專利名稱：用分子遺傳標(biāo)記培育zw型鱗翅目害蟲性連鎖平衡致死系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ZW型鱗翅目害蟲的遺傳育種與遺傳防治領(lǐng)域，尤其涉及用分子遺傳標(biāo)記培育ZW型鱗翅目害蟲性連鎖平衡致死系的方法。
背景技術(shù)：
對于鱗翅目害蟲的防治目前多使用化學(xué)殺蟲劑、輻射不育或生物防治?；瘜W(xué)殺蟲劑曾經(jīng)在農(nóng)作物害蟲防治領(lǐng)域中取得了巨大的成就，但長期以來，由于高毒化學(xué)農(nóng)藥的大量使用，而導(dǎo)致產(chǎn)生三“R”問題(即次要害蟲的再猖獗、害蟲的抗性和農(nóng)藥殘留)，并造成嚴(yán)重的環(huán)境污染，破壞了自然界的生態(tài)平衡。
害蟲輻射不育防治技術(shù)是一種將人工飼養(yǎng)目標(biāo)害蟲，通過輻照后進(jìn)行野外釋放，與野生種群雜交等手段使害蟲喪失繁育能力而使蟲口數(shù)目自行下降的防治方法。這種技術(shù)具有不污染環(huán)境，滅蟲專一性強(qiáng)等特點(diǎn)，但該項技術(shù)存在很大的缺陷，主要是需要在實(shí)驗室里進(jìn)行大規(guī)模的害蟲飼養(yǎng)和輻照處理，成本高，輻照處理后的害蟲往往生命力下降，野外生活競爭力降低，對于遷飛習(xí)性強(qiáng)的害蟲防治效果差等缺陷，這些都限制了該技術(shù)的推廣。
生物防治主要是利用天敵生物，如細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蜂等自然生態(tài)系統(tǒng)的營養(yǎng)關(guān)系，各種生物之間相互依存、相互制約的生態(tài)學(xué)現(xiàn)象和某些生物學(xué)特征，使天敵和害蟲之間保持一定的平衡關(guān)系，達(dá)到防治害蟲的目的。生物防治雖然具有專一性強(qiáng)、持久控制害蟲、不會造成環(huán)境污染的優(yōu)點(diǎn)；但仍存在很多局限性，如見效慢，生物制劑不易成批生產(chǎn)，使用復(fù)雜和效果不穩(wěn)定等。
性連鎖平衡致死控制技術(shù)是通過平衡鱗翅目害蟲性染色體上兩個不等位的致死突變基因，即致死突變基因隱性純合致死、而雜合則都可以生存下來，從而實(shí)現(xiàn)性別控制。該技術(shù)的關(guān)鍵是培育具有正常生命活動能力的性連鎖平衡致死品系。V.A.Strunnikov院士等運(yùn)用輻射誘變等技術(shù)手段，在國際上首次育成了家蠶性連鎖平衡致死系統(tǒng)，該系統(tǒng)可以繁衍繼代，但當(dāng)平衡致死系雄蠶與任何一個普通品種的雌蠶雜交，其后代的雌蠶卵皆在胚胎期死亡(不孵化)，而雄蠶卵均能正常孵化，使專養(yǎng)雄蠶變成了現(xiàn)實(shí)。同時他提出了利用性連鎖平衡致死方法防治害蟲的技術(shù)設(shè)想，即利用人工培育的鱗翅目害蟲性連鎖平衡致死品系的雄蟲，人工釋放至野外，與野生雌蟲交配，其后代雌蟲在致死基因的作用下自然死亡，后代雄蟲雖能成活但仍攜帶致死基因，這種雄蟲與野生的雌蟲雜交，其后代的雌群體又有50％自然死亡，依次遞減……，從而達(dá)到有效地控制害蟲種群數(shù)目的目的。1990年捷克科學(xué)家Marec F利用EMS誘變技術(shù)，培育出了性連鎖平衡致死的地中海粉螟品品系，使利用性連鎖平衡致死方法防治害蟲的技術(shù)設(shè)想變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。
