專利名稱：水溶性印楝素生物農(nóng)藥超分子配合物和制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及超分子配合物的制備，特別是水溶性印楝素生物農(nóng)藥超分子配合物和制備方法。該超分子配合物是環(huán)糊精-印楝素超分子配合物，其特點是將不溶于水的印楝素溶于水，并保持印楝素原有的拒食活性，可有效地提高其生物利用度，所使用的環(huán)糊精價格低廉，無毒易降解，因此該配合物具有廣闊的綠色農(nóng)業(yè)應(yīng)用前景。
背景技術(shù)：
印楝素(Azadirachtin)是從印楝(Azadriachta indica)中提取，主要分布在種核，其次在葉子中。印楝素的生物活性作用機制特殊，具有拒食、忌避、觸殺、胃毒、內(nèi)吸和抑制昆蟲生長發(fā)育作用，被國際公認為最重要的昆蟲拒食劑。結(jié)構(gòu)類似昆蟲的蛻皮激素，是昆蟲內(nèi)蛻皮激素的抱制劑，降低蛻皮激素的釋放量；也可以直接破壞表皮結(jié)構(gòu)或阻止表皮幾丁質(zhì)的合成，或干擾呼吸代謝，影響生殖系統(tǒng)發(fā)育等；具體作用為破壞或干擾卵、幼蟲或蛹的生長發(fā)育；阻止若蟲或幼蟲的脫皮；改變昆蟲的交尾及性行為；對若蟲、幼蟲及成蟲的拒食作用；阻止成蟲產(chǎn)卵及破壞卵巢發(fā)育；使成蟲變?yōu)椴挥?。印楝素的生物活性高效、廣譜、無污染、無殘留、不易產(chǎn)生抗藥性、對人畜等溫血動物無害及對害蟲天敵安全，可防治10目400余種農(nóng)林、倉儲和衛(wèi)生害蟲。應(yīng)用印楝素殺蟲劑可有效地防治棉鈴蟲、日本金龜甲、煙芽夜蛾、、舞毒蛾、稻褐飛虱、薊馬、玉米螟、毛蟲鉆背蟲、果蠅、谷實夜蛾、斜紋夜蛾、菜蛾、潛葉蠅、草地夜蛾、沙漠蝗、非洲飛蝗、黏蟲等害蟲，可以廣泛用于糧食、棉花、林木、蔬菜、瓜果、煙草、花卉、茶葉、咖啡等作物，不會使害蟲對其產(chǎn)生抗藥性。印楝素殺蟲劑施于土壤，可被棉花，水稻、玉米、小麥、蠶豆等作物根系吸收，輸送到莖葉，從而使整株植物具有抗蟲性。
印楝素由于以上這些特點，印楝素作為農(nóng)藥應(yīng)用的研究引起了科學家們的廣泛興趣成都綠金生物科技有限責任公司(專利申請?zhí)?2133828.0)得到了印楝素的水分散粒劑，并已申請國家專利；他們(專利申請?zhí)?2133827.2)生產(chǎn)的氟蟲腈印楝素乳油能夠拓寬藥劑的使用范圍，延長特效期，提高藥效。而云南中科生物產(chǎn)業(yè)有限公司生產(chǎn)的“愛禾”0.3％印楝素乳油成為我國第一個獲得國家“農(nóng)藥三證”的印楝素生物農(nóng)藥。但是，由于印楝素極低的水溶性，這些藥劑都含有各種各樣的難以水溶或降解的有機毒性成分，其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用前景受到制約，不利于我國綠色農(nóng)業(yè)的發(fā)展。
環(huán)糊精(Cyclodextrins，Cycloamyloses，通常簡稱為CD)，是一類由D型吡喃葡萄糖單元以1，4糖苷鍵首尾相連的截錐狀大環(huán)分子，具有疏水的空腔和親水的表面。環(huán)糊精習慣上用一個希臘字母表示其葡萄糖單元數(shù)目，其中最常見的是α-、β-和γ-環(huán)糊精，分別擁有6、7和8個葡萄糖單元。近幾十年來，環(huán)糊精已廣泛應(yīng)用于分子識別，模擬酶，藥物傳輸?shù)妊芯款I(lǐng)域。環(huán)糊精特別是全甲基化環(huán)糊精具有極高的水溶性，生物可降解性，無毒或低毒，可以同印楝素形成包結(jié)配合物，從而提高印楝素的水溶性和生物利用度，并利于降解，具有廣闊的綠色農(nóng)業(yè)應(yīng)用前景。
