專(zhuān)利名稱(chēng)：一種蠟蚧輪枝菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的微生物菌株及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，特別是涉及一種蠟蚧輪枝菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)既可寄生于白粉虱、蚜蟲(chóng)、蚧、鞘翅目、鱗翅目等害蟲(chóng)，還可以寄生于銹病、立枯病病菌、白粉病等植物病菌，并且遺傳穩(wěn)定性較好，對(duì)人、植物、畜、禽均未發(fā)現(xiàn)有毒害，對(duì)天敵昆蟲(chóng)安全，因此在防治保護(hù)地菜蟲(chóng)中具有重要潛力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的蠟蚧輪枝菌及其培養(yǎng)方法。
本發(fā)明所提供的蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)Verle(Bj085-1)已于2004年07月12日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱(chēng)CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC № 1187。
在光學(xué)顯微鏡(400倍)可以看到在該菌株的菌絲上長(zhǎng)著分生孢子梗，分生孢子梗直立，錐形瓶梗輪生于菌絲體中間或頂部。分生孢子呈橢圓形，大小為2.3-6.4×1.5微米。在馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基上菌株的菌落為圓形、白色，菌落中央隆起呈笠狀。本發(fā)明的菌株Bj085-1與現(xiàn)有的已知菌株相比，更耐低溫，溫度范圍在10-15攝氏度，分生孢子萌發(fā)率可達(dá)43-89％(24小時(shí))。該菌株以5百萬(wàn)個(gè)孢子接種2齡溫室白粉虱，7天后，致死率為87％以上，比未經(jīng)單孢分離的原菌株致病力提高15-20％。
本發(fā)明蠟蚧輪枝菌的培養(yǎng)方法，是將菌株接種到液體培養(yǎng)基中，在23-25℃下培養(yǎng)得到蠟蚧輪枝菌產(chǎn)品；所述液體培養(yǎng)基含有1-3％重量的蔗糖，2-4％重量的淀粉，2-4％重量的啤酒酵母，0.1-0.3％重量的碳酸鈣，余量為水。
其中，優(yōu)選液體培養(yǎng)基含有2％重量的蔗糖，3％重量的淀粉，3％重量的啤酒酵母，0.2％重量的碳酸鈣，余量為水。優(yōu)選培養(yǎng)溫度為23℃。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種以本發(fā)明菌株為活性成分的殺蟲(chóng)劑。
將培養(yǎng)得到的蠟蚧輪枝菌產(chǎn)品可配制成濃度為10×109孢子/毫升的孢子懸浮液保存于0℃-15℃環(huán)境中，保存時(shí)間可達(dá)6個(gè)月左右。作為殺蟲(chóng)劑使用時(shí)，將該懸浮液稀釋后噴霧使用。
本發(fā)明液體培養(yǎng)蠟蚧輪枝菌的工藝流程如圖1所示。本發(fā)明的蠟蚧輪枝菌菌株對(duì)我國(guó)溫室白粉虱和蚜蟲(chóng)有良好的防治效果。該蠟蚧輪枝菌液體發(fā)酵工藝生產(chǎn)中所用原料便宜、來(lái)源廣、生產(chǎn)工藝較為簡(jiǎn)單，而且生產(chǎn)過(guò)程無(wú)污染性廢料、廢渣和廢氣產(chǎn)生，環(huán)保。用該產(chǎn)品防治溫室白粉虱和蚜蟲(chóng)等害蟲(chóng)，可以減少化學(xué)農(nóng)藥對(duì)蔬菜和環(huán)境的污染，而且對(duì)人畜十分安全，保證蔬菜的無(wú)公害生產(chǎn)。