與其他害蟲防治技術(shù)相比，性連鎖平衡致死方法防治害蟲具有多方面的優(yōu)勢，其中最為突出的特點(diǎn)是1、座位在性染色體上的致死基因遺傳穩(wěn)定，具有可持續(xù)作用；2、與輻射不育技術(shù)相比，釋放蟲量少，成本低，基因型相對較單純；3、無毒、無殘留、不傷害天敵、不存在害蟲抗藥性問題、與環(huán)境兼容性強(qiáng)；4、可以通過篩選分別位于兩個同源染色體上相距很近的雙致死基因的平衡致死系統(tǒng)，利用減數(shù)分裂時配子交換的特性，將害蟲控制在危害程度下，又保持了生物種群平衡和生物鏈的連續(xù)。
雖然性連鎖平衡致死方法防治害蟲具有多方面的優(yōu)勢，但到目前為止，僅在家蠶和地中海粉螟中取得成功，還很難推廣運(yùn)用于整個鱗翅目害蟲，其主要原因是人們對其他害蟲的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如家蠶，尚缺少可以用于性連鎖平衡致死研究的穩(wěn)定品系，尤其是沒有Z染色體上的可見表型性狀標(biāo)記。除家蠶、地中海粉螟外，人們對ZW型害蟲的研究還僅僅停留在生物學(xué)和生態(tài)學(xué)上。很多害蟲還不能人工飼養(yǎng)，更沒有種群與品系的區(qū)分，對這樣的物種，利用表型標(biāo)記進(jìn)行性連鎖平衡致死品系的培育是非常困難的，這也就是為什么性連鎖平衡致死技術(shù)至今沒有能夠用于害蟲防治的主要原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用分子遺傳標(biāo)記培育ZW型鱗翅目害蟲性連鎖平衡致死系的方法，利用分子遺傳標(biāo)記及比較定量PCR技術(shù)及多色熒光原位雜交技術(shù)，一只雄蟲與正常雌蟲和易位雌蟲進(jìn)行交配，同步篩選培育性連鎖平衡致死的鱗翅目害蟲。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下1)用已知鱗翅目物種Z染色體上的基因序列，克隆目標(biāo)害蟲(被研究的害蟲)的同源基因，以常染色體上的分子標(biāo)記為參照，利用比較定量PCR技術(shù)尋找目標(biāo)害蟲Z染色體上的分子標(biāo)記；2)以尋找到的Z染色體上的分子標(biāo)記為染色體易位檢測標(biāo)記，用比較定量PCR技術(shù)篩選發(fā)生 染色體易位的雌性個體，并用多色熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)行驗證；3)用γ射線同時輻照雌雄蟲，誘發(fā)隱性致死突變、互交產(chǎn)生F1代，用一個F1代雄蟲先后與正常雌蟲及 易位雌蟲進(jìn)行交配，以W染色體特異片段為標(biāo)記用PCR技術(shù)檢測F2代中是否有雌蟲存活，同步篩選兩個分別位于不同Z染色體上的非等位、且緊密連鎖、并能被 易位染色體片段顯性基因掩蓋的隱性致死基因。