專利名稱：水產(chǎn)動物抗菌藥及其制備方法和喂藥方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種水產(chǎn)動物抗菌藥及其制備方法和喂藥方法。
背景技術：
目前，水產(chǎn)養(yǎng)殖中各類新病不斷出現(xiàn)，使得在水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中，需大量使用藥物對養(yǎng)殖水環(huán)境消毒、改良及水產(chǎn)養(yǎng)殖動物進行預防和治療，而在治療過程中，大劑量的藥物濃度，很容易造成水產(chǎn)養(yǎng)殖動物及養(yǎng)殖水環(huán)境中藥物殘留甚至嚴重超標，藥物的大量投放，還容易引起水體理化指標的改變，破壞水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的生長環(huán)境。如當前，在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)中，對細菌病的防治大多采用抗菌素為主的藥物治療方法，抗菌素對水產(chǎn)動物病害的防治的確起到相當大的作用。但近年來，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗菌素使用種類、劑量及頻度都有大幅度提高，如環(huán)丙沙星、諾氟沙星等醫(yī)用喹諾酮(qunolones)類等抗菌素已成為各種漁藥制劑中的主要成分，此外一些醫(yī)用的新型喹諾酮類藥物如氧氟沙星等也在養(yǎng)殖生產(chǎn)中大量使用。但在許多細菌中，一些與抗菌素抗性相關的移動基因可以轉(zhuǎn)移到其它細菌中，從而有可能導致與人類疾病相關的細菌也有可能對此類抗菌素產(chǎn)生耐藥性。同時使用不當也會造成藥物在水產(chǎn)品中的殘留，降低水產(chǎn)品質(zhì)量，對人類產(chǎn)生潛在威脅。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種使用安全、對水產(chǎn)動物的細菌性疾病具有治療和預防作用的水產(chǎn)動物抗菌藥及其制備方法和喂藥方法。
本發(fā)明的技術方案是一種水產(chǎn)動物抗菌藥，它含有噁喹酸、維生素C、淀粉。
一種水產(chǎn)動物抗菌藥的制備方法，它包括如下步驟(1)、將淀粉于105℃～110℃的溫度條件下烘干2小時，冷卻后過40目篩；(2)、按比例稱取噁喹酸和維生素C；(3)、取與噁喹酸和維生素C的總重量相等的淀粉，使得淀粉與噁喹酸、維生素C充分混合制成母粉；(4)、將母粉與剩余的淀粉再進行充分混合。
一種水產(chǎn)動物抗菌藥的喂藥方法，它包括如下步驟
(1)、在餌料中添加本藥物；(2)、將餌料投喂活體餌料魚；(3)、將活體餌料魚投喂水產(chǎn)動物。
噁喹酸(Qxolinic acid(OA))又名奧基索林酸，喹菌酮等，屬一代喹諾酮類，是我國推薦使用的水產(chǎn)專用抗菌素。噁喹酸殺菌范圍廣、殺菌力強，對大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、嗜血桿菌、葡萄球菌、孤菌、氣單胞菌、假單胞菌等均有強烈的抑菌和殺菌作用，其安全性高，無副作用，口服易吸收，組織穿透力強，幾乎完全從尿中排泄，與各類抗生素無交叉耐藥。噁喹酸對水產(chǎn)動物因細菌性感染引起疾病如豎鱗病、赤皮病、爛鰓、爛尾、淡水魚類細菌性敗血癥，鰻的愛德華氏菌病、弧菌病、赤鰭、潰瘍、赤點、爛尾、爛鰓，牛蛙的紅腿、腹水、腸炎、爛皮病，蝦、蟹的爛鰓、黑鰓、紅腿病、熒光病、甲殼附肢潰瘍病等，甲魚的白斑、底板出血、白板、腹甲紅腫、細菌性腸炎、腹水、爛頸尾等均有良好的療效。在殘留方面，噁喹酸在魚肉及魚皮內(nèi)的殘留量較少。
