專(zhuān)利名稱(chēng)：模擬神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動(dòng)物模型的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及模擬神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動(dòng)物模型。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種模擬神經(jīng)系統(tǒng)疾病的非人類(lèi)動(dòng)物模型，和制備動(dòng)物模型的方法與組合物，以及使用它的方法。通過(guò)給動(dòng)物灌注Aβ并聯(lián)合至少一種促氧化化合物和至少一種抗氧化劑抑制劑獲得這種模擬神經(jīng)系統(tǒng)疾病的非人類(lèi)動(dòng)物。另外，該動(dòng)物還可以灌注一種磷酸酶抑制劑和/或一種促炎化合物。產(chǎn)生的非人類(lèi)哺乳動(dòng)物在大腦中發(fā)展神經(jīng)系統(tǒng)疾病。該動(dòng)物模型可以用于藥劑的篩選過(guò)程，而這可以用于開(kāi)發(fā)針對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防、治療和/或診斷方法。
在一個(gè)實(shí)施例方案，通過(guò)誘導(dǎo)腦組織的組織病理學(xué)改變和記憶受損，可以開(kāi)發(fā)一種AD的藥理學(xué)動(dòng)物模型，這在腦中產(chǎn)生了一個(gè)類(lèi)似于推測(cè)出現(xiàn)在AD腦中的微環(huán)境。
附圖簡(jiǎn)述


圖1A是由各組大鼠獲得的Morris水迷宮得分的柱狀圖。結(jié)果以平均值±SD(n＝8)示出。＊＊＊相對(duì)于對(duì)照組p＜0.001。
圖1B是大鼠CSF中磷酸化Tau水平的柱狀圖，平均值±SD(n＝6-8)。＊＊＊相對(duì)于對(duì)照組p＜0.001。
圖2A是對(duì)照組的海馬中的淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)Campbell-Switzer染色的顯微照片(×40)。激活的吞噬Aβ42的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞(黃色箭頭)、神經(jīng)炎斑塊(紅色箭頭)、含有NFT的神經(jīng)元(藍(lán)色箭頭)、血管淀粉樣變性(黑色箭頭)(適用于圖2中所有的顯微照片)。
圖2B是FAB組的海馬中的淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)Campbell-Switzer染色的顯微照片(×40)。
圖2C-2E是FAB組的CA1中的淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)Campbell-Switzer染色的顯微照片(×400)。
圖2F是FAB組的CA2中的淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)Campbell-Switzer染色的顯微照片(×400)。
圖2G是FAB組的CA3中的淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)Campbell-Switzer染色的顯微照片(×400)。
圖2H-2I是FAB組的齒狀回中的淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)Campbell-Switzer染色的顯微照片(×400)。
圖2J是對(duì)照組的扣帶回皮質(zhì)中的淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)Campbell-Switzer染色的顯微照片(×40)。
圖2K是FAB組的扣帶回皮質(zhì)中的淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)Campbell-Switzer染色的顯微照片(×40)。
圖2L是對(duì)照組的顳葉皮質(zhì)中的淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)Campbell-Switzer染色的顯微照片(×400)。
