專利名稱：囊絲黃精再生體系的建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有藥用價(jià)值的黃精屬植物再生體系的建立方法，特別是囊絲黃精再生體系的建立方法。
背景技術(shù)：
黃精為百合科植物黃精(Polygonatum sibiricum Redoute)、囊絲黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)、熱河黃精(Polygonatum macropodiumTurcz.)、滇黃精(Polygonatum kingianum Coll.et Hemsl.)、卷葉黃精(Polygonatum cirrhifolium(Wall.)Royle)等的根莖[1]。黃精入藥治病古已有之，《神農(nóng)本草經(jīng)》把它列為上品，黃精性甘、味平，歸肺、脾、腎、經(jīng)，具養(yǎng)陰潤(rùn)肺補(bǔ)脾益氣的功效，用于滋補(bǔ)強(qiáng)身和治療腎虛精虧、肺虛燥咳以及脾胃虛之癥，是中醫(yī)常用藥物?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，黃精具有增強(qiáng)免疫、降低血脂、血糖、延緩衰老、營養(yǎng)神經(jīng)和解毒功能等多種藥理作用，對(duì)黃精化學(xué)成分的研究表明，黃精含有黃精皂苷、菸酸、糖類、醌類、氨基酸及微量元素。
近年來，對(duì)黃精多糖的研究已取得一些很有意義的進(jìn)展，從囊絲黃精中提取的多聚糖(提供組培植物的多聚糖含量)具有增強(qiáng)大鼠免疫系統(tǒng)的活性[2]；其根狀莖中的甘露糖結(jié)合凝集素-黃精凝集素II(Polygonatumcyrtonema Hua.lectin II，PCL II)具有特異結(jié)合甘露糖的活性，作為植物凝集素超家族的一員具有廣泛的生物學(xué)活性，可作為逆轉(zhuǎn)錄病毒的有效抑制劑和用于防止農(nóng)作物的病蟲害等[3，4，5]。
目前，黃精主要采用根狀莖繁殖。由于根狀莖繁殖率低，需3-5年才能長(zhǎng)成具藥用價(jià)值的植株，加之，長(zhǎng)期大規(guī)模的無序采挖黃精，我國黃精已經(jīng)面臨匱乏的危險(xiǎn)。雖然，美國申請(qǐng)?zhí)枮?0030100109的發(fā)明專利提供了一種新的培養(yǎng)基和一種黃精屬植物卷葉黃精離體再生系統(tǒng)的建立方法，該方法將黃精種子分別在三種培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)生上胚軸、胚芽鞘、根并終止上胚軸的休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)，但是，該方法所得幼苗要長(zhǎng)成具藥用價(jià)值的植株所需年限仍然很長(zhǎng)。
利用組織培養(yǎng)方法快速繁殖營養(yǎng)繁殖系及產(chǎn)生有效藥用成分，已漸漸成為藥物生產(chǎn)的新方向之一。對(duì)于囊絲黃精來說，在組織培養(yǎng)中易發(fā)生黃化或玻璃化現(xiàn)象，到目前為止還沒有見到通過誘導(dǎo)它的外植體產(chǎn)生愈傷組織，再經(jīng)組織分化形成再生體系，并在該再生體系根狀莖中發(fā)現(xiàn)甘露糖結(jié)合凝集素的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種囊絲黃精再生體系的建立方法，克服囊絲黃精根狀莖繁殖殖率低、生長(zhǎng)年限長(zhǎng)的缺陷，并使再生體系中的蛋白質(zhì)成分種類和含量與野生的植株相似。
本發(fā)明對(duì)所要解決的技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為提供一種囊絲黃精再生體系的建立方法，其步驟為a、囊絲黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)外植體愈傷組織的誘導(dǎo)；b、將前述愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生苗；c、將步驟b中未生根的幼苗移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；d、將步驟b和c中生根的試管苗先煉苗，然后，栽培。
在步驟a中，所述的囊絲黃精外植體為其根、根狀莖或葉；將囊絲黃精外植體滅菌后接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，于避光條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)愈傷組織，培養(yǎng)溫度為25±2℃，培養(yǎng)時(shí)間為5-8周，所述的愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基、0.5-2.0mg/L 6-BA、0.5-4.0mg/L 2，4-D、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8；本發(fā)明愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選組成為MS基本培養(yǎng)基、1.0mg/L 6-BA、2.0mg/L 2，4-D、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8。
以上所述的MS基本培養(yǎng)基的組成為大量元素(1.65g/L NH4NO3，1.9g/L KNO3，0.44g/L CaCl2.2H2O，0.37g/L MgSO4.7H2O，0.17g/L KH2PO4)、微量元素(37.25mg/L Na2EDTA，27.8mg/L FeSO4.7H2O，0.83mg/L KI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4.4H2O，8.6mg/L ZnSO4.7H2O，0.25mg/LNa2MoO4.2H2O，0.025mg/L CuSO4.5H2O，0.025mg/L CoCl2.6H2O)、2mg/L苷氨酸、100mg/L肌醇、0.1mg/L鹽酸硫胺素(B1)、0.5mg/L鹽酸吡哚醇(B6)、0.5mg/L煙酸。
