專利名稱：用于冷凍保藏的針葉樹胚胎再生的方法和成分的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于冷凍保藏的針葉樹胚胎再生的方法和成分。
背景技術(shù)：
為了生產(chǎn)木制產(chǎn)品，對于用針葉樹如松木和冷杉的需求正不斷增加。對于該問題的一個(gè)建設(shè)性解決方案是鑒別擁有所需特性如快速生長率的個(gè)體樹木，并生成大量遺傳上完全相同的通過體細(xì)胞克隆的優(yōu)勢樹木的無性繁殖系。
體細(xì)胞克隆是從樹木組織而非雌雄配子中產(chǎn)生遺傳上完全相同的樹木的方法。植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物被廣泛用于體細(xì)胞胚胎的再生。冷凍保藏使得這些培養(yǎng)物可能無限期地被保藏，最低限度地維持并將風(fēng)險(xiǎn)降低到最小程度。但是，需要一種冷凍的針葉樹胚胎發(fā)生培養(yǎng)物再生的有效方法，該方法應(yīng)該是自動(dòng)的或半自動(dòng)的方法。本發(fā)明就是用來滿足這種需要的。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種用于針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞再生的方法。該方法包括步驟(a)用液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基接觸冷凍保藏的針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞，和(b)在再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)接觸過的針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞使之再生?？梢杂靡后w轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基接觸冷凍保藏的針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞長達(dá)大約96小時(shí)。一般地，用液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基接觸冷凍保藏的針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞低于大約24小時(shí)，比如大約1小時(shí)。胚胎發(fā)生細(xì)胞一般在再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約1周到大約10周的時(shí)間。
再生培養(yǎng)基可以是固體，半固體或液體培養(yǎng)基。在一些具體實(shí)施方式
中，轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基包含的主要糖源選自麥芽糖，葡萄糖或兩者結(jié)組合。轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基或再生培養(yǎng)基可選擇加入脫落酸。
優(yōu)選實(shí)施方式的詳細(xì)描述這里所使用的全部術(shù)語，除非特殊定義，具有本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的同樣的含義。
除非另外規(guī)定，所有濃度值都是以重量體積百分比來表示的。
本發(fā)明提供了針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞再生的方法。該方法包括步驟(a)用液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基接觸冷凍保藏的針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞低于大約24小時(shí)，和(b)在再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)接觸過的針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞使之再生。在一些具體實(shí)施方式
中，用液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基接觸針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞大約1小時(shí)。本發(fā)明中的方法可適用于松柏目中的任何一種，例如花旗杉，Norway云杉，冷杉屬(例如Noble冷杉)和松屬(genuspinus)，例如Loblolly松木(taeda松果松)。
這里使用的術(shù)語“胚胎發(fā)生細(xì)胞”是指任何細(xì)胞，包括來自松柏目的植物的具有機(jī)體結(jié)構(gòu)以形成組織或器官的細(xì)胞，該細(xì)胞能夠生產(chǎn)一個(gè)或多個(gè)針葉樹的體細(xì)胞胚胎。因此，術(shù)語“胚胎發(fā)生細(xì)胞”包括了例如針葉樹胚胎囊柄團(tuán)(ESMs)。實(shí)施例1中描述了制備針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞的一個(gè)示范性的方法。