圖2M-2O是FAB組的顳葉皮質(zhì)中的淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)Campbell-Switzer染色的顯微照片(×400)。
圖2P是FAB組的頂葉皮質(zhì)中的淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)Campbell-Switzer染色的顯微照片(×1000)圖3A-3D是對(duì)照大鼠(3A和3C)和FAB大鼠(3B和3D)中的磷酸化Tau免疫染色的顯微照片。相對(duì)于對(duì)照(3A和3C)，在CA1(3B)和齒狀回(3D)神經(jīng)元(黃色箭頭)中發(fā)現(xiàn)了免疫反應(yīng)性的磷酸化Tau。
圖3E-3H是對(duì)照大鼠(3E和3G)和FAB大鼠(3F和3H)中的Aβ42免疫染色的顯微照片。相對(duì)于對(duì)照(3E和3G)，F(xiàn)AB大鼠在CA1(3F)、CA3(3H)和扣帶回皮質(zhì)(3F)中顯示出強(qiáng)的Aβ42免疫反應(yīng)性。
圖4A-4C是對(duì)照大鼠(4A)和FAB大鼠(4B和4C)中活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP免疫染色的顯微照片。
圖5A-5H是通過(guò)De Olmos氨基銅銀(amino cupric silver)和甲酚紫染色描述神經(jīng)元死亡的顯微照片。相對(duì)于對(duì)照大鼠(5A)，用氨基銅銀方法，死亡細(xì)胞在FAB大鼠的CA1、CA2、CA3和齒狀回(5B)區(qū)域染成黑色。神經(jīng)元的喪失通過(guò)甲酚紫染色確認(rèn)，如相對(duì)于對(duì)照鼠(5C)，在FAB大鼠的CA1、CA3和齒狀回嵴(5D)中觀察到的染色濃度降低所示。重要的神經(jīng)元喪失也可以在FAB大鼠的顳皮質(zhì)中觀察到，如相對(duì)于對(duì)照(5E和5G)兩種不同的染色方法(5F和5H)所示。
詳細(xì)描述本發(fā)明涉及一種非人類(lèi)動(dòng)物模型，優(yōu)選猴子、狗或嚙齒類(lèi)動(dòng)物，例如小鼠或大鼠，或者其它動(dòng)物，它們天生能夠進(jìn)行學(xué)習(xí)和記憶測(cè)試，以及用于制備和使用這些動(dòng)物的方法和組合物。該動(dòng)物被共同灌注Aβ和至少一種促氧化化合物以及至少一種抗氧化劑抑制劑，其能夠在該動(dòng)物腦中引發(fā)見(jiàn)于人類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的生理病理學(xué)改變。如這里所使用的，Aβ指Aβ42、Aβ42的肽片段，例如Aβ1-40或Aβ24-35，例如，或者模擬淀粉樣蛋白的肽模擬物(peptidomimetics)。另外，該動(dòng)物也可以灌注一種磷酸酶抑制劑和/或一種促炎化合物。灌注后，該動(dòng)物在短時(shí)間內(nèi)，通常在30天內(nèi)發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種篩選化合物的方法，該化合物在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防、治療和/或診斷方法的開(kāi)發(fā)中是有用的。感興趣的化合物可以給灌注了的動(dòng)物施用以評(píng)估該化合物在逆轉(zhuǎn)一種神經(jīng)性紊亂中的有效性。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“治療”或“治療性的”指任何與涉及到受檢者的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括但不限于AD、神經(jīng)毒性或β-淀粉樣蛋白誘發(fā)的神經(jīng)毒性的疾病或紊亂相關(guān)的紊亂或疾病的治療，還包括但不限于預(yù)防該紊亂或疾病出現(xiàn)于傾向于患該紊亂或疾病但還沒(méi)有診斷為患有該紊亂或疾病的受檢者；抑制該紊亂或疾病，例如，阻止該紊亂或疾病的發(fā)展；緩解該紊亂或疾病，例如，引起該紊亂或疾病消退；或緩解由該疾病或紊亂引起的狀況，例如，消除該疾病或紊亂的癥狀。如同這里使用的，“神經(jīng)系統(tǒng)疾病”意欲包括上述所有的紊亂和/或疾病。