在步驟b中，將愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生苗，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照時(shí)間為12-16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為1200-2000Lx，培養(yǎng)時(shí)間3-4周，所述的分化培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基、0.5-4.0mg/L 2，4-D、0-2.0mg/L 6-BA、0-0.6mg/L NAA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8；本發(fā)明分化培養(yǎng)基優(yōu)選組成為MS基本培養(yǎng)基、2.0mg/L 2，4-D、2.0mg/L6-BA、0.3mg/L NAA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為1200Lx，培養(yǎng)2-3周。
在步驟c中，將未生根的幼苗移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)根的分化，培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照時(shí)間為12-16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為1200-2000Lx，培養(yǎng)3-4周，所述的生根培養(yǎng)基組成為1/2MS基本培養(yǎng)基、0.3-0.5mg/LNAA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8；本發(fā)明生根培養(yǎng)基優(yōu)選組成為1/2MS基本培養(yǎng)基、0.5mg/L NAA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為1200Lx，培養(yǎng)3-4周。
在步驟c中，本發(fā)明所述的生根培養(yǎng)基組成也可為1/2MS基本培養(yǎng)基、0.5mg/L 6-BA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8；培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為1200Lx，培養(yǎng)3-4周。
以上所述的1/2MS基本培養(yǎng)基的組成為大量元素(0.83g/L NH4NO3，0.95g/L KNO3，0.22g/L CaCl2.2H2O，0.185g/L MgSO4.7H2O，0.085g/LKH2PO4)、微量元素(37.25mg/L Na2EDTA，27.8mg/L FeSO4.7H2O，0.83mg/LKI，6.2mg/L H3BO3，22.3mg/L MnSO4.4H2O，8.6mg/L ZnSO4.7H2O，0.25mg/LNa2MoO4.2H2O，0.025mg/L CuSO4.5H2O，0.025mg/L CoCl2.6H2O)、2mg/L苷氨酸、100mg/L肌醇、0.1mg/L鹽酸硫胺素(B1)、0.5mg/L鹽酸吡哚醇(B6)、0.5mg/L煙酸。
在步驟d中，所述的煉苗和栽培包括將生根的試管苗移至自然光下培養(yǎng)3-4天，打開瓶蓋，煉苗2-3天，然后再取出幼苗，洗凈瓊脂，移入疏松的重量比為1∶1的泥炭土與蛭石中，在溫度為27±1℃、自然光下培養(yǎng)。
本發(fā)明的有益效果為本發(fā)明方法具有較高的分化率，只需3-4個(gè)月即可得到囊絲黃精再生體系，其移栽后的成活率達(dá)70-75％，有利于大規(guī)模的栽培和使用；而且，其根狀莖中的蛋白質(zhì)成分種類和含量與野生的植株相似，特別是甘露糖結(jié)合凝集素與野生的植株含量和凝血活力相近，為根狀莖中的主要蛋白；此外，培養(yǎng)的根狀莖與野生型形態(tài)相似(如附圖8所示)，而生長(zhǎng)快于野生型。


圖1黃精體外培養(yǎng)生長(zhǎng)過程中外植體表面形成愈傷組織；圖2黃精體外培養(yǎng)生長(zhǎng)過程中愈傷組織膨大；圖3黃精體外培養(yǎng)生長(zhǎng)過程中愈傷組織形成分化芽點(diǎn)；圖4黃精體外培養(yǎng)生長(zhǎng)過程中形成不定芽；圖5黃精體外培養(yǎng)生長(zhǎng)過程中形成黃精植株；圖6黃精體外培養(yǎng)生長(zhǎng)過程中形成膨大的根狀莖；圖7黃精體外培養(yǎng)生長(zhǎng)過程中黃精植株生根；圖8黃精體外培養(yǎng)生長(zhǎng)過程中移植成活的黃精幼苗圖9黃精總蛋白和黃精凝集素II的SDS-PAGE圖；其中，1，2分別為野生和離體再生型根狀莖總蛋白；3為黃精凝集素II。
具體實(shí)施例方式
一、本發(fā)明囊絲黃精外植體愈傷組織的誘導(dǎo)實(shí)施例11、植物材料囊絲黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)，為百合科黃精屬囊絲黃精。材料取自四川省長(zhǎng)寧縣山區(qū)。
2、愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成為(1)MS基本培養(yǎng)基組成為大量元素(1.65g/L NH4NO3，1.9g/L KNO3，0.44g/L CaCl2.2H2O，0.37g/L MgSO4.7H2O，0.17g/L KH2PO4)、微量元素(37.25mg/L Na2EDTA，27.8mg/L FeSO4.7H2O，0.83mg/L KI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/L MnSO4.4H2O，8.6mg/L ZnSO4.7H2O，0.25mg/L Na2MoO4.2H2O，0.025mg/L CuSO4.5H2O，0.025mg/L CoCl2.6H2O)、2mg/L苷氨酸、100mg/L肌醇、0.1mg/L鹽酸硫胺素(B1)、0.5mg/L鹽酸吡哚醇(B6)、0.5mg/L煙酸。
