專(zhuān)利名稱(chēng)：一種hcv轉(zhuǎn)基因小鼠模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
長(zhǎng)期以來(lái)，丙型肝炎的研究一大難題即缺乏小動(dòng)物感染模型，阻礙了對(duì)HCV致病機(jī)理探討、抗病毒藥物篩選和疫苗研究等研究進(jìn)程。因此探索具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的HCV感染模型或HCV基因表達(dá)模型，是當(dāng)今丙型肝炎防治研究的重大課題。
針對(duì)HCV基因組抗病毒治療研究的主要靶位是位于基因組5’非編碼區(qū)(NCR)內(nèi)介導(dǎo)并控制著整個(gè)HCV基因組的翻譯的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)。針對(duì)病毒基因組高度保守區(qū)IRES設(shè)計(jì)的藥物應(yīng)用于體內(nèi)時(shí)，也會(huì)極大地降低病毒突變體產(chǎn)生的可能性，因而IRES是抗HCV治療的理想靶位。多年來(lái)針對(duì)HCV IRES抑制劑的研究取得可喜的進(jìn)展，反義寡核苷酸、核酶(Ribozyme)、脫氧核酶(DNAzyme)、寡核苷酸適配子(Aptamers)和干涉性小dsRNA(siRNA)等藥物在體外或細(xì)胞體系均顯示出良好的抗病毒作用。但由于缺乏理想的HCV感染小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，這些反義核酸類(lèi)藥物在體內(nèi)抗HCV的作用效果，以及對(duì)其毒性、安全性等難以作出評(píng)估，極大地延緩了這些藥物進(jìn)入臨床。在可預(yù)見(jiàn)的一段時(shí)期內(nèi)，HCV感染小動(dòng)物模型的建立還是難以取得突破性的進(jìn)展。在此情況下，以HCV轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型替代HCV感染的體內(nèi)模型仍然是丙型肝炎抗病毒藥物研究的一個(gè)重要途徑。但目前還沒(méi)有實(shí)用的，來(lái)源方便的，能穩(wěn)定評(píng)價(jià)抗HCV IRES藥物體內(nèi)作用效果的小動(dòng)物模型。最近水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)的出現(xiàn)為建立在肝臟特異表達(dá)HCV IRES的小鼠模型提供了新思路。
水動(dòng)力轉(zhuǎn)染技術(shù)(Hydrodynamic transfection)是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新的簡(jiǎn)單、方便、高效的體內(nèi)基因轉(zhuǎn)染方法，它是高壓下經(jīng)小鼠尾靜脈快速注射大體積含目的基因的生理鹽水，從而在小鼠體內(nèi)主要在小鼠肝臟中實(shí)現(xiàn)目的基因的高效表達(dá)，該方法被正式定名為水動(dòng)力轉(zhuǎn)染法。該方法的要點(diǎn)是高壓下在小鼠尾靜脈內(nèi)快速(＜5s)注射大體積含目的基因(10μg DNA)的生理鹽水(體重的8％-12％)，用此方法導(dǎo)入體內(nèi)的基因在肝臟中表達(dá)水平較其他器官中高102-105倍，而且一次注射能使40％的肝細(xì)胞得到轉(zhuǎn)染。它不需要特殊儀器，具有研究周期短、花費(fèi)小、表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)，因此，該技術(shù)尤其適合于作為經(jīng)典轉(zhuǎn)基因技術(shù)的替代，用于研究目的基因在成年小鼠體內(nèi)肝細(xì)胞的表達(dá)及其功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法。
本發(fā)明所提供的構(gòu)建HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法，包括下述步驟1)構(gòu)建包括海腎熒光素酶(Rluc)基因和螢火蟲(chóng)熒光素酶(Fluc)基因以及位于所述海腎熒光素酶(Rluc)基因和螢火蟲(chóng)熒光素酶(Fluc)基因之間的HCV IRES序列的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體；2)采用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染方法將所述雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi)，得到HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
所述雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體中以螢火蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)水平反映HCV IRES的活性，而“依賴(lài)帽子的掃描機(jī)制”翻譯表達(dá)的Rluc作為HCV IRES調(diào)控?zé)晒馑孛阁w內(nèi)表達(dá)的內(nèi)對(duì)照。
所述雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體的啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子或肝臟特異性人α抗胰蛋白酶(hAAT)啟動(dòng)子(Gene Bank Acession NumberD38257)。
