專利名稱：轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉調(diào)節(jié)劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于農(nóng)藥領(lǐng)域，涉及一種轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉調(diào)節(jié)劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉抗蟲性不穩(wěn)定，表現(xiàn)為，不同部位器官和不同生育期葉片抵御棉鈴蟲危害的效果存在顯著差異，首先，在Bt棉株不同部位葉片和不同器官中毒蛋白含量不同(束春娥，1998，棉花學(xué)報(bào)，1998，10(1)301-306；崔金杰，1999棉花學(xué)報(bào)，1999，11(3)141-146；董志強(qiáng)，棉花學(xué)報(bào)，2000，12(3)113-117)；其次，隨著棉花生育期的推進(jìn)，Bt基因在葉片中的表達(dá)強(qiáng)度逐漸減弱(陳松，棉花學(xué)報(bào)，2000，12(4)189-193)；并且在高溫、干旱等逆境脅迫下，Bt棉外源基因表達(dá)存在失活與基因“沉默”現(xiàn)象(楊金水，生物工程進(jìn)展，1995，15(3)41-45；Kaiser，Science，1996，273423)?？瓜x性不穩(wěn)定狀況極易導(dǎo)致棉鈴蟲抗性群體的產(chǎn)生。室內(nèi)汰選試驗(yàn)證明，棉鈴蟲對(duì)殺蟲毒蛋白的抗性隨著汰選次數(shù)的增加呈顯著上升趨勢(shì)(夏敬源，棉花學(xué)報(bào)，1999，11(2)57-64)；用Bt棉葉片連續(xù)喂飼棉鈴蟲，經(jīng)過12-18代的汰選后，Bt棉的抗蟲性幾乎徹底消失(郭三堆，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，32(3)1-7)。因而，如果不從根本上解決Bt棉抗蟲性不穩(wěn)定表達(dá)的問題，將給棉花生產(chǎn)造成的危害更加嚴(yán)重。目前一般采用噴施化學(xué)殺蟲劑或噴施Bt生物殺菌劑的輔助措施根據(jù)防治指標(biāo)及時(shí)防治。這樣，既違背了轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉發(fā)明的初衷，同時(shí)造成棉農(nóng)在操作上的麻煩，同時(shí)增加了種植成本，對(duì)環(huán)境保護(hù)也不利。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種配方科學(xué)、制備方便的增加轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉抗蟲性的調(diào)節(jié)劑產(chǎn)品，用以克服轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉抗蟲性不穩(wěn)定的缺陷，同時(shí)調(diào)節(jié)優(yōu)化棉株的形態(tài)指標(biāo)和產(chǎn)量構(gòu)成指標(biāo)，最終達(dá)到在增加抗蟲性的同時(shí)，提高產(chǎn)量和品質(zhì)的目的。同時(shí)，該調(diào)節(jié)劑可應(yīng)用于噴施于轉(zhuǎn)基因棉花葉面農(nóng)藥、種子包衣劑。本發(fā)明所述調(diào)節(jié)劑引入了促進(jìn)Bt基因表達(dá)的化學(xué)制劑和提高蛋白穩(wěn)定性的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，并輔之以調(diào)節(jié)棉花形態(tài)指標(biāo)和產(chǎn)量指標(biāo)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。
所述調(diào)節(jié)劑中，氨基酸4.90～5.10％氨基酸可以緩解常規(guī)蛋白和殺蟲蛋白之間的競(jìng)爭(zhēng)，在棉花不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和不同部位葉片中產(chǎn)生足夠量的Bt殺蟲蛋白；本發(fā)明所述氨基酸為市場(chǎng)上常見的氨基酸添加劑，一般含有多種氨基酸，如河南鄭州聯(lián)新化工有限公司農(nóng)用氨基酸(粉劑)產(chǎn)品，含有17種氨基酸主成分，總氨基酸含量≥50％，水分≤2.0％，灰分、鹽分、堿分、氨含量≤2.0％；表1氨基酸成分含量(％)氨基酸名稱 含量(％)蘇氨酸 3.56％天冬氨酸 3.45％絲氨酸 4.49％谷氨酸 9.12％胱氨酸 2.45％脯氨酸 3.50％甘氨酸 2.43％丙氨酸 2.20％賴氨酸 2.30％