(2)瓊脂8g/L、蔗糖30g/L。
(3)激素組成及含量見表見表1-12.4-D(2，4-dichlorophenoxyacetic acid)，2，4-二氯苯氧乙酸)，6-BA(N6-Benzyladenine，N6-芐氨基嘌呤)，NAA(a-naphthaleneacetic acid，a-萘乙酸)為中科院上海生化所產(chǎn)品。
(4)pH為5.8。
3、愈傷組織的誘導(dǎo)取幼嫩黃精根狀莖，用軟毛刷輕輕刷洗干凈；再放入75％的乙醇中浸泡1min；之后置于0.1％的升汞溶液(HgCl2)中浸泡8min滅菌，每過2min輕蕩燒杯；最后用無菌水洗5~6次，每次2min。在無菌紙上將材料切成0.5cm×0.5cm×0.5cm大小，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。置于溫度為25±2℃、黑暗的環(huán)境下培養(yǎng)5-8周。
4、結(jié)果如附圖1所示，在黑暗環(huán)境中培養(yǎng)兩周后，接種的黃精外植體開始膨大且表面有黃色的小突起，4周左右有明顯愈傷組織生成。由表1-1結(jié)果可知，最佳培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基、1.0mg/L 6-BA、2.0mg/L 2，4-D、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8，可有效誘導(dǎo)愈傷組織形成。
表1-1 不同培養(yǎng)基對(duì)誘導(dǎo)黃精愈傷組織形成的影響接種的外植體(個(gè))形成的愈傷組織(個(gè))MS 2，4-D(mg/l) 6-BA(mg/l)0.0 0.00 00.0 0.50 00.5 0.5 72531.0 1.0 7757
2.0 1.0 86724.0 1.0 61452.0 1.5 88612.0 2.0 79652.0 0.0 7432二、黃精愈傷組織的誘導(dǎo)分化實(shí)施例21、材料實(shí)施例1所誘導(dǎo)的囊絲黃精愈傷組織。
2、培養(yǎng)基愈傷組織分化培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基、0.50mg/L 2，4-D+0.5mg/L6-BA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8。
3、培養(yǎng)條件6周后，將實(shí)施例1中長(zhǎng)成的愈傷組織直接轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基中，在25±2℃，光照13h/d，2000Lx光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)2-3周。
實(shí)施例3培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基、1.0mg/L 2，4-D、A1.0mg/L 6-B、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8。
培養(yǎng)條件為溫度為25±2℃，光照14h/d，光照強(qiáng)度為1800Lx。
其它與實(shí)施例2相同。
實(shí)施例4培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基、2.0mg/L 2，4-D、1.0mg/L 6-BA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8。
培養(yǎng)條件為溫度為25±2℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度為1200Lx。
其它與實(shí)施例2相同。
實(shí)施例5培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基、4.0mg/L 2，4-D、1.0mg/L 6-BA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8。
培養(yǎng)條件為溫度為25±2℃，光照15h/d，光照強(qiáng)度為1600Lx。
其它與實(shí)施例2相同。
實(shí)施例6培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基、2.0mg/L 2，4-D、1.0mg/L 6-BA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8。
培養(yǎng)條件為溫度為25±2℃，光照16 h/d，光照強(qiáng)度為1400Lx。
其它與實(shí)施例2相同。
實(shí)施例7培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基、2.0mg/L 2，4-D、2.0mg/L 6-BA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8。
培養(yǎng)條件為溫度為25±2℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度為1200Lx。
其它與實(shí)施例2相同。
實(shí)施例8培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基、2.0mg/L 2，4-D、0.4mg/L NAA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8。
