白領(lǐng)域，特別是關(guān)于印度芥菜(Brassica juncea)CE(cation-efflux transporters)家族Zn、Ni、Cd、Co等重金屬離子跨膜運載蛋白的基因序列和氨基酸序列。
背景技術(shù)：
CE(陽離子輸出轉(zhuǎn)運蛋白cation-efflux transporters)家族的金屬陽離子跨膜運載蛋白對生物體細胞內(nèi)金屬離子的胞外輸出和胞內(nèi)液泡的區(qū)域化隔離，提高金屬離子的抗性和富集量發(fā)揮著關(guān)鍵作用。Nies和Silver(1995)首先在細菌中鑒定出CDF(cation diffuse facilitor proteins)家族，之后在真菌、植物和動物中均發(fā)現(xiàn)有這類運載蛋白。其典型的結(jié)構(gòu)特征是具有6個跨膜(TM，transmembrane)結(jié)構(gòu)域(TM1-6)，1個N端特征氨基酸序列(SLAI/V M/L TDAA/LHL/MLT/SD)和1個C端陽離子輸出域。另外，在真核生物家族成員的TM4和TM5之間含有一個可變的富含His區(qū)，位于細胞質(zhì)內(nèi)，推測其與金屬離子的結(jié)合和專一性有關(guān)(圖1)。由于缺乏CDF運載蛋白動力學(xué)的基本信息，但已知所鑒定的該家族成員具有陽離子輸出功能，所以Maser等(2001)建議將其重命名為CE(cation-efflux proteins)家族更為準確。
CE家族成員具有很高的蛋白質(zhì)序列差異和大小變化(300-750個殘基之間)，一些被認為催化重金屬吸收，而另一些被認為催化重金屬輸出。在細胞質(zhì)膜和細胞內(nèi)膜上均發(fā)現(xiàn)有該家族的不同成員。已鑒定有特定功能的該家族成員是哺乳動物的ZnT1、2、3和4運載蛋白，參與Zn的胞外輸出(ZnT1，4)和胞內(nèi)區(qū)室的輸入(ZnT2，3)(Huang L，Gitschier J 1997.Nature Gen，17292-297)；酵母的COT1與Co的抗性有關(guān)，酵母的ZRC1與Zn、Cd抗性有關(guān)(Li L，kaplan J 1998.J Biol Chem，27322181-22187)；擬南芥的ZAT(AtMTP1)與Zn的抗性及Zn在根部的積累有關(guān)(Van der Zaal BJ et al.，1999.Plant Physiol，1991047-1055)。這些蛋白的表達對于提高金屬的耐性已經(jīng)在植物和異源表達的酵母中得到證明。在擬南芥中過量表達Zn運載蛋白基因ZAT1，其根部比對照植物累積了高濃度的Zn，在200μM的Zn水培條件下，對照植株的根生長被抑制了85％，而轉(zhuǎn)基因植株的根只被抑制了15％(Vander Zaal BJ et al.，1999.Plant Physiol，1991047-1055)；COT1和ZRC1位于酵母的液泡膜上，參與了液泡對重金屬的隔離，其缺陷型酵母表現(xiàn)了對Co、Zn和Cd的敏感性，而過量表達則提高了酵母對Co和Zn的抗性。利用COT1和ZRC1缺陷型酵母進行功能互補實驗，對于鑒定動植物CE家族成員發(fā)揮了重要作用，其中包括T.goesingense中對Ni超富集起主要作用的跨膜運載蛋白基因TgMTP1的克隆和鑒定。目前已從Zn/Cd超富集植物T.caerulescens中克隆和分離出ZTP1、ZNT1和ZNT2三種Zn運載蛋白cDNAs(Pence N S etal.，2000.Proc Natl Acad Sci USA，974956-4960；Assucao et al.，2001.Plant，Cell and Environment，24217-226)，正常和缺Zn條件下它們在T.caerulescens中的表達水平均遠高于非超富集植物T.arvense，預(yù)示三者在植物重金屬超富集中起重要作用。ZTP1的cDNA具有1340個堿基，編碼的推測蛋白為393個氨基酸，與擬南芥的ZAT1 cDNA的核苷酸和氨基酸序列的一致性分別達到90％和75％，歸屬于CE家族，主要在葉部表達，在根部也有表達。ZTP1基因的表達與Zn供給無關(guān)，對于Zn在植物體內(nèi)的螯合和液泡隔離起重要作用。ZNT1和ZNT2的cDNA分別具有1375和1520個堿基，其編碼的推測蛋白分別為409和423個氨基酸，與擬南芥的ZIP4 cDNA的核苷酸序列的一致性分別達到90％和83％，氨基酸序列的一致性分別達到76％和65％。二者具有典型的ZIP家族結(jié)構(gòu)特征，歸屬于ZIP家族，主要在根部表達，對Zn的吸收和轉(zhuǎn)運起主要作用。
Persans等(2001)發(fā)現(xiàn)T.goesingense對Ni的超富集似乎被增強的Ni在葉片液泡內(nèi)的積累所控制，并克隆了推斷為液泡重金屬運載蛋白的基因，其編碼產(chǎn)物命名為金屬忍耐蛋白(metal tolerant protein，TgMTPs)(Persans MW et al.，2001.Proc Natl Acad Sci USA，989995-10000)。這些蛋白擁有所有CE家族成員的特征，是由同一基因(TgMTP1)序列產(chǎn)生的未拼接(unspliced，TgMTP1t1)和拼接的(spliced，TgMTP1t2)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。它們在酵母中異源表達可互補TgMTP1同源基因COT1和ZRC1的缺陷型敏感系，說明TgMTP1s運載金屬離子進入酵母液泡中的方式類似于COT1和ZRC1。拼接的和未拼接的TgMTP1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在推斷的富含組氨酸的金屬結(jié)合域內(nèi)存在差異，而這些差異在其運載金屬離子的專一性上得到了反映。在酵母中TgMTP1t1表達可以抗高濃度的Cd、Co和Zn，而表達TgMTP1t2可以抗高濃度的Ni。TgMTP1在T.goesingense中高水平表達，解釋了該植物能在莖葉液泡中累積Ni的超富集能力。
印度芥菜(Brassica juncea，BJ)又稱春菜，是一種高產(chǎn)、快生芥科植物，具有相對較高的多種重金屬富集能力，如Cd、Cr、Ni、Zn、Cu、Au、Se、等，是目前利用植物修復(fù)技術(shù)(phytoremediation)清除污染土壤和水體中重金屬和放射性物質(zhì)的主要模式植物。研究表明，0.4mg/L Cd處理7天的BJ，其莖葉(干重)富集的Cd可達310mg/kg(Salt DE et al.，1995.PlantPhysiol，109(4)1427-1433)，已達到Cd的超富集標準(＞100mg/kg)；BJ富Pb量可達其干重的3.5％(Brown K S，1995.BioScience，45(9)579-585)，在富鉛土壤中(2500ppmPb)，每千克土壤添加22.0g的HEDTA可使BJ莖葉中Pb含量從40mg/kg提高到10,600mg/kg；BJ具有較強的硒富集和生物轉(zhuǎn)化作用，其硒酸鹽含量可達1575mg/kg，占總硒量的75％，有機硒含量可達630mg/kg，占總硒量的25％，而且沒有其他毒性化合物生成，是補硒的理想物質(zhì)；在含金土壤中BJ生長得特別茂盛，它們的根系特別善于吸收土地中的Au、Ni等貴金屬，噴灑硫氰酸銨溶液，能迅速溶解土壤中的黃金，從而能提高近5倍的黃金吸收量；在切爾諾貝利核電站附近遭受核輻射污染的土壤，只有BJ生長得很旺盛，美國一些科學(xué)家認為利用印度芥菜和向日葵可以清除其周圍大約90％的放射性物質(zhì)Cs和Sr。因此，印度芥菜蘊藏著豐富的基因資源，利用基因工程技術(shù)挖掘和轉(zhuǎn)化其金屬離子的富集和耐性基因，可以培育具有產(chǎn)業(yè)化潛力的超富集和富集金屬離子的植物品種，對于清除環(huán)境重金屬污染以及提高人類食品的礦質(zhì)營養(yǎng)、增進人類健康方面具有重要應(yīng)用價值，并將產(chǎn)生積極的社會效益、生態(tài)效益和經(jīng)濟效益。目前國際上還未見印度芥菜CE家族金屬陽離子跨膜運載蛋白基因的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供印度芥菜CE家族的金屬陽離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白，以及編碼該蛋白的新基因，為今后開發(fā)基因工程產(chǎn)品奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種印度芥菜CE家族金屬陽離子跨膜運載蛋白分子，它為如下蛋白質(zhì)分子(i)或(ii)(i)具有附圖11所述的氨基酸序列；(ii)在附圖11限定的氨基酸序列經(jīng)過取代，缺失或疊加一個或幾個氨基酸衍生的蛋白質(zhì)且與(i)的蛋白質(zhì)具有相同的功能。
較佳地，所述的蛋白質(zhì)分子具有附圖11所述的氨基酸序列，也就是本發(fā)明的BjCET2蛋白。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種DNA分子，它包括編碼所述的印度芥菜CE家族金屬陽離子跨膜運載蛋白分子的核苷酸序列。
較佳地，本發(fā)明所述的DNA分子編碼附圖11所示的氨基酸序列；進一步優(yōu)選該DNA分子為附圖11所述的DNA序列，該分子編碼附圖11所示的氨基酸序列。
圖11中DNA序列的編碼框(ORF)為64-1224位。由于密碼子的簡并性，所以與圖11的64-1224位核苷酸同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出圖11所示的BjCET2氨基酸序列。
本發(fā)明的DNA分子是采用如下方法獲得的首先，用Cd2+脅迫處理印度芥菜，提取總RNA；再以總RNA為模板進行逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)，得到印度芥菜的ss cDNA；然后根據(jù)Genebank中注冊的Ni/Cd超富集植物T.goesingensed的轉(zhuǎn)運蛋白基因TgMTP1和擬南芥(A.thalia na)的植物轉(zhuǎn)運蛋白基因ZAT mRNA序列的N端和C端保守區(qū)設(shè)計了一對簡并引物P1(5’-ggcggaattcatggagtcttcaagt-3’)和P2(5’-cccggatcccatgactg/aata/gttgtactc-3’)，以脅迫處理的印度芥菜sscDNA為模板進行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T Easy載體(Prome ga)，由上海聯(lián)眾基因公司測序，序列分析采用NCBI的BLAST軟件，得到了含有目標基因的片斷；為獲得目標基因mRNA的全長序列，依據(jù)已知序列設(shè)計引物，采用ClONTECH公司的SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit進行5’-RACE和3’-RACE(具體操作規(guī)程參見試劑盒說明書)，得到了圖7所示的BjCET1全長cDNA核苷酸。
由于CE家族的多成員性，已發(fā)現(xiàn)的擬南芥CE家族具有5個含有6個跨膜結(jié)構(gòu)域(TM)的CE成員，其編碼框(ORF)的C端具有很高的核苷酸和氨基酸序列同源性。因此本發(fā)明5’-RACE依據(jù)已獲得的印度芥菜CE成員核苷酸和氨基酸序列，并參照TgMTP1和ZAT的mRNA序列，在ORF的C端高保守區(qū)設(shè)計了5’-RACE的下游簡并引物，以期獲得印度芥菜的其它CE成員。為提高3’-RACE的效率和準確性，部分3’-RACE采用巢式PCR(Furuya Y，1993.Journal if Clinical Microbiology，31(6)，1637-1640.)。PCR反應(yīng)產(chǎn)物克隆入pGEM-T Easy載體(Promega)，由上海聯(lián)眾基因公司測序，得到了其它三個目的基因。見圖11，圖12，和圖13。
應(yīng)用本發(fā)明的基因序列或氨基酸序列進行轉(zhuǎn)基因開發(fā)基因工程產(chǎn)品在以下方面具有重大應(yīng)用價值1、可提高植物或作物的重金屬抗性，減少毒性重金屬在植物可食部位的積累，從而提高作物產(chǎn)量，增加食品的安全性。
2、培育高生物量的重金屬超富集植物，一方面用于重金屬(如Cd，Pb，Hg等)污染土壤或水體的生態(tài)治理。另一方面，對于Zn，Ni，Se等必需礦質(zhì)微量元素的富集，可以開發(fā)礦質(zhì)強化食品，對于增進人類健康具有積極意義。