在實(shí)際應(yīng)用中，如果需要在小鼠肝臟瞬時(shí)表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶，所述雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體可采用CMV啟動(dòng)子，如果需要在小鼠肝臟長(zhǎng)期表達(dá)螢火蟲(chóng)熒光素酶，所述雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體可采用肝臟特異性人α抗胰蛋白酶(hAAT)啟動(dòng)子。
所述CMV啟動(dòng)子可為來(lái)源于表達(dá)載體pCI-neo。
所述HCV IRES序列為具有序列表中序列1的DNA序列或與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有相同活性的DNA序列。
所述雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體可為質(zhì)粒pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc和/或pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc。
所述質(zhì)粒pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc可按照下述方法得到的以pCI-neo載體為出發(fā)載體，將海腎熒光素酶(Rluc)基因和螢火蟲(chóng)熒光素酶(Fluc)基因以及HCVIRES序列插入pCI-neo載體，且使HCV IRES序列位于所述海腎熒光素酶(Rluc)基因和螢火蟲(chóng)熒光素酶(Fluc)基因之間。
以hAAT啟動(dòng)子取代質(zhì)粒pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc中的CMV啟動(dòng)子即可得到pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc。
上述表達(dá)載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
由上述方法構(gòu)建的HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
本發(fā)明構(gòu)建的雙順?lè)醋颖磉_(dá)質(zhì)粒載體，以螢火蟲(chóng)熒光素酶表達(dá)水平反映HCV IRES的活性，而“依賴(lài)帽子的掃描機(jī)制”翻譯表達(dá)的Rluc作為HCV IRES調(diào)控?zé)晒馑孛阁w內(nèi)表達(dá)的內(nèi)對(duì)照，有利于克服系統(tǒng)誤差。本發(fā)明用成年小鼠采用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染方法建立小鼠模型，不需要特殊儀器，具有研究周期短、花費(fèi)小、目的基因在肝臟特異長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)，且具有表達(dá)量高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明構(gòu)建的HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型可用于以HCV IRES為靶標(biāo)的反義寡核苷酸、特異性核酶及siRNA等抗HCV藥物的篩選，評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性、作用效果及其在體內(nèi)的毒性、安全性等，為此類(lèi)藥物進(jìn)入臨床提供數(shù)據(jù)資料；也可用于研究宿主因素對(duì)HCV IRES的影響。


圖1為雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc的構(gòu)建過(guò)程示意2為siRNA/DNAzyme對(duì)小鼠體內(nèi)表達(dá)HCV IRES的抑制作用柱狀圖具體實(shí)施方式
實(shí)施例1、雙順?lè)醋颖磉_(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建(1)pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc的構(gòu)建如圖1所示，pRluc-CMV載體(Promega產(chǎn)品)經(jīng)NheI和XbaI雙酶切，獲得Rluc基因序列，連接到同樣經(jīng)NheI和XbaI雙酶切的pCI-neo表達(dá)載體(Promega產(chǎn)品)上，得到pCI-Rluc表達(dá)載體。以pHCV-neo4載體(中華微生物和免疫學(xué)雜志，1999，19(1)17-20)(含HCV IRES與螢火蟲(chóng)熒光素酶基因的融合基因)為模板，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成引物IRES-Fluc15`-acgcgtcgaccccaagcttgccagcccc-3`，IRES-Fluc25`-ataagaatgcggccgcagaattacacggcgatctttc-3`，上下游引物分別含SalI和NotI酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增得到的HCV IRES-Fluc融合基因片段，經(jīng)SalI和NotI雙酶切后與同樣經(jīng)SalI和NotI雙酶切的pCI-Rluc表達(dá)載體連接，得到pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc雙順?lè)醋颖磉_(dá)質(zhì)粒。
其中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃2min后，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94℃30s，55℃40s，72℃1min；然后72℃延伸5min。