培養(yǎng)條件為溫度為25±2℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度為1200Lx。
其它與實(shí)施例2相同。
實(shí)施例9培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基、2.0mg/L 2，4-D、0.5mg/L NAA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8。
培養(yǎng)條件為溫度為25±2℃，光照12 h/d，光照強(qiáng)度為1200Lx。
其它與實(shí)施例2相同。
實(shí)施例10培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基、2.0mg/L 2，4-D、0.6mg/L NAA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8。
培養(yǎng)條件為溫度為25±2℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度為1200Lx。
其它與實(shí)施例2相同。
上述實(shí)施例2-10的黃精愈傷組織誘導(dǎo)分化結(jié)果見表1-2如附圖2-6所示，將實(shí)施例1所得的愈傷組織轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上后，愈傷組織進(jìn)一步膨大，顏色變?yōu)榫G色。從表1-2可知，兩周后分化出小芽，實(shí)施例4中莖的分化率最高，可達(dá)83.7±2.1％。
實(shí)施例7中根和莖的分化效果最佳，平均分化率為48.1±3.1％。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，莖繼續(xù)生長(zhǎng)，在基部還有大量的球狀膨大，葉子展開直至長(zhǎng)成小苗。
表1-2 黃精愈傷組織的分化結(jié)果.
分化的狀態(tài)分化率(％)實(shí)施例 AS AR AS+AR實(shí)施例2AS73.60.00.0實(shí)施例3AS74.00.00.0實(shí)施例4AS83.70.00.0實(shí)施例5AS73.80.00.0實(shí)施例6AS+AR 37.50.031.8實(shí)施例7AS+AR 34.20.048.1實(shí)施例8AR0.0 43.2 0.0實(shí)施例9AR0.0 64.9 0.0實(shí)施例10 AR0.0 48.6 0.0AS，分化出莖；AR，分化出根。
分化率＝(愈傷組織分化的數(shù)目/接種的愈傷組織塊數(shù))×100％三、生根誘導(dǎo)實(shí)施例111、材料實(shí)施例2-10中未生根的幼苗。
2、培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基1/2MS基本培養(yǎng)基、0.3mg/L NAA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8。
1/2MS基本培養(yǎng)基組成為大量元素(0.83g/L NH4NO3，0.95g/L KNO3，0.22g/L CaCl2.2H2O，0.185g/L MgSO4.7H2O，0.085g/L KH2PO4)、微量元素(37.25mg/L Na2EDTA，27.8mg/L FeSO4.7H2O，0.83mg/L KI，6.2mg/LH3BO3，22.3mg/L MnSO4.4H2O，8.6mg/L ZnSO4.7H2O，0.25mg/L Na2MoO4.2H2O，0.025mg/L CuSO4.5H2O，0.025mg/L CoCl2.6H2O)、2mg/L苷氨酸、100mg/L肌醇、0.1mg/L鹽酸硫胺素(B1)、0.5mg/L鹽酸吡哚醇(B6)、0.5mg/L煙酸。
3、培養(yǎng)條件在培養(yǎng)出黃精外植體的幼苗后，將未生根的幼苗移植至生根培養(yǎng)基中，在25±2℃，光照14h/d，2000Lx光照強(qiáng)度的條件下培養(yǎng)3-4周。
實(shí)施例121、培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基1/2MS基本培養(yǎng)基、0.5mg/L NAA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8。
2、培養(yǎng)條件溫度為25±2℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度為1200Lx。
其它同實(shí)施例11。
實(shí)施例131、培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基1/2MS基本培養(yǎng)基、0.4mg/NAAL、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8。
2、培養(yǎng)條件溫度為25±2℃，光照116h/d，光照強(qiáng)度為1500Lx。
其它同實(shí)施例11。
實(shí)施例141、培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基1/2MS基本培養(yǎng)基、0.5mg/L 6-BA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8。
2、培養(yǎng)條件溫度為25±2℃，光照12h/d，光照強(qiáng)度為1200Lx，培養(yǎng)2-3周。
其它同實(shí)施例11。
上述實(shí)施例11-14的生根誘導(dǎo)結(jié)果見表1-3
如附圖7所示，將未生根的幼苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，兩周后，幼苗分化出根，各實(shí)施例的生根誘導(dǎo)率見表1-3。黃精離體培養(yǎng)生長(zhǎng)過程見說明書附圖1-8。
表1-3 幼芽在不同條件下離體生根的情況.
