專利名稱：一種防治三七根腐病的生物菌劑的制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治三七根腐病的生物殺菌劑的制備方法和應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥
背景技術(shù)：
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen，1948)，又名田七、山漆和金不換等，是五加科人參屬的一種多年生陰生草本植物，作為第三紀(jì)古熱帶的殘遺物種現(xiàn)僅存于北緯23°30′附近的我國云南省文山州和廣西自治區(qū)百色地區(qū)的部分中高海拔地區(qū)。由于具有活血化淤、消腫止痛和滋補(bǔ)強(qiáng)身等多種功效，故作為我國中醫(yī)藥中的一種名貴藥材而被廣泛用于多種疾病特別是近年來日益嚴(yán)重的心血管疾病的預(yù)防和治療。目前，野生三七已十分罕見。大力開展人工栽培和進(jìn)行大面積集約化種植是解決野生資源日益枯竭問題和不斷滿足國內(nèi)外對三七日益增長需求的重要手段。云南省文山州由于具有獨特的氣候和土壤條件，歷史上一直是我國三七的主要產(chǎn)地。由于三七具有的重要經(jīng)濟(jì)價值，目前該草藥的種植和加工已成為云南省文山州發(fā)展地方經(jīng)濟(jì)的重要支助產(chǎn)業(yè)之一。
但由于連年大面積單一種植，加之三七為多年生宿根草本植物，性喜溫暖陰濕，因此病害問題十分突出，特別是根腐病問題，目前已成為限制三七種植業(yè)發(fā)展的嚴(yán)重障礙。據(jù)王朝梁等人的調(diào)查，各年生三七均可受害，且生長年限越長受害越重，在文山州的發(fā)病率一般為5-20％，嚴(yán)重的達(dá)46.68％，甚至絕產(chǎn)。對該病的防治目前主要依靠輪作倒茬和化學(xué)藥劑灌根。但輪作年限一般要求8年以上，生產(chǎn)上難以大面積推行。藥劑灌根雖有效，但農(nóng)藥殘留問題嚴(yán)重。因此，研究開發(fā)高效的生物殺菌劑很有經(jīng)濟(jì)價值和社會價值。
三七根腐病是由多種病原菌復(fù)合侵染或交叉感染引起的。與癥狀相關(guān)的微生物類群主要包括Cylindrocarpon didynum、C.destructans、Fusarium solani、F.oxysporum、Phytophthora cactorum、Phoma herbarum、Rhizoctonia solani和Pseudomonas sp.等。其中兩種株孢菌Cylindrocarpon didynum和C.destructans在田間分布范圍較廣，分離頻率較高，可導(dǎo)致典型的黃腐型癥狀，被認(rèn)為是生產(chǎn)上三七根腐病的主要致病菌。
側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus)是一種好氧的，可形成芽孢的細(xì)菌。該菌可通過形成伴孢晶體，分泌酶、毒蛋白或其他毒肽而產(chǎn)生殺菌功能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對一株具有殺菌功能的側(cè)孢短芽孢桿菌研究，開發(fā)應(yīng)用于防治三七根腐病的生物殺菌劑。
本發(fā)明利用Brevibacillus laterosporus G4菌株或由該菌株產(chǎn)生的各種突變株，通過液體培養(yǎng)方法，獲得菌體培養(yǎng)物(包括菌體及其代謝物質(zhì))，添加農(nóng)業(yè)上允許使用的填充料，粘合劑，表面活性劑等有利于有效成分施用和分散的物質(zhì)，制成種粉劑，顆粒劑，可濕性粉劑，用于防治引起三七根腐病的主要病原菌Cylindrocarpon didynum和C.destructans。