作為噁喹酸的主要輔劑的維生素C又稱抗壞血酸，屬于水溶性維生素。是魚類維持生理機能所必需的物質(zhì)。自從Kitamura等(1965)首次通過實驗證實魚類的正常生長需要攝人維生素C之后，更多的研究表明維生素C對魚類的繁殖、生長發(fā)育、抗病和存活率提高等方面有重要的作用。維生素C為魚類維持其正常的生長功能和生命活動所必需。在膠原蛋白的合成過程中維生素C作為脯氨酸羥化酶的輔酶，直接影響膠原蛋白的合成，參與細胞間質(zhì)的生成。有降低毛細血管的通透性、刺激凝血功能、增加對感染的抵抗作用，并參與解毒功能。用于各種急、慢性傳染病或其它疾病以增強抵抗力，病后恢復期、創(chuàng)傷愈合期的輔助治療。此外，在體內(nèi)幾種藥物的解毒反應中必須有維生素C存在，維生素C還可促進鐵的吸收，有益于造血功能。維生素C還參與體內(nèi)的氧化還原反應，參與葉酸、鈣等的代謝及類激素的合成。在水產(chǎn)動物病害防治方面，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，維生素C可影響魚類傷口的愈合速度，飼料中缺乏維生素C時，大馬哈魚出現(xiàn)椎前、眼損傷等癥狀；在溝鯰中也觀察到維生素C能增強其對細胞感染。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有下列優(yōu)點試驗報告如下樣品臨床試驗報告

抑菌試驗的報告一、試驗材料白色粉未狀的樣品；試驗菌株河蟹的氣單胞菌致病菌CL990909-3中華鱉溫和氣單胞菌致病菌TL97424嗜水氣單胞菌致病菌ATCC51208
淡水魚類細菌性敗血癥病原菌嗜水氣單胞菌BSK-10淡水魚類細菌性敗血癥病原菌嗜水氣單胞菌DF-30鰻弧菌鰻愛德華氏菌魚害粘球菌二、試驗方法試驗方法按農(nóng)業(yè)部《新漁藥臨床試驗技術規(guī)范》(暫行)和國家環(huán)保局等編著的《水和廢水監(jiān)測分析方法》及中的有關細菌學方法進行。
三、樣品對8株不同水產(chǎn)動物致病抑菌、殺菌濃度的測定培養(yǎng)基細菌培養(yǎng)基用肉汁胨培養(yǎng)基。
菌液的制備用接種環(huán)沾取純化的試驗菌株，接種到肉汁胨培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)18小時后，將菌液稀釋到200萬個細菌/ml。
測定方法取滅菌試管10支，再以無菌操作每管加滅菌生理鹽9ml(第1管)、5ml(第2-10管)。無菌操作吸取待測純噁喹酸稀釋液1ml入放第1管，混勻后吸取5ml放入第2管中，混勻后吸取5ml放入第3管中，以此作逐管稀釋第9管，混勻后吸取5ml棄去，第10管不加藥物作對照。
每管加稀釋好的菌液0.5ml，混勻后28℃培養(yǎng)。24小時后移取1ml至無菌培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24小時后肉眼觀察，含最小量尚呈不混蝕的試管所含藥物的濃度為最小抑菌濃度。試驗結(jié)果樣品對河蟹的氣單胞菌致病菌CL990909-3菌株的最小抑菌濃度為1.1mg/L。
樣品對中華鱉溫和氣單胞菌致病菌TL97424菌株的最小抑菌濃度1.8mg/L。
樣品對嗜水氣單胞菌致病菌ATCC51208菌株的最小抑菌濃度0.91mg/L。
樣品對淡水魚類細菌性敗血癥病原菌嗜水氣單胞菌BSK-10的最小抑菌濃度為0.91mg/L。
樣品對淡水魚類細菌性敗血癥病原菌嗜水氣單胞菌DF-30的最小抑菌濃度為2.1mg/L。
樣品對鰻弧菌的最小抑菌濃度為0.91mg/L。
樣品對鰻愛德華氏菌的最小抑菌濃度為0.91mg/L。
樣品對魚害粘球菌的最小抑菌濃度為1.82mg/L。
對淡水青蝦的急性毒性試驗一、試驗材料樣品、健康青蝦。