圖1為推測的CE家族成員的拓撲結(jié)構(gòu)其中1表示胞內(nèi)部分 2表示胞外部分3表示脂膜 4表示CE特征序列5表示可變區(qū)圖2為以印度芥菜葉部第一鏈cDNA為模板的擴增產(chǎn)物電泳圖其中M表示分子量Maker 1，2，3和4分別表示4個電泳泳道圖3為BjCET1核苷酸和氨基酸序列片段圖4為用TMPRED軟件分析得到的BjCET1跨膜結(jié)構(gòu)示意5為BjCET1 5’-RACE PCR產(chǎn)物電泳6為BjCET1 3’-RACE PCR產(chǎn)物電泳7為BjCET1全長cDNA核苷酸和氨基酸序列圖8為含有CE家族成員BjCET1，BjCET2，BjCET3和BjCET4 DNA片段混合物的5’-RACE PCR產(chǎn)物電泳9為BjCET2 3’-RACE PCR產(chǎn)物電泳10為BjCET3(左)和BjCET4(右)3’-RACE PCR產(chǎn)物電泳11為BjCET2全長cDNA核苷酸和氨基酸序列圖12為BjCET3全長cDNA核苷酸和氨基酸序列圖13為BjCET4全長cDNA核苷酸和氨基酸序列圖14為BjCET1全長cDNA核苷酸PCR產(chǎn)物電泳15為穿梭載體pYES2質(zhì)粒圖譜圖16為雙價載體pBIN-mGFP5-ER質(zhì)粒圖譜圖17A為WT和各轉(zhuǎn)基因煙草植株檢測融合基因GFP的基因組DNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖其中泳道從左至右依次是陰性對照WT、陽性對照GFP、轉(zhuǎn)BjCET1-GFP植株1、轉(zhuǎn)BjCET1-GFP植株2、100bp DNA marker圖17B為各轉(zhuǎn)基因煙草植株檢測融合基因GFP的基因組DNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖其中泳道從左至右依次是轉(zhuǎn)BjCET1-GFP植株2、轉(zhuǎn)BjCET2-GFP植株1、轉(zhuǎn)BjCET3-GFP植株1、轉(zhuǎn)BjCET4-GFP植株1、100bp DNA marker具體實施方式
實施例1 印度芥菜CE家族的金屬陽離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白新基因的制備步驟1總RNA提取將3周生長期的印度芥菜植株轉(zhuǎn)入1/2×Hoagland液體培養(yǎng)基中(不含蔗糖和瓊脂)預(yù)培養(yǎng)，每兩天換一次新鮮培養(yǎng)液。一周之后向培養(yǎng)基中加入200mM CdCl2進行脅迫，每天換一次新鮮培養(yǎng)基，兩天之后采集(收割)根和葉片。對照為在同樣條件下培養(yǎng)的印度芥菜，但是培養(yǎng)基中未加CdCl2進行脅迫處理。采用QIAGEN公司的RNA提取試劑盒(Rneasy Plant Mini Kit)進行對照和CdCl2脅迫處理的樣品總RNA的提取。以Rnase-free DNase I(終濃度80,000U/L)除去其中污染的DNA，經(jīng)甲醛變性凝膠電泳鑒定其完整性，其中28s和18s RNA的量大約為2∶1，表明完整性很好。
步驟2PCR引物設(shè)計和合成根據(jù)Genebank中注冊的Ni/Cd超富集植物T.goesingense和擬南芥(A.thalia na)植物轉(zhuǎn)運蛋白基因TgMTP1和ZAT mRNA序列的N端和C端保守區(qū)設(shè)計了上游引物P1(5’-ggcggaattcatggagtctt caagt-3’)和下游簡并引物P2(5’-cccggatcccatgact g/a at a/g ttgtac tc-3’)。術(shù)語“簡并引物”是指根據(jù)某些特定的目的而選用的一組引物混合物，在寡核苷酸的某一位置(一個簡并位)上可以有多個堿基存在于不同的寡核苷酸分子中，如一組簡并引物中有N1，N2，N3三個簡并位，在N1位上可以有三個堿基簡并，N2二個，N3四個，則此簡并引物中共有3*2*4＝24種寡核苷酸分子。
步驟3單鏈cDNA的合成、PCR和基因克隆以印度芥菜葉片對照總RNA和CdCl2處理的印度芥菜葉片總RNA為模板，采用GIBCO BRL公司的SuperScriptTMFirst-Strand Synthesis System forRT-PCR(Cat.No.11904-018)試劑盒進行ss cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成。操作按說明書。
以上面得到的印度芥菜葉片對照和處理印度芥菜葉片的ss cDNA為模版，p1和p2為引物進行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系(50μL)包括20mmol/LTris-HCL(pH9.0)，10mmol/L KCl，2mmol/L MgCl2，10mmol/L(NH4)2SO4，0.1％Triton X-100，0.2mmol/L dNTP mix(4種dNTP體積比為1∶1∶1∶1)，P1和P2各0.4mmol/L，2 Units Taq DNA聚合酶，對照和處理樣品印度芥菜葉片的sscDNA均分別取2.0μL和3μL。反應(yīng)條件94℃變性10min；94℃1min，退火溫度50℃2min，72℃2min，10個循環(huán)，退火溫度每一輪循環(huán)增加0.5℃；94℃1min，60℃1min，72℃2min，25個循環(huán)；72℃延伸10min。
分別取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳結(jié)果如圖2所示，其中Mmarker；泳道1，2對照；泳道3，4Cd2+處理的樣品；50μL PCR反應(yīng)體系所加模板量泳道1和3為2μL，泳道2和4為3μL。4個泳道均得到3條擴增帶，按條帶大小依次命名為B1(約1100bp)、B2(約870bp)和B3(約660bp)，說明200mM CdCl2處理2d對B1，B2和B3的轉(zhuǎn)錄量無較大影響。
將B1、B2和B3分別切膠回收，連接到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，各挑取10個白色克隆，培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶酶切，分別取含有插入片段的3個克隆進行測序，所測序列一致，結(jié)果顯示B1為1145bp，B2為879bp，B3為666bp。各序列與GenBank/BLAST數(shù)據(jù)庫進行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B1為本研究所要克隆的金屬陽離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白基因，將該基因命名為BjCET1(圖3)。B2為一未知功能的基因，與擬南芥未知蛋白基因AY096642氨基酸序列具有較高同源性，達到78％，而B3含有DnaJ-domain(結(jié)構(gòu)域)(DnaJ-domain為分子伴侶系統(tǒng)的一部分)，與Hsp70熱激蛋白系統(tǒng)相關(guān)，為Dnaj-like(樣)蛋白基因。通過GenBank/BLAST數(shù)據(jù)庫進行同源性比較分析可知，BjCET1與TgMTP1核苷酸序列同源性達到85％，氨基酸序列同源性達到75％；與ZAT核苷酸序列同源性達到83％，氨基酸序列同源性達到78％。用TMPRED軟件(http//www.ch.embnet.org/software/TMPRED form.html)根據(jù)基因序列分析預(yù)測基因編碼的蛋白質(zhì)的特性，得到的結(jié)果是BjMAP1編碼的蛋白質(zhì)具有CDF家族典型的蛋白結(jié)構(gòu)特征6個跨膜(TM，transmembrane)結(jié)構(gòu)域(TM1-6，圖4)，1個N端特征氨基酸序列和1個C端陽離子輸出域，另外還具有CDF真核生物家族成員在TM4和TM5之間含有一個可變的富含His特征區(qū)，存在于胞質(zhì)內(nèi)，推測與金屬離子的結(jié)合和專一性有關(guān)。
步驟4BjCET1全長cDNA克隆以印度芥菜葉片CdCl2處理的總RNA為模板，采用ClONTECH公司的SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit分別合成了5’-RACE和3’-RACE的cDNA模板(具體操作規(guī)程參見試劑盒說明書)。依據(jù)已知的BjCET1序列設(shè)計合成5’-RACE引物5p15’-AGTCTGCCTCGGCGTCGCTTCCCAACCA-3和3’-RACE引物3p15’-gggaattcgaag tctttggtggca-3’。5’-RACE反應(yīng)條件94℃變性10min；94℃30s，72℃3min，5個循環(huán)；94℃30s，70℃30s，72℃3min，5個循環(huán)；94℃30s，68℃30s，72℃3min，25個循環(huán)；72℃延伸10min。3’-RACE反應(yīng)條件94℃變性10min；94℃45s，50℃1min，72℃2min 30s，25個循環(huán)；72℃延伸10min。
取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(見圖5)，圖5左邊的泳道是分子量Marker，右邊是PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，5’-RACE得到3條擴增帶，其中約600bp位置的擴增帶為所預(yù)計的擴增產(chǎn)物，命名為5R1。3’-RACE在約1000bp位置出現(xiàn)所預(yù)計的擴增帶(圖6左邊的泳道是分子量Marker，右邊是PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果)，命名為3R1。將5’-RACE和3’-RACE所預(yù)計的PCR擴增產(chǎn)物分別切膠回收，連接到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，各挑取10個白色克隆，培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶酶切，分別取含有插入片段的3個克隆進行測序(上海聯(lián)眾基因公司)，所測序列一致。各序列通過GenBank/BLAST軟件與BjCET1已有序列進行同源性比較，重疊區(qū)同源性均達99％以上，只有2-3個堿基的差異，通過參照測序圖譜，經(jīng)過拼接得到BjCET1的全長cDNA序列(圖7)，共1481個核苷酸，ORF216-1361，編碼382個氨基酸，MW＝42012。
步驟5BjCET2，BjCET3，BjCET4全長cDNA克隆依據(jù)已知的BjCET1序列，參照植物轉(zhuǎn)運蛋白基因TgMTP1和ZATmRNA序列，在3’端保守區(qū)設(shè)計合成5’-RACE簡并引物5p35’-ccggatccgatagcccaa/tatgtga/gag-3’。以步驟4合成的5’-RACE cDNA產(chǎn)物為本次5’-RACE反應(yīng)的擴增模板(具體操作規(guī)程參見試劑盒說明書)。5’-RACE反應(yīng)條件94℃變性10min；94℃1min，退火溫度55℃2min，72℃2min，10個循環(huán)，退火溫度每一輪循環(huán)增加0.5℃；94℃1min，60℃1min，72℃2min，25個循環(huán)；72℃延伸10min。取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖8左邊的泳道是分子量Marker，右邊是PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，5’-RACE得到在1000-1500bp之間的一條亮帶，為所預(yù)計的擴增產(chǎn)物，命名為5R2(下面的克隆測序?qū)嶒炚f明了條帶5R2是至少含有3條片段大小相近的DNA序列的混合物)。將5R2切膠回收，連接到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取20個白色克隆，培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶酶切，得到9個含有約1200bp大小插入片段的克隆。分別取該9個克隆進行測序(上海聯(lián)眾基因公司)，得到4個不同序列。各序列通過GenBank/BLAST軟件分析證明為4個不同的CE家族成員，其中之一為BjCET1(序列為圖7中的1-1226位核苷酸)，有2個重復(fù)的克隆。其它3個不同序列分別命名為BjCET2(序列為圖11中的1-1089位核苷酸)，BjCET3(序列為圖12中的1-1114位核苷酸)，BjCET4(序列為圖13中的1-1123位核苷酸)。其中BjCET3有2個重復(fù)的克隆，BjCET4有3個重復(fù)的克隆。
鑒于BjCET2，BjCET3和BjCET4 ORF區(qū)域的高同源性，而3序列5’端具有較高的特異性，為了得到BjCET2，BjCET3和BjCET4片段的全長cDNA，在3’-RACE采用巢式PCR。具體實施如下引物設(shè)計分別以BjCET2，BjCET3和BjCET4 5’端特異序列設(shè)計第1次PCR的上游引物。BjCET2為3p2-15’-GGGAACAAACAGATAGAAACTTTA TTGATC-3’；BjCET3為3p3-15’-GGAGCACAGGCACGACGACACGAGGC-3’；BjCET4為3p4-15’-GGGAGGCAAAAGTGAATCTAAAGGG-3’。然后分別在BjCET2，BjCET3和BjCET4的ORF區(qū)域靠近3’端設(shè)計第2次PCR的上游引物。BjCET2為3p2-25’-CTTGGGGACTCCATCCAGAGCGTTGGTGTT-3’；BjCET3為3p3-25’-CGTCATCT GGTGCAACCCGGAATGGAAAA-3’；BjCET4為3p4-15’-CCAGAGCGTTGGTGTTATGGTT GGAGGAGC-3’。兩次PCR的下游引物均為UPM5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30N-1N-3’(其中d(T)30表示30個脫氧胸酰嘧啶，N＝A，G，C或T；N-1＝A，G或C)。