實(shí)施例SNNSRFR(％)實(shí)施例11 206 30.0實(shí)施例12 2013 65.0實(shí)施例13 209 45.0實(shí)施例14 203 15.0SN幼芽數(shù) NSR生根幼芽數(shù) FR生根頻率實(shí)施例15將實(shí)施例2-14中的已生根試管苗從玻璃溫室中移至自然光下培養(yǎng)3~4天；之后打開瓶蓋，煉苗三天；然后取出幼苗，洗凈瓊脂，移入疏松的泥炭土∶蛭石(1∶1)中，在溫度為27℃、自然光下培養(yǎng)。
移栽后的幼苗成活率達(dá)70-75％，培養(yǎng)的根狀莖與野生型形態(tài)相似(如附圖8所示)，而生長(zhǎng)快于野生型，但有效成分與野生型含量相似。
四、囊絲黃精再生體系中甘露糖結(jié)合凝集素的鑒定和含量測(cè)定實(shí)施例161.1 根狀莖總蛋白的提取分別取野生可藥用的黃精和上述實(shí)施例制備的離體再生黃精根狀莖，液氮研磨后加入2倍體積(W/V)的Tris-HCl(50mM，pH6.8，含有0.2M NaCl)，4℃靜置過夜。勻漿液過濾后3000g離心15min。將上清液用濾紙(Whatman3MM)過濾，-20℃保存待用。
1.2 SDS-PAGE電泳活性分析取野生型和離體再生型總蛋白提取液及從野生黃精中純化的黃精凝集素II樣品(純化方法見文獻(xiàn)[6])進(jìn)行不連續(xù)SDS-PAGE電泳[7](Tris-HCl，緩沖液pH7.2，濃縮膠5％，分離膠10％)，銀染觀察電泳結(jié)果。
1.3 兔紅細(xì)胞凝集活性分析分別取上述兩種提取液和黃精凝集素II 25ul(濃度相同)，在96孔微量血清稀釋板上進(jìn)行系列倍比稀釋[8]，再向每孔中加入25ul兔血紅細(xì)胞(兔血紅細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次，并用相同溶液配制成2％細(xì)胞懸液)。震蕩混勻后，室溫放置2h，顯微鏡下檢查凝集結(jié)果。
2.1 SDS-PAGE電泳鑒定結(jié)果比較野生根狀莖和離體再生的根狀莖總蛋白提取物的SDS解離電泳圖譜(附圖9)，黃精凝集素II占有較大的比例(約占20％)，為主要蛋白染色帶；離體再生型和野生型根狀莖總蛋白中蛋白種類和含量相似，尤其是甘露糖結(jié)合凝集素含量沒有明顯差別，且均為總蛋白中主要組分。
2.2 黃精凝集素凝血活性的測(cè)定結(jié)果根狀莖總蛋白提取物的凝血活性測(cè)定結(jié)果見表1-4，黃精凝集素II在0.25μg/ml時(shí)仍能凝集兔紅細(xì)胞；野生黃精根狀莖的總蛋白抽提液在1.95μg/ml時(shí)有活性，而離體再生型根狀莖中抽提的總蛋白在1.95μg/ml時(shí)仍有微弱活性，而在3.9μg/ml時(shí)具有明顯活性。野生型與離體再生型根狀莖中甘露糖結(jié)合凝集素最低凝集濃度相差不到一個(gè)數(shù)量級(jí)，可以判斷野生型與離體再生的黃精根狀莖中甘露糖結(jié)合凝集素的含量相近，均為根狀莖中的主要蛋白。與SDS-PAGE電泳結(jié)果所得出的結(jié)論一致。
表1-4 野生和離體再生型根狀莖總蛋白提取物兔血凝集活性蛋白質(zhì)濃度(ug/ml)樣品 1000 500 250 125 62.5 31.25 15.6 7.8 3.9 1.95 0.98 0.49野生型++ + + ++ ++ + +--再生型++ + + ++ ++ + +- --黃精凝集素++ + + ++ ++ + +++II+凝血 -未凝血顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更，凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
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1.囊絲黃精再生體系的建立方法，其特征在于其步驟為a、囊絲黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)外植體愈傷組織的誘導(dǎo)；b、將前述愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生苗；c、將步驟b中未生根的幼苗移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；d、將步驟b和c中生根的幼苗先煉苗，然后，栽培。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的囊絲黃精再生體系的建立方法，其特征在于在步驟a中，所述的囊絲黃精外植體為其根、根狀莖或葉。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的囊絲黃精再生體系的建立方法，其特征在于在步驟a中，所述的愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)、0.5-2.0mg/L6-BA、0.5-4.0mg/L2，4-D、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8；培養(yǎng)溫度為25±2℃，避光培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為5-8周。