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是直接從分子水平尋找和利用生物個體在基因組或基因型上所含有的遺傳信息，因而具有穩(wěn)定性高、受環(huán)境條件的影響較小、信息量大、不同層次和類群之間廣泛可比，擺脫了性狀標(biāo)記受種群和品系的限制；同時根據(jù)同源基因相對保守的特點(diǎn)，利用已知物種Z染色體上的基因序列，克隆目標(biāo)害蟲的同源基因，并通過比較定量PCR技術(shù)進(jìn)行基因定位，從而徹底擺脫了物種的限制；利用比較定量PCR技術(shù)直接在F1代檢測易位個體，避免了大大量飼養(yǎng)F2代幼蟲的無效勞動；在雙致死基因的篩選中采用一雄交二雌的選育方式，并用W染色體特異片段和PCR技術(shù)檢測后代后代雌性個體的存活與否，大加快了致死基因的篩選進(jìn)程；整個技術(shù)涉及面廣，適用于所有鱗翅目ZW型害蟲。


圖1是雌蟲染色體組成、相應(yīng)的基因比例及其定量PCR檢測結(jié)果示意圖；圖2是雄蟲染色體組成、相應(yīng)的基因比例及其定量PCR檢測結(jié)果示意圖；圖3是帶有K基因的Z染色體片段易位到W染色體上成為 基因型易位個體的染色體組成、相應(yīng)的基因比例及其定量PCR檢測結(jié)果示意圖；圖4是γ射線輻照處理雌蟲誘發(fā)帶有K基因Z染色體片段向W染色體易位后與正常雄蟲交配篩選易位個體模式圖；圖5是γ射線輻照處理雌蟲使帶有K基因Z染色體片段斷裂成為一個染色體外的片段并與正常雄蟲交配產(chǎn)生假易位個體；圖6是假易位F1個體與正常雄蟲交配的后代基因型模式圖；圖7是易位F1個體與正常雄蟲交配產(chǎn)生的后代的基因型模式圖；圖8是分別位于兩個Z染色體上隱性致死基因的誘變模式圖；圖9是帶有兩個致死基因的雄蟲與正常雌蟲交配的后代基因型及雌雄性別比例；圖10是帶有一個致死基因的雄蟲與正常雌蟲交配的后代基因型及雌雄性別比例；圖11是雙致死基因(l1、l2)不能被 易位染色體片段掩蓋的后代基因型及雌雄性別比例；圖12是雙致死基因(k1、k2)被 易位染色體片段掩蓋的后代基因型及雌雄性別比例。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明主要是利用分子遺傳標(biāo)記結(jié)合比較定量PCR技術(shù)培育性連鎖平衡致死的鱗翅目害蟲，可用于鱗翅目害蟲的遺傳防治。具體地說，是以位于常染色體上的基因(如A基因)為參照基因，利用比較定量PCR技術(shù)尋找目標(biāo)害蟲Z染色體上的分子標(biāo)記(如K基因)，Z染色體上的分子標(biāo)記與常染色體上基因的比例(K/A)在雌雄之間存在差異，在雌性個體中K/A＝1/2，在雄性個體中K/A＝2/2；利用這一差異就可確定目標(biāo)害蟲Z染色體上的分子標(biāo)記。用γ射線輻照誘變的Z染色體片段向W染色體易位，并以Z染色體上的分子標(biāo)記(如K基因)為易位篩選標(biāo)記，利用比較定量PCR技術(shù)及多色熒光原位雜交技術(shù)篩選發(fā)生 染色體易位個體。用γ射線輻照，在Z染色體上誘變兩個分別位于不同Z染色體上的非等位、且緊密連鎖、并能被 易位染色體片段顯性基因掩蓋的隱性致死基因，通過與 染色體易位個體反復(fù)交配就可培育出目標(biāo)害蟲的性連鎖平衡致死品系，用于目標(biāo)害蟲的遺傳防治。
主要方法包括利用RAPD技術(shù)尋找目標(biāo)害蟲W染色體特異片段；以常染色體上的分子標(biāo)記為參照，利用比較定量PCR技術(shù)尋找目標(biāo)害蟲Z染色體上的分子標(biāo)記；用γ射線輻照誘變，并用比較定量PCR技術(shù)及多色熒光原位雜交技術(shù)篩選發(fā)生 染色體易位個體；用γ射線同時輻照雌雄蟲，誘發(fā)隱性致死突變、互交產(chǎn)生F1代，用一個F1代雄蟲先后與正常雌蟲及 易位雌蟲交配，以W染色體特異片段為標(biāo)記用PCR技術(shù)檢測F2代中是否有雌蟲存活，同步篩選兩個分別位于不同Z染色體上的非等位、且緊密連鎖、并能被 易位染色體片段所掩蓋的隱性致死基因并與 染色體易位個體交配培育出性連鎖平衡致死品系。