這里使用的術(shù)語“冷凍保藏”是指在極低的溫度下保藏細(xì)胞，比如針葉樹的胚胎發(fā)生細(xì)胞，通常是在液氮中(-196℃)。由于采用了冷凍保藏措施，細(xì)胞在保藏過程中自始至終保持其活力。實(shí)施例1中描述了示范性的冷凍防護(hù)和冷凍保藏的方法。
本發(fā)明方法的第一步是冷凍保藏的針葉樹的胚胎發(fā)生細(xì)胞與液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基相接觸。通常，針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞的冷凍保藏物很快就融化了，并被轉(zhuǎn)移到固體支持物上排干液體。舉個(gè)例子，如實(shí)施例1中所描述的，培養(yǎng)物可以被轉(zhuǎn)移到置于干襯墊或吸墨紙上的濾紙上面。融化了的并被吸干的胚胎發(fā)生細(xì)胞隨后與液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基接觸。例如，如實(shí)施例1中所描述的，融化并被吸干的胚胎發(fā)生細(xì)胞可以轉(zhuǎn)移到置于小碟子中被液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基浸透的襯墊上。
液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基一般含有無機(jī)鹽和有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)。例如，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中可以含有麥芽糖，蔗糖，葡萄糖，或者三者組合，作為主要糖源。糖的有效濃度是在大約1％到大約5％的范圍內(nèi)，比如大約3％。液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基的同滲重量摩爾濃度一般是大約100mM/kg到大約250mM/kg之間，比如是大約150mM/kg。液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基一般含有生長激素。液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基中可含有的激素的例子是茁長素(例如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D))和細(xì)胞激動(dòng)素(如6-芐基氨基嘌呤(BAP))。舉例來說，茁長素可采用從1mg/L到200mg/L的濃度。細(xì)胞激動(dòng)素可采用從0.1mg/L到10mg/L的濃度。
轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基可選擇加入激素脫落酸。脫落酸是一種倍半萜烯類(sesquiterpenoid)的植物激素，它涉及多種植物的生理過程(見例如，Milborrow(2001)J.Exp.Botany 521145-1164；Leung & Giraudat(1998)Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.49199-123)。本發(fā)明方法的一些具體實(shí)施方式
中，液體發(fā)育培養(yǎng)基中的脫落酸的濃度是從1mg/l到200mg/l之間，比如5mg/l到50mg/l。適宜的轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基的例子是實(shí)施例1所示的BM1-4中的成分。
一般而言，胚胎發(fā)生細(xì)胞與轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基接觸的時(shí)間少于24小時(shí)，比如大約3小時(shí)，或大約1小時(shí)。但與液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基接觸的時(shí)間也可以更長一些，比如長達(dá)大約96小時(shí)。
本發(fā)明方法的第二步中，冷凍保藏的胚胎發(fā)生細(xì)胞是培養(yǎng)在再生培養(yǎng)基之中或之上，以使針葉樹的胚胎發(fā)生細(xì)胞再生。
再生培養(yǎng)基可以是固體的，半固體的或液體培養(yǎng)基。再生培養(yǎng)基一般含有無機(jī)鹽和有機(jī)營養(yǎng)物質(zhì)。例如，在再生培養(yǎng)基中可以含有麥芽糖，蔗糖，葡萄糖，或者三者組合，作為主要糖源。源的有效濃度是在大約1％到大約5％的范圍內(nèi)，比如大約3％。在一些具體實(shí)施方式
中，再生培養(yǎng)基含有的麥芽糖的濃度是在大約1％到大約5％的范圍內(nèi)，和/或蔗糖的濃度在大約1％到3％的范圍內(nèi)。
