專利名稱：無公害高效能寡聚糖高產(chǎn)酶復(fù)合動物微生態(tài)制劑及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無公害高效能寡聚糖高產(chǎn)酶復(fù)合動物微生態(tài)制劑及其制備方法。
背景技術(shù)：
飼用微生物添加劑是九十年代開始發(fā)展起來的新型飼料添加劑，由于它在防病、提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進(jìn)動物生長和生產(chǎn)性能等方面具有抗生素所不具備的優(yōu)點(diǎn)，日益受到重視。益生素作為替代抗生素的第一代產(chǎn)品，盡管在克服抗生素的副作用和促進(jìn)動物生長以及生產(chǎn)性能等方面發(fā)揮了較好的作用，但單一的益生素仍存在諸多不足之處。一是動物消化道中原生菌的優(yōu)生作用使活菌劑很難在短時間內(nèi)定植、完成續(xù)生或大量繁殖，從而使益生菌在動物腸道中附著、定植的數(shù)量有限。二是動物腸道中原生菌優(yōu)勢和腸道中的營養(yǎng)素限制，使益生素的應(yīng)用效果受到影響。因?yàn)榛罹苿┚衅涮囟ǖ奈⑸鷳B(tài)環(huán)境，如果無法在腸道中長久供應(yīng)外源活菌制劑的營養(yǎng)素，它也將死亡而失效。三是產(chǎn)酶能力不高，使益生素的作用效果受到限制。四是活菌制劑必須耐受飼料制粒過程中的高溫以及胃腸道中消化酶、酸堿環(huán)境。然而實(shí)驗(yàn)表明在65℃以上時，益生菌將被大量殺滅，同時酸、堿、氧等不良環(huán)境也將造成益生菌的失活。以上不足之處，直接影響著益生素作用的發(fā)揮，使其作用效果不夠充分和穩(wěn)定，作用仍受到許多限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題設(shè)計一種無公害高效能寡聚糖高產(chǎn)酶復(fù)合動物微生態(tài)制劑及其制備方法，在益生素的基礎(chǔ)上，通過對益生素組方的調(diào)整、重組以及寡聚糖、高產(chǎn)霉菌的合理添加與組合配伍，以達(dá)到益生菌、益生元、高產(chǎn)酶技術(shù)的集成和三效合一的效果。使各菌種協(xié)同作用，使雙歧因子等有益菌的作用充分體現(xiàn)，高產(chǎn)酶的作用有效發(fā)揮，優(yōu)化了養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，是一種無污染、無公害的高效綠色環(huán)保型飼料添加劑。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案科學(xué)研究表明，寡聚糖是一種重要的雙歧桿菌等有益菌促生長因子(BF)，它能被有益菌發(fā)酵，有效地促進(jìn)腸道內(nèi)雙歧桿菌的生長、繁殖，具有提高免疫力，降低腸道內(nèi)PH值，抑制腸道內(nèi)有害菌生長，產(chǎn)生B族維生素，促進(jìn)動物腸道蠕動及蛋白吸收等多種功能。且低熱、穩(wěn)定、安全無毒。寡聚糖作為有益菌的基質(zhì)，與益生素合成應(yīng)用，使二者功能得到相輔相成的發(fā)揮，一是二者都能從不同角度提高腸道內(nèi)有益菌的定植。即寡聚糖可提供雙歧桿菌增殖的營養(yǎng)環(huán)境，而益生素中細(xì)菌的繁殖則提供了雙歧桿菌的厭氧環(huán)境，從而形成功能互補(bǔ)作用。二是二者均可競爭性排斥大腸桿菌、沙門氏菌等有害菌在著位點(diǎn)上的定值，而益生素還可分泌細(xì)菌類物質(zhì)，直接抑制有害菌的定植，從而產(chǎn)生了功能相輔疊加的強(qiáng)化效應(yīng)。經(jīng)對比試驗(yàn)，在眾多雙歧桿菌增殖低聚糖中，低聚異麥芽糖具有口感好、熱穩(wěn)定性強(qiáng)、不易變化，能很好地被雙歧桿菌利用，且生產(chǎn)原料眾多，生產(chǎn)工藝較為成熟，成為本發(fā)明配伍的理想選擇。
