專利名稱：含羞草的繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)方法，具體地講，是指一種采用組織培養(yǎng)技術(shù)對含羞草離體培養(yǎng)進(jìn)行快速繁殖的方法。
背景技術(shù)：
植物組織培養(yǎng)是指用植物的任何器官、組織或細(xì)胞，在人工控制條件下進(jìn)行無菌培養(yǎng)生長發(fā)育的過程。該技術(shù)取材少，培養(yǎng)植物材料成本低，生長周期短，管理方便。利用植物組織培養(yǎng)這種快速繁殖技術(shù)，能在短時間內(nèi)繁衍出大量保持母本生物特性和遺傳性狀的植株。據(jù)了解，我國快速繁殖的植物已有近千種。通常使用的基本培養(yǎng)基有數(shù)種，如MS、B5、White、N6等。在組織培養(yǎng)中，植物外植體要在植物生長物質(zhì)的作用下，經(jīng)過誘導(dǎo)脫分化、恢復(fù)細(xì)胞分裂的能力、影響再分化、促進(jìn)器官形成等過程。植物外植體繁殖系數(shù)的大小，直接影響著生產(chǎn)后代植株的數(shù)量和質(zhì)量。
含羞草(Mimosa pudica L.)，別名知羞草、感應(yīng)草，是豆科含羞草屬多年生草本或半灌木，常做1年生栽培。原產(chǎn)美洲熱帶地區(qū)，早年引入我國，云南省西雙版納、德宏等熱區(qū)均有逸生。各地作盆栽植物栽培，植物教學(xué)上常做實驗材料。含羞草全株有小毒，供藥用，有安神鎮(zhèn)靜、止血收斂之功效，鮮葉搗爛外敷可治帶狀皰癥。含羞草中含有一種植物氨基酸—含羞草堿(mimosine)，最近已被定性為一種可逆性細(xì)胞周期抑制物，可與脫氧胸苷三磷酸在DNA復(fù)制點(diǎn)直接競爭。
有關(guān)含羞草無性繁殖幼苗的組織培養(yǎng)方法在國內(nèi)尚未有人報道，國際上僅有一例報道(Gharyal P K & Maheshwari S C，Plantlet formation intissue cultures of the sensitive plant Mimosa pudica L.International Journal ofPlant Physiology，1982，105(2)179-182)。其方法主要包括如下步驟(1)外植體消毒以種子為外植體，繁殖前先先進(jìn)行消毒；(2)萌發(fā)無菌苗在B5培養(yǎng)基上萌發(fā)無菌苗；(3)誘導(dǎo)愈傷組織將無菌苗根、子葉、下胚軸、葉片、莖尖，分別放在附加有吲哚乙酸(簡稱IAA)、萘乙酸(簡稱NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(簡稱2，4-D)，6-芐基氨基嘌呤(簡稱6-BA)的B5固體培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織；(4)誘導(dǎo)不定芽發(fā)生愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基B5+0.5mg/L 2，4-D+1mg/L 6-BA中誘導(dǎo)不定芽發(fā)生，其培養(yǎng)條件為溫度25±2℃；光照強(qiáng)度750Lux；(5)培養(yǎng)生根將高度為3-7厘米的不定芽分切成單株，在附加2mg/L IAA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同步驟(4)。但經(jīng)試驗，該繁殖方法主要存在使用激素種類繁多，操作不方便，分化率低、生根率低等不足。
(三)發(fā)明的內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對含羞草已有組織培養(yǎng)方法的不足，提供一種快速繁殖的新方法，它能夠明顯提高含羞草的無性繁殖系數(shù)，而且操作簡便。
已知在調(diào)節(jié)控制植物材料離體培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基的種類對植物的分化有著一定的影響，植物生長物質(zhì)也起著重要的作用，其中影響最顯著的是生長素類和細(xì)胞分裂素類物質(zhì)。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明在上述現(xiàn)有方法包括五步驟的基礎(chǔ)上進(jìn)行如下改進(jìn)在步驟(3)中，減少激素種類，提高培養(yǎng)基中生長素和細(xì)胞分裂素的濃度，以提高誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生速率；減少步驟(4)中培養(yǎng)基所用激素的種類，僅用細(xì)胞分裂素類，以提高誘導(dǎo)不定芽發(fā)生的能力；對步驟(5)的培養(yǎng)基進(jìn)行改進(jìn)。