組氨酸 0.90％纈氨酸 3.10％蛋氨酸 0.23％異亮氨酸1.70％亮氨酸 2.80％酪氨酸 1.02％苯丙氨酸1.78％精氨酸 5.20％植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑占4.90％～5.10％其中，促進(jìn)細(xì)胞染色體復(fù)制，提高細(xì)胞液濃度，調(diào)節(jié)棉花形態(tài)指標(biāo)與產(chǎn)量構(gòu)成因素的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑包括兩類第一類選擇了矮壯素(chlormequat，CCC)、甲哌鎓(mepiquat-chloride，Pix)、烯效唑(uniconazole，PP333)、丁酰肼(daminozide，B9)，優(yōu)選矮壯素和甲哌鎓，結(jié)合產(chǎn)量性狀和實(shí)用性，甲哌鎓為最優(yōu)。第二類細(xì)胞分裂素(cytokinin)、2-氯-4-吡啶基-3-苯基脲(forchlorfenuron，4PU-30)、油菜素內(nèi)酯(brassinolide，BR)和6-芐氨基嘌呤(accel，6-BA)，優(yōu)選油菜素內(nèi)酯為最優(yōu)。
其中，甲哌鎓(Pix)分子式C7H8CLN，分子量149.7，純品為白色結(jié)晶，易溶于水，難溶于丙酮、乙酸乙酯。甲哌鎓抑制赤酶素的生物合成，抑制細(xì)胞伸長(zhǎng)，矮化植株，提高同化能力，促進(jìn)成熟，增加產(chǎn)量。
油菜素內(nèi)酯(BR)分子式C28H48O6，分子量480，熔點(diǎn)274-275℃，純品為白色結(jié)晶粉末，易溶于甲醇和乙醇。促進(jìn)細(xì)胞的伸長(zhǎng)和分裂，促進(jìn)光合作用，提高抗逆性。
基因激活劑占25％～50％選用5-氨基水楊酸(5-AminosalicylicAcid)、水楊酸(Salicylic Acid)和阿司匹林(Aspirin)，優(yōu)選水楊酸。
其中，水楊酸(SA)C7H6O3，分子量138.12，熔點(diǎn)159℃，沸點(diǎn)211℃(20mmHg)，76℃升華，白色針狀晶體，微溶于水，易溶于有機(jī)溶劑及熱水。急劇加熱分解成酚和二氧化碳。水楊酸可以促進(jìn)外源Bt基因的表達(dá)。Qin(The Plant Cell，1994，6863-874)的研究報(bào)道轉(zhuǎn)Bt基因棉花使用的啟動(dòng)子中有一段受水楊酸激活的asl序列，Gatz(Current opinion in Biotech.，1996，7168-172)研究指出，水楊酸可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。
本發(fā)明所述的調(diào)節(jié)劑中還可含有常規(guī)的活性劑和展著劑，濃度一般占1.95～2.05％選用曲拉通(Triton)和吐溫(Tween)類，優(yōu)選為吐溫類，包括吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80和吐溫85。
余量為溶劑，本發(fā)明優(yōu)選為水、甲醇和乙醇，三者體積比例為1∶4～6∶11～17。
在上述配方中，水楊酸可以激活Bt外源基因啟動(dòng)子，促進(jìn)外源Bt基因的復(fù)制，在棉花不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期和不同部位葉片中外源Bt基因正常表達(dá)，產(chǎn)生足夠量的Bt殺蟲蛋白；表油菜素內(nèi)酯可以提高細(xì)胞活性，增加棉花體內(nèi)Bt殺蟲蛋白的穩(wěn)定性，保證Bt殺蟲蛋白在逆境中保持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定；增加轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉抗蟲穩(wěn)定性。甲哌鎓可以增加細(xì)胞質(zhì)的濃度，促進(jìn)細(xì)胞染色體的復(fù)制，同時(shí)，可以優(yōu)化調(diào)節(jié)棉花的形態(tài)指標(biāo)(包括株高、葉片大小、葉面積、葉傾角等)和產(chǎn)量指標(biāo)(包括成鈴部位、成鈴數(shù)、鈴重和衣分率等)。在具體實(shí)施中，三種組分具有顯著的協(xié)同作用。選擇甲哌鎓、水楊酸和表油菜素內(nèi)酯為主要組分，設(shè)置0、1、2三個(gè)濃度梯度(濃度梯度見表2，加入5％的氨基酸)，進(jìn)行排列組合，共計(jì)26個(gè)處理1個(gè)對(duì)照，以轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉GK-12(以下統(tǒng)稱Bt棉)為測(cè)試品種，室內(nèi)浸種12小時(shí)，砂培，出苗后，澆灌Hogland完全營(yíng)養(yǎng)液。三葉期收獲，測(cè)定真葉中毒蛋白的含量。如表3所示，結(jié)果表明三種組分具有顯著的協(xié)同作用，毒蛋白含量增加了98.98％。