針對益生素產(chǎn)酶能力不強(qiáng)，酶活性不高的缺點(diǎn)，選用高產(chǎn)酶生物工程菌株，即對篩選出的菌株進(jìn)行耐高溫、耐熱性、耐藥性、熱滅活、包被等特殊的技術(shù)處理，保證菌株特定的性能要求。一是可消除消化障礙，參與動物體內(nèi)的各種反應(yīng)，提高反應(yīng)速度，有效促進(jìn)營養(yǎng)物的吸收利用；二是補(bǔ)充內(nèi)源酶的不足，達(dá)到比動物本身消化更好的效果。它與產(chǎn)品中的低聚糖、益生素有益菌協(xié)同作用，最大限度地分解、消化飼料。
本發(fā)明不是單純追求營養(yǎng)的平衡和提升生產(chǎn)性能的設(shè)計。而是一方面注重對環(huán)境的保護(hù)，把提高飼料轉(zhuǎn)化率，減少養(yǎng)分損失，控制藥物殘留，改善和控制動物排泄物的臭味及氮、磷、氨對環(huán)境的污染，力求性能與環(huán)保統(tǒng)一。
本發(fā)明由下述重量百分比的原料組成蠟狀芽孢桿菌10～15枯草芽孢桿菌10～15地衣芽孢桿菌10～15釀酒酵母1～5熱帶假絲酵母1～5光合細(xì)菌1～5植物乳桿菌 0.5～3嗜酸乳桿菌 0.5～3青春雙歧桿菌1～3所述的寡聚糖是低聚異麥芽糖。所述的載體是麥飯石。
本發(fā)明的制備方法①將所述的芽孢桿菌、光合細(xì)菌、酵母菌、曲霉菌菌種進(jìn)行耐高溫馴化、耐藥馴化后保藏，并對保藏的菌種傳代；
②對保藏的菌種進(jìn)行活化、發(fā)酵后微膠囊包被，并對包被后的菌種干燥；③將干燥后的菌種粉碎并與寡聚糖、載體按比例混合均勻。
所述耐高溫馴化過程為第一步，先將所述的光合細(xì)菌稀釋液分別置于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃水浴中加熱5′、10′、15′，用平板計數(shù)法測熱處理后的各類細(xì)菌活菌數(shù)，計算存活率；再將所述的酵母菌稀釋液分別置于55℃、60℃、65℃、70℃、75℃水浴中加熱5′、10′、15′，用平板計數(shù)法測熱處理后的各類細(xì)菌活菌數(shù)，計算存活率；最后將所述的曲霉菌稀釋液分別置于55℃、60℃、65℃、70℃、75℃水浴中加熱5′、10′、15′，前后分別接種于適宜培養(yǎng)皿上，30℃培養(yǎng)24～48h，觀察有無菌絲長出，并視其生長狀況確定其成活率；第二步，每種菌種選擇耐較高溫度相對較長時間的菌株為初發(fā)菌株，并對該菌株進(jìn)行純化、復(fù)壯、鑒定、擴(kuò)大培養(yǎng)；第三步，采用紫外線照射法進(jìn)行誘變，將所選初發(fā)菌株暴露于紫外燈下分別照射30′、60′、90′，取不同照射時間的菌株進(jìn)行增殖培養(yǎng)、稀釋分離，獲得單菌落，然后挑選菌落，做種菌鑒定，對符合性狀的菌株測定其耐高溫活性，篩選出各類耐高溫菌株，并且要驗(yàn)證篩選出的耐高溫菌株均具有良好的可遺傳能力。