二、試驗方法在面積0.5m2、深0.5m的網(wǎng)箱內(nèi)飼養(yǎng)淡水青蝦40只，暫養(yǎng)7天后進行急性毒性試驗，試驗前三天停止喂食。試驗采用拌餌口服法，飼料投喂量為淡水青蝦體重的5％。
試驗前，將淡水青蝦飼料粉碎后，加入20％的魚粉和0.5％的飼料粘合劑，將適量的樣品拌入已粉碎的淡水青蝦飼料中，加水重新制成顆粒飼料并45干燥。藥物餌料中含有樣品分別為2、4、6、8和10g/Kg，按5％的投飼量計算，則相當于每公斤淡水青蝦每天攝入100、200、300、400和500mg樣品。
試驗時，每天投喂含樣品的藥餌一次，連續(xù)投喂四天后統(tǒng)計每只網(wǎng)箱內(nèi)淡水青蝦數(shù)量并計算成活率。同時設空白對照組。每24小時至少觀察三次，記錄死亡數(shù)，進行96小時觀察記錄。試驗期間的水溫為22±2℃，PH為7.50。
三、試驗結(jié)果各給藥組和對照組的淡水青蝦未出現(xiàn)大量死亡，對照組淡水青蝦的成活率為90％，100mg/Kg組成活率為95％；200mg/Kg組成活率為90％；300mg/Kg組成活率為97.5％；400mg/Kg組成活率為92.5％；500mg/Kg組成活率為90％。經(jīng)SPSS統(tǒng)計軟件分析，試驗組和對照組成活率無顯著差異，因此結(jié)果表明樣品對淡水青蝦的96小時LD50≥500mg/kg體重。結(jié)果見表表 對青蝦的急性毒性試驗

四、基本結(jié)論根據(jù)使用說明，樣品的使用劑量僅1mg/kg，而對青蝦的LD50≥500mg/kg，因此本產(chǎn)品的使用是安全的。
對鱖魚細菌性出血病的防治試驗一、材料與方法
1、試驗材料1.1試驗動物試驗用鱖魚體重為87.4克-112.9克，購自農(nóng)貿(mào)市場。試驗前先在水溫為25℃～28℃的室內(nèi)水泥池中暫養(yǎng)一周后，并隨機抽取五只鱖魚，對血液和肌肉、肝胰腺、心臟進行細菌分離，確認無細菌感染后進行試驗。
1.2試驗菌株鱖魚細菌性出血病的病原菌溫和氣單胞菌GY20010506菌株(由中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)中心分離)，接種于普通肉胨培養(yǎng)液中，25-27℃培養(yǎng)20-24小時的菌懸液備用。在進行魚體試驗時，先測菌株對河鱖魚的半致死量(LD50)，再以LD50的倍量腹腔注射接種魚體，注射的劑量為2000萬/只。
1.3樣品。
2、試驗方法2.1試驗分組飼料中添加劑量為2％的樣品，并以5％投餌量投喂餌料魚，再用7-8％的餌料魚投喂鱖魚。即餌料魚攝入樣品的量為0.100g/Kg試驗分三組，高劑量組，餌料魚口灌劑量為1.000g/Kg，將餌料魚去頭勻漿制成肉糜后，再以80g/Kg魚糜口灌鱖魚。使用劑量組，餌料魚口灌劑量為0.100g/Kg，再以80g/Kg魚糜口灌鱖魚。低劑量組，口灌劑量為0.010g/Kg，再以80g/Kg魚糜口灌鱖魚。同時每組再成分別鱖魚口灌魚糜給藥4小時后攻毒和攻毒2小時后口灌魚糜兩組，以評價本產(chǎn)品對鱖魚細菌性出血病的預防和治療效果。攻毒劑量為2×107CFU/尾。同時設口灌生理鹽水攻毒組和口灌生理鹽水空白對照組。
2.2試驗方法在試驗時，分別稱取0.500克、5.000克和50.00克的樣品，加水制成糊狀后，定容于250毫升，口灌劑量為每公斤鯽魚口灌20ml。使鯽魚攝入樣品的量分別為0.005g/Kg、0.050g/Kg、0.500g/Kg?？诠?0分鐘后，將鯽魚捕出，去除鱗片、頭部和鰭條，用組織勻漿機，以8000rpm勻漿5min，制成肉糜后，4℃保存。
在2M×3M網(wǎng)箱內(nèi)隨機飼養(yǎng)141.7～275.3克的鱖魚10只，暫養(yǎng)一周后開始試驗。將已勻漿的魚糜吸入10ml注射器，注射器連接硬質(zhì)膠管。將鱖魚從水池中撈取出，稱重后，從嘴器插入膠管約2cm，根據(jù)鱖魚的體重，分別灌入高中低三組含樣品的魚糜，使鱖魚攝入魚糜的量為80g/Kg。隔天口灌一次，口灌4天，同時設按口灌空白魚糜80g/Kg的攻毒組和空白對照組。每24小時至少觀察三次，記錄死亡數(shù)，進行觀察記錄7天。試驗期間水溫為25±1℃，PH為7.4。