具體的講，本發(fā)明的具體操作如下(1)外植體消毒將含羞草種子置于65-75％乙醇中浸泡20-60s(表示“秒”，下同)，0.1％升汞中滅菌4-15min(表示“分鐘”，下同，)，再用無菌水沖洗3-6次；(2)萌發(fā)無菌苗消毒后的種子接種到1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)15-30天，萌發(fā)出無菌苗，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500Lux，光照時間12h·d-1(表示“小時/天”，下同)；(3)誘導(dǎo)愈傷組織將無菌苗置于配方為MS+2mg/L 2，4-D+0.2mg/L6-BA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，培養(yǎng)時間為10-30天，培養(yǎng)條件同步驟(2)；(4)誘導(dǎo)不定芽發(fā)生將愈傷組織置于配方為MS或B5+1.0-2.0mg/L6-BA+0-0.5mg/L TDZ的培養(yǎng)基上培養(yǎng)30-60天獲得不定芽(高度一般為3-7厘米)，培養(yǎng)條件同步驟(2)；
(5)培養(yǎng)生根將步驟(4)所得到的不定芽分切成單株，在B5+2mg/LIAA的培養(yǎng)基、或者1/2MS+0.5-2mg/L IBA(吲哚丁酸)或NAA(萘乙酸)培養(yǎng)基上培養(yǎng)10-30天，培養(yǎng)條件同步驟(2)。
上述方法中，在步驟(4)芽分化過程中，激素6-BA的濃度最好是2.0mg/L。步驟(5)中培養(yǎng)基最好是采用1/2MS+0.5-2mg/L IBA或NAA配方，它可以避免B5+2mg/L IAA配方中激素分解和操作不便的缺點(diǎn)，即吲哚乙酸在有光的條件下容易分解，并且在操作中要采用過濾滅菌的方法，而采用萘乙酸或者吲哚丁酸后使操作更方便，生根率提高；其中NAA的濃度最好是1.0mg/L。
在本方法中，MS和B5培養(yǎng)基是最常用的培養(yǎng)基，一般從有關(guān)植物組織培養(yǎng)的書都可找到其配方。
本發(fā)明具有如下的優(yōu)點(diǎn)和效果1.經(jīng)實驗證明，與原有的方法比較，本發(fā)明方法步驟(3)愈傷組織的誘導(dǎo)率為100％；步驟(4)中，采用提高細(xì)胞分裂素濃度的方法，不定芽的誘導(dǎo)頻率及每塊外植體產(chǎn)生的芽數(shù)均高于原方法；在步驟(5)中，采用萘乙酸、吲哚丁酸替換原來的吲哚乙酸，不定根發(fā)生時間縮短，生根率增加，而且長勢良好，保證了試管苗不定根質(zhì)量。
2.本發(fā)明方法與已有的常規(guī)方法相比，無需增加專有設(shè)備，操作簡便。
(四)具體的實施方式實施例1(1)外植體的消毒取羞草種子置于65％乙醇中浸泡20s，0.1％升汞中滅菌15min，再用無菌水沖洗3次；(2)無菌苗的萌發(fā)將已消毒的種子接種到1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)15天，獲取無菌苗，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500Lux，光照時間12h·d-1(表示“小時/天”，下同)；(3)愈傷組織的誘導(dǎo)取無菌苗下胚軸切段，轉(zhuǎn)接到附加有2mg/L2，4-D和0.2mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)30天，誘導(dǎo)愈傷組織，愈傷組織誘導(dǎo)率100％；(4)芽的分化一個月后接種到附加有1mg/L 6-BA和0.5mg/L TDZ的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)兩個月時，分化頻率為40％，平均每塊愈傷組織上小苗數(shù)為5-10個；(5)根的形成形成的的小苗，轉(zhuǎn)接入附加2.0mg/L IAA的B5培養(yǎng)基上，30天時，生根率為50％。
而采用原有方法培養(yǎng)的對照組，在添加多種激素的條件下，外植體愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到100％，但此時有80％的愈傷組織產(chǎn)生根，不利于進(jìn)一步的培養(yǎng)。其不定芽的發(fā)生率在其他外植體上最高為31％，在以下胚軸為外植體時僅為8％分化出芽，生長慢，明顯差于本發(fā)明方法。本方案采用較少種類的激素就可使愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到100％，此時沒有根的形成，不定芽發(fā)生頻率也高于對照9％。
實施例2其它操作及對照組同實施例1，所不同的是步驟(1)中，取羞草種子置于75％乙醇中浸泡60s，0.1％升汞中滅菌4min，再用無菌水沖洗6次；步驟(2)中，培養(yǎng)時間為30天；步驟(3)中，培養(yǎng)時間為10天；步驟(4)中，培養(yǎng)基配方為MS+2mg/L 6-BA，培養(yǎng)時間為30天，不定芽分化率達(dá)到60％；步驟(5)中，培養(yǎng)基改為1/2MS+1.0mg/L NAA，20天時，生根率為64.2％，隨著培養(yǎng)時間的延長，生根率會更高。