所述耐藥馴化過程為首先用瓊脂紙片擴(kuò)散培養(yǎng)法確定各菌種的最高耐藥濃度，再以此濃度為基礎(chǔ)逐漸增加藥物濃度進(jìn)行耐藥性強(qiáng)化培養(yǎng)，篩選出耐最高濃度的菌株進(jìn)行增殖培養(yǎng)、稀釋分離，獲得單菌落，然后挑選菌落，做種菌鑒定，對符合要求的菌株要驗(yàn)證其耐藥性狀具有良好的可遺傳能力；不符合要求的菌株采用紫外線照射法進(jìn)行誘變。
所述微膠囊包被過程為將發(fā)酵終止的的菌液離心后取菌泥，用生理鹽水將菌泥稀釋成所需濃度，做活菌計數(shù)；分別制備4.5％～5.5％阿拉伯膠水溶液和9％～11％明膠水溶液，45℃保溫備用；將菌液與4.5％～5.5％阿拉伯膠水溶液按體積比1.8～2.2∶1比例混合后迅速振蕩混勻，調(diào)PH值至4.2～4.6，并迅速降溫至19.5～20.5℃制成混合液，在混合液中按體積比1.8～2.2∶1比例加入9％～11％明膠水溶液，繼續(xù)攪拌，并迅速降溫至4℃以下，調(diào)PH值至2.0后繼續(xù)攪拌30min，干燥后測活菌數(shù)。
所述的耐藥性強(qiáng)化培養(yǎng)采用平皿濃度梯度法進(jìn)行，具體過程根據(jù)菌株所耐受的濃度將耐受藥品稀釋到一定濃度制成藥液，然后先在滅菌空培養(yǎng)皿內(nèi)加入一定量的藥液，再傾入15-20ml冷卻至50-60℃的瓊脂培養(yǎng)基，迅速混勻后擺成斜面，培養(yǎng)皿與水平面夾角25-35°，做成平皿斜面；冷卻后再傾入等量的同等條件培養(yǎng)基，擺成平面、冷卻備用，將目的菌株均勻涂布于該平皿上，適宜條件培養(yǎng)，選出耐高濃度藥物菌株，重復(fù)上述過程，篩選耐更高濃度的菌株。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1、本發(fā)明使益生菌、益生元、高產(chǎn)酶菌功能互補(bǔ)，三效合一協(xié)同作用，活性高?；罹倲?shù)可達(dá)27億。內(nèi)源菌的增殖和外源菌的添加能有機(jī)結(jié)合，以雙歧桿菌的增殖為例，可由采食該產(chǎn)品前的17％迅速達(dá)到82％，增殖4-5倍，且定殖力強(qiáng)，能長期穩(wěn)定地發(fā)揮作用。
2、本發(fā)明選用高產(chǎn)酶菌株，并對篩選出的菌株進(jìn)行耐高溫、耐熱性、耐藥性、熱滅活、包被等特殊的技術(shù)處理，與普通菌株相比具有極強(qiáng)的產(chǎn)纖維素、半纖維素等多種消化、誘食等酶類的能力，還具有一定的抗菌譜特性，可替代酶制劑。
3、本發(fā)明耐熱性強(qiáng)、耐藥性好、穩(wěn)定性高。本發(fā)明經(jīng)耐高溫馴化后可耐受90-100℃高溫10分鐘，存活率達(dá)80％。本發(fā)明經(jīng)耐藥性馴化后可耐受包括沙星類在內(nèi)的20種飼用抗生素正常劑量藥物的影響。本發(fā)明經(jīng)熱滅活處理、雙膠囊包被后提高了菌種的耐熱穩(wěn)定性、耐酸堿穩(wěn)定性及產(chǎn)酶穩(wěn)定性，有效貯存期達(dá)18個月。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明實(shí)施例1原料組成(協(xié)力2000)蠟狀芽孢桿菌 15％枯草芽孢桿菌 10％地衣芽孢桿菌 15％釀酒酵母 3％熱帶假絲酵母 2％光合細(xì)菌 5％植物乳桿菌 0.5％嗜酸乳桿菌 0.5％青春雙歧桿菌 1％黑曲霉 0.5％米曲霉 1％綠色木霉 0.5％低聚異麥芽糖 6％
麥飯石 40％制備方法(一)將所述的芽孢桿菌、光合細(xì)菌、酵母菌、曲霉菌菌種進(jìn)行耐高溫馴化、耐藥馴化后保藏，并對保藏的菌種傳代；1.耐高溫馴化1.1菌種種類、來源及馴化前耐受溫度。(詳見表1)表1菌種種類、來源及馴化前耐受溫度