溫室白粉虱和蚜蟲(chóng)是我國(guó)蔬菜特別是保護(hù)地蔬菜生產(chǎn)中的主要害蟲(chóng)，發(fā)生面積廣大、危害嚴(yán)重，因此本發(fā)明的殺蟲(chóng)劑產(chǎn)品具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為液體培養(yǎng)蠟蚧輪枝菌的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、篩選蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)Verle(Bj085-1)CGMCC №1187將患有蠟蚧輪枝菌病的溫室白粉虱尸體經(jīng)過(guò)70％酒精浸泡表面消毒后，放于100％相對(duì)濕度、23℃條件下培養(yǎng)，長(zhǎng)出菌絲體后，用接種針挑出菌絲并接種在PDA培養(yǎng)基上，在23℃下繼續(xù)培養(yǎng)15天-20天，按常規(guī)方法進(jìn)行單孢分離、培養(yǎng)，得到純的、致病力強(qiáng)的菌株蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)Verle(Bj085-1)CGMCC № 1187。
對(duì)得到的菌株進(jìn)行生物測(cè)定，在實(shí)驗(yàn)室種群中挑選3-4齡無(wú)病的溫室白粉虱若蟲(chóng)作為試蟲(chóng)。把若蟲(chóng)接在番茄幼苗上，并用扎眼透氣的塑料口杯罩住，防止試蟲(chóng)外逃。按生物測(cè)定的實(shí)驗(yàn)規(guī)則，將蠟蚧輪枝菌產(chǎn)品用無(wú)菌水稀釋為5個(gè)濃度，分別為104、105、106、107、108；以無(wú)菌水為陰性對(duì)照。孢子懸浮液和對(duì)照溶液中均加入1％吐溫-20。每個(gè)劑量進(jìn)行3次重復(fù)，每次重復(fù)30頭試蟲(chóng)，按下述方法進(jìn)行接種用微量注射器吸取0.1ml的蠟蚧輪枝菌孢子懸浮液，滴于蟲(chóng)體表面，待蟲(chóng)體表面干后，放回番茄苗上，蓋好塑料口杯，放于相對(duì)濕度為90％以上的光照培養(yǎng)箱中，在23℃-25℃下每天光照培養(yǎng)12小時(shí)，暗培養(yǎng)12小時(shí)。每天記錄觀察試蟲(chóng)的死亡率。
結(jié)果表明，接種后9天校正死亡率分別為74.0％7±4.15；60.71％±4.75；55.71％±9.81；48.57％±8.21；38％±5.58。
實(shí)施例2、培養(yǎng)蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)Verle(Bj085-1)CGMCC №1187采用液體發(fā)酵大量生產(chǎn)蠟蚧輪枝菌首先將活化后的蠟蚧輪枝菌Verle(Bj085-1)用無(wú)菌水稀釋至濃度為107孢子/毫升孢子懸浮液，然后以千分之一的比例接種到滅菌的裝有5000L液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，液體培養(yǎng)基含有2％重量的蔗糖，3％重量的淀粉，3％重量的啤酒酵母，0.2％重量的碳酸鈣，其余為水。將培養(yǎng)基在0.15MPa下滅菌3個(gè)小時(shí)，然后用于接種。接種完成后調(diào)節(jié)攪拌器轉(zhuǎn)速為140轉(zhuǎn)/分鐘，保持溫度23℃培養(yǎng)3天后出罐。
將帶有蠟蚧輪枝菌菌絲和分生孢子的液體培養(yǎng)基以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心30分鐘，去掉上清液，取出沉淀，以無(wú)菌水配置成10×109孢子/毫升的孢子懸浮液，在0℃-15℃環(huán)境中可保存6個(gè)月。
實(shí)施例3、培養(yǎng)蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)Verle(Bj085-1)CGMCC №1187培養(yǎng)方式同實(shí)施例2，不同之處在于所用液體培養(yǎng)基為1％重量的蔗糖，4％重量的淀粉，2％重量的啤酒酵母，0.3％重量的碳酸鈣，其余為水，培養(yǎng)溫度為23℃，培養(yǎng)3天后得到蠟蚧輪枝菌產(chǎn)品。
實(shí)施例4、培養(yǎng)蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)Verle(Bj085-1)CGMCC №1187培養(yǎng)方式同實(shí)施例2，不同之處在于所用液體培養(yǎng)基為3％重量的蔗糖，2％重量的淀粉，4％重量的啤酒酵母，0.1％重量的碳酸鈣，其余為水，培養(yǎng)溫度為23℃，培養(yǎng)3天后得到蠟蚧輪枝菌產(chǎn)品。