再生培養(yǎng)基的同滲重量摩爾濃度一般是在大約100mM/kg到大約250mM/kg之間，比如150mM/kg。再生培養(yǎng)基一般含有生長激素，比2，4-D，BAP或激動(dòng)素，其濃度與液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基中所用的相同。再生培養(yǎng)基中可選擇加入激素脫落酸。本發(fā)明的一些具體實(shí)施方式
中，固體再生培養(yǎng)基不含有脫落酸。
再生培養(yǎng)基的成分可以與轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基的成分完全相同。如實(shí)施例1所示，BM1-4的成分是適用的液體再生培養(yǎng)基的例子。如實(shí)施例1所示，BM5-8的成分是適用的固體再生培養(yǎng)基的例子。
冷凍保藏的胚胎發(fā)生細(xì)胞可以培養(yǎng)在再生培養(yǎng)基之中或之上大約1周到大約10周的時(shí)間，比如大約3到大約8周，溫度從10℃到30℃，比如從15℃到25℃，或者從20℃到23℃。
本發(fā)明提供簡單并可靠的用于針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞冷凍保藏后再生的方法。比如說，與用同等方法制備的相比，本發(fā)明方法得到的冷凍保藏的針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞胚胎的再生量是相同的或更高，在所述同等方法中，胚胎發(fā)生細(xì)胞首先是與和液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基完全不同的固體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基接觸。在一些具體實(shí)施方式
中，如實(shí)施例1和2所示，利用液體或固體的再生培養(yǎng)基得到了胚胎發(fā)生細(xì)胞相同的再生量。另外，在都不含脫落酸的液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基中得到了高再生率。例如，如實(shí)施例1和2所示，利用不含脫落酸的固體再生培養(yǎng)基得到了高再生率。
此外，根據(jù)本發(fā)明，使用液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基以及可任選的液體再生培養(yǎng)基，使得子葉胚胎的制備簡單化，因?yàn)橐后w培養(yǎng)基更容易制備，保存，而且可用于自動(dòng)制備過程。
下面的實(shí)施例僅僅是闡明上述的最佳模式，以此用來實(shí)施本發(fā)明，而不應(yīng)該將其認(rèn)做是限制本發(fā)明的。
實(shí)施例1本實(shí)施例顯示的是本發(fā)明用于Loblolly松木體細(xì)胞胚胎冷凍保藏培養(yǎng)物再生的具代表性的方法。
方法從受精4到5周的8種基因型的種子中取出含有合子胚胎的雌性配子體。去掉種子外衣，除了切除珠心末端，不要再將胚胎從周圍的配子體中剖出。球果保存在4℃直到被使用。先對種子進(jìn)行消毒，采用初步的沖洗，以及15％的H2O2滅菌10分鐘后用洗滌劑處理，隨后立即取出未成熟的胚胎。每一次處理后都用無菌蒸餾水對外植體進(jìn)行徹底地沖洗。
帶有完整的胚胎的無菌配子體被放置到固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上并保持在22℃-25℃、24小時(shí)暗光周期的環(huán)境中3到5周。誘導(dǎo)培養(yǎng)基具有表1所示的BM1的成分，其中除了含有1600mg/l的GELRITE，以及2，4-D，BAP和激動(dòng)素的濃度分別是3.3mg/l，0.4mg/l和0.4mg/l。時(shí)間的長短是根據(jù)被培養(yǎng)的特殊基因型而定。該時(shí)間結(jié)束時(shí)，形成的是與原始外植體結(jié)合的白色的粘性團(tuán)塊兒(胚胎囊柄團(tuán)狀物，ESM)。通常，顯微鏡檢測顯示的是與團(tuán)塊兒結(jié)合的許多早期的胚胎。
在誘導(dǎo)階段產(chǎn)生的ESMs被放置到液體維持和增殖培養(yǎng)基上。該培養(yǎng)基與誘導(dǎo)培養(yǎng)基不同的是不含gellan樹膠，而且2，4-D，BAP和激動(dòng)素的濃度分別降低到1.1mg/l，0.1mg/l和0.1mg/l。溫度和光周期也是22℃到25℃和24小時(shí)暗處理。
為了冷凍保護(hù)，7天的懸浮培養(yǎng)物沉淀15到20分鐘，隨后除去上清液。以1∶9的密度將5ml的沉淀細(xì)胞轉(zhuǎn)移到25ml第一次冷凍保護(hù)培養(yǎng)基的250ml三角瓶中。除了添加0.2M的山梨醇外，第一次冷凍保護(hù)培養(yǎng)基的成分與維持培養(yǎng)基的成分相同。置于搖床24小時(shí)后(轉(zhuǎn)速為100rpm)，5ml的沉淀細(xì)胞以1∶9的密度轉(zhuǎn)移到第二次冷凍保護(hù)培養(yǎng)基中。除了將山梨醇的濃度提高到0.4M外，第二次冷凍保護(hù)培養(yǎng)基的成分與第一次冷凍保護(hù)培養(yǎng)基的成分相同。置于搖床24小時(shí)后(轉(zhuǎn)速為100rpm)，將三角瓶置于冰上，在連續(xù)振蕩過程中添加10倍的DMSO到終濃度為5％(v/v)，歷時(shí)超過30分鐘。