側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus)G4菌株已于2003年6月2日保藏于武漢大學(xué)中國典型培育物保藏中心，保藏號CCTCC NOM203045。
本發(fā)明通過以下步驟實現(xiàn)(1)本發(fā)明使用的微生物的來源和特性；(2)微生物菌種的培養(yǎng)(包括微生物試管斜面種子培養(yǎng)、微生物液體種子培養(yǎng))(3)微生物菌體及其代謝物質(zhì)的大量培養(yǎng)；(4)菌劑的加工及應(yīng)用。以上各步驟分述如下本發(fā)明使用的微生物是側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus)G4菌株或由該菌株通過突變、遺傳改造獲得的衍生物。該菌株已于2003年6月2日保藏于武漢大學(xué)中國典型培育物保藏中心，保藏號CCTCC NOM203045。G4菌株形態(tài)特征是菌體長桿狀，個體較大，兩端鈍圓，多以凝集形式存在。在YPD培養(yǎng)基(10克酵母浸膏，5克蛋白胨，15克葡萄糖，20克瓊脂，水1000毫升，pH6～7)上，菌落呈圓形、隆起、邊緣較整齊，表面無光澤、粗糙、類似細(xì)小粉末狀，菌苔白色；培養(yǎng)36小時后可見大量脫落的芽孢，芽孢為橢圓形呈獨木舟狀體。G4菌株通過分泌細(xì)胞壁降解酶分解病原真菌的細(xì)胞壁，繼而通過分泌的抗菌肽抑制病原菌的生長和繁殖，其抑菌能力顯著高于同類的其它側(cè)孢短芽孢桿菌。
微生物斜面種子培養(yǎng)方法將微生物的菌絲體接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基斜面上，28～32℃下培養(yǎng)1～4天，獲得試管種。
微生物液體種子的培養(yǎng)方法將斜面種子接種到Y(jié)DFG液體培養(yǎng)基(5克酵母粉，150克大豆餅粉，5克魚粉，200克葡萄糖，水1000毫升，pH6～7)中，于25～35℃，轉(zhuǎn)速為200～300rpm的搖床上培養(yǎng)2～5天，獲得液體菌種。
微生物液體條件下的大量繁殖方法將液體種子接種到有液體YDFG培養(yǎng)基的20立升，50立升，1000～4000立升發(fā)酵罐中，生產(chǎn)這種微生物的菌體和代謝產(chǎn)物。發(fā)酵時，發(fā)酵罐的培養(yǎng)溫度控制在28～35℃，轉(zhuǎn)速為300～500rmp，培養(yǎng)時間36～72小時。
菌劑各種劑型的制備如下粉劑的制備微生物大量菌體制備好以后作為原藥與粉碎(粒徑小于1毫米以下)的單一或組合的填料(如草粉，米糠，木屑，滑石，葉蠟石，高嶺土，膨潤土，凹凸棒土，硅藻土，陶土，草炭等)和助劑(如烷基芳基聚氧乙基醚，脂肪醇，氧乙基醚，烷基萘磺酸鹽，木質(zhì)素磺酸鹽以及它們的復(fù)配物)混合，混合物中微生物及其代謝物(即發(fā)酵終產(chǎn)物)的重量百分比為30～75％?；旌现髮⑺窒鄬穸日{(diào)節(jié)到5％以下，包裝，室溫或4～10℃下保存。
顆粒劑的制備按粉劑的方法將菌體與填料和助劑混合，用造粒機(jī)制成直徑為1～4mm，長度為0.5～8cm的顆粒，在30～35℃下烘干到水分含量小于5％，制成顆粒劑。
可濕性粉劑的制備微生物大量發(fā)酵生產(chǎn)以后，將發(fā)酵終產(chǎn)物與填料(同粉劑)，潤濕劑(茶枯，皂角，土溫60，拉開粉，洗衣粉，十二烷基苯磺酸鈉等)，分散劑(No，NNO，PolyFON，SOPA，HO，拉散劑MF等)，穩(wěn)定劑(如抗壞血酸)均勻混合，將水分調(diào)節(jié)到2％以下。在制備時先將微生物發(fā)酵物以外的成分混合并粉碎小于44微米后再與菌體混合。可濕性粉劑中微生物的重量百分比為35～75％。
以上菌劑中，粉劑和可濕性粉劑的使用方法可以是拌種，拌土穴施、溝施，也可以是噴霧；顆粒劑為拌土穴施。