PCR反應(yīng)以步驟4合成的5’-RACE cDNA產(chǎn)物為本次3’-RACE第1次PCR反應(yīng)的擴增模板，50μL反應(yīng)體系模板取2μL。分別將各自的第1次PCR反應(yīng)產(chǎn)物稀釋50倍，用作第2次PCR反應(yīng)的擴增模板，50μL反應(yīng)體系模板取3μL。PCR反應(yīng)體系同步驟3。第1次PCR反應(yīng)的條件為94℃變性10min；94℃1min，55℃45s，72℃3min，25個循環(huán)；72℃延伸10min。第2次PCR反應(yīng)的條件為94℃變性10min；94℃1min，60℃45s，72℃1min30s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。
PCR產(chǎn)物分析分別取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖9右邊的泳道是分子量Marker，左邊是BjCET2 3’-RACE第2次PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，在500-600bp位置的有一很亮的擴增帶，為所預(yù)計的擴增產(chǎn)物，命名為3R2。圖10中間的泳道是分子量Marker，左邊是BjCET3 3’-RACE第2次PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，在500bp左右的位置有一亮的擴增帶，命名為3R3。右邊是BjCET4 3’-RACE第2次PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果，在500-600bp的位置有一亮的擴增帶，命名為3R4。將3R2，3R3和3R4 PCR擴增產(chǎn)物分別切膠回收，連接到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，各挑取10個白色克隆，培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶酶切，分別取含有插入片段的3個克隆進行測序(上海聯(lián)眾基因公司)，所測序列一致。通過GenBank/BLAST軟件進行同源性比較，3R4與BjCET4重疊區(qū)同源性達100％，3R2與BjCET2，3R3與BjCET3的重疊區(qū)同源性均達99％，只有1-2個堿基的差異，差異的堿基通過參照測序圖譜進行修正。
經(jīng)過拼節(jié)得到BjCET2的全長cDNA序列(圖11)，共1336個核苷酸，ORF64-1224，編碼387個氨基酸，MW＝42159。BjCET3的全長cDNA序列(圖12)，共1363個核苷酸，ORF95-1249，編碼385個氨基酸，MW＝42359。BjCET4的全長cDNA序列(圖13)，共1379個核苷酸，ORF131-1258，編碼376個氨基酸，MW＝41421。
步驟6BjCET1，BjCET2，BjCET3，BjCET4全長cDNA克隆載體構(gòu)建依據(jù)已有BjCET1，BjCET2，BjCET3，BjCET4的全長cDNA序列，分別設(shè)計擴增其全長cDNA的上游引物p1和下游引物p2如下BjCET1p15’-GGGGAAGGATAAGAGAGAGAAAAAAAG-3’，p25’-GGACAAAAAGATAGAAAACTTTATTGATT-3’；BjCET2p15’-GGAGGAAGTAGTGAATCTATCAAACCGGTG-3’，
p25’-ggGAACAAACAGATAGAAACFTTATTGATC-3’；BjCET3p15’-GGAGCACAGGCACGACGACACGAGGC-3’，p25’-gcgggGCAAAAGATTGGAAACTATTG-3’；BjCET4p15’-GGGAGGCAAAAGTGAATCTAAAGGG-3’，p25’-GGGCGGGGCAAAAGGATTGAAAC-3’。
以步驟4合成的5’-RACE cDNA產(chǎn)物為本次PCR反應(yīng)的擴增模板，50μL反應(yīng)體系模板取2μL。PCR反應(yīng)體系同步驟3。PCR反應(yīng)的條件為94℃變性10min；94℃1min，55℃2min，72℃2min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。分別取5μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，如圖14均在1300-1500bp位置有一很亮的擴增帶，為所預(yù)計的擴增產(chǎn)物。將PCR擴增產(chǎn)物分別切膠回收，連接到pGEM-T Easy載體上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，各挑取5-10個單克隆，培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶酶切，分別取含有插入片段的克隆進行測序(上海聯(lián)眾基因公司)驗證，所測序列與已知序列一致。-80℃超低溫冰箱分別保存pGEM-T Easy載體上含有BjCET1，BjCET2，BjCET3，BjCET4的全長cDNA序列的DH5α菌株。
實施例2 印度芥菜CE家族的金屬陽離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白新基因轉(zhuǎn)化酵母的重金屬抗性分析步驟1酵母表達載體的構(gòu)建依據(jù)穿梭載體pYES2(見圖15)上的多克隆限制性酶切位點HindIII/BamHI序列，設(shè)計了BjCETs(1-4)序列的ORF區(qū)PCR引物(見表1)，以pGEM-T Easy載體上的BjCETs(1-4)全長cDNA序列為模板分別擴增其ORF區(qū)域，擴增的DNA片段經(jīng)HindIII/BamHI雙酶切后，與HindIII/BamHI雙酶切的pYES2載體進行環(huán)化連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，在含有50μg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上進行篩選，37℃過夜培養(yǎng)。分別挑取5-10個單克隆，培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒進行HindIII/BamHI雙酶切，取含有插入片段的克隆進行測序(上海聯(lián)眾基因公司)驗證，所測序列與已知序列一致，得到pYES2-BjCET1、pYES2-BjCET2、pYES2-BjCET3和pYES2-BjCET4酵母表達載體。
表1BjCETs(1-4)序列的ORF區(qū)PCR引物基因 上游引物下游引物BjCET1 5’-gggAAGCTTATGGCGTCTTCAAGC-3’5’-ggcGGATCCTTAGCGCTCGATTTGTAT-3’BjCET2 5’-gggAAGCTTATGGCGTCTTCAAGC-3 5’-ggcGGATCCTTAACGCTCGATTTGTAT-3’BjCET3 5’-gggAAGCTTATGGCGTCCTCAAGC-3 5’-ggcGGATCCTTAGCGCTCAATTTGTAT-3’BjCET4 5’-gggAAGCTTATGGAGCCTTCAAGC-3 5’-ggcGGATCCTTAACGCTCAATTTGTAT-3’步驟2轉(zhuǎn)化缺陷型酵母通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法(PEG-LiAC法)分別將pYES2-BjCET1、pYES2-BjCET2、pYES2-BjCET3和pYES2-BjCET4導(dǎo)入缺陷型酵母菌YK40、YK41和YK44中，其中YK40(ura3-52 his3-200，ΔCot1，交配型α)為Co/Ni缺陷型；YK41(ura3-52his3-200，ΔZRC1，交配型α)為Zn/Cd缺陷型；YK44(ura3-52 his3-200，ΔZRC，ΔCot1，交配型α)為Zn/Cd/Ni/Co缺陷型。選擇培養(yǎng)基為SMM固體培養(yǎng)基6.7g無氨基酸的酵母基本氮源(invitrogen)+20g/L葡萄糖+20mg/L尿嘧啶+20g/L瓊脂粉，并通過菌斑PCR技術(shù)對單克隆酵母轉(zhuǎn)化菌進行確證，挑選與已知序列大小一致的菌斑保存于-80℃超低溫冰箱。
步驟3抗重金屬分析從-80℃超低溫冰箱取出YK40、YK41和YK44及其轉(zhuǎn)化酵母菌劃平板。YK40、YK41和YK44用YPD固體培養(yǎng)基(參見《精編分子生物學(xué)實驗指南》，p481，科學(xué)出版社，1998)，轉(zhuǎn)化酵母菌用SMM固體選擇培養(yǎng)基。在30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待長出單克隆后，分別挑取單克隆接種于SMM液體培養(yǎng)基(附加20mg/L尿嘧啶和20mg/L組氨酸)。30℃恒溫搖床培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速280rpm/min，待菌液濃度搖至對數(shù)生長期，分別稀釋至OD600＝0.1，在含有不同重金屬濃度的SMM固體選擇培養(yǎng)基(附加20mg/L尿嘧啶和20mg/L組氨酸)上劃線，30℃培養(yǎng)，4天后觀察酵母菌的生長情況。
結(jié)果(1)Zn/Cd/Ni/Co缺陷型酵母yk44及其轉(zhuǎn)化菌Yk44-pyes2(用p0表示)，Yk44-pyes2-BjCET1(用p1表示)，Yk44-pyes2-BjCET2(用p2表示)，Yk44-pyes2-BjCET3(用p3表示)和Yk44-pyes2-BjCET4(用p4表示)在含有0.5mM NiCl2，0.5mM ZnCl2和0.5mM CoCl2培養(yǎng)基上的生長情況。只含有空載體的酵母菌Yk44-pyes2在三種培養(yǎng)基上均不能生長，沒有單克隆菌斑出現(xiàn)，而轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)基因酵母卻表現(xiàn)了不同程度的重金屬抗性。在0.5mM NiCl2培養(yǎng)基上，四種轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)基因酵母p1-p4劃線部分均長滿了菌斑，表現(xiàn)了對Ni和Co高的抗性。在0.5mM ZnCl2培養(yǎng)基上，只有BjCET1和BjCET2轉(zhuǎn)化酵母p1和p2劃線部分有菌斑長出，說明二者對Zn有較高的抗性。在0.5mMCoCl2培養(yǎng)基上，BjCET1轉(zhuǎn)化酵母p1出現(xiàn)的菌斑較少，說明BjCET1對Co的抗性要低于其它三種轉(zhuǎn)運蛋白基因，但高于對照空載體轉(zhuǎn)化酵母菌p0。
(2)Ni/Co缺陷型酵母yk40及其轉(zhuǎn)化菌Yk40-pyes2(p0)，Yk40-pyes2-BjCET1(p1)，Yk40-pyes2-BjCET2(p2)，Yk40-pyes2-BjCET3(p3)和Yk40-pyes2-BjCET4(p4)在含有0.5mM CoCl2，0.8mM CoCl2和1.2mMCoCl2培養(yǎng)基上的生長情況。轉(zhuǎn)運蛋白基因轉(zhuǎn)化酵母菌p1-p4均表現(xiàn)了對Co高的抗性，在0.5mM CoCl2和0.8mM CoCl2培養(yǎng)基上均有大量菌斑長出，但隨Co濃度增加菌斑量也逐漸減少，在1.2mM CoCl2培養(yǎng)基上只有轉(zhuǎn)基因酵母p2有菌斑出現(xiàn)，表明BjCET2比其它三個基因表現(xiàn)了更高的Co抗性。而只含有空載體的酵母菌p0在0.5mM CoCl2培養(yǎng)基上略有生長，在0.8mMCoCl2和1.2mM CoCl2培養(yǎng)基上均不能生長。四種基因?qū)o的抗性在結(jié)果(1)也得到了驗證。
(3)Zn/Cd缺陷型酵母yk41及其轉(zhuǎn)化菌Yk41-pyes2(p0)，Yk41-pyes2-BjCET1(p1)，Yk41-pyes2-BjCET2(p2)，Yk41-pyes2-BjCET3(p3)和Yk41-pyes2-BjCET4(p4)，在含有0.5mM CoCl2，0.8mM CoCl2和1.2mMCoCl2培養(yǎng)基上的生長情況。Yk41對Co不敏感，故在0.5mM CoCl2和0.8mMCoCl2培養(yǎng)基上p0-p4均有不少菌斑長出，但含有空載體的酵母菌p0菌斑量要少于p1-p4。在1.2mM CoCl2培養(yǎng)基上只含有空載體的酵母菌p0不能生長，而p1-p4轉(zhuǎn)化酵母菌均有菌斑長出。再次說明轉(zhuǎn)BjCET1、BjCET2、BjCET3和BjCET4基因能提高酵母菌對Co脅迫的抗性。
(4)Ni/Co缺陷型酵母yk40及其轉(zhuǎn)化菌Yk40-pyes2(p0)，Yk40-pyes2-BjCET1(p1)，Yk40-pyes2-BjCET2(p2)，Yk40-pyes2-BjCET3(p3)和Yk40-pyes2-BjCET4(p4)在含有0.5mM NiCl2和1mM NiCl2培養(yǎng)基上的生長情況。轉(zhuǎn)運蛋白基因轉(zhuǎn)化酵母菌p1-p4均表現(xiàn)了對Ni高的抗性，只含有空載體的酵母菌p0在0.5mM NiCl2培養(yǎng)基上略有生長，在1mM NiCl2培養(yǎng)基上已不能生長，但p1-p4均可生長，其中p2菌斑量最大，表現(xiàn)了對Ni更高的抗性。