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的囊絲黃精再生體系的建立方法，其特征在于所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基、1.0mg/L6-BA、2.0mg/L2，4-D、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的囊絲黃精再生體系的建立方法，其特征在于在步驟b中，所述的分化培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基、0.5-4.0mg/L2，4-D、0-2.0mg/L6-BA、0-0.6mg/L NAA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8；培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照時(shí)間為12-16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為1200～2000Lx，培養(yǎng)3-4周。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的囊絲黃精再生體系的建立方法，其特征在于所述的分化培養(yǎng)基組成為MS基本培養(yǎng)基、2.0mg/L2，4-D、2.0mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8；培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為1200Lx，培養(yǎng)2-3周。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的囊絲黃精再生體系的建立方法，其特征在于在步驟c中，所述的生根培養(yǎng)基組成為1/2MS基本培養(yǎng)基、0.3-0.5mg/LNAA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8；培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照時(shí)間為12-16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為1200～2000Lx，培養(yǎng)3-4周。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的囊絲黃精再生體系的建立方法，其特征在于所述的生根培養(yǎng)基組成為1/2MS基本培養(yǎng)基、0.5mg/L NAA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8；培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照時(shí)間為12小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為1200Lx，培養(yǎng)3-4周。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的囊絲黃精再生體系的建立方法，其特征在于步驟c所述的生根培養(yǎng)基組成為1/2MS基本培養(yǎng)基、0.5mg/L6-BA、8g/L瓊脂、30g/L蔗糖，pH5.8；培養(yǎng)溫度為25±2℃，光照時(shí)間為12-16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度為1200-2000Lx，培養(yǎng)3-4周。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的囊絲黃精再生體系的建立方法，其特征在于步驟d所述的煉苗和栽培包括將生根的試管苗移至自然光下培養(yǎng)3-4天，打開瓶蓋，煉苗2-3天，然后再取出幼苗，洗凈瓊脂，移入疏松的重量比為1∶1的泥炭土與蛭石中，在溫度為27±1℃、自然光下培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了囊絲黃精再生體系的建立方法，其步驟為A.囊絲黃精(Polygonatum cyrtonema Hua)外植體愈傷組織的誘導(dǎo)；B.將前述愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生苗；C.將步驟B中未生根的幼苗移至生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根；D.將步驟B和C中生根的幼苗先煉苗，然后，栽培。采用本發(fā)明方法只需3－4個(gè)月即可得到囊絲黃精再生體系，其移栽后的成活率達(dá)70－75％；其根狀莖與藥用黃精相比較，甘露糖結(jié)合凝集素的含量相近，凝血活性無明顯差異。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1557143SQ200410021659
公開日2004年12月29日 申請(qǐng)日期2004年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年1月13日
發(fā)明者鮑錦庫, 吳傳芳, 安潔, 高順, 趙曦, 常麗青, 榮艷珍, 呂鴻周, 何小佳, 洪志霞, 鄧潔, 劉超, 顧瑩, 陳放 申請(qǐng)人:四川大學(xué)