1.2因芽孢桿菌成芽孢后均能耐受100℃高溫，無需再做馴化篩選1.3耐高溫馴化過程。
第一步，先將所述的光合細(xì)菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌稀釋液分別置于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃水浴中加熱5′、10′、15′，用平板計數(shù)法測熱處理后的各類細(xì)菌活菌數(shù)，計算存活率；再將所述的釀酒酵母、熱帶假絲酵母稀釋液分別置于55℃、60℃、65℃、70℃、75℃水浴中加熱5′、10′、15′，用平板計數(shù)法測熱處理后的各類細(xì)菌活菌數(shù)，計算存活率；最后將所述的黑曲霉、米曲霉、綠色木霉稀釋液分別置于55℃、60℃、65℃、70℃、75℃水浴中加熱5′、10′、15′，前后分別接種于適宜培養(yǎng)皿上，30℃培養(yǎng)24～48h，觀察有無菌絲長出，并視其生長狀況確定其成活率；第二步，每種菌種選擇耐較高溫度相對較長時間的菌株為初發(fā)菌株，并對該菌株進(jìn)行純化、復(fù)壯、鑒定、擴(kuò)大培養(yǎng)；結(jié)果見表2。
表2初發(fā)菌株

第三步，采用紫外線照射法進(jìn)行誘變，將所選初發(fā)菌株暴露于紫外燈下(照射強(qiáng)度40w，距離20cm)分別照射30′、60′、90′，取不同照射時間的菌株進(jìn)行增殖培養(yǎng)、稀釋分離，獲得單菌落，然后挑選菌落，做種菌鑒定，對符合性狀的菌株測定其耐高溫活性，篩選出各類耐高溫菌株，并且要驗(yàn)證篩選出的耐高溫菌株均具有良好的可遺傳能力。
1.4通過紫外線誘變及耐高溫篩選，成功篩選出各類耐高溫菌株。(詳見表3)
表3耐高溫菌株

2.耐藥馴化2.1幾種常用藥物的通常使用濃度表4

2.2按表4中藥物的平均濃度做成紙片，用“瓊脂紙片擴(kuò)散法”對不同菌種進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。測定和細(xì)分各菌種對各種藥物的適應(yīng)、耐受程度，按抑菌圈直徑大小為不敏、低敏、較敏、極敏等級別。結(jié)果詳見表5。
表5藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注不敏-+；低敏+；較敏++；極敏+++++2.2耐藥性強(qiáng)化培養(yǎng)。所有真菌對上述藥物均不敏感，可直接應(yīng)用。低敏、較敏、極敏的細(xì)菌，以此濃度為基礎(chǔ)逐漸增加藥物濃度采用平皿濃度梯度法進(jìn)行耐藥性強(qiáng)化培養(yǎng)，具體過程根據(jù)菌株所耐受的濃度將耐受藥品稀釋到一定濃度制成藥液，然后先在滅菌空培養(yǎng)皿內(nèi)加入一定量的藥液，再傾入18ml冷卻至55℃的瓊脂培養(yǎng)基，迅速混勻后擺成斜面，培養(yǎng)皿與水平面夾角30°，做成平皿斜面；冷卻后再傾入等量的同等條件培養(yǎng)基，擺成平面、冷卻備用，將目的菌株均勻涂布于該平皿上，適宜條件培養(yǎng)，選出耐高濃度藥物菌株，重復(fù)上述過程，篩選耐更高濃度的菌株。對篩選出的菌株進(jìn)行增殖培養(yǎng)、稀釋分離，獲得單菌落，然后挑選菌落，做種菌鑒定，對符合要求的菌株要驗(yàn)證其耐藥性狀具有良好的可遺傳能力；不符合要求的菌株采用紫外線照射法進(jìn)行誘變。