表2甲哌鎓(PIX)、水楊酸(S)和表油菜素內(nèi)酯(B)濃度梯度表(濃度ppm)代碼 B PIX S00 0 010.02 100 50020.04 200 1000表3、甲哌鎓(P)、水楊酸(S)和表油菜素內(nèi)酯(B)協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)
所述調(diào)節(jié)劑的配置方法是用配方比例的水溶解甲哌鎓，而后用乙醇分別溶解表油菜素內(nèi)酯和水楊酸，用乙醇溶解氨基酸，之后按配方比例混合，用甲醇定容。
該調(diào)節(jié)劑可以在轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉初蕾期、盛花期和盛鈴期均可施用，施用時(shí)兌水稀釋成300～700倍液，然后噴施于葉面。
同時(shí)本發(fā)明還提供一種種子包衣劑，由上述配制出的調(diào)節(jié)劑按照常規(guī)的包衣劑的制備方法制備得到。
包衣劑的應(yīng)用與葉面噴施相配合進(jìn)行的，包衣劑的作用限于播種后到現(xiàn)蕾以前即4月20日-5月30日40天左右的時(shí)間期限。
如果播種前不用包衣劑，也要用本發(fā)明所述的調(diào)節(jié)劑配置的浸種液做浸種處理。本發(fā)明所述的調(diào)節(jié)劑是一種具有增強(qiáng)抗蟲性和提高產(chǎn)量雙重功能的產(chǎn)品，它具有無毒、無副作用、成本低、使用方便等特點(diǎn)。又由于該產(chǎn)品的配方新穎獨(dú)特，一次使用可以起到多種功效，相比現(xiàn)有的調(diào)節(jié)棉花形態(tài)指標(biāo)和產(chǎn)量指標(biāo)的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑以及增強(qiáng)抗蟲性的增抗劑而言，具有投資少、作用范圍廣、可以全面提高轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉抗蟲性和提高產(chǎn)量的優(yōu)勢(shì)，因而本發(fā)明對(duì)我國(guó)棉花生產(chǎn)具有積極的推動(dòng)作用。據(jù)本發(fā)明申請(qǐng)人在河北省邢臺(tái)市和衡水市、河南省、山西省、山東省的多點(diǎn)示范試驗(yàn)觀察，施用該產(chǎn)品后，轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉葉片中殺蟲蛋白含量提高96％～283％，產(chǎn)量提高30％以上。
①激活Bt殺蟲基因，促進(jìn)Bt殺蟲基因在逆境中正常表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞活力，促進(jìn)殺蟲蛋白的合成，從而降低了Bt棉田的化學(xué)用藥次數(shù)和用藥量。
②促進(jìn)棉花根系發(fā)育，矮化株高，縮短節(jié)間長(zhǎng)度，改善株型，協(xié)調(diào)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)的比例，為Bt棉高產(chǎn)搭好豐產(chǎn)架子。
③促使棉花結(jié)鈴集中，結(jié)鈴多，結(jié)鈴大，下位和內(nèi)圍鈴多，使棉花吐絮流暢，品質(zhì)好產(chǎn)量高。
④提高Bt棉葉片葉綠素含量，延長(zhǎng)葉片壽命，增強(qiáng)光合強(qiáng)度，改善棉花品質(zhì)，增加霜前花比例，提高棉花品質(zhì)。
在下文中采用未限定性實(shí)施例加以列舉說明。
具體實(shí)施方式本發(fā)明所述植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑選用氨基酸(河南鄭州聯(lián)信化工有限公司，登記證號(hào)LD2021)、甲哌鎓(國(guó)家科委北京協(xié)辦農(nóng)村技術(shù)開發(fā)公司，登記證號(hào)LS91328)和表油菜素內(nèi)酯(昆明云大科技產(chǎn)業(yè)股份有限公司，農(nóng)藥登記證號(hào)LS94573)，基因激活劑選用水楊酸(江蘇省洪興化工廠，醫(yī)藥級(jí)登記證號(hào)BP93198)，吐溫20作為活性劑和展著劑。
實(shí)施例1首先，用48ml水溶解甲哌鎓50g，用10ml乙醇溶解表油菜素內(nèi)酯0.01g，150ml乙醇溶解水楊酸250g，60ml乙醇溶解氨基酸50g，之后將上述溶液混合，加入20ml吐溫20，用甲醇定容至1000ml。
實(shí)施例2首先，用48ml水溶解甲哌鎓50g，用10ml乙醇溶解表油菜素內(nèi)酯0.008g，150ml乙醇溶解水楊酸300g，60ml乙醇溶解氨基酸50g，之后將上述溶液混合，加入20ml吐溫20，用甲醇定容至1000ml。