以上菌劑的使用時期可以是播種期，一年期和二年期。
本發(fā)明產(chǎn)品對三七根腐病菌的抑制試驗試驗一 粉劑、可濕性粉劑、顆粒劑防治三七根腐病菌的室內(nèi)平板測定1.試驗菌劑及稀釋粉劑、可濕性粉劑、顆粒劑(其中，填料為85％草炭和15％硅藻土；助劑為50％烷基萘磺酸鹽和50％木質(zhì)素磺酸鹽；菌劑中微生物發(fā)酵終產(chǎn)物的重量百分比為50％)通過上述方法制備；用水將菌劑稀釋500倍后備用。以水作為菌劑的對照。
2.病原菌的準(zhǔn)備柱孢菌C.didynum和C.destructans由發(fā)明人分離自云南文山州所采集的三七根腐病病根。將這兩種病原菌分別接種到PDA培養(yǎng)基(蔗糖20g，去皮馬鈴薯200g，瓊脂10g，用水定容至1000mL)平板上，25℃下培養(yǎng)14天后所得的菌落作為接種體備用。
3.試驗方法在PDA平板(直徑＝9cm)上接種1片病原菌菌落(直徑＝5mm)，在與病原菌接種體距離3cm處的牛津杯(1×0.5cm)中加入200μL菌劑稀釋液。每處理設(shè)三個重復(fù)，以加水的處理作為對照。將各處理平板置于25℃下培養(yǎng)，14天后測量各處理中病原菌的菌落直徑。
4.試驗結(jié)果與分析表1 粉劑、可濕性粉劑、顆粒劑對兩種三七根腐病菌的抑菌效果

相對抑制率(％)＝(對照菌落直徑平均值-處理菌落直徑平均值)÷對照菌落直徑平均值×100；a表示各處理間無顯著差異。
從表1可以看出，使用本發(fā)明制備的三種菌劑在平板上能顯著抑制兩種三七病原菌的生長，三種菌劑中以可濕性粉劑的抑菌效果最好，但三種菌劑對兩種病原菌的抑菌效果間沒有顯著差異。粉劑、可濕性粉劑和顆粒劑對病原菌對C.didynum的相對抑菌率分別為83.77％、89.54％和87.54％；對病原菌C.destructans的相對抑菌率分別為83.62％、87.24％和86.03％。
試驗二 利用粉劑、可濕性粉劑、顆粒劑對三七種苗進(jìn)行處理防治三七根腐病的田間防治效果1.試驗菌劑及稀釋粉劑、可濕性粉劑、顆粒劑(其中，填料為85％草炭和15％硅藻土；助劑為50％烷基萘磺酸鹽和50％木質(zhì)素磺酸鹽；菌劑中微生物發(fā)酵終產(chǎn)物的重量百分比為50％)通過上述方法制備；用水將菌劑稀釋500倍后備用。以水、500倍的2％次氯酸鈉、500倍的2％優(yōu)氯凈和500倍的2％消菌靈作為菌劑的對照。
2.材料及試驗場地一年生三七種苗取自云南省文山州三七試驗場。實驗場地為自云南省文山州三七試驗場，實驗地上連作三七10年，根腐病嚴(yán)重。實驗時間2003年2月18日。
3.試驗方法將供試種苗浸于以上藥劑藥液中20分鐘取出，自然風(fēng)干植株水跡后立即移栽入土，使芽尖離地面0.5-1cm。每處理10株，重復(fù)3次。試驗區(qū)上置遮陽物使透光率在15-20％。不進(jìn)行任何肥水和施藥管理。30天后進(jìn)行第一次調(diào)查，對比出苗數(shù)量、成苗率、苗嫩葉頂芽有無藥物灼傷和移栽后1年的成苗率。
4.試驗結(jié)果與分析表2 粉劑、可濕性粉劑、顆粒劑對三七種苗進(jìn)行處理防治三七根腐病的田間防治效果

數(shù)據(jù)后的標(biāo)有同一字母表示這些處理間尤顯著差異；而不同字母間的處理有顯著差異。
從表1可以看出，使用本發(fā)明制備的三種菌劑處理三七種苗后能有效降低根腐病菌的危害。與水處理相比較，能顯著提高出苗率(三種菌劑的出苗率分別為90％、89％和87％；水處理的出苗率僅為63％；菌劑處理與水處理的出苗率間存在顯著差異)，1年后的成苗率(三種菌劑的成苗率分別為65％、63％和58％；水處理的成苗率僅為34％；菌劑處理與水處理的成苗率間存在顯著差異)和降低根腐病危害的病情指數(shù)(三種菌劑的病情指數(shù)分別為2.9％、3.1％和3.9％；水處理的病情指數(shù)為8.4％；菌劑處理與水處理的病情指數(shù)間存在顯著差異)。