中國專利CN 1425293A公開了采用共沉淀法和固相反應(yīng)法反應(yīng)，制得一些印楝素環(huán)糊精的包和物，該包和物使得印楝素對光和熱的穩(wěn)定性提高，利于發(fā)揮印楝素的殺蟲效果。但是，該文獻沒有公開印楝素-全甲基化β-環(huán)糊精包和物和它的活性。此外，所使用的制備方法較復(fù)雜，不易推廣。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的水溶性印楝素生物農(nóng)藥超分子配合物和制備方法。本發(fā)明可以克服已有技術(shù)的不足，通過簡單的混合溶劑攪拌法(一步法)制備了新的環(huán)糊精印楝素配和物，精確測定了其配位比，系統(tǒng)研究了它們的熱穩(wěn)定性和拒食活性。天然β-環(huán)糊精或全甲基化β-環(huán)糊精分別和印楝素形成包結(jié)配位后，可以得到水溶性的印楝素-環(huán)糊精配合物，溶解度分別為2.7mg/mL和3.5mg/mL(以印楝素計)，兩種印楝素-環(huán)糊精配合物對昆蟲可以保持印楝素原有的拒食活性。
本發(fā)明提供了印楝素-環(huán)糊精超分子配合物中，環(huán)糊精結(jié)構(gòu)如下所示
β-CD為β-環(huán)糊精，TMβCD為全甲基化β-環(huán)糊精。
本發(fā)明水溶性印楝素生物農(nóng)藥超分子配合物包括β-環(huán)糊精為配體的印楝素-環(huán)糊精超分子配合物，所述的超分子配合物是印楝素-全甲基化β-環(huán)糊精配合物，其中的印楝素與全甲基化β-環(huán)糊精的配合比為1∶2。
所述的水溶性印楝素生物農(nóng)藥超分子配合物的制備方法包括下列步驟1)室溫下將印楝素和β-環(huán)糊精或全甲基化β-環(huán)糊精溶于乙醇和水的混合溶液中，攪拌4-6天。
2)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后，過濾除去未反應(yīng)的印楝素，濾液旋干，真空干燥得到印楝素-環(huán)糊精配合物。
所述的反應(yīng)物摩爾比為印楝素∶β-環(huán)糊精＝1∶1。
所述的反應(yīng)物摩爾比為印楝素∶全甲基化β-環(huán)糊精＝1∶2。
所述的乙醇和水的體積比為1∶5。
本發(fā)明中所得固體產(chǎn)物經(jīng)過1H NMR證明。
本發(fā)明特別采用全甲基化β-環(huán)糊精做為印楝素載體。全甲基化β-環(huán)糊精具有相比天然環(huán)糊精更大的疏水空腔和更好的水溶性；由于其全修飾的特性，相比其他的環(huán)糊精衍生物具有合成副產(chǎn)物少，更易于制備分離的特點，利于大規(guī)模推廣?；谶@些特點使得全甲基化β-環(huán)糊精成為更為合適的藥物載體。
本發(fā)明通過簡單的混合溶劑攪拌法(一步法)制備，具有拒食活性的印楝素-環(huán)糊精超分子配合物具有較高的水溶性，溶解度分別達到2.7mg/mL和3.5mg/mL。該配合物具有與相等量的印楝素相近的拒食活性。由于該超分子配合物具有極高的水溶性和廉價易制備的特點，無毒易降解，本發(fā)明可以作為新型綠色農(nóng)藥藥物應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，制備方法工藝簡單，具有廣泛的應(yīng)用前景。


圖1印楝素-環(huán)糊精配合物的DSC圖。
圖2a印楝素的TG-DTA圖；圖2b天然β-環(huán)糊精的TG-DTA圖；圖2c全甲基化β-環(huán)糊精的TG-DTA圖；圖2d印楝素-天然β-環(huán)糊精配合物的TG-DTA圖；圖2e印楝素-全甲基化β-環(huán)糊精配合物的TG-DTA圖。
具體實施例方式
實施例本發(fā)明所涉及的印楝素-環(huán)糊精超分子配合物按下述方法合成1)印楝素-β-環(huán)糊精配合物的合成印楝素-β-環(huán)糊精配合物的合成路線室溫下將印楝素(0.03mM，21.6mg)和β-環(huán)糊精(上?；瘜W試劑廠)(0.01mM，12.6mg)全部溶于無水乙醇和水的混合溶液中(7mL，體積比1∶5)，將該混合物攪拌四天。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后，過濾除去未反應(yīng)的印楝素，濾液旋干，真空干燥得到印楝素-β-環(huán)糊精配合物22.6mg，產(chǎn)率約92％。該化合物的表征數(shù)據(jù)如下1H NMR(D2O，TMS，ppm)δ0.6-2.42(m，22H，印楝素氫)，3.36-3.80(m，＞50H，β-天然環(huán)糊精2位～6位氫和印楝素一部分氫)，4.87-4.89(s，7H，β-天然環(huán)糊精1位氫)。