實(shí)施例3首先，用48ml水溶解甲哌鎓50.5g，用10ml乙醇溶解表油菜素內(nèi)酯0.008g，150ml乙醇溶解水楊酸350g，60ml乙醇溶解氨基酸49g，之后將上述溶液混合，加入20ml吐溫20，用甲醇定容至1000ml。
實(shí)施例4首先，用48ml水溶解甲哌鎓49.5g，用10ml乙醇溶解表油菜素內(nèi)酯0.012g，150ml乙醇溶解水楊酸400g，60ml乙醇溶解氨基酸51g，之后將上述溶液混合，加入20ml吐溫20，用甲醇定容至1000ml。
實(shí)施例5首先，用48ml水溶解甲哌鎓50g，用10ml乙醇溶解表油菜素內(nèi)酯0.01g，150ml乙醇溶解水楊酸450g，60ml乙醇溶解氨基酸50g，之后將上述溶液混合，加入20ml吐溫20，用甲醇定容至1000ml。
實(shí)施例6首先，用48ml水溶解甲哌鎓50g，用10ml乙醇溶解表油菜素內(nèi)酯0.01g，150ml乙醇溶解水楊酸500g，60ml乙醇溶解氨基酸50g，之后將上述溶液混合，加入20ml吐溫20，用甲醇定容至1000ml。
實(shí)施例7葉面噴施調(diào)節(jié)劑葉面噴施調(diào)節(jié)劑可以在轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉初蕾期、盛花期和盛鈴期施用，施用時(shí)將實(shí)施例2的調(diào)節(jié)劑兌水稀釋成500倍液，然后噴施于葉面。
實(shí)施例8種子包衣劑實(shí)施例3所得調(diào)節(jié)劑----------------2ml聚乙烯吡咯烷酮-------------------300克胭脂紅---------------------------0.1克配置方法是用600ml水溶解聚乙烯吡咯烷酮和胭脂紅，之后加入調(diào)節(jié)劑，以水定容至1000ml。
包衣劑可以在轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉播種以前對(duì)進(jìn)行包衣處理，1000ml調(diào)節(jié)劑可以包衣100kg種子。
實(shí)驗(yàn)例1①本試驗(yàn)選擇甲哌鎓(Pix)、水楊酸(SA)和油菜素內(nèi)酯(B)為主要組分，設(shè)置0、1、2三個(gè)濃度梯度(濃度梯度見表2，加入5％的氨基酸)，進(jìn)行排列組合，共計(jì)26個(gè)處理1個(gè)對(duì)照，以轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉GK-12(以下統(tǒng)稱Bt棉)為測(cè)試品種，室內(nèi)浸種12小時(shí)，砂培，出苗后，澆灌Hogland完全營(yíng)養(yǎng)液。三葉期收獲，測(cè)定真葉中毒蛋白的含量。結(jié)果表明27個(gè)處理中有16處理具有正效應(yīng)，Bt蛋白的含量增加幅度為4.70％-190.63％，其中B1P1S0、B1P2S0、B1P1S1、B2P1S0和B2P1S2五個(gè)處理為第一梯隊(duì)，Bt蛋白含量增幅介于96.97％-190.63％。第二梯隊(duì)增幅介于41.33％-70.37％。第三梯隊(duì)增幅介于4.70％-28.60％。據(jù)此，選取B1P1S0、B1P2S0、B1P1S1、B2P1S0和B2P1S2處理進(jìn)行大田試驗(yàn)。
②以轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉GK-12為試驗(yàn)材料，布置田間試驗(yàn)，設(shè)置B1P1S0、B1P1S1、B1P2S0、B2P1S0和B2P1S2系統(tǒng)化控處理，以清水為對(duì)照。分別在播前浸種(200μg/g)和盛蕾期(07-20，150μg/g)葉面噴施。小區(qū)試驗(yàn)，隨機(jī)排列，三次重復(fù)；小區(qū)面積11m×4.8m。大小行種植(50cm、100cm)，株距22.22cm，密度52,500株/公頃。結(jié)果表明①B1P1S0、B1P2S0、B1P1S1、B2P1S0四種處理籽棉嚴(yán)量及皮棉產(chǎn)量高于對(duì)照，產(chǎn)量構(gòu)成因素即單株成鈴數(shù)、單鈴重、衣分率均高于對(duì)照，1-2果節(jié)和1-10果枝優(yōu)質(zhì)結(jié)鈴部位結(jié)鈴率高于對(duì)照。B2P1S2處理出苗困難，但產(chǎn)量構(gòu)成因素均高于對(duì)照。②B1P1S0、B1P2S0、B1P1S1、B2P1S2、B2P1S0五個(gè)處理在苗蕾期、盛花期和盛鈴期對(duì)幼葉、功能葉和衰老葉片中Bt蛋白的含量大部分時(shí)段為增效作用，其中B1P1S1、B1P2S0和B2P1S2處理表現(xiàn)最為突出，在3個(gè)生育期、3類葉片中基本均為增效作用。