(5)Ni/Co缺陷型酵母yk40及其轉(zhuǎn)化菌Yk40-pyes2(p0)，Yk40-pyes2-BjCET1(p1)，Yk40-pyes2-BjCET2(p2)，Yk40-pyes2-BjCET3(p3)和Yk40-pyes2-BjCET4(p4)在含有0.5mM ZnCl2，1mM ZnCl2和7.5mM ZnCl2培養(yǎng)基上的生長情況。yk40對Zn不敏感，在三個濃度梯度的培養(yǎng)基上p0-p4均能生長，但p1-p4酵母轉(zhuǎn)化菌菌斑量明顯好于轉(zhuǎn)空載體的酵母菌p0，說明轉(zhuǎn)BjCET1、BjCET2、BjCET3和BjCET4基因能提高酵母菌對Zn脅迫的抗性。
從以上實驗還發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)空載體的缺陷型酵母菌比其本身對重金屬離子更敏感，BjCET1，BjCET2，BjCET3和BjCET4轉(zhuǎn)基因酵母可不同程度挽救缺陷型酵母菌對金屬離子的敏感性，從而提高了酵母菌對重金屬的抗性。
實施例3 印度芥菜CE家族的金屬陽離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白新基因轉(zhuǎn)化煙草的重金屬抗性和累積分析步驟1植物表達載體的構(gòu)建與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化依據(jù)雙價載體pBIN-mGFP5-ER(見圖16)上的多克隆限制性酶切位點XbaI/BamHI序列，設(shè)計了BjCETs(1-4)序列的ORF區(qū)PCR引物(見表2)，以pGEM-T Easy載體上的BjCETs(1-4)全長cDNA序列為模板分別擴增其ORF區(qū)域，擴增的DNA片段經(jīng)XbaI/BamHI酶切后，與XbaI/BamHI雙酶切的pBIN-mGFP5-ER載體進行環(huán)化連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基上進行篩選。37℃過夜培養(yǎng)。分別挑取5-10個單克隆，培養(yǎng)擴增，提取質(zhì)粒進行XbaI/BamHI雙酶切，分別取含有插入片段的克隆進行測序(上海聯(lián)眾基因公司)驗證，所測序列與已知序列一致，得到pBIN-mGFP5-ER-BjCET1、pBIN-mGFP5-ER-BjCET2、pBIN-mGFP5-ER-BjCET3和pBIN-mGFP5-ER-BjCET4植物表達載體，其中含有CaMV 35S組成性表達強啟動子和GFP綠色熒光蛋白報告基因，所表達的CE轉(zhuǎn)運蛋白與GFP構(gòu)成融合蛋白。應(yīng)用熱激法(TzVi Tzfira et al，PlantMolecular Biology Reporter，1997，15219-235)將pBIN-mGFP5-ER-BjCET1、pBIN-mGFP5-ER-BjCET2、pBIN-mGFP5-ER-BjCET3和pBIN-mGFP5-ER-BjCET4導(dǎo)入農(nóng)桿菌(Agrobacteria tumefaciencs)EHA105中，在含有30μg/mL利福平(Rif)和50μg/mL卡那霉素(Kan)的LB培養(yǎng)基上進行篩選，并通過菌斑PCR技術(shù)對單克隆轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌進行確證。
表2基因 上游引物 下游引物BjCET1 5’-gggTCTAGAATGGCGTCTTC 5’-ggcGGATCCgGCGCTCGATTTGAAGC-3’ TAT-3’BjCET2 5’-gggTCTAGAATGGCGTCTTC 5’-ggcGGATCCgACGCTCGATTTGAAGC-3TAT-3’BjCET3 5’-gggTCTAGAATGGCGTCCTC 5’-ggcGGATCCgGCGCTCAATTTGAAGC-3TAT-3’BjCET4 5’-gggTCTAGAATGGAGCCTTC 5’-ggcGGATCCgACGCTCAATTTGAAGC-3TAT-3’步驟2煙草轉(zhuǎn)化選用煙草品種W38(Nicotiana tabacum c.v.W38)作為轉(zhuǎn)基因受體，采用葉盤法(Horsch R B et al，Science，1985，2271229-1231)轉(zhuǎn)化煙草品種W38。以MS(Murashige&Shoog)為基本培養(yǎng)基，其中分化再生培養(yǎng)基為T0MS+1mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+100mg/L卡那霉素+250mg/L Cef(頭孢霉素)+8g/L瓊脂，PH5.8；生根培養(yǎng)基為T11/2MS+0.1mg/L NAA+100mg/L卡那霉素+250mg/L Cef+8g/L瓊脂，PH5.8。
挑取攜帶pBIN-mGFP5-ER-BjCET1、pBIN-mGFP5-ER-BjCET2、pBIN-mGFP5-ER-BjCET3和pBIN-mGFP5-ER-BjCET4改良載體的農(nóng)桿菌EHA105的單菌落，接種于5ml含Rif20mg/l和Kan 50mg/L的YEB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜。取活化過夜的農(nóng)桿菌，按1∶50的比例稀釋到含Rif30mg/L和Kan 50mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值大約為0.6-0.8。5000rpm離心5min，收集菌體，用1/2 MS液體培養(yǎng)基洗滌菌體一次，并將其稀釋至OD600值0.3-0.35。
選取約30天苗齡的煙草無菌苗，切下成熟葉片，用直徑6mm的打孔器制取葉盤外植體。將新制備的外植體投入已準備好的農(nóng)桿菌菌液中，振蕩侵染15-20分鐘后，取出用濾紙吸干附著于葉盤表面的殘液，然后放在表面鋪有一層濾紙的不含抗生素的T0培養(yǎng)基上暗處共培養(yǎng)兩天，然后再轉(zhuǎn)到T0培養(yǎng)基上進行篩選培養(yǎng)，每隔2-3周用T0培養(yǎng)基繼代一次。待抗性芽長到1-1.5cm時，將其切下?lián)Q到T1培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根并獲得抗性植株。2周后觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草長勢明顯優(yōu)于野生型煙草(WT)，對照WT無根生出，而轉(zhuǎn)基因煙草均已有根生出。
利用CTAB法提取WT及轉(zhuǎn)基因煙草植株葉片基因組DNA，用GFP上游引物p15’-cccGGATCCAAGGAGATATAAC-3’和下游引物p25’-CCCGAGCTCTTATTTGTATAGTTCATCC-3’做PCR，反應(yīng)體系25μL反應(yīng)體系，取基因組DNA模板2μL，PCR反應(yīng)體系同實施例1步驟3。PCR反應(yīng)的條件為94℃預(yù)變性10min；94℃1min，55℃2min，72℃2min，35個循環(huán)；72℃延伸10min。如圖17A和17B，GFP片段約800bp，對照WT無擴增帶，各轉(zhuǎn)基因煙草植株均有800bp DNA擴增帶，說明融合基因BjCET1-GFP、BjCET2-GFP、BjCET3-GFP和BjCET4-GFP已分別整合到煙草基因組中。
利用共聚焦激光掃描電鏡(Confocal laser-scanning microscope)，取活體植株葉片進行觀察，拍照，對照WT植株只是紅色葉綠素激發(fā)熒光，轉(zhuǎn)基因植株葉片均有綠色激發(fā)熒光。說明所轉(zhuǎn)化基因在蛋白質(zhì)水平上得到表達。
步驟3T0代煙草重金屬抗性和累積分析重金屬對轉(zhuǎn)基因植株組織培養(yǎng)分化再生的影響分別剪取約1cm2的WT及轉(zhuǎn)基因植株葉片，接種于T0分化培養(yǎng)基(不含抗生素，附加有200μM/L的CdCL2)上，每瓶接種10片，各接種3瓶，25℃，16h/d光照培養(yǎng)。約35d(天)后，計算分化苗個數(shù)(見表3)。
表3分化苗個數(shù)

可見Cd脅迫嚴重抑制了野生型煙草的葉片組織分化成苗，而轉(zhuǎn)CE轉(zhuǎn)運蛋白基因的煙草植株，均不同程度提高了Cd脅迫條件下的組織分化成苗能力，約為WT的3倍以上，其中，轉(zhuǎn)BjCET4煙草出苗數(shù)最多，約是WT的4.67倍，三者也均遠高于轉(zhuǎn)空載體煙草。
重金屬脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株的重金屬抗性和累積分析分別剪取約1cm2的WT及轉(zhuǎn)基因植株葉片，接種于T0分化培養(yǎng)基(WT接種于不含抗生素的T0培養(yǎng)基)上，25℃，16h/d光照培養(yǎng)。待再生植株長至2-3cm時挑選整齊一致的再生苗，接種于不含抗生素的T1生根培養(yǎng)基，附加有200μM/L的CdCL2，每瓶接種3棵，各接種兩瓶。12d后觀察生根情況(見表4)，發(fā)現(xiàn)，野生型與轉(zhuǎn)空載體煙草苗均無根生出，而轉(zhuǎn)基因煙草，均有根生出，其中轉(zhuǎn)BjCET4煙草生根較多，且長，長勢也優(yōu)于對照。30d后，從培養(yǎng)瓶中收獲煙草，測試計算各種指標數(shù)據(jù)見表5。其中Cd含量的測定應(yīng)用原子吸收光譜法，由國家有色金屬研究院測試中心完成。
由表5分析可知，Cd脅迫對煙草根的生長有明顯抑制作用，轉(zhuǎn)CE轉(zhuǎn)運蛋白基因煙草明顯提高了煙草根的抗脅迫能力，其每株根數(shù)約是WT的1.3-1.8倍，每株根長約是WT的1.4-1.6倍，而每株根鮮重約是WT的1.88-3.98倍。其中轉(zhuǎn)BjCET1和BjCET4煙草植株根的抗Cd能力最具優(yōu)勢。通過對比轉(zhuǎn)基因煙草與WT根部Cd累積量發(fā)現(xiàn)，根部過量表達BjCET1，比WT減少了16.92％的Cd累積量；過量表達BjCET3，比WT減少了6.15％的Cd累積量。故二者根部抗Cd能力的提高可能是通過BjCET1和BjCET3的外排作用，減少了Cd在根部的累積而獲得的。參照莖葉部的Cd含量發(fā)現(xiàn)，二者莖葉部Cd含量最高，比WT均增加了56％。所以，過量表達BjCET1和BjCET3可以起到在煙草莖葉部富集Cd的作用，雖然Cd的富集一定程度抑制了莖葉的生長，但仍高于轉(zhuǎn)空載體煙草植株。過量表達BjCET4在根部和莖葉部與WT相比均增加了Cd累積量，但主要是提高了莖葉部的Cd含量，雖然增幅低于BjCET1和BjCET3，但其莖葉部生物量卻遠高于二者及WT，故其對Cd的累積量在莖葉部最高。過量表達BjCET2轉(zhuǎn)基因煙草，在根部的Cd累積量最高，比WT增加了41.5％，而莖葉部則比WT減少了52％，故過量表達BjCET2轉(zhuǎn)運蛋白明顯限制了Cd向地上部的運輸累積，很適于在應(yīng)用基因工程技術(shù)降低重金屬在糧食和蔬菜可食物部位累積方面發(fā)揮作用。
表412天后的生根情況

表530天后的煙草生長情況

FPI04055-sequence listSEQUENCE LISTING<110>中國科學(xué)院研究生院<120>印度芥菜陽離子輸出轉(zhuǎn)運蛋白家族的基因BjCET2及其蛋白質(zhì)<130>FPI04055<150>CN 03119515.6<151>2003-03-07<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1125<212>DNA<213>Brassica juncea<220>
<221>CDS<222>(1)..(1125)<223>