具體步驟如下1尋找目標(biāo)害蟲Z染色體上的分子標(biāo)記隨著以家蠶為代表的鱗翅目昆蟲分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，ZW型鱗翅目昆蟲Z染色體上的基因越來越多的被人們發(fā)現(xiàn)，利用同類物種間基因相對保守的特點(diǎn)，根據(jù)已知模式昆蟲如家蠶Z染色體上的基因(如K基因)序列，克隆目標(biāo)害蟲的同源基因(如K基因)；以位于常染色體上的基因(如A基因)為參照基因，利用比較定量PCR技術(shù)鑒定目標(biāo)害蟲的K基因是否在Z染色體上。Z染色體上的基因(如K基因)與常染色體上基因(如A基因)的比例(K/A)在雌雄之間存在差異，這是因為雌蟲的基因型為WZKAA，只有一個K基因，兩個A基因，K/A＝1/2(如圖1)；而雄蟲的基因型為ZKZKAA，有兩個K基因，兩個A基因，K/A＝2/2(如圖2)；利用這一差異就可確定目標(biāo)害蟲Z染色體上的分子標(biāo)記。實(shí)時定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種基因檢測與診斷技術(shù)，是在熒光定量PCR儀上將基因的PCR擴(kuò)增與基因的熒光檢測結(jié)合起來一種非常準(zhǔn)確的基因檢測手段。比較定量PCR是以一個基因為內(nèi)參照，與被檢測基因同時進(jìn)行實(shí)時定量PCR擴(kuò)增，然后通過參照基因的拷貝數(shù)計算被檢測基因的拷貝數(shù)。
2篩選 染色體易位體用γ射線輻照處理雌蟲，以K基因作為易位篩選標(biāo)記，使帶有K基因的Z染色體片段向W染色體易位。經(jīng)輻照處理的雌蟲與正常的雄蟲交配，對F1代雌蟲逐個進(jìn)行單蟲比較定量PCR檢測(如圖4)。正常雌蟲的基因型為WZKAA，K/A＝1/2(如圖1)；如果帶有K基因的Z染色體片段易位到W染色體上，則易位個體的基因型為 將有兩個K基因，K/A＝2/2(如圖3)。
對于沒有易位但帶有一個標(biāo)記基因的染色體片段的個體(如圖5)，雖然K/A＝2/2，但當(dāng)這樣的個體與正常的雄蟲交配后，則ZK染色體片段發(fā)生分離，后代中雌的個體的基因型將發(fā)生變化，有的為WZAA型，K/A＝1/2；有的為WZKZKAA型，K/A＝2/2(如圖6)。而易位個體 與正常雄蟲交配，后代雌蟲的基因型全為 K/A＝2/2(如圖7)。通過對F2或F3代雌蟲的跟蹤調(diào)查，就可鑒定出易位個體。并且對于經(jīng)定量PCR檢測為 染色體易位的個體，可以用W特異片段和K基因片段為探針進(jìn)行多色熒光原位雜交技術(shù)驗證。
3培育性連鎖平衡致死的鱗翅目害蟲品系3.1分子水平鑒定目標(biāo)害蟲的雌雄ZW型鱗翅目害蟲的染色體組成在雌雄個體間存在顯著差異，雌蟲的性染色體為ZW，雄蟲的性染色體為ZZ，利用RAPD技術(shù)尋找目標(biāo)害蟲W染色體特異的分子標(biāo)記，經(jīng)序列分析，合成特異的引物，直接通過PCR技術(shù)在分子水平鑒定目標(biāo)害蟲的雌雄。