③生物學(xué)測(cè)定結(jié)果分別于6月20日(苗蕾期)、7月20日(盛花期)和8月20日(盛鈴期)取不同處理幼葉、功能葉、衰老葉片以及苞葉、蕾、花(花瓣、花萼、雄蕊和雌蕊)幼鈴，室內(nèi)喂養(yǎng)一齡幼蟲，觀察幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育和死亡狀況，結(jié)果表明①B1P1S0、B1P2S0、B1P1S1、B2P1S2、B2P1S0五種處理下轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉在苗蕾期殺蟲效果顯著增加，棉鈴蟲的死亡率為100％。②盛花期和盛鈴期，B1P1S0、B1P2S0、B1P1S1、B2P1S2、B2P1S0五種處理下轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉葉片抗蟲性及產(chǎn)量器官的抗蟲效果以B1P1S1和B2P1S2處理表現(xiàn)最為突出。然而B2P1S2處理浸種處理導(dǎo)致棉花出苗困難，葉面噴施燒苗，因此最終確定B1P1S1為增加轉(zhuǎn)基因抗蟲棉抗蟲性的化學(xué)調(diào)節(jié)劑配方。
表4、產(chǎn)量及產(chǎn)量構(gòu)成表處理平均單株成鈴數(shù)平均鈴重 平均籽棉產(chǎn)量平均皮棉產(chǎn)量衣分率(個(gè)) (g) (Kg.hm2) (Kg.hm2) (％)CK16.64 5.37 2405.25 915.1538.05B1P1S131.00 6.68 3114.45 1250.440.1權(quán)利要求
1.轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉調(diào)節(jié)劑，該調(diào)節(jié)劑含有如下重量百分比的組分氨基酸4.90～5.10％；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑4.90％～5.10％；基因激活劑25％～50％。
2.如權(quán)利要求1所述的調(diào)節(jié)劑，其中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑選用矮壯素、甲哌嗡、烯效唑和比久之一和/或細(xì)胞分裂素、2-氫-4-吡啶基苯脲、表油菜素內(nèi)酯和6-芐氨基嘌呤之一。
3.如權(quán)利要求2所述的調(diào)節(jié)劑，其中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑選用甲哌嗡和表油菜素內(nèi)酯，兩者重量比為5000∶0.8～1.2。
4.如權(quán)利要求1所述的調(diào)節(jié)劑，基因激活劑選用氨基水楊酸、水楊酸和阿司匹林。
5.如權(quán)利要求4所述的調(diào)節(jié)劑，基因激活劑選用水楊酸。
6.配制權(quán)利要求1～5所述調(diào)節(jié)劑的方法，該方法包括以下步驟用配方比例的水溶解甲哌嗡，用乙醇分別溶解表油菜素內(nèi)酯和水楊酸，用乙醇溶解氨基酸，之后按配方比例混合，用甲醇定容。
7.權(quán)利要求1～5所述之調(diào)節(jié)劑用于制備噴施于轉(zhuǎn)基因棉花葉面之農(nóng)藥的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1～5所述之調(diào)節(jié)劑用于制備浸泡轉(zhuǎn)基因棉花種子之浸泡液的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求1～5所述之調(diào)節(jié)劑用于制備種子包衣劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于農(nóng)藥領(lǐng)域，涉及一種轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉調(diào)節(jié)劑及其應(yīng)用。具體提供一種含有氨基酸、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、基因激活劑的調(diào)節(jié)劑，可用于制備種子包衣劑或稀釋后噴施于轉(zhuǎn)基因棉花葉面。調(diào)節(jié)劑可以克服轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉抗蟲性不穩(wěn)定的缺陷，同時(shí)調(diào)節(jié)優(yōu)化棉株的形態(tài)指標(biāo)和產(chǎn)量構(gòu)成指標(biāo)，最終達(dá)到在增加抗蟲性的同時(shí)，提高產(chǎn)量和品質(zhì)的目的。
文檔編號(hào)A01N43/00GK1568692SQ20041003750
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2004年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月23日
發(fā)明者董志強(qiáng), 舒文華, 張保明, 金石橋, 寧明宇 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物育種栽培研究所