而對照組的不定芽誘導(dǎo)率僅為8％，不定根發(fā)生率最高為50％，明顯差于本發(fā)明方法。
實施例3其它操作及對照組同實施例1，所不同的是步驟(1)中，取羞草種子置于70％乙醇中浸泡30s，0.1％升汞中滅菌8min，再用無菌水沖洗5次；步驟(4)中，含羞草愈傷組織轉(zhuǎn)接到附加有2mg/L 6-BA的B5培養(yǎng)基上，不定芽分化率達(dá)到70％；步驟(5)中，培養(yǎng)基為1/2MS+1mg/L NAA，培養(yǎng)時間為10天，生根率為64.2％。
而對照組步驟(4)采用附加激素2，4-D 0.5mg/L和2mg/L 6-BA的B5培養(yǎng)基，不定芽誘導(dǎo)率僅為8％，步驟(5)中采用B5+2mg/L IAA的培養(yǎng)基，不定根發(fā)生率僅為50％，生長慢，明顯差于本發(fā)明方法。
實施例4其它操作及對照組同實施例3，所不同的是步驟(4)中，培養(yǎng)基配方為B5+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L TDZ；步驟(5)中，培養(yǎng)基配方為1/2MS+0.5mg/LNAA，生根率為50％，與對照組基本持平。
實施例5其它操作及對照組同實施例3，步驟(5)中，培養(yǎng)基配方為1/2MS+2mg/L NAA，生根率為60％。而對照組不定根發(fā)生率僅為50％，生長慢，明顯差于本發(fā)明方法。
實施例6其它操作及對照組同實施例3，所不同的是步驟(5)中，培養(yǎng)基為附加有2mg/L IBA的1/2MS，生根率為50％，生長較慢。對照組不定根發(fā)生率也為50％，但是IAA見光容易分解，并且需要過濾滅菌，操作復(fù)雜。
實施例7其它操作及對照組同實施例3，所不同的是步驟(5)中，培養(yǎng)基為附加有0.5mg/L IBA的1/2MS上，生根率為60％。而對照組不定根發(fā)生率僅為50％，明顯差于本發(fā)明方法。
權(quán)利要求
1.一種含羞草的繁殖方法，其特征在于包括如下步驟(1)外植體消毒將含羞草種子置于65-75％乙醇中浸泡20-60s，0.1％升汞中滅菌4-15min，再用無菌水沖洗3-6次；(2)萌發(fā)無菌苗消毒后的種子接種到1/2MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)15-30天，萌發(fā)出無菌苗，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照強(qiáng)度1500Lux，光照時間12h·d-1；(3)誘導(dǎo)愈傷組織將無菌苗置于配方為MS+2mg/L 2，4-D+0.2mg/L6-BA的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，培養(yǎng)時間為10-30天，培養(yǎng)條件同步驟(2)；(4)誘導(dǎo)不定芽發(fā)生將愈傷組織置于配方為MS或B5+1.0-2.0mg/L6-BA+0-0.5mg/L TDZ的培養(yǎng)基上培養(yǎng)30-60天獲得不定芽，培養(yǎng)條件同步驟(2)；(5)培養(yǎng)生根將步驟(4)所得到的不定芽分切成單株，在B5+2mg/LIAA的培養(yǎng)基、或者1/2MS+0.5-2mg/L IBA或NAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10-30天，培養(yǎng)條件同步驟(2)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟(4)芽分化過程中，激素6-BA的濃度為2.0mg/L。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(5)中培養(yǎng)基的配方為1/2MS+0.5-2mg/LIBA或NAA。
4.如權(quán)利要5所述的方法，其特征在于步驟(5)中，NAA的濃度為1.0mg/L。
全文摘要
含羞草的繁殖方法，它在現(xiàn)有技術(shù)五步驟——(1)外植體消毒、(2)萌發(fā)無菌苗、(3)誘導(dǎo)愈傷組織、(4)誘導(dǎo)不定芽發(fā)生和(5)培養(yǎng)生根的基礎(chǔ)上對步驟(3)～(5)進(jìn)行改進(jìn)步驟(3)采用MS+2mg/L2，4－D+0.2mg/L 6－BA培養(yǎng)基；步驟(4)采用MS或B5+1.0－2.0mg/L 6－BA+0－0.5mg/L TDZ培養(yǎng)基；步驟(5)采用B5+2 mg/L IAA的培養(yǎng)基、或者1/2MS+0.5－2mg/L IBA或NAA培養(yǎng)基。本方法能明顯提高含羞草的無性繁殖系數(shù)，且操作簡便。
文檔編號A01H4/00GK1600080SQ200410051960
公開日2005年3月30日 申請日期2004年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月27日
發(fā)明者陳剛, 李玲 申請人:華南師范大學(xué)