<400>1atg gag tct tca agt ccc caa cat tgc cac atc atc gag gtc aat cga 48Met Glu Ser Ser Ser Pro Gln His Cys His Ile Ile Glu Val Asn Arg1 5 10 15ggt aaa tcc gtt gaa gaa agc aca aca att ctg gca agc aaa gcc tgc 96Gly Lys Ser Val Glu Glu Ser Thr Thr Ile Leu Ala Ser Lys Ala Cys20 25 30gga gaa gcc ccc tgc ggc ttc tca gat ctc aac aac gct tcc ggt gac144Gly Glu Ala Pro Cys Gly Phe Ser Asp Leu Asn Asn Ala Ser Gly Asp35 40 45gcc caa gaa cgc aat gcc tcc atg cgc aag ctc tgc atc gcc gtg gtg192Ala Gln Glu Arg Asn Ala Ser Met Arg Lys Leu Cys Ile Ala Val Val50 55 60tta tgc ctt ctc ttc atg acc gtt gaa gtc ttt ggt ggc atc aaa gct240Leu Cys Leu Leu Phe Met Thr Val Glu Val Phe Gly Gly Ile Lys Ala65 70 75 80aac agc cta gct ata ctc acc gac gca gcg cat ctc ctc tct gac gtt288Asn Ser Leu Ala Ile Leu Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ser Asp Val85 90 95gct gcc ttc gcc atc tcc ctg ttc tcc ctg tgg gcc gct ggt tgg gaa336Ala Ala Phe Ala Ile Ser Leu Phe Ser Leu Trp Ala Ala Gly Trp Glu100 105 110gcg acg ccg agg cag act tat ggt ttt ttc agg att gag att ttg gga384Ala Thr Pro Arg Gln Thr Tyr Gly Phe Phe Arg Ile Glu Ile Leu Gly115 120 125gct ctt gtc tcc atc cag ctc att tgg ctc ctc act ggt att ctt gtc432Ala Leu Val Ser Ile Gln Leu Ile Trp Leu Leu Thr Gly Ile Leu Val130 135 140tat gaa gct atc atc aga ctt ctt agt gag act agt gag gtt aat ggt480Tyr Glu Ala Ile Ile Arg Leu Leu Ser Glu Thr Ser Glu Val Asn Gly145 150 155 160ttc ctt atg ttc ctt gtt gct gct ttt ggg ttg ctt gtg aat atc ata528Phe Leu Met Phe Leu Val Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val Asn Ile Ile165 170 175atg gct gtt ctg ttg gga cat gat cat ggt cac ggt cat ggc cat ggt576Met Ala Val Leu Leu Gly His Asp His Gly His Gly His Gly His Gly180 185 190cat gat cat cac agt cat ggg gtg acg gtt acc aca cat cat cac cat624
FPI04055-sequence listHis Asp His His Ser His Gly Val Thr Val Thr Thr His His His His195 200205cat ggt cat gga gag gac aag cat cat cat cac gct cat ggg gat gaa 672His Gly His Gly Glu Asp Lys His His His His Ala His Gly Asp Glu210 215 220gat gtg act gag cag ttg ctg gag aaa tca gag aag aga aag agg aac 720Asp Val Thr Glu Gln Leu Leu Glu Lys Ser Glu Lys Arg Lys Arg Asn225 230 235 240atc aat gtc caa gga gct tac ctc cat gtc ctt gga gac tca atc cag 768Ile Asn Val Gln Gly Ala Tyr Leu His Val Leu Gly Asp Ser Ile Gln245 250 255agc gtt ggt gtt atg att gga gga ggt atc atc tgg tac aac ccg gag 816Ser Val Gly Val Met Ile Gly Gly Gly Ile Ile Trp Tyr Asn Pro Glu260 265 270tgg aag ata gtc gat ctg atc tgc acg ctt gtc ttt tcc gtg att gtc 864Trp Lys Ile Val Asp Leu Ile Cys Thr Leu Val Phe Ser Val Ile Val275 280 285ttg ggg acg acc atc aac atg atc aga agc att ctt gag gtg ttg atg 912Leu Gly Thr Thr Ile Asn Met Ile Arg Ser Ile Leu Glu Val Leu Met290 295 300gag agc acg ccg aga gag att gac gct acg aag ctg gag aag ggt ttg 960Glu Ser Thr Pro Arg Glu Ile Asp Ala Thr Lys Leu Glu Lys Gly Leu305 310 315 320ctg gag atg gaa gaa gtg gtg gct gtt cat gag ctt cac att tgg gct1008Leu Glu Met Glu Glu Val Val Ala Val His Glu Leu His Ile Trp Ala325 330 335atc acg gtg ggg aaa gtg ttg ctt gct tgc cat gtt aat atc aca ccg1056Ile Thr Val Gly Lys Val Leu Leu Ala Cys His Val Asn Ile Thr Pro340 345 350gag gca gat gcg gac atg gtg ctt aac aag gtc att gat tac atc cgc1104Glu Ala Asp Ala Asp Met Val Leu Asn Lys Val Ile Asp Tyr Ile Arg355 360 365agg gag tac aac atc agt cat1125Arg Glu Tyr Asn Ile Ser His370 375<210>2<211>375<212>PRT<213>Brassica juncea<400>2Met Glu Ser Ser Ser Pro Gln His Cys His Ile Ile Glu Val Asn Arg1 5 10 15Gly Lys Ser Val Glu Glu Ser Thr Thr Ile Leu Ala Ser Lys Ala Cys20 25 30Gly Glu Ala Pro Cys Gly Phe Ser Asp Leu Asn Asn Ala Ser Gly Asp35 40 45Ala Gln Glu Arg Asn Ala Ser Met Arg Lys Leu Cys Ile Ala Val Val50 55 60Leu Cys Leu Leu Phe Met Thr Val Glu Val Phe Gly Gly Ile Lys Ala65 70 75 80
FPI04055-sequence listAsn Ser Leu Ala Ile Leu Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ser Asp Val85 90 95Ala Ala Phe Ala Ile Ser Leu Phe Ser Leu Trp Ala Ala Gly Trp Glu100 105 110Ala Thr Pro Arg Gln Thr Tyr Gly Phe Phe Arg Ile Glu Ile Leu Gly115 120 125Ala Leu Val Ser Ile Gln Leu Ile Trp Leu Leu Thr Gly Ile Leu Val130 135 140Tyr Glu Ala Ile Ile Arg Leu Leu Ser Glu Thr Ser Glu Val Asn Gly145150 155 160Phe Leu Met Phe Leu Val Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val Asn Ile Ile165 170 175Met Ala Val Leu Leu Gly His Asp His Gly His Gly His Gly His Gly180 185 190His Asp His His Ser His Gly Val Thr Val Thr Thr His His His His195 200 205His Gly His Gly Glu Asp Lys His His His His Ala His Gly Asp Glu210 215 220Asp Val Thr Glu Gln Leu Leu Glu Lys Ser Glu Lys Arg Lys Arg Asn225 230 235 240Ile Asn Val Gln Gly Ala Tyr Leu His Val Leu Gly Asp Ser Ile Gln245 250 255Ser Val Gly Val Met Ile Gly Gly Gly Ile Ile Trp Tyr Asn Pro Glu260 265 270Trp Lys Ile Val Asp Leu Ile Cys Thr Leu Val Phe Ser Val Ile Val275 280 285Leu Gly Thr Thr Ile Asn Met Ile Arg Ser Ile Leu Glu Val Leu Met290 295 300Glu Ser Thr Pro Arg Glu Ile Asp Ala Thr Lys Leu Glu Lys Gly Leu305 310 315 320Leu Glu Met Glu Glu Val Val Ala Val His Glu Leu His Ile Trp Ala325 330 335Ile Thr Val Gly Lys Val Leu Leu Ala Cys His Val Asn Ile Thr Pro340 345 350Glu Ala Asp Ala Asp Met Val Leu Asn Lys Val Ile Asp Tyr Ile Arg355 360 365Arg Glu Tyr Asn Ile Ser His370 375
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FPI04055-sequence listLys His His His His Ala His Gly Asp Glu Asp Val Thr Glu Gln Leu215 220 225 230ctg gag aaa tca gag aag aga aag agg aac atc aat gtc caa gga gct 953Leu Glu Lys Ser Glu Lys Arg Lys Arg Asn Ile Asn Val Gln Gly Ala235 240 245tac ctc cat gtc ctt gga gac tca atc cag agc gtt ggt gtt atg att 1001Tyr Leu His Val Leu Gly Asp Ser Ile Gln Ser Val Gly Val Met Ile250 255 260gga gga ggt atc atc tgg tac aac ccg gag tgg aag ata gtc gat ctg 1049Gly Gly Gly Ile Ile Trp Tyr Asn Pro Glu Trp Lys Ile Val Asp Leu265 270 275atc tgc acg ctt gtc ttt tcc gtg att gtc ttg ggg acg acc atc aac 1097Ile Cys Thr Leu Val Phe Ser Val Ile Val Leu Gly Thr Thr Ile Asn280 285 290atg atc aga agc att ctt gag gtg ttg atg gag agc acg ccg aga gag 1145Met Ile Arg Ser Ile Leu Glu Val Leu Met Glu Ser Thr Pro Arg Glu295 300 305 310att gac gct acg aag ctg gag aag ggt ttg ctg gag atg gaa gaa gtg 1193Ile Asp Ala Thr Lys Leu Glu Lys Gly Leu Leu Glu Met Glu Glu Val315 320 325gtg gct gtt cat gag ctt cac att tgg gct atc acg gtg ggg aaa gtg 1241Val Ala Val His Glu Leu His Ile Trp Ala Ile Thr Val Gly Lys Val330 335 340ttg ctt gct tgc cat gtt aat atc aca ccg gag gca gat gcg gac atg 1289Leu Leu Ala Cys His Val Asn Ile Thr Pro Glu Ala Asp Ala Asp Met345 350 355gtg ctt aac aag gtc att gat tac atc cgc agg gag tat aat atc agt 1337Val Leu Asn Lys Val Ile Asp Tyr Ile Arg Arg Glu Tyr Asn Ile Ser360 365 370cat gtc act ata caa atc gag cgc tgaaaggcaa atcaaatatc tcaagagtat1391His Val Thr Ile Gln Ile Glu Arg375 380tttgtataag catttgcatt gacatgatga taaaatcaat aaagttttct atctttttgt 1451ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa1481<210>4<211>382<212>PRT<213>Brassica juncea<400>4Met Ala Ser Ser Ser Pro Gln His Cys His Ile Ile Glu Val Asn Arg1 5 10 15Gly Lys Ser Val Glu Glu Ser Thr Thr Ile Leu Ala Ser Lys Ala Cys20 25 30Gly Glu Ala Pro Cys Gly Phe Ser Asp Leu Asn Asn Ala Ser Gly Asp35 40 45Ala Gln Glu Arg Asn Ala Ser Met Arg Lys Leu Cys Ile Ala Val Val50 55 60Leu Cys Leu Leu Phe Met Thr Val Glu Val Phe Gly Gly Ile Lys Ala65 70 75 80