(2)pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc的構(gòu)建以從人肝臟組織中提取的總DNA為模板，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成haat啟動(dòng)子上游引物5`-GGAAGATCTTTCCCTGGTCTGAATGTGTG-3`，haat啟動(dòng)子下游引物5`-GGCCTTAAGACAGTCCCAGGTCAGTGGTGGTGC-3`，上下游引物分別含BegII和IPpo-I酶切位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增得到的hAAT啟動(dòng)子基因片段，經(jīng)BegII和IPpo-I雙酶切后與同樣經(jīng)BegII和IPpo-I雙酶切的pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc表達(dá)載體連接，構(gòu)建得到pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc雙順?lè)醋颖磉_(dá)質(zhì)粒。
其中，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為94℃2min后，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)94℃30s，55℃40s，72℃1min；然后72℃延伸5min。
實(shí)施例2、pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc質(zhì)粒、pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc質(zhì)粒分別經(jīng)水動(dòng)力轉(zhuǎn)染小鼠構(gòu)建HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型應(yīng)用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染法向小鼠(6-8周齡，18-20g)尾靜脈短時(shí)間內(nèi)(5-8s)注射大體積(1.5-2ml)含pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc或pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc質(zhì)粒DNA(5-10μg)的生理鹽水溶液，對(duì)照組只注射相同體積的生理鹽水。在注射后不同時(shí)間點(diǎn)12h、24h、48h、72h、1周、2周、4周處死小鼠，取肝臟制備成單細(xì)胞懸液。采用雙熒光素酶測(cè)定試劑盒(Dual Luciferase Assay System，Promega)檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)熒光素酶活性，按推薦的操作步驟進(jìn)行。結(jié)果表明采用CMV為啟動(dòng)子的雙順?lè)醋颖磉_(dá)質(zhì)粒，水動(dòng)力轉(zhuǎn)染后目的基因熒光素酶在小鼠肝臟為瞬時(shí)表達(dá)，水動(dòng)力轉(zhuǎn)染后12h HCV IRES調(diào)控的熒光素酶表達(dá)水平達(dá)到高峰，48h后表達(dá)水平顯著下降；而采用肝臟特異性人α抗胰蛋白酶(hAAT)啟動(dòng)子的雙順?lè)醋颖磉_(dá)質(zhì)粒，水動(dòng)力轉(zhuǎn)染后目的基因在小鼠肝臟獲得較長(zhǎng)期表達(dá)，4周后HCV IRES調(diào)控的熒光素酶仍有較高的表達(dá)水平。
實(shí)施例3、HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型的應(yīng)用應(yīng)用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染法向小鼠(昆明鼠，6-8周齡，18-20g)尾靜脈短時(shí)間內(nèi)(5s)注射大體積(1.5ml)含pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc質(zhì)粒DNA(10μg)為對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組水動(dòng)力轉(zhuǎn)染pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc質(zhì)粒DNA(10μg)和40μg siRNA或40μg DNAzyme(DNAzyme5’-ATGGTGCAGGCTAGCTACAACGAGGTCTACG-3’，由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；siRNA序列siRNA(sense)5’-UUGUAGACCGUGCACCAUGAGC-3’，siRNA(antisense)5’-UUGCUCAUGGUGCACGGUCUAC-3’，制備方法參見(jiàn)文獻(xiàn)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊.2004，28(2)163-165)的生理鹽水溶液，siRNA和DNAzyme為靶向HCVIRES第328-347核苷酸處的小干擾性RNA和脫氧核酶。結(jié)果表明水動(dòng)力轉(zhuǎn)染24h后，與對(duì)照組相比siRNA和DNAzyme分別使HCV IRES介導(dǎo)的熒光素酶表達(dá)水平降低90％和51％(圖2)，表明本發(fā)明建立的以HCV IRES調(diào)控?zé)晒馑孛副磉_(dá)小鼠模型，可用于探討宿主因素對(duì)HCV IRES的影響，評(píng)價(jià)干擾素對(duì)HCV IRES介導(dǎo)翻譯啟動(dòng)的影響，以及用于評(píng)價(jià)抗HCV IRES的反義寡核苷酸、特異性核酶及siRNA的作用效果。