3.2 Z染色體上非等位、且緊密連鎖的隱性胚胎期致死基因的誘變和篩選同時用γ射線輻照處理雌蟲、雄蟲，在Z染色體上誘變致死突變。雌雄交配(如圖8)，F(xiàn)1雄蟲與正常雌蟲及 易位雌蟲先后進(jìn)行單蛾交配、隔離飼養(yǎng)，如果某個F1雄蟲的兩個Z染色體上分別帶有一個致死基因(如k1，k2)，且不等位、又緊密連鎖，當(dāng)這個雄蟲與正常的雌蟲交配后，其F2代成活的全部為雄蟲，雌蟲全部致死(如圖9)；如果某個F1雄蟲僅有一個致死基因或完全沒有致死基因，則其與正常雌蟲交配后，F(xiàn)2代就有雌蟲成活(如圖10)。在幼蟲剛孵化出來時，提取數(shù)十、甚至上百頭幼蟲的DNA，利用W染色體上的雌性特異性片段進(jìn)行PCR檢測，如果有雌蟲存活，PCR檢測為陽性；如果沒有雌蟲存活，PCR檢測為陰性。這樣既可以避免大規(guī)模飼養(yǎng)F2代幼蟲，又可以判斷F1代雄蟲的遺傳特性。
3.3 Z染色體上隱性致死基因與 易位染色片段的平衡被 易位染色體片段掩蓋的Z染色體上隱性致死基因的篩選與前面雙致死基因的篩選同時進(jìn)行，如果發(fā)現(xiàn)F1代雄蟲與正常的雌蟲交配產(chǎn)生的F2代幼蟲全為雄蟲(如圖9的結(jié)果)，則用同樣的W染色體上的雌性特異性片段進(jìn)行PCR方法檢測其與 易位雌蟲交配后產(chǎn)生的F2代幼蟲，如果PCR檢測為陰性，說明這個F1代雄蟲的兩個Z染色體上的致死基因(如圖11)不能被 易位染色體片段顯性基因掩蓋；如果PCR檢測結(jié)果為陽性，說明這個F1個體的兩個Z染色體上的致死基因(如圖12)可以被 易位染色體片段顯性基因掩蓋，可被顯性基因掩蓋F1代雄性個體和相對應(yīng)的易位雌性個體就組成了目標(biāo)害蟲的性連鎖平衡致死品系。
權(quán)利要求
1.用分子遺傳標(biāo)記培育ZW型鱗翅目害蟲性連鎖平衡致死系的方法其特征在于1)用已知ZW型鱗翅目昆蟲Z染色體上的基因序列，克隆目標(biāo)害蟲的同源基因，以常染色體上的分子標(biāo)記為參照，利用比較定量PCR技術(shù)尋找目標(biāo)害蟲Z染色體上的分子標(biāo)記；2)以尋找到的Z染色體上的分子標(biāo)記為染色體易位檢測標(biāo)記，用比較定量PCR技術(shù)篩選發(fā)生 染色體易位的雌性個體，并用多色熒光原位雜交技術(shù)進(jìn)行驗證；3)用γ射線同時輻照雌雄蟲，誘發(fā)隱性致死突變、互交產(chǎn)生F1代，用一個F1代雄蟲先后與正常雌蟲及 易位雌蟲進(jìn)行交配，以W染色體特異片段為標(biāo)記用PCR技術(shù)檢測F2代中是否有雌蟲存活，同步篩選兩個分別位于不同Z染色體上的非等位、且緊密連鎖、并能被 易位染色體片段顯性基因掩蓋的隱性致死基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用分子遺傳標(biāo)記培育ZW型鱗翅目害蟲性連鎖平衡致死系的方法。以常染色體上的分子標(biāo)記為參照，利用比較定量PCR技術(shù)尋找目標(biāo)害蟲Z染色體上的分子標(biāo)記，并以此標(biāo)記為作為易位篩選標(biāo)記，用γ射線輻照誘發(fā)W
文檔編號A01K67/033GK1561712SQ20041001794
公開日2005年1月12日 申請日期2004年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月21日
發(fā)明者孟智啟, 牛寶龍, 翁宏飚, 沈衛(wèi)鋒, 顧偉平, 夏大榮 申請人:浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院