2)印楝素-全甲基化β-環(huán)糊精配合物的合成印楝素-全甲基化β-環(huán)糊精配合物的合成路線室溫下將印楝素(0.03mM，21.6mg)和全甲基化β-環(huán)糊精(按照文獻合成Boger，J.，Corcoran，R.J.，Lehn，J.-M.Cyclodextrin Chemistry.Selective Modification of all PrimaryHydroxyl Groups of α-and β-Cyclodextrins.Helvetica Chimica Acta 1978，61，2190-2218.)(0.01mM，14.4mg)全部溶于乙醇和水的混合溶液中(7mL，體積比1∶5)，將該混合物攪拌四天。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后，過濾除去未反應(yīng)的印楝素，濾液旋干，真空干燥得到印楝素-全甲基化β-環(huán)糊精配合物15.3mg，產(chǎn)率約85％。該化合物的表征數(shù)據(jù)如下1H NMR(D2O，TMS，ppm)δ 0.6-2.4(m，22H，印楝素氫)，3.14-3.70(m，＞220H，全甲基化β-環(huán)糊精2位～6位氫和2，3，6位甲氧基氫和印楝素一部分氫)，5.10-5.11(s，14H，甲基化β-環(huán)糊精1位氫)。
3)兩種印楝素-環(huán)糊精配合物的配合比通過核磁積分比確定。
4)兩種印楝素-環(huán)糊精配合物的拒食活性，熱穩(wěn)定性及溶解度研究拒食活性試蟲亞洲玉米螟根據(jù)周大榮等方法飼養(yǎng)，溫度25±2℃，RH80％～90％，光照2000Lux。取蛻皮后約8小時的五齡幼蟲饑餓4小時后，備用。
基底飼料的配制測試用半人工飼料配方為玉米面4.8g，大豆面3.7g，瓊脂0.5g，水35mL。按此比例稱量，熱溶混勻，再冷卻后切成塊。
混藥飼料柱的制備稱取一定量的待測化合物，以少量水溶解(終濃度不過1％)再加入適量的上述飼料塊，攪碎，使與化合物混合，在90～100℃水浴中使飼料熱溶成糊，充分攪拌，以使化合物均勻分散，再以一支兩端開口的玻璃管(直徑0.6cm，長約30cm)吸入熱飼料糊，冷凝成形后用吸耳球吹出，切割成長約1cm的均一短柱，備用。
非選擇測定法將一個待測化合物飼料柱稱重后，水平放置于直徑1.9cm、高4.8cm的玻璃小瓶內(nèi)，對照組采用只含溶劑的飼料柱，取1頭幼蟲稱重后接入，蓋上瓶塞，每處理10蟲，重復(fù)一次。保持于25℃黑暗狀態(tài)下取食24小時，然后稱量并計算飼料重，并依下式計算相應(yīng)的拒食率。

其中，C、T分別是對照組、處理組試蟲的飼料減少量。
表1化合物不同濃度下對亞洲玉米螟五齡幼蟲的拒食活性(濃度以印楝素計)拒食活性*殺蟲劑 125μg/g250μg/g拒食率(％) 拒食率(％)印楝素 30.69±8.35b51.32±12.5a印楝素-β-環(huán)糊精7.86±8.14c45.93±7.22a印楝素-全甲基化β-環(huán)糊精20.53±6.51bc44.51±9.69a*使用DMRT法，具有相同字母的值沒有顯著不同，P＜0.05.。
結(jié)果表明，在250μg/g的條件下，兩種包和物的拒食活性同純印楝素基本相同；而在125μg/g的條件下，僅印楝素-全甲基化β-環(huán)糊精的拒食活性同純印楝素基本一致，印楝素-β-環(huán)糊精的下降比較明顯。