三種菌劑以粉劑的效果最好，但三種菌劑的處理效果間五差異顯著性。與三種化學(xué)藥劑相比較，三種菌劑和三種化學(xué)藥劑處理的出苗率無差異顯著性；三種菌劑與次氯酸鈉和優(yōu)氯凈處理的1年后成苗率和病情指數(shù)相當(dāng)，無顯著差異；消菌靈處理后1年后的成苗率和防治效果最好(分別為73％和2.8)，與三種菌劑和另外兩種化學(xué)藥劑的處理效果存在顯著差異。但是從藥害灼傷率上看，次氯酸鈉和消菌靈對種苗存在藥害灼傷，三種菌劑和優(yōu)氯凈無藥害灼傷。綜合以上效果和從較低農(nóng)藥殘留的角度看，三種菌劑是處理三七種苗、降低根腐病危害的理想生物菌劑。
試驗三 利用粉劑、可濕性粉劑、顆粒劑防治一年生三七種苗根腐病的田間防病效果1.試驗菌劑及稀釋粉劑、可濕性粉劑、顆粒劑(其中，填料為85％草炭和15％硅藻土；助劑為50％烷基萘磺酸鹽和50％木質(zhì)素磺酸鹽；菌劑中微生物發(fā)酵終產(chǎn)物的重量百分比為50％)通過上述方法制備；用水將菌劑稀釋200倍后備用。以水、3％多抗霉素200倍液、50％甲霜靈錳鋅+98％惡霉靈(1∶1)200倍、50％甲霜靈錳鋅200倍、50％速克靈200倍，98％惡霉靈200倍作為菌劑的對照。
2.材料及試驗場地一年生三七種苗取自云南省文山州三七試驗場老病地。實驗場地為自云南省文山州三七試驗場，實驗地上連作三七10年，根腐病嚴(yán)重。實驗時間2003年2月18日。
3.試驗方法將供試種苗用上述藥劑浸泡1分鐘后取出直接移栽入土。為增加附著力和持效性，每處理藥液中加入60目細(xì)木粉5g。每處理10株，重復(fù)3次。試驗區(qū)上置遮陽物使透光率在15-20％。不進(jìn)行任何肥水和施藥管理。處理1年后調(diào)查根腐病危害的病情指數(shù)。
表3 粉劑、可濕性粉劑、顆粒劑防治一年生三七種苗根腐病的田間防病效果

注1為粉劑，2為可濕性粉劑，3為顆粒劑，4為3％多抗霉素，5為50％甲霜靈錳鋅+98％惡霉靈，6為50％甲霜靈錳鋅，7為50％速克靈，8為98％惡霉靈，9為水。
從表3看出，供試的三種菌劑和5種化學(xué)藥劑都能很好防治三七根腐病的危害，其中以98％惡霉靈和50％甲霜靈錳鋅+98％惡霉靈和防治效果最好；三種菌劑種粉劑的效果與50％速克靈、50％甲霜靈錳鋅和3％多抗霉素水平相當(dāng)，可濕性粉劑和顆粒劑的效果稍差；三種菌劑中以粉劑最好。
以上可見本發(fā)明利用低成本原料和采用常規(guī)生產(chǎn)工藝制成的菌劑對防治三七的兩種主要病原菌有很好的抑菌效果。
具體實施例方式
實施例1小規(guī)模制備粉劑的方法在20升發(fā)酵罐中發(fā)酵菌劑的具體方法和菌劑制備的工藝是在發(fā)酵罐中裝入16升YDFG培養(yǎng)基，121℃滅菌90分鐘，接入1升液體培養(yǎng)菌種，在通氣率為0.7，轉(zhuǎn)速為450rpm，溫度為28～35℃的波動范圍內(nèi)發(fā)酵2-4天，發(fā)酵1天后每4小時檢測一次菌體數(shù)量，當(dāng)菌體量達(dá)到1013個/mL以上，并且數(shù)量不再增加時及時中止發(fā)酵。然后按50毫升發(fā)酵終產(chǎn)物∶45克填料∶5克助劑的比例混合，在35～45℃下烘干到水分含量小于5％，最后用塑料袋密封，4℃或室溫保存于通風(fēng)避光處。以上使用的填料可以是粒徑小于1mm的以下各種填料中的一種或多種的混合物草粉，米糠，木屑，滑石，葉蠟石，高嶺土，膨潤土，凹凸棒土，硅藻土，陶土，草炭。以上使用的助劑可以是以下各種助劑中的一種或多種的混合物烷基芳基聚氧乙基醚，脂肪醇，氧乙基醚，烷基萘磺酸鹽，木質(zhì)素磺酸鹽。微生物及其代謝產(chǎn)物在制成的粉劑中的重量百分比為30％。