實(shí)施例5、蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)Verle(Bj085-1)CGMCC № 1187防治溫室白粉虱在溫室白粉虱發(fā)生時(shí)，將實(shí)施例2所得蠟蚧輪枝菌產(chǎn)品在室溫下用水配置成5×107孢子/毫升孢子懸浮液，以清水為對(duì)照，分兩次噴霧，間隔7天，每次噴霧1000ml/畝。第二次噴霧10天后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，噴本發(fā)明殺蟲(chóng)劑的處理中害蟲(chóng)大量死亡，較對(duì)照高出70％。
實(shí)施例6、蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)Verle(Bj085-1)CGMCC № 1187防治蚜蟲(chóng)在蚜蟲(chóng)發(fā)生時(shí)，將實(shí)施例2所得蠟蚧輪枝菌產(chǎn)品在室溫下用水配置成5×107孢子/毫升孢子懸浮液，以清水為對(duì)照，分兩次噴霧，間隔7天，每次噴霧1000ml/畝。第二次噴霧10天后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，噴本發(fā)明殺蟲(chóng)劑的處理中害蟲(chóng)大量死亡，較對(duì)照高出67％。
權(quán)利要求
1.蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)Verle(Bj085-1)CGMCC №1187。
2.一種培養(yǎng)權(quán)利要求1所述蠟蚧輪枝菌的方法，將菌株接種到液體培養(yǎng)基中，在23-25℃下培養(yǎng)得到蠟蚧輪枝菌產(chǎn)品；所述液體培養(yǎng)基含有1-3％重量的蔗糖，2-4％重量的淀粉，2-4％重量的啤酒酵母，0.1-0.3％重量的碳酸鈣，余量為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述液體培養(yǎng)基含有2％重量的蔗糖，3％重量的淀粉，3％重量的啤酒酵母，0.2％重量的碳酸鈣，余量為水。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)溫度為23℃。
5.以權(quán)利要求1所述蠟蚧輪枝菌為活性成分的殺蟲(chóng)劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種蠟蚧輪枝菌及其培養(yǎng)方法與應(yīng)用，目的是提供一種防蟲(chóng)效果好的蠟蚧輪枝菌產(chǎn)品。本發(fā)明所提供的菌株為蠟蚧輪枝菌(Verticillium lecanii)Verle(Bj085－1)CGMCC №1187，該菌株的培養(yǎng)方法是將菌株接種到液體培養(yǎng)基中，在23℃－25℃下培養(yǎng)得到蠟蚧輪枝菌產(chǎn)品；所述液體培養(yǎng)基含有1－3％重量的蔗糖，2－4％重量的淀粉，2－4％重量的啤酒酵母，0.1－0.3％重量的碳酸鈣，余量為水?？梢詫⑴囵B(yǎng)所得產(chǎn)品制成以該菌株為活性成分的殺蟲(chóng)劑。本發(fā)明的蠟蚧輪枝菌菌株對(duì)我國(guó)溫室白粉虱和蚜蟲(chóng)有良好的防治效果。該菌株液體發(fā)酵工藝生產(chǎn)中所用原料便宜、來(lái)源廣、生產(chǎn)工藝較為簡(jiǎn)單，而且生產(chǎn)過(guò)程無(wú)污染性廢料、廢渣和廢氣產(chǎn)生，可廣泛用于防治溫室白粉虱和蚜蟲(chóng)等害蟲(chóng)。
文檔編號(hào)A01N63/02GK1587377SQ20041005801
公開(kāi)日2005年3月2日 申請(qǐng)日期2004年8月6日 優(yōu)先權(quán)日2004年8月6日
發(fā)明者張龍 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)