熱穩(wěn)定性通過視差掃描量熱法(DSC)如圖1所示和熱重-差熱法(TG-DTA)如圖2所示，圖1印楝素-環(huán)糊精配合物的DSC圖(a印楝素；b天然β-環(huán)糊精；c全甲基化β-環(huán)糊精；d印楝素-天然β-環(huán)糊精配合物；e印楝素-全甲基化β-環(huán)糊精配合物。圖2印楝素-環(huán)糊精配合物的TG-DTA圖(圖2a印楝素；圖2b天然β-環(huán)糊精；圖2c全甲基化β-環(huán)糊精；圖2d印楝素-天然β-環(huán)糊精配合物；圖2e印楝素-全甲基化β-環(huán)糊精配合物)。系統(tǒng)研究了印楝素-環(huán)糊精配合物的熱穩(wěn)定性。結(jié)果表明，印楝素-環(huán)糊精配合物具有良好的熱穩(wěn)定性，高溫下不易分解。且包和物的生成，還有效的提高了印楝素自身的熱穩(wěn)定性。
溶解度按常規(guī)方法將一定量的配合物溶于5mL水中，超聲振蕩一段時間至不再有固體溶解，過濾，將所得固體干燥稱重，可得知本配合物的溶解度值。結(jié)果是印楝素-β-環(huán)糊精溶解度達到2.7mg/mL，而印楝素-全甲基化β-環(huán)糊精達到3.5mg/mL。
權(quán)利要求
1.一種水溶性印楝素生物農(nóng)藥超分子配合物，它是包括β-環(huán)糊精為配體的印楝素-環(huán)糊精超分子配合物，其特征在于所述的超分子配合物是印楝素-全甲基化β-環(huán)糊精配合物。
2.按照權(quán)利要求1所述的水溶性印楝素生物農(nóng)藥超分子配合物，其特征在于所述的超分子配合物中所述的印楝素與全甲基化β-環(huán)糊精的配合比為1∶2。
3.權(quán)利要求1所述的水溶性印楝素生物農(nóng)藥超分子配合物的制備方法，其特征在于它包括下列步驟1)室溫下將印楝素和β-環(huán)糊精或全甲基化β-環(huán)糊精溶于乙醇和水的混合溶液中，攪拌4-6天；2)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇后，過濾除去未反應(yīng)的印楝素，濾液旋干，真空干燥得到印楝素-環(huán)糊精配合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的所述的水溶性印楝素生物農(nóng)藥超分子配合物的制備方法，其特征在于所述的反應(yīng)物摩爾比為印楝素∶β-環(huán)糊精＝1∶1。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的所述的水溶性印楝素生物農(nóng)藥超分子配合物的制備方法，其特征在于所述的反應(yīng)物摩爾比為印楝素∶全甲基化β-環(huán)糊精＝1∶2。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的所述的水溶性印楝素生物農(nóng)藥超分子配合物的制備方法，其特征在于所述的乙醇和水的體積比為1∶5。
全文摘要
本發(fā)明涉及水溶性印楝素生物農(nóng)藥超分子配合物和制備方法。該超分子配合物是β－環(huán)糊精和印楝素－全甲基化β－環(huán)糊精超分子配合物，溶解度分別達到2.7mg/mL和3.5mg/mL。通過簡單的混合溶劑攪拌法(一步法)制備，即室溫下將印楝素和環(huán)糊精溶于乙醇和水的混合溶液中，攪拌4－6天。蒸發(fā)除去乙醇后和過濾除去未反應(yīng)的印楝素，濾液旋干，真空干燥得到印楝素－環(huán)糊精配合物。所述的超分子配合物保持印楝素原有的拒食活性，可有效地提高其生物利用度，所使用的環(huán)糊精價格低廉，無毒易降解，制備方法工藝簡單，具有廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號A01N43/90GK1631145SQ200410072709
公開日2005年6月29日 申請日期2004年11月12日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月12日
發(fā)明者劉育, 陳國頌, 陳湧 申請人:南開大學