FPI04055-sequence listAsn Ser Leu Ala Ile Leu Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ser Asp Val85 90 95Ala Ala Phe Ala Ile Ser Leu Phe Ser Leu Trp Ala Ala Gly Trp Glu100 105 110Ala Thr Pro Arg Gln Thr Tyr Gly Phe Phe Arg Ile Glu Ile Leu Gly115 120 125Ala Leu Val Ser Ile Gln Leu Ile Trp Leu Leu Thr Gly Ile Leu Val130 135 140Tyr Glu Ala Ile Ile Arg Leu Leu Ser Glu Thr Ser Glu Val Asn Gly145 150 155 160Phe Leu Met Phe Leu Val Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val Asn Ile Ile165 170 175Met Ala Val Leu Leu Gly His Asp His Gly His Gly His Gly His Gly180 185 190His Asp His His Ser His Gly Val Thr Val Thr Thr His His His His195 200 205His Gly His Gly Glu Asp Lys His His His His Ala His Gly Asp Glu210 215 220Asp Val Thr Glu Gln Leu Leu Glu Lys Ser Glu Lys Arg Lys Arg Asn225 230 235 240Ile Asn Val Gln Gly Ala Tyr Leu His Val Leu Gly Asp Ser Ile Gln245 250 255Ser Val Gly Val Met Ile Gly Gly Gly Ile Ile Trp Tyr Asn Pro Glu260 265 270Trp Lys Ile Val Asp Leu Ile Cys Thr Leu Val Phe Ser Val Ile Val275 280 285Leu Gly Thr Thr Ile Asn Met Ile Arg Ser Ile Leu Glu Val Leu Met290 295 300Glu Ser Thr Pro Arg Glu Ile Asp Ala Thr Lys Leu Glu Lys GlM Leu305 310 315 320Leu Glu Met Glu Glu Val Val Ala Val His Glu Leu His Ile Trp Ala325 330 335Ile Thr Val Gly Lys Val Leu Leu Ala Cys His Val Asn Ile Thr Pro340 345 350Glu Ala Asp Ala Asp Met Val Leu Asn Lys Val Ile Asp Tyr Ile Arg355 360 365Arg Glu Tyr Asn Ile Ser His Val Thr Ile Gln Ile Glu Arg370 375 380
FPI04055-sequence list<210>5<211>1336<212>DNA<213>Brassica juncea<220>
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FPI04055-sequence listGlu Lys Arg Lys Arg Asn Ile Asn Val Gln Gly Ala Tyr Leu His Val240 245 250 255ctt ggg gac tcc atc cag agc gtt ggt gtt atg atc ggt gga gct gtc 876Leu Gly Asp Ser Ile Gln Ser Val Gly Val Met Ile Gly Gly Ala Val260 265 270atc tgg tac aaa ccg gag tgg aag ata gtt gat ctg atc tgc acg ctt 924Ile Trp Tyr Lys Pro Glu Trp Lys Ile Val Asp Leu Ile Cys Thr Leu275 280 285gtc ttt tcg gtt att gtc ttg ggg aca acc atc aac atg atc cga agc 972Val Phe Ser Val Ile Val Leu Gly Thr Thr Ile Asn Met Ile Arg Ser290 295 300att ctt gag gtg ttg atg gag agt aca ccg aga gag att gac gct acg 1020Ile Leu Glu Val Leu Met Glu Ser Thr Pro Arg Glu Ile Asp Ala Thr305 310 315aag ctg gaa aag ggt ctg ctg gaa atg gat gaa gtg gtg gct gtt cat 1068Lys Leu Glu Lys Gly Leu Leu Glu Met Asp Glu Val Val Ala Val His320 325 330 335gag ctt cac att tgg gct atc acg gtg ggg aaa gtg ctg ctt gct tgc 1116Glu Leu His Ile Trp Ala Ile Thr Val Gly Lys Val Leu Leu Ala Cys340 345 350cat gtt aat atc aca cca gag gca gat gcg gat atg gtg ctc aat aaa 1164His Val Asn Ile Thr Pro Glu Ala Asp Ala Asp Met Val Leu Asn Lys355 360 365gtc att gat tac atc cgc ggg gag tat aat atc agt cat gtc act ata 1212Val Ile Asp Tyr Ile Arg Gly Glu Tyr Asn Ile Ser His Val Thr Ile370 375 380caa atc gag cgt taaaagcaaa catctgcaga gtattttgta taagcattct 1264Gln Ile Glu Arg385cattgacgat gataagatca ataaagtttc tatctgtttg ttcaaaaaaa aaaaaaaaaa 1324aaaaaaaaaa aa 1336<210>6<211>387<212>PRT<213>Brassica juncea<400>6Met Ala Ser Ser Ser Pro Gln Arg Ser His Ile Ile Glu Val Lys Ala1 5 10 15Gly Lys Ala Val Glu Glu Ser Thr Thr Ser Leu Ala Ser Leu Ala Cys20 25 30Gly Glu Ala Pro Cys Gly Phe Ser Asp Leu Asn Asn Ala Ser Gly Asp35 40 45Ala Gln Glu Arg Asn Ala Ser Met Arg Lys Leu Cys Ile Ala Val Val50 55 60Leu Cys Leu Leu Phe Met Thr Val Glu Val Phe Gly Gly Ile Lys Ala65 70 75 80Asn Ser Leu Ala Ile Leu Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ser Asp Val85 90 95
FPI04055-sequence listAla Ala Phe Ala Ile Ser Leu Phe Ser Leu Trp Ala Ala Gly Trp Glu100 105 110Ala Thr Pro Arg Gln Thr Tyr Gly Phe Phe Arg Val Glu Ile Leu Gly115 120 125Ala Leu Val Ser Ile Gln Leu Ile Trp Leu Leu Thr Gly Ile Leu Val130 135 140Tyr Glu Ala Ile Ile Arg Leu Leu Ser Glu Thr Ser Glu Val Asn Gly145 150 155 160Phe Leu Met Phe Leu Val Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val Asn Ile Val165 170 175Met Ala Val Leu Leu Gly His Asp His Gly His Gly His Gly His Gly180 185 190His Gly His Asp His His Ser His Gly Val Thr Val Thr Thr His His195 200 205His Gly His Asp His Gly His Thr His Gly Glu Asp Lys His His His210 215 220Ala His Gly His Gly Asp Val Thr Glu Gln Leu Leu Asp Lys Ser Glu225 230 235 240Lys Arg Lys Arg Asn Ile Asn Val Gln Gly Ala Tyr Leu His Val Leu245 250 255Gly Asp Ser Ile Gln Ser Val Gly Val Met Ile Gly Gly Ala Val Ile260 265 270Trp Tyr Lys Pro Glu Trp Lys Ile Val Asp Leu Ile Cys Thr Leu Val275 280 285Phe Ser Val Ile Val Leu Gly Thr Thr Ile Asn Met Ile Arg Ser Ile290 295 300Leu Glu Val Leu Met Glu Ser Thr Pro Arg Glu Ile Asp Ala Thr Lys305 310 315 320Leu Glu Lys Gly Leu Leu Glu Met Asp Glu Val Val Ala Val His Glu325 330 335Leu His Ile Trp Ala Ile Thr Val Gly Lys Val Leu Leu Ala Cys His340 345 350Val Asn Ile Thr Pro Glu Ala Asp Ala Asp Met Val Leu Asn Lys Val355 360 365Ile Asp Tyr Ile Arg Gly Glu Tyr Asn Ile Ser His Val Thr Ile Gln370 375 380Ile Glu Arg385
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<221>CDS<222>(95)..(1249)<223>