二、試驗結(jié)果結(jié)果表明口灌樣品高劑量組中，口灌4小時后攻毒組鱖魚的成活率為100％，攻毒2小時后口灌組鱖魚的成活率為90％；使用組中，口灌4小時后攻毒組鱖魚的成活率為80％，攻毒2小時后口灌組鱖魚的成活率為80％；低劑量組中，口灌4小時后攻毒組鱖魚的成活率為50％，攻毒2小時后口灌組鱖魚的成活率為40％；口灌飼料攻毒組的死亡率為100％，口灌飼料空白組的成活率為100％。結(jié)果見下表表 對鱖魚細菌性出血病的防治效果

本發(fā)明對由氣單胞菌引起的鱖魚細菌性出血病有較好的防治作用，防治的有效率在80％左右，使用劑量是合理的。
藥物制劑的穩(wěn)定性測定一、試驗材料白色粉未狀樣品(噁喹酸的含量約為1％)。
儀器與藥品液相色譜儀系統(tǒng)，高速離心機；25ul和100ul的微量注射器；高效液相色譜分析用噁喹酸標準品(純度≥99％)，二氯甲烷、NaOH、磷酸氫二鉀為分析純；甲醇、磷酸為色譜純。
二、實驗方法色譜條件Alltech C18反相色譜柱(15mm×4mm，粒度5um)；流動相為甲醇∶稀磷酸(體積比為40∶60，pH2.5)，用0.45um微孔有機相過濾膜過濾，并超聲脫氣。流速1.0mL/min；檢測波長280nm；進樣體積10uL，保留時間為7～8min；檢測靈敏度0.01AUFS；最低檢出濃度0.010ug/ml。
標準曲線精密稱取樣品0.0500mg于50ml容量瓶中，加少量0.1mol/LNaOH溶解后，再加流動相稀釋至標線。分別取2.50、5.00、7.50、10.00、15.00、20.00ml于50ml容量瓶，用流動相稀釋至刻度，則樣品的濃度分別為0.05、0.10、0.1、0.2、0.3、0.4mg/ml，分別取10ul進樣，以峰面積(Y)對濃度(C)回歸，兩者線性關系良好，回歸方程C＝24536.58X+9719.24，r＝0.999樣品回收率測定精密稱取樣品6.670g(按7.5％生產(chǎn)標準，應含噁喹酸50mg)，置250ml燒杯中，加入甲醇20ml。振蕩10min，置具塞離心管中，高速離心機4℃、5000rpm離心15min，取上清，殘渣繼續(xù)加入甲醇20ml攪拌均勻后，繼續(xù)用按上述方法處理，離心后合并上清于50ml容量瓶定容。然后取10ml提取液置100ml容量瓶中，加流動相至標線，用0.45um濾膜過濾后，取10ul進樣，記錄峰面積并計算噁喹酸的回收率。見下表

三、藥物制劑穩(wěn)定性考察漁用藥物制劑穩(wěn)定性考察參照衛(wèi)生部藥政局《新藥臨床前研究指導原則匯編》有關加速試驗進行。
由于本產(chǎn)品的主劑為噁喹酸，而輔劑為高穩(wěn)維生素C和淀粉，因主劑與輔劑間不會產(chǎn)生氧化、水解等降解反應。因此將三個批次的樣品分裝于棕色玻璃瓶中，置于40±2℃，相對濕度為75±5％的培養(yǎng)箱中，隔5、15、30、60、90天取樣，按樣品回收率測定中的方法提取樣品中的噁喹酸，用高效液相色譜法測定制劑中噁喹酸的含量，結(jié)果見下表

三個批次的樣品中有效成份—噁喹酸在進行加速試驗前的平均含量為9.975μg/ml，在90天加速試驗后的平均含量為9.800μg/ml，平均減少1.77％。加速試驗結(jié)果表明，該藥物制劑穩(wěn)定性較好，有效期暫訂為兩年。
四、基本結(jié)論三批次的樣品的平均回收率為99.75％，表明樣品中有效成分的含量符合標準；在40±2℃，相對濕度為75±5％條件下保存三個月后的平均回收率為98.00％，降低1.77％。因此本發(fā)明較為穩(wěn)定，根據(jù)其穩(wěn)定性暫訂有效期為二年。