序列表<160>1<210>1<211>341<212>DNA<213>黃病毒屬丙型肝炎病毒(Flavivirus hepatitis C virus)<400>1gcccgccccc tgatgggggc gacactccgc catgagtcac tcccctgtga ggaactactg 60tcttcacgca gaaagcgtct agccatggcg ttagtatgag tgtcgtacag cctccaggcc120cccccctccc gggagagcca tagtggtctg cggaaccggt gagtacaccg gaattaccgg180aaagactggg tcctttcttg gataaaccca ctctatgtcc ggtcatttgg gcgtgccccc240gcaagactgc tagccgagta gcgttgggtt gcgaaaggcc ttgtggtact gcctgatagg300gtgcttgcga gtgccccggg aggtctcgta gaccgtgcat c34權(quán)利要求
1.一種構(gòu)建HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法，包括下述步驟1)構(gòu)建包括海腎熒光素酶基因和螢火蟲(chóng)熒光素酶基因以及位于所述海腎熒光素酶基因和螢火蟲(chóng)熒光素酶基因之間的HCV IRES序列的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體；2)采用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染方法將所述雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi)，得到HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體的啟動(dòng)子為CMV啟動(dòng)子或hAAT啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述HCV IRES序列為具有序列表中序列1的DNA序列或與序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有相同活性的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體為質(zhì)粒pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc和/或pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述質(zhì)粒pCI-CMV-Rluc-HCVIRES-Fluc是按照下述方法得到的以pCI-neo載體為出發(fā)載體，將海腎熒光素酶基因和螢火蟲(chóng)熒光素酶基因以及HCV IRES序列插入pCI-neo載體，且使HCV IRES序列位于所述海腎熒光素酶基因和螢火蟲(chóng)熒光素酶基因基因之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于以hAAT啟動(dòng)子取代所述質(zhì)粒pCI-CMV-Rluc-HCV IRES-Fluc中的CMV啟動(dòng)子，得到pCI-hAAT-Rluc-HCV IRES-Fluc。
7.用權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法構(gòu)建的HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。
8.權(quán)利要求7所述的HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型在研究宿主因素對(duì)HCV IRES的影響中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求7所述的HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型在進(jìn)行抗HCV IRES藥物篩選中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。本發(fā)明所提供的構(gòu)建HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型的方法，包括下述步驟1)構(gòu)建包括海腎熒光素酶基因和螢火蟲(chóng)熒光素酶基因以及位于所述海腎熒光素酶基因和螢火蟲(chóng)熒光素酶基因之間的HCV IRES序列的雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體；2)采用水動(dòng)力轉(zhuǎn)染方法將所述雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體轉(zhuǎn)染到小鼠體內(nèi)，得到HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型。本發(fā)明構(gòu)建的HCV轉(zhuǎn)基因小鼠模型可用于以HCV IRES為靶標(biāo)的反義寡核苷酸、特異性核酶及siRNA等抗HCV藥物的篩選，評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性、作用效果及其在體內(nèi)的毒性、安全性等，為此類(lèi)藥物進(jìn)入臨床提供數(shù)據(jù)資料；也可用于研究宿主因素對(duì)HCV IRES的影響。
文檔編號(hào)A01K67/027GK1718731SQ200410062739
公開(kāi)日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2004年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年7月8日
發(fā)明者詹林盛, 王全立, 饒林, 彭劍淳 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所