2.3采用紫外線照射法進(jìn)行誘變，將不符合要求的菌株暴露于紫外燈下(照射強(qiáng)度40w，距離20cm)分別照射30′、60′、90′，取不同照射時間的菌株進(jìn)行增殖培養(yǎng)、稀釋分離，獲得單菌落，然后挑選菌落，做種菌鑒定，對符合性狀的菌株測定其耐藥性，篩選出各類耐藥菌株，并且要驗(yàn)證篩選出的耐藥菌株均具有良好的可遺傳能力。
2.4通過對菌株進(jìn)行耐藥馴化、誘變和純化鑒定，成功篩選出了耐受部分抗生素的有益菌株，且這些菌株均具有較強(qiáng)的廣譜耐藥性。結(jié)果詳見表6。
表6誘變后最終藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(二)對保藏的菌種進(jìn)行活化、發(fā)酵后微膠囊包被，并對包被后的菌種干燥；1.微膠囊包被。將發(fā)酵終止的的菌液離心后取菌泥，用生理鹽水將菌泥稀釋成所需濃度，做活菌計數(shù)；分別制備5％阿拉伯膠水溶液和10％明膠水溶液，45℃保溫備用；將菌液與5％阿拉伯膠水溶液按體積比2∶1比例混合后迅速振蕩混勻，調(diào)PH值至4.6，并迅速降溫至20℃制成混合液，在混合液中按體積比2∶1比例加入10％明膠水溶液，繼續(xù)攪拌，并迅速降溫至4℃以下，調(diào)PH值至2.0后繼續(xù)攪拌30min，干燥后測活菌數(shù)。
2.相關(guān)技術(shù)指標(biāo)2.1微膠囊形態(tài)、大小取混合液做革蘭氏染色，鏡檢(16×40倍)，清晰可見視野中雙層微膠囊，直徑50μm~200μm，每個微膠囊包含20～50個細(xì)菌。
2.2耐高溫、酸、堿性檢驗(yàn)取一定量微膠囊液分別進(jìn)行如下處理①85℃10min②37℃pH＝2H℃L溶液30min③37℃ pH＝13 NaOH溶液30min然后，離心取沉淀物染色鏡檢，其破壁率分別為0、8％、12％2.3包被與未包被菌液干燥后成活率對比2.3.1檢驗(yàn)方法平板計數(shù)法2.3.2模擬腸胃環(huán)境體外破壁液的配制1號液稀鹽酸溶液pH調(diào)為2.0+酸性蛋白酶(本公司自制)適量2號液取1號液750ml加250ml 0.2mol/L硫酸鈉溶液，調(diào)pH至6.82.3.3雙層微膠囊破壁精確稱量一定量的干燥樣品置一定體積的1號液中，37℃水浴保溫30min，調(diào)pH至6.8，加入等體積的2號液，37℃保溫30min。離心，取沉淀物，鏡檢破壁率。
2.3.4對2.3.3沉淀物做平板計數(shù)并與未包被干燥樣品比較活菌數(shù)。結(jié)果如下與未包被菌液相比，包被后的干燥樣品與未包被的干燥樣品有益菌平均存活率分別為95％，50％。
3.結(jié)論3.1該項(xiàng)技術(shù)首次將微膠囊包被技術(shù)應(yīng)用于動物微生態(tài)領(lǐng)域，并且針對動物的消化道生理特性，設(shè)計了兩種不同性質(zhì)的囊材，以保證其在動物胃腸道有層次的降解，順利釋放出有益菌。
3.2雙層微膠囊具有抗熱、耐酸、堿等特性?？鼓嫘圆畹奈⑸?尤其是專性厭氧的雙歧桿菌、兼性厭氧的乳酸菌、光合菌等)經(jīng)雙層微膠囊包被后可極大提高其抗熱。耐氧、酸、堿等特性。該項(xiàng)技術(shù)在動物微生態(tài)制劑上的應(yīng)用可大大提高產(chǎn)品性能。
3.3該項(xiàng)技術(shù)所用材料、器皿均為普通工業(yè)實(shí)驗(yàn)用品，其操作方法簡便實(shí)用。
(三)將干燥后的菌種粉碎并與低聚異麥芽糖、麥飯石按比例混合均勻，包裝，入庫。
本發(fā)明實(shí)施例2原料組成(協(xié)力3000)蠟狀芽孢桿菌14％