實施例2大規(guī)模制備粉劑的方法在4000升發(fā)酵罐中發(fā)酵菌體的具體方法和菌劑制備的工藝是在發(fā)酵罐中裝入3500升YDFG培養(yǎng)基，121℃滅菌120分鐘，接入175升液體培養(yǎng)菌種，在通氣率為0.9，轉(zhuǎn)速為450rpm，溫度為28～35℃的波動范圍內(nèi)發(fā)酵2～4天，發(fā)酵1天后每4小時檢測一次菌體數(shù)量，當(dāng)菌體量達(dá)到1013個/mL以上，并且數(shù)量不再增加時及時中止發(fā)酵。之后按實例1中的方法制備粉劑。微生物及其代謝產(chǎn)物在制成的粉劑中的重量百分比為75％。
實施例3制備顆粒劑的方法按實施例1或?qū)嵤├?的方法發(fā)酵生產(chǎn)微生物及其代謝產(chǎn)物。將發(fā)酵終產(chǎn)物與25％的硅藻酸鈉溶液按體積比為1∶1的比例混合，然后用造粒機(jī)制成直徑為4mm，長度為4.5cm的顆粒，在35℃下烘干到水分含量小于5％，制成顆粒劑。微生物及其代謝產(chǎn)物在制成的顆粒劑中的重量百分比為45％。
實施例4可濕性粉劑的制備按實施例1或?qū)嵤├?的方法發(fā)酵生產(chǎn)微生物及其代謝產(chǎn)物。將發(fā)酵終產(chǎn)物與填料按15克∶85克的比例混合制成顆粒劑。其中填料為95％草炭，2％吐溫60，1％十二烷基苯磺酸鈉，1％拉散劑MF，1％抗壞血酸，混合后將含水量調(diào)節(jié)2％。微生物及其代謝產(chǎn)物在制成的可濕性粉劑中的重量百分比為55％。
權(quán)利要求
1.一種防治三七根腐病的生物菌劑的制備方法，其生產(chǎn)工序包括微生物試管斜面種子培養(yǎng)和微生物液體種子培養(yǎng)；將液體種子接入液體培養(yǎng)料中，通過液體培養(yǎng)，獲得大量的菌體及其代謝物；根據(jù)劑型需要將菌體及其代謝物與相應(yīng)的填充料、粘合劑、表面活性劑混合，制成粉劑、顆粒劑和可濕性粉劑，其特征在于1.1所用的微生物為側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus)G4菌株，該菌株已于2003年6月2日保藏于武漢大學(xué)的中國典型培育物保藏中心，保藏號CCTCC NOM203045；1.2微生物液體下大量繁殖所用的培養(yǎng)基成分為5克酵母粉，150克大豆餅粉，5克魚粉，200克葡萄糖，水1000毫升，pH6～7；1.3微生物及其代謝產(chǎn)物在制成的粉劑、可濕性粉劑和顆粒劑中的重量百分比為30％～75％，菌劑的含水量小于5％。
2.按權(quán)利要求1所述方法制備的生物殺菌劑適用于防治三七根腐病的兩種主要病原菌Cylindrocarpon didynum和C.destructans。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治三七根腐病的生物菌劑的制備方法和應(yīng)用，屬生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。該生產(chǎn)方法的工序包括微生物菌種培養(yǎng)，微生物的大量繁殖及菌劑加工。本發(fā)明使用的微生物是側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacillus laterosporus)G4菌株。該菌株已于2003年6月2日武漢大學(xué)的中國典型培育物保藏中心，保藏號CCTCC NOM203045。利用本發(fā)明生產(chǎn)的菌劑對三七根腐病有很好的防治效果。本發(fā)明具有原料成本低，生產(chǎn)工藝先進(jìn)易行，菌劑質(zhì)量高、防治效果好等優(yōu)點。
文檔編號A01N63/04GK1631166SQ200410079548
公開日2005年6月29日 申請日期2004年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月4日
發(fā)明者莫明和, 張克勤, 黃英, 周薇, 田寶玉 申請人:云南大學(xué)