<400>7ggagcacagg cacgacgaca cgaggctctt cttctttttg taaataaata acccaaccac 60cacccacctt gaatctctca gctctcttct tctg atg gcg tcc tca agc cct caa115Met Ala Ser Ser Ser Pro Gln1 5cat agt cac atc att gag gtt aat ata gca aaa cct gat gaa caa aga 163His Ser His Ile Ile Glu Val Asn Ile Ala Lys Pro Asp Glu Gln Arg10 15 20aca gca ctt ggg gca agt aaa gcc tgt gga gaa gca cct tgt ggg ttc 211Thr Ala Leu Gly Ala Ser Lys Ala Cys Gly Glu Ala Pro Cys Gly Phe25 30 35tca gat ctc aac aat gct tct ggt gat gca cat gaa cgc aat gct tcc 259Ser Asp Leu Asn Asn Ala Ser Gly Asp Ala His Glu Arg Asn Ala Ser40 45 50 55atg cgg aag ctc tgt atc gcg gtc gtg tta tgt ctt ttg ttc atg acc 307Met Arg Lys Leu Cys Ile Ala Val Val Leu Cys Leu Leu Phe Met Thr60 65 70gtt gaa gtt ttc ggc ggg atc aaa gct aat agc ttg gct ata cta acc 355Val Glu Val Phe Gly Gly Ile Lys Ala Asn Ser Leu Ala Ile Leu Thr75 80 85gat gca gct cac ctt ctc tct gac gtt gct gcc ttt gcc atc tcc ttg 403Asp Ala Ala His Leu Leu Ser Asp Val Ala Ala Phe Ala Ile Ser Leu90 95 100ttc tcc ttg tgg gct gct ggc tgg gaa gcc act cct agg cag acg tat 451Phe Ser Leu Trp Ala Ala Gly Trp Glu Ala Thr Pro Arg Gln Thr Tyr105 110 115ggg ttt ttc agg att gag atc ctc gga gct ctt gtc tct atc cag ctc 499Gly Phe Phe Arg Ile Glu Ile Leu Gly Ala Leu Val Ser Ile Gln Leu120 125 130 135att tgg ttg ctc act ggt att ctc gtc tac gaa gcc att atc aga ctt 547Ile Trp Leu Leu Thr Gly Ile Leu Val Tyr Glu Ala Ile Ile Arg Leu140 145 150ctt acc gag acc act gag gtt aat gga ttc ctt atg ttc ctt gtt gct 595Leu Thr Glu Thr Thr Glu Val Asn Gly Phe Leu Met Phe Leu Val Ala155 160 165gcg ttt ggg ctg ctt gtg aat atc ata atg gct gtt ctg ctc ggg cat 643Ala Phe Gly Leu Leu Val Asn Ile Ile Met Ala Val Leu Leu Gly His170 175 180gat cac ggt cat gga cat ggt cat gac cat cac aac cac ggt ggg gtg 691Asp His Gly His Gly His Gly His Asp His His Asn His Gly Gly Val185 190 195act gtt acc act cgt cac cat cat gat cat ggt cat act cat gga gag 739Thr Val Thr Thr Arg His His His Asp His Gly His Thr His Gly Glu200 205 210 215gac aag cac cac cac gct cat ggt gat gtt act gag aag tta ctc gac 787Asp Lys His His His Ala His Gly Asp Val Thr Glu Lys Leu Leu Asp220 225 230aaa tcg aag ccg gat aaa gag aag aga aag agg aac atc aat gtc caa 835
FPI04055-sequence listLys Ser Lys Pro Asp Lys Glu Lys Arg Lys Arg Asn Ile Asn Val Gln235 240 245gga gct tat ctt cat gtc ctt ggg gac tcc atc cag agc gtt ggt gtt 883Gly Ala Tyr Leu His Val Leu Gly Asp Ser Ile Gln Ser Val Gly Val250 255 260atg atc gga ggg gcc gtc atc tgg tgc aac ccg gaa tgg aaa ata gta 931Met Ile Gly Gly Ala Val Ile Trp Cys Asn Pro Glu Trp Lys Ile Val265 270 275gac ctg atc tgc act ttt gtc ttc tcg gtt att gtc ttg gga aca acc 979Asp Leu Ile Cys Thr Phe Val Phe Ser Val Ile Val Leu Gly Thr Thr280 285 290 295atc aac atg att cga agc att ctt gaa gtg ttg atg gag agt aca ccg 1027Ile Asn Met Ile Arg Ser Ile Leu Glu Val Leu Met Glu Ser Thr Pro300 305 310aga gag att gat gct aca aaa ctg gaa gag ggt ttg gtg gaa atg gaa 1075Arg Glu Ile Asp Ala Thr Lys Leu Glu Glu Gly Leu Val Glu Met Glu315 320 325gaa gtg gtg gct gtt cat gag ctt cac att tgg gct atc aca gtg gga 1123Glu Val Val Ala Val His Glu Leu His Ile Trp Ala Ile Thr Val Gly330 335 340aaa gtg ctg ctc gct tgc cat gtc aat atc aga cca gaa gca gat gca 1171Lys Val Leu Leu Ala Cys His Val Asn Ile Arg Pro Glu Ala Asp Ala345 350 355gat atg gtg ctc aac aag gtc att gat tac atc cgc agg gag tac aat 1219Asp Met Val Leu Asn Lys Val Ile Asp Tyr Ile Arg Arg Glu Tyr Asn360 365 370 375att agt cat gtc aca ata caa att gag cgc taagagcaaa ccaaacatgt 1269Ile Ser His Val Thr Ile Gln Ile Glu Arg380 385gaaggaatat tctgtatcag ctttctcatt aacaaccatt aaatcaatag tttccaatct 1329tttgcaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaa 1363<210>8<211>385<212>PRT<213>Brassica juncea<400>8Met Ala Ser Ser Ser Pro Gln His Ser His Ile Ile Glu Val Asn Ile1 5 10 15Ala Lys Pro Asp Glu Gln Arg Thr Ala Leu Gly Ala Ser Lys Ala Cys20 25 30Gly Glu Ala Pro Cys Gly Phe Ser Asp Leu Asn Asn Ala Ser Gly Asp35 40 45Ala His Glu Arg Asn Ala Ser Met Arg Lys Leu Cys Ile Ala Val Val50 55 60Leu Cys Leu Leu Phe Met Thr Val Glu Val Phe Gly Gly Ile Lys Ala65 70 75 80Asn Ser Leu Ala Ile Leu Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ser Asp Val85 90 95
FPI04055-sequence listAla Ala Phe Ala Ile Ser Leu Phe Ser Leu Trp Ala Ala Gly Trp Glu100 105 110Ala Thr Pro Arg Gln Thr Tyr Gly Phe Phe Arg Ile Glu Ile Leu Gly115 120 125Ala Leu Val Ser Ile Gln Leu Ile Trp Leu Leu Thr Gly Ile Leu Val130 135 140Tyr Glu Ala Ile Ile Arg Leu Leu Thr Glu Thr Thr Glu Val Asn Gly145 150 155 160Phe Leu Met Phe Leu Val Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val Asn Ile Ile165 170 175Met Ala Val Leu Leu Gly His Asp His Gly His Gly His Gly His Asp180 185 190His His Asn His Gly Gly Val Thr Val Thr Thr Arg His His His Asp195 200 205His Gly His Thr His Gly Glu Asp Lys His His His Ala His Gly Asp210 215 220Val Thr Glu Lys Leu Leu Asp Lys Ser Lys Pro Asp Lys Glu Lys Arg225 230 235 240Lys Arg Asn Ile Asn Val Gln Gly Ala Tyr Leu His Val Leu Gly Asp245 250 255Ser Ile Gln Ser Val Gly Val Met Ile Gly Gly Ala Val Ile Trp Cys260 265 270Asn Pro Glu Trp Lys Ile Val Asp Leu Ile Cys Thr Phe Val Phe Ser275 280 285Val Ile Val Leu Gly Thr Thr Ile Asn Met Ile Arg Ser Ile Leu Glu290 295 300Val Leu Met Glu Ser Thr Pro Arg Glu Ile Asp Ala Thr Lys Leu Glu305 310 315 320Glu Gly Leu Val Glu Met Glu Glu Val Val Ala Val His Glu Leu His325 330 335Ile Trp Ala Ile Thr Val Gly Lys Val Leu Leu Ala Cys His Val Asn340 345 350Ile Arg Pro Glu Ala Asp Ala Asp Met Val Leu Asn Lys Val Ile Asp355 360 365Tyr Ile Arg Arg Glu Tyr Asn Ile Ser His Val Thr Ile Gln Ile Glu370 375 380Arg385
FPI04055-sequence list<210>9<211>1379<212>DNA<213>Brassica juncea<220>