具體實施例方式
一種水產(chǎn)動物抗菌藥，它含有噁喹酸、維生素C、淀粉，所述的維生素C通常采用穩(wěn)定型維生素C。所述的噁喹酸的重量配比為5％～10％，所述的維生素C的重量配比為1％～4％，所述的淀粉的重量配比為88％～92％。
更進一步的配方是所述的噁喹酸的重量配比為7％～8％，所述的維生素C的重量配比為2％～3％，所述的淀粉的重量配比為89.5％～90.5％。
一種水產(chǎn)動物抗菌藥的制備方法，它包括如下步驟，(1)、將淀粉于105℃～110℃的溫度條件下烘干2小時，冷卻后過40目篩；(2)、按比例稱取噁喹酸和維生素C；(3)、取與噁喹酸和維生素C的總重量相等的淀粉，使得淀粉與噁喹酸、維生素C充分混合制成母粉；(4)、將母粉與剩余的淀粉再進行充分混合。
在步驟(2)中所稱取的噁喹酸的純度含量大于或等于98％。
一種水產(chǎn)動物抗菌藥的喂藥方法，它包括如下步驟，(1)、在餌料中按重量配比2％添加本藥物；
(2)、按重量配比5％左右將餌料投喂餌料魚；(3)、按重量配比7％～8％將餌料魚投喂鱖魚等水產(chǎn)動物。
鱖魚在患有腸炎、嚴重爛鰓和出血病時，需服用藥餌。但鱖魚是捕食活魚的，藥餌需先由飼料魚吃進肚中，再由鱖魚捕食，屬間接服藥法。按飼料魚攝食量一般為魚體重的6-7％，鱖魚捕食飼料魚的量一般為體重的10％，再按藥物的有效劑量設計出藥方配方。故對于鱖魚等水產(chǎn)動物，本發(fā)明采用上述喂藥方法。
本發(fā)明的水產(chǎn)動物抗菌藥的主要優(yōu)點可通過試驗具體證明，其最小抑菌濃度較小，使用安全，對由氣單胞菌引起的鱖魚細菌性出血病有較好的防治作用，防治的有效率在80％左右，且該抗菌藥物制劑的有效成分的穩(wěn)定性較好。
權利要求
1.一種水產(chǎn)動物抗菌藥，其特征在于它含有噁喹酸、維生素C、淀粉。
2.根據(jù)權利要求1所述的水產(chǎn)動物抗菌藥，其特征在于所述的噁喹酸的重量配比為5％～10％，所述的維生素C的重量配比為1％～4％，所述的淀粉的重量配比為88％～92％。
3.根據(jù)權利要求2所述的水產(chǎn)動物抗菌藥，其特征在于所述的噁喹酸的重量配比為7％～8％，所述的維生素C的重量配比為2％～3％，所述的淀粉的重量配比為89.5％～90.5％。
4.根據(jù)權利要求1所述的水產(chǎn)動物抗菌藥，其特征在于所述的維生素C為穩(wěn)定型維生素C。
5.一種水產(chǎn)動物抗菌藥的制備方法，其特征在于它包括如下步驟，(1)、將淀粉于105℃～110℃的溫度條件下烘干2小時，冷卻后過40目篩；(2)、按比例稱取噁喹酸和維生素C；(3)、取與噁喹酸和維生素C的總重量相等的淀粉，使得淀粉與噁喹酸、維生素C充分混合制成母粉；(4)、將母粉與剩余的淀粉再進行充分混合。
6.根據(jù)權利要求5所述的水產(chǎn)動物抗菌藥的制備方法，其特征在于在步驟(2)中所稱取的噁喹酸的純度含量大于或等于98％。
7.一種水產(chǎn)動物抗菌藥的喂藥方法，其特征在于它包括如下步驟，(1)、在餌料中添加本藥物；(2)、將餌料投喂活體餌料魚；(3)、將活體餌料魚投喂水產(chǎn)動物。
全文摘要
一種水產(chǎn)動物抗菌藥，它含有噁喹酸、維生素C、淀粉。該抗菌藥在特殊的工藝中制得，并且針對鱖魚等水產(chǎn)動物采用特殊的方法喂藥。通過臨床試驗證明，該水產(chǎn)動物抗菌藥的最小抑菌濃度較低，使用安全，對由氣單胞菌引起的鱖魚細菌性出血病有較好的防治作用，防治的有效率在80％左右，且該抗菌藥物制劑的有效成分的穩(wěn)定性較好。
文檔編號A23K1/16GK1660084SQ20041010322
公開日2005年8月31日 申請日期2004年12月30日 優(yōu)先權日2004年12月30日
發(fā)明者徐建春, 惠永樂, 孫濤, 譚云娥, 鮑俊杰 申請人:吳江市魚病防治中心