枯草芽孢桿菌13％地衣芽孢桿菌14％釀酒酵母3％熱帶假絲酵母2％光合細(xì)菌4.5％植物乳桿菌 1％嗜酸乳桿菌 1％青春雙歧桿菌1.5％黑曲霉 0.5％米曲霉 1％綠色木霉0.5％低聚異麥芽糖6％麥飯石 38％制備方法與實(shí)施例1基本相同。
權(quán)利要求
1.一種無公害高效能寡聚糖高產(chǎn)酶復(fù)合動物微生態(tài)制劑，其特征是所述制劑的原料組成的重量百分比為蠟狀芽孢桿菌10～15枯草芽孢桿菌10～15地衣芽孢桿菌10～15釀酒酵母1～5熱帶假絲酵母1～5光合細(xì)菌1～5植物乳桿菌 0.5～3嗜酸乳桿菌 0.5～3青春雙歧桿菌1～3黑曲霉 0.5～3米曲霉 0.5～3綠色木霉0.5～3寡聚糖 5～10載體30～50
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無公害高效能寡聚糖高產(chǎn)酶復(fù)合動物微生態(tài)制劑，其特征是所述的寡聚糖是低聚異麥芽糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無公害高效能寡聚糖高產(chǎn)酶復(fù)合動物微生態(tài)制劑，其特征是所述的載體是麥飯石。
4.一種無公害高效能寡聚糖高產(chǎn)酶復(fù)合動物微生態(tài)制劑的制備方法，其特征是①將所述菌種進(jìn)行耐高溫馴化、耐藥馴化后保藏，并對保藏的菌種傳代；②對保藏的菌種進(jìn)行活化、發(fā)酵后微膠囊包被，并對包被后的菌種干燥；③將干燥后的菌種粉碎并與寡聚糖、載體按比例混合均勻。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無公害高效能寡聚糖高產(chǎn)酶復(fù)合動物微生態(tài)制劑的制備方法，其特征是所述耐高溫馴化過程為第一步，先將所述的光合細(xì)菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、青春雙歧桿菌稀釋液分別置于45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃水浴中加熱5′、10′、15′，用平板計數(shù)法測熱處理后的各類細(xì)菌活菌數(shù)，計算存活率；再將所述的釀酒酵母、熱帶假絲酵母稀釋液分別置于55℃、60℃、65℃、70℃、75℃水浴中加熱5′、10′、15′，用平板計數(shù)法測熱處理后的各類細(xì)菌活菌數(shù)，計算存活率；最后將所述的黑曲霉、米曲霉、綠色木霉稀釋液分別置于55℃、60℃、65℃、70℃、75℃水浴中加熱5′、10′、15′，前后分別接種于適宜培養(yǎng)皿上，30℃培養(yǎng)24～48h，觀察有無菌絲長出，并視其生長狀況確定其成活率；第二步，每種菌種選擇耐較高溫度相對較長時間的菌株為初發(fā)菌株，并對該菌株進(jìn)行純化、復(fù)壯、鑒定、擴(kuò)大培養(yǎng)；第三步，采用紫外線照射法進(jìn)行誘變，將所選初發(fā)菌株暴露于紫外燈下分別照射30′、60′、90′，取不同照射時間的菌株進(jìn)行增殖培養(yǎng)、稀釋分離，獲得單菌落，然后挑選菌落，做種菌鑒定，對符合性狀的菌株測定其耐高溫活性，篩選出各類耐高溫菌株，并且要驗(yàn)證篩選出的耐高溫菌株均具有良好的可遺傳能力。