為了冷凍保藏，通過除去上清液濃縮細(xì)胞體積將細(xì)胞的密度調(diào)整到30％(v/v)。1.0ml細(xì)胞懸浮物的等分試樣被分裝到1.2ml的冷凍小瓶中。將冷凍小瓶放到容器里立在碎冰中。將該容器裝入CryoMed可編程的冷凍機(jī)中，以每分鐘0.4℃到1℃的制冷速率將溫度降低到負(fù)35℃。隨后將容器放置在冷凍保藏箱的架子上，該保藏箱是儲(chǔ)存在液氮浸沒相中的。
為了復(fù)蘇冷凍保藏的培養(yǎng)物，冷凍小瓶被放入無菌水中，水浴使其溫度達(dá)到37℃，并攪拌直到所有的ESM融化。然后將冷凍小瓶轉(zhuǎn)移到室溫放置的架子上。每支小瓶用70％的異丙醇溶液擦拭。將每支冷凍小瓶中的內(nèi)容物傾倒在置于小Pall-Gelman吸墨盤上的無菌Whatman#2濾紙上。液體吸干后，將濾紙轉(zhuǎn)移到陪氏培養(yǎng)皿中浸有液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基(成分為BM1，見表1)的襯墊上。室溫下1小時(shí)后，濾紙既可被轉(zhuǎn)移到新鮮的浸有液體再生培養(yǎng)基(成分為BM1)襯墊上，也可轉(zhuǎn)移到固體的再生培養(yǎng)基上(成分為BM1，見表1)。
表1.用于冷凍保藏的胚胎發(fā)生培養(yǎng)物的培養(yǎng)基的成分
結(jié)果在再生培養(yǎng)基之中或之上培養(yǎng)8天后，所有小瓶的培養(yǎng)物正長成ESMs。18天后將樣品稱重。從帶濾紙和ESMs的平板的重量中減去不帶濾紙和ESMs的平板的重量得到ESMs的重量。在固體再生培養(yǎng)基之上或液體再生培養(yǎng)基之中再生而得到的ESMs平均重量是777.5mg。
實(shí)施例2本實(shí)施例顯示了先用四種不同的液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基再用四種不同的液體或固體再生培養(yǎng)基接觸冷凍保藏的針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞后，Loblolly松木體細(xì)胞胚胎復(fù)蘇的對照結(jié)果。
8種不同基因型的Loblolly松木胚胎發(fā)生培養(yǎng)物用實(shí)施例1中描述的方法制備和冷凍保藏。為了復(fù)蘇冷凍保藏的培養(yǎng)物，每個(gè)基因型的8支冷凍小瓶被放入無菌水中，水浴溫?zé)岬?7℃，并且攪動(dòng)直到所有的冰融化掉。然后將冷凍小瓶轉(zhuǎn)移到室溫放置的架子上。每支小瓶用70％的異丙醇溶液擦拭。
對每個(gè)基因型隨機(jī)地選擇2支小瓶，將其內(nèi)容物放到四種液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基的一種上，每種的成分是BM1-4(見表1)。每種液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基上一小瓶中的ESMs被轉(zhuǎn)移到液體再生培養(yǎng)基中，其成分與液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基完全相同，其它小瓶中的ESMs被轉(zhuǎn)移到除了不含有脫落酸但含有1600mg/l gellan樹膠以外，其余成分與液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基完全相同的固體再生培養(yǎng)基(成分為BM5-8，見表1)上，如表2所示。
將每支小瓶中的內(nèi)容物以細(xì)流方式傾倒在置于無菌的陪氏培養(yǎng)皿中干燥襯墊上的無菌Whatman#2濾紙上。吸干培養(yǎng)物后，將濾紙轉(zhuǎn)移到帶有襯墊的新的陪氏培養(yǎng)皿上，襯墊用大約18ml的4種液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基之一的培養(yǎng)基浸透。1小時(shí)后，將濾紙轉(zhuǎn)移到含有固體再生培養(yǎng)基的新鮮平板上或帶有浸透了液體再生培養(yǎng)基的襯墊的新鮮平板上。將所有的平板包在封口膜(parafilm)中并放到保存盒中室溫保持1周。
結(jié)果8天后，在再生培養(yǎng)基之中或之上的所有樣品都長出了ESMs。18天后，對樣品稱重。從帶濾紙和ESMs的平板的重量中減去不帶濾紙和ESMs的平板的重量得到ESMs的重量。得到的綜合了所有8種基因型的ESMs的平均重量顯示在表2中。
表2.用不同的培養(yǎng)基得到的ESM的平均重量培養(yǎng)基成分 ESM重量(mg)轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基 再生培養(yǎng)基BM1BM1793.4BM2BM2764.0BM3BM3706.1BM4BM4662.9BM1BM5891.6BM2BM6876.5BM3BM7634.2BM4BM8890.9綜合所有的基因型，在固體再生培養(yǎng)基BM5-8上生長而得到的ESMs的平均重量是823.2803mg，而在液體再生培養(yǎng)基BM1-4上生長而得到的ESMs的平均重量是731.6094mg。在液體再生培養(yǎng)基和固體再生培養(yǎng)基上生長的ESMs重量上的差別不具統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。