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<400>9gaggcaaaag tgaatctaaa gggttttcga atcaatggtg aatattttca accaagtacc 60ttcatcctcc tctctcttct tcttctgatt cggaaaccta ttgtgcttca ctcgcattct120tattacagag atg gag cct tca agc ccc caa cat agt cac atc atc gag 169Met Glu Pro Ser Ser Pro Gln His Ser His Ile Ile Glu1 5 10gtc aat gca tca aaa tct gat gaa gaa cag aga aca aca acg ctt ggt 217Val Asn Ala Ser Lys Ser Asp Glu Glu Gln Arg Thr Thr Thr Leu Gly15 20 25tca gtt aaa gtc tgt gga gaa aca cct tgt cat ctc aac aat gcc tct 265Ser Val Lys Val Cys Gly Glu Thr Pro Cys His Leu Asn Asn Ala Ser30 35 40 45ggt gac gcc gag gaa cgc act gcc tcc atg aga aag ctc tgc atc gct 313Gly Asp Ala Glu Glu Arg Thr Ala Ser Met Arg Lys Leu Cys Ile Ala50 55 60gtg gtg cta tgt ctt ctc ttc atg act gtt gaa gtc ttt ggt ggg atc 361Val Val Leu Cys Leu Leu Phe Met Thr Val Glu Val Phe Gly Gly Ile65 70 75aaa gct aac agc ttg gct ata ctt acc gac gca gct cat ctc ctc tct 409Lys Ala Asn Ser Leu Ala Ile Leu Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ser80 85 90gat gtt gcc gcc ttt gcc atc tcc ttg ttc tcc ctg tgg gct gct ggc 457Asp Val Ala Ala Phe Ala Ile Ser Leu Phe Ser Leu Trp Ala Ala Gly95 100 105tgg gaa gcg act cca agg cag act tat ggg ttt ttc agg att gag att 505Trp Glu Ala Thr Pro Arg Gln Thr Tyr Gly Phe Phe Arg Ile Glu Ile110 115 120 125ctc gga gct ctt gtc tct atc cag ctc att tgg ctt ctc aca ggg att 553Leu Gly Ala Leu Val Ser Ile Gln Leu Ile Trp Leu Leu Thr Gly Ile130 135 140ctc gtc tat gaa gct atc att aga ctt ctt act gag acc agt gag gtt 601Leu Val Tyr Glu Ala Ile Ile Arg Leu Leu Thr Glu Thr Ser Glu Val145 150 155gat ggg ttc ctt atg ttc ctt gtt gct gcg ttt ggg ctg ttg gtg aac 649Asp Gly Phe Leu Met Phe Leu Val Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val Asn160 165 170atc gta atg gct gtt ctg tta ggt cat gat cat gga cat ggt cat gga 697Ile Val Met Ala Val Leu Leu Gly His Asp His Gly His Gly His Gly175 180 185cat ggt cac agt cat gat ggg gtg act gtt acc acc cat cac cat cat 745His Gly His Ser His Asp Gly Val Thr Val Thr Thr His His His His190 195 200 205ggt cat act cat ggt gag gac aag cat cac tct cat ggt gat gtt acc 793Gly His Thr His Gly Glu Asp Lys His His Ser His Gly Asp Val Thr210 215 220gag gag ttg cta gac aaa tca gag aag agg aag agg aac atc aat gtg 841Glu Glu Leu Leu Asp Lys Ser Glu Lys Arg Lys Arg Asn Ile Asn Val225 230 235
FPI04055-sequence listcaa gga gct tac ctc cac gtc ctt gga gac tta atc cag agc gtt ggt 889Gln Gly Ala Tyr Leu His Val Leu Gly Asp Leu Ile Gln Ser Val Gly240 245 250gtt atg gtt gga gga gcc atc atc tgg tac aag cca gag tgg aag ata 937Val Met Val Gly Gly Ala Ile Ile Trp Tyr Lys Pro Glu Trp Lys Ile255 260 265gtt gat ctg atc tgc acg ctt gtc ttc tcg gtt att gtc ttg ggg aca 985Val Asp Leu Ile Cys Thr Leu Val Phe Ser Val Ile Val Leu Gly Thr270 275 280 285acc atc aac atg atc aga agc att ctc gag gtg ttg atg gag agt aca 1033Thr Ile Asn Met Ile Arg Ser Ile Leu Glu Val Leu Met Glu Ser Thr290 295 300cct aga gag att gac gct acg aag ctg gaa cag ggt ttg ctg gag atg 1081Pro Arg Glu Ile Asp Ala Thr Lys Leu Glu Gln Gly Leu Leu Glu Met305 310 315gag gaa gtg gtg gct gtt cat gag ctt cac att tgg gct atc acg gtg 1129Glu Glu Val Val Ala Val His Glu Leu His Ile Trp Ala Ile Thr Val320 325 330ggg aaa gtg ctg ctt gct tgc cat gtt aat atc aca ccg gag gca gat 1177Gly Lys Val Leu Leu Ala Cys His Val Asn Ile Thr Pro Glu Ala Asp335 340 345gct gat atg gtg ttg aac aag gtt att gat tac atc cgg aga gag tat 1225Ala Asp Met Val Leu Asn Lys Val Ile Asp Tyr Ile Arg Arg Glu Tyr350 355 360 365aac atc agt cat gtc aca ata caa att gag cgt taaaaaggca tagcaaacat 1278Asn Ile Ser His Val Thr Ile Gln Ile Glu Arg370 375ctcaagagtc ttttgtatca gtattctctt tattaacaat aataaaatca ataaagtttc 1338aatccttttg caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1379<210>10<211>376<212>PRT<213>Brassica juncea<400>10Met Glu Pro Ser Ser Pro Gln His Ser His Ile Ile Glu Val Asn Ala1 5 10 15Ser Lys Ser Asp Glu Glu Gln Arg Thr Thr Thr Leu Gly Ser Val Lys20 25 30Val Cys Gly Glu Thr Pro Cys His Leu Asn Asn Ala Ser Gly Asp Ala35 40 45Glu Glu Arg Thr Ala Ser Met Arg Lys Leu Cys Ile Ala Val Val Leu50 55 60Cys Leu Leu Phe Met Thr Val Glu Val Phe Gly Gly Ile Lys Ala Asn65 70 75 80Ser Leu Ala Ile Leu Thr Asp Ala Ala His Leu Leu Ser Asp Val Ala85 90 95Ala Phe Ala Ile Ser Leu Phe Ser Leu Trp Ala Ala Gly Trp Glu Ala100 105 110
FPI04055-sequence listThr Pro Arg Gln Thr Tyr Gly Phe Phe Arg Ile Glu Ile Leu Gly Ala115 120 125Leu Val Ser Ile Gln Leu Ile Trp Leu Leu Thr Gly Ile Leu Val Tyr130 135 140Glu Ala Ile Ile Arg Leu Leu Thr Glu Thr Ser Glu Val Asp Gly Phe145 150 155 160Leu Met Phe Leu Val Ala Ala Phe Gly Leu Leu Val Asn Ile Val Met165 170 175Ala Val Leu Leu Gly His Asp His Gly His Gly His Gly His Gly His180 185 190Ser His Asp Gly Val Thr Val Thr Thr His His His His Gly His Thr195 200 205His Gly Glu Asp Lys His His Ser His Gly Asp Val Thr Glu Glu Leu210 215 220Leu Asp Lys Ser Glu Lys Arg Lys Arg Asn Ile Asn Val Gln Gly Ala225 230 235 240Tyr Leu His Val Leu Gly Asp Leu Ile Gln Ser Val Gly Val Met Val245 250 255Gly Gly Ala Ile Ile Trp Tyr Lys Pro Glu Trp Lys Ile Val Asp Leu260 265 270Ile Cys Thr Leu Val Phe Ser Val Ile Val Leu Gly Thr Thr Ile Asn275 280 285Met Ile Arg Ser Ile Leu Glu Val Leu Met Glu Ser Thr Pro Arg Glu290 295 300Ile Asp Ala Thr Lys Leu Glu Gln Gly Leu Leu Glu Met Glu Glu Val305 310 315 320Val Ala Val His Glu Leu His Ile Trp Ala Ile Thr Val Gly Lys Val325 330 335Leu Leu Ala Cys His Val Asn Ile Thr Pro Glu Ala Asp Ala Asp Met340 345 350Val Leu Ash Lys Val Ile Asp Tyr Ile Arg Arg Glu Tyr Asn Ile Ser355 360 365His Val Thr Ile Gln Ile Glu Arg370 37權(quán)利要求
1.一種印度芥菜CE家族金屬陽離子跨膜運載蛋白分子，他為如下蛋白質(zhì)分子(i)或(ii)(i)具有附圖11所述的氨基酸序列；(ii)在附圖11限定的氨基酸序列經(jīng)過取代，缺失或疊加一個或幾個氨基酸衍生的蛋白質(zhì)且與(i)的蛋白質(zhì)具有相同的功能。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白分子，其特征在于，具有附圖11所述的氨基酸序列。
3.一種DNA分子，它包括編碼權(quán)利要求1所述的印度芥菜CE家族金屬陽離子跨膜運載蛋白分子的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的DNA分子，其特征在于，該DNA分子編碼具有圖11的氨基酸序列。
5.如權(quán)利要求4所述的DNA分子，其特征在于，該DNA為圖11的核苷酸序列。
6.權(quán)利要求1所述的蛋白分子在開發(fā)轉(zhuǎn)基因工程產(chǎn)品上的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3所述的DNA分子在開發(fā)轉(zhuǎn)基因工程產(chǎn)品上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新的CE基因家族的成員。本發(fā)明提供了印度芥菜CE家族金屬離子跨膜運載蛋白基因BjCET2的cDNA序列以及這些序列推測編碼蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列。應(yīng)用本發(fā)明的基因序列或氨基酸序列進行轉(zhuǎn)基因開發(fā)基因工程產(chǎn)品，對于提高植物的重金屬抗性，減少毒性重金屬在植物可食部位的積累；以及使植物對Zn，Ni，Se等必需礦質(zhì)微量元素的富集，開發(fā)礦質(zhì)強化食品等方面具有重大的應(yīng)用價值。
文檔編號A01H1/00GK1569894SQ200410004658
公開日2005年1月26日 申請日期2004年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月7日
發(fā)明者柴團耀, 朗明林 申請人:中國科學(xué)院研究生院