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無公害高效能寡聚糖高產(chǎn)酶復(fù)合動物微生態(tài)制劑的制備方法，其特征是所述耐藥馴化過程為首先用瓊脂紙片擴(kuò)散培養(yǎng)法確定各菌種的最高耐藥濃度，再以此濃度為基礎(chǔ)逐漸增加藥物濃度進(jìn)行耐藥性強(qiáng)化培養(yǎng)，篩選出耐最高濃度的菌株進(jìn)行增殖培養(yǎng)、稀釋分離，獲得單菌落，然后挑選菌落，做種菌鑒定，對符合要求的菌株要驗(yàn)證其耐藥性狀具有良好的可遺傳能力；不符合要求的菌株采用紫外線照射法進(jìn)行誘變。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無公害高效能寡聚糖高產(chǎn)酶復(fù)合動物微生態(tài)制劑的制備方法，其特征是所述微膠囊包被過程為將發(fā)酵終止的的菌液離心后取菌泥，用生理鹽水將菌泥稀釋成所需濃度，做活菌計數(shù)；分別制備4.5％～5.5％阿拉伯膠水溶液和9％～11％明膠水溶液，45℃保溫備用；將菌液與4.5％～5.5％阿拉伯膠水溶液按體積比1.8～2.2∶1比例混合后迅速振蕩混勻，調(diào)PH值至4.2～4.6，并迅速降溫至19.5～20.5℃制成混合液，在混合液中按體積比1.8～2.2∶1比例加入9％～11％明膠水溶液，繼續(xù)攪拌，并迅速降溫至4℃以下，調(diào)PH值至2.0后繼續(xù)攪拌30min，干燥后測活菌數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的無公害高效能寡聚糖高產(chǎn)酶復(fù)合動物微生態(tài)制劑的制備方法，其特征是采用平皿濃度梯度法進(jìn)行耐藥性強(qiáng)化培養(yǎng)，具體過程根據(jù)菌株所耐受的濃度將耐受藥品稀釋到一定濃度制成藥液，然后先在滅菌空培養(yǎng)皿內(nèi)加入一定量的藥液，再傾入15-20ml冷卻至50-60℃的瓊脂培養(yǎng)基，迅速混勻后擺成斜面，培養(yǎng)皿與水平面夾角25-35°，做成平皿斜面；冷卻后再傾入等量的同等條件培養(yǎng)基，擺成平面、冷卻備用，將目的菌株均勻涂布于該平皿上，適宜條件培養(yǎng)，選出耐高濃度藥物菌株，重復(fù)上述過程，篩選耐更高濃度的菌株。
全文摘要
一種無公害高效能寡聚糖高產(chǎn)酶復(fù)合動物微生態(tài)制劑，由下述重量百分比的原料組成蠟狀芽孢桿菌10～15，枯草芽孢桿菌10～15，地衣芽孢桿菌10～15，釀酒酵母1～5，熱帶假絲酵母1～5，光合細(xì)菌1～5，植物乳桿菌0.5～3，嗜酸乳桿菌0.5～3，青春雙歧桿菌1～3，黑曲霉0.5～3，米曲霉0.5～3，綠色木霉0.5～3，寡聚糖5～10，載體30～50。制備方法①將所述菌種進(jìn)行耐高溫馴化、耐藥馴化后保藏，并對保藏的菌種傳代；②對保藏的菌種進(jìn)行活化、發(fā)酵后微膠囊包被，并對包被后的菌種干燥；③將干燥后的菌種粉碎并與寡聚糖、載體按比例混合均勻。本發(fā)明通過對益生素組方的調(diào)整、重組以及寡聚糖、高產(chǎn)霉菌的合理添加與組合配伍，使各菌種協(xié)同作用，使雙歧因子等有益菌的作用充分體現(xiàn)，高產(chǎn)酶的作用有效發(fā)揮，優(yōu)化了養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境，是一種無污染、無公害的高效綠色環(huán)保型飼料添加劑。
文檔編號A23K1/16GK1653932SQ20041007341
公開日2005年8月17日 申請日期2004年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月10日
發(fā)明者王剛, 豆曉梅, 王平, 劉麗 申請人:寶雞市星星協(xié)力生物有限公司