在再生培養(yǎng)基中使用麥芽糖，葡萄糖或麥芽糖與葡萄糖結(jié)合使用(也就是BM1，BM2和BM4)而得到的再生量之差也沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的意義。但是，值得注意的是，再生培養(yǎng)基中使用蔗糖(也就是BM2)而得到的再生量顯著低(p＝0.1325)。
當(dāng)本發(fā)明優(yōu)選的具體實(shí)施方式
被闡明和描述時(shí)，可以理解的是，在無需脫離本發(fā)明的法旨和范圍的條件下能對其進(jìn)行多種修改。
權(quán)利要求
1.一種用于冷凍保藏的針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞再生的方法，包含步驟(a)用液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基接觸冷凍保藏的針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞；和(b)在再生培養(yǎng)基之中或之上培養(yǎng)接觸過的針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞以使針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞再生。
2.權(quán)利要求1的方法，其中針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞與液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基接觸少于大約24小時(shí)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞與液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基接觸大約1小時(shí)。
4.權(quán)利要求1的方法，其中再生培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基。
5.權(quán)利要求1的方法，其中再生培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基。
6.權(quán)利要求1的方法，其中再生培養(yǎng)基不含有脫落酸。
7.權(quán)利要求1的方法，其中液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基和再生培養(yǎng)基含有的主要糖源選自麥芽糖，葡萄糖或兩者組合。
8.權(quán)利要求7的方法，其中再生培養(yǎng)基含有葡萄糖。
9.權(quán)利要求8的方法，其中葡萄糖的濃度是在大約10g/l到大約50g/l之間。
10.權(quán)利要求7的方法，其中再生培養(yǎng)基含有麥芽糖。
11.權(quán)利要求10的方法，其中麥芽糖的濃度是在大約10g/l到大約50g/l之間。
12.權(quán)利要求7的方法，其中再生培養(yǎng)基含有葡萄糖和麥芽糖。
13.權(quán)利要求12的方法，其中葡萄糖的濃度是在大約10g/l到大約30g/l之間，而麥芽糖的濃度是在大約10g/l到大約30g/l之間。
14.權(quán)利要求1的方法，其中針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞在再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)大約1周到大約10周。
15.權(quán)利要求1的方法，其中針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞選自松屬。
全文摘要
本發(fā)明提供針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞再生的方法。方法包括步驟(a)用液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基接觸冷凍保藏的針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞，和(b)在再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)接觸過的針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞以使之再生。通常，冷凍保藏的針葉樹胚胎發(fā)生細(xì)胞與液體轉(zhuǎn)換培養(yǎng)基接觸的時(shí)間少于大約24小時(shí)，比如大約1小時(shí)。
文檔編號A01H4/00GK1576363SQ20041005564
公開日2005年2月9日 申請日期2004年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月30日
發(fā)明者普拉莫德·K·古普塔, 博尼·拉松, 多麗絲·巴德沃思 申請人:韋爾豪澤公司