專利名稱：一種牙鲆受精卵第一次卵裂抑制的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海水魚類染色體操作技術(shù)，具體地說是一種我國重要海水養(yǎng)殖對(duì)象-牙鲆四倍體的誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
受精卵第一次卵裂的抑制是產(chǎn)生四倍體或與精子滅活技術(shù)結(jié)合產(chǎn)生同質(zhì)雌核發(fā)育二倍體的關(guān)鍵技術(shù)。雖然日本學(xué)者曾采用靜水壓法進(jìn)行牙鲆受精卵第一次卵裂的抑制與精子滅活技術(shù)結(jié)合產(chǎn)生了牙鲆同質(zhì)雌核發(fā)育二倍體，但靜水壓法需要用特殊的儀器(水靜壓儀)，成本較高，而我們采用的是低溫休克法，方法簡單易行，適于應(yīng)用；另外，采用上述方法，其成活率雖然高一些，但誘導(dǎo)率卻并不高，為2.7-5.3％。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種牙鲆受精卵第一次卵裂抑制的方法，根據(jù)我國的國情和應(yīng)用的可行性，我們一開始除了采用自行設(shè)計(jì)改造的水靜壓機(jī)進(jìn)行誘導(dǎo)外，也一直進(jìn)行了低成本的低溫法進(jìn)行牙鲆受精卵第一次卵裂的抑制研究，并獲得了一定的誘導(dǎo)率。
本發(fā)明的技術(shù)方案是首先觀察一定培育水溫下第一次卵裂的發(fā)生時(shí)間，由此確定處理的最佳效應(yīng)期范圍，這也是第一次卵裂有效抑制的關(guān)鍵點(diǎn)。然后通過多次的梯度實(shí)驗(yàn)和重復(fù)實(shí)驗(yàn)，最終確定了處理時(shí)刻區(qū)間。依此為基礎(chǔ)，又進(jìn)行了處理溫度和處理時(shí)間的篩選實(shí)驗(yàn)，獲得了各自的范圍，采用篩選出各處理因子的適宜條件進(jìn)行重復(fù)誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，最終獲得了第一次卵裂抑制的胚胎-四倍體胚胎。誘導(dǎo)的具體方法如下選取發(fā)育正常的牙鲆雌魚和雄魚，分別擠取成熟卵、精液，行人工授精，卵啟動(dòng)75-100min，置于0-5℃，30-55min，抑制激活卵子的第一次卵裂，使染色體組加倍，產(chǎn)生四倍體，將牙鲆四倍體誘導(dǎo)組置于正常海水中培育，發(fā)育至原腸期時(shí)，取其100粒左右進(jìn)行染色體制片，以檢測其誘導(dǎo)效果。
所述牙鲆受精卵第一次卵裂抑制的方法，較佳為卵啟動(dòng)80-90min，置于0-3℃下，時(shí)間40-50min。
本發(fā)明原理是采用略高于致死溫度(低溫)的溫度來終止已經(jīng)進(jìn)行染色體復(fù)制但還未開始的第一次卵裂(此時(shí)受精卵處于有絲分裂中后期)。
與其他研究報(bào)道相比，本發(fā)明的特點(diǎn)有1、本發(fā)明通過我們的反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明，采用低溫方法的確可以抑制牙鲆受精卵的第一次卵裂，從而獲得一定比例的牙鲆四倍體。
2、采用該發(fā)明方法可以誘導(dǎo)產(chǎn)生一定比例的牙鲆四倍體，其誘導(dǎo)率為6.2-11.2％，雖然比例并不太高，但是采用染色體計(jì)數(shù)的直接方法來檢測的，其卵子相對(duì)啟動(dòng)率為50～70％。該發(fā)明方法簡單，容易掌握，適用于將來的推廣應(yīng)用。而現(xiàn)有技術(shù)得到的誘導(dǎo)率是2.7-5.3％，則是用同工酶法這種間接方法檢測得到的。
3、本發(fā)明工藝簡單、成熟、成本低，可以誘導(dǎo)出牙鲆四倍體，而且只要用海水冰甚至普通淡水冰就可以實(shí)施本實(shí)驗(yàn)，不需要其它過多投資。
4、本發(fā)明不僅可以用于牙鲆四倍體的誘導(dǎo)，結(jié)合紫外照射滅活精子遺傳物質(zhì)技術(shù)，也適用于牙鲆同質(zhì)雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)；其技術(shù)方案和其中的一些處理參數(shù)也適用于其它海水魚類的四倍體和同質(zhì)雌核發(fā)育二倍體誘導(dǎo)。因此，其適用范圍較廣。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)例詳述本發(fā)明。
實(shí)施例1選取成熟的牙鲆雌魚和雄魚，分別擠取成熟卵、精液，鏡檢其質(zhì)量無誤后，行半干濕法人工授精，2min后洗卵置于正常海水(15℃)中恒溫培育。卵啟動(dòng)85min時(shí)，放于2℃海水中處理45min，使染色體組加倍，牙鲆四倍體誘導(dǎo)組放于正常海水(15℃)中培育，發(fā)育到原腸期時(shí)，取其100粒左右采用普通空氣干燥法進(jìn)行染色體制片，經(jīng)鏡檢計(jì)數(shù)獲得其誘導(dǎo)率為11.2％，卵子相對(duì)啟動(dòng)率為55％。
實(shí)施例2選取成熟的牙鲆雌魚和雄魚，分別擠取成熟卵、精液，鏡檢其質(zhì)量無誤后，行半干濕法人工授精，2min后洗卵置于正常海水(15℃)中恒溫培育。卵啟動(dòng)80min時(shí)，放于0℃海水中處理40min，使染色體組加倍，牙鲆四倍體誘導(dǎo)組放于正常海水(15℃)中培育，發(fā)育到原腸期時(shí)，取其100粒左右采用普通空氣干燥法進(jìn)行染色體制片，經(jīng)鏡檢計(jì)數(shù)獲得其誘導(dǎo)率為7.2％，卵子相對(duì)啟動(dòng)率為50％。
實(shí)施例3選取成熟的牙鲆雌魚和雄魚，分別擠取成熟卵、精液，鏡檢其質(zhì)量無誤后，行半干濕法人工授精，2min后洗卵置于正常海水(15℃)中恒溫培育。卵啟動(dòng)90min時(shí)，放于2～3℃海水中處理50min，使染色體組加倍，牙鲆四倍體誘導(dǎo)組放于正常海水(15℃)中培育，發(fā)育到原腸期時(shí)，取其100粒左右采用普通空氣干燥法進(jìn)行染色體制片，經(jīng)鏡檢計(jì)數(shù)獲得其誘導(dǎo)率為6.2％，卵子相對(duì)啟動(dòng)率為70％。
權(quán)利要求
1.一種牙鲆受精卵第一次卵裂抑制的方法，其特征在于誘導(dǎo)方法如下選取發(fā)育正常的牙鲆雌魚和雄魚，分別擠取成熟卵、精液，行人工授精，卵啟動(dòng)75-100min，置于0-5℃，30-55min，抑制激的卵子的第一次卵裂，使染色體組加倍，產(chǎn)生四倍體，將牙鲆四倍體誘導(dǎo)組置于正常海水中培育，發(fā)育至原腸期時(shí)，取樣進(jìn)行染色體制片，以獲得誘導(dǎo)效果。
2.按照權(quán)利要求1所述牙鲆受精卵第一次卵裂抑制的方法，其特征在于所述卵啟動(dòng)80-90min，置于0-3℃下，時(shí)間40-50min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牙鲆受精卵第一次卵裂抑制的方法，首先觀察一定培育水溫下第一次卵裂的發(fā)生時(shí)間，由此確定處理的最佳效應(yīng)期范圍，然后進(jìn)行了處理溫度和處理時(shí)間的篩選實(shí)驗(yàn)，獲得了各自的范圍。選取發(fā)育正常的牙鲆雌魚和雄魚，分別擠取成熟卵、精液，行人工授精，使用篩選獲得的低溫處理參數(shù)進(jìn)行誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)抑制牙鲆受精卵第一次卵裂，使染色體組加倍，產(chǎn)生四倍體胚胎。經(jīng)染色體直接計(jì)數(shù)法測定誘導(dǎo)率為6.2－11.2％，其卵子相對(duì)啟動(dòng)率為50～70％。該發(fā)明方法簡單，容易掌握，適用于養(yǎng)殖生產(chǎn)應(yīng)用。
文檔編號(hào)A01K67/02GK1739346SQ20041005031
公開日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2004年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月25日
發(fā)明者尤鋒, 張培軍, 王新成, 許建和 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院海洋研究所