術(shù)語(yǔ)“預(yù)防”，與涉及受檢者神經(jīng)系統(tǒng)疾病的疾病或紊亂相關(guān)，意思是如果還沒(méi)有發(fā)生，就沒(méi)有疾病紊亂發(fā)展，或如果該疾病或紊亂已經(jīng)發(fā)生，則紊亂或疾病沒(méi)有進(jìn)一步發(fā)展。
除非另外限定，這里使用的所有技術(shù)和科學(xué)名詞具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的相同的意義。
為了誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可以直接在非人類(lèi)動(dòng)物的左腦室中用一種溶液灌注四周，該溶液只包含Aβ或者與促氧化化合物和抗氧化劑抑制劑聯(lián)合。Aβ42是AD中主要涉及的肽。如上所提到的，例如Aβ42的肽片段，例如Aβ1-40或Aβ24-35，或者模擬淀粉樣蛋白的肽模擬物也可用于本發(fā)明。聯(lián)合Aβ使用以引發(fā)見(jiàn)于人類(lèi)AD的生理病理學(xué)改變的促氧化化合物可以包括，例如，硫酸亞鐵(FeSO4)、硫酸銅、硫酸鈷、硫酸錳和硫酸鋅。硫酸亞鐵是促氧化的并且是神經(jīng)炎斑塊的一種組份。另外，輔助引發(fā)見(jiàn)于人類(lèi)AD的生理病理學(xué)改變的腦抗氧化防御的抑制劑可以包括例如buthionine sulfoximine(BSO)。buthioninesulfoximine是谷胱甘肽合成的一種抑制劑，可以用于降低腦的抗氧化防御。另外，任何能夠降低腦中抗氧化防御的化學(xué)或藥理學(xué)試劑都可以模擬BSO的作用，并且因此是動(dòng)物模型中所感興趣的。使用FeSO4和BSO的一個(gè)目的是產(chǎn)生有利于Aβ毒性的條件。另外，除了給予Aβ，也可以給予一種促氧化化合物和一種抗氧化劑抑制劑、磷酸酶抑制劑和促炎化合物。例如，該磷酸酶抑制劑可以包括岡田酸、1-正-岡田酮(1-nor-okadaone)、反丙烯除蟲(chóng)菊酯、花萼海綿誘癌素A(calycullin A)、斑蝥酸、斑蝥素、氯氰菊酯、溴氰菊酯(delatamethrin)、草藻滅、草藻滅硫代酸酐(endothall thioanhydride)、氰戊菊酯、okadol、氯菊酯、氧化苯砷(phenylarsine oxide)、焦磷酸鹽或酯、氟化鈉和釩酸鹽。岡田酸抑制Tau蛋白的去磷酸化，導(dǎo)致這種蛋白的一種過(guò)磷酸化狀態(tài)，并且接著形成NFT，即AD的第二種組織學(xué)特征。例如，該促炎化合物可以包括TNF-α、IL-6和IL-1b。TNF-α再現(xiàn)在AD中證明的炎性過(guò)程。上述的這些化合物可以分開(kāi)或一起和同時(shí)或順序性共同給予。并且，鋁可以用于誘發(fā)阿爾茨海默病樣生理病理學(xué)。這些化合物以“藥理學(xué)有效劑量”使用。這意味著給予的化合物的濃度是這樣的，即在聯(lián)合給藥時(shí)，在給予該化合物期間，送遞的化合物能夠達(dá)到AD誘發(fā)水平。
在給動(dòng)物灌注上述化合物的聯(lián)合后，可以通過(guò)一種適于物種的神經(jīng)行為測(cè)試對(duì)動(dòng)物進(jìn)行評(píng)估以確定神經(jīng)系統(tǒng)疾病的出現(xiàn)。例如，對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)/探究行為的研究是一種評(píng)價(jià)神經(jīng)心理學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法。(File和Wardill，(1975)Psychopharmacologia(Berl)4453-59；Loggi等，(1991)Pharmacol.Biochem.Behav.38817-822)。例如，對(duì)于小鼠，使用了“角指數(shù)”(CI)測(cè)試。這是一種快速且簡(jiǎn)單的神經(jīng)行為測(cè)試以篩選具有大腦神經(jīng)病理學(xué)跡象的動(dòng)物。也對(duì)該動(dòng)物的神經(jīng)病理學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)。為了進(jìn)行CI測(cè)試，抓住測(cè)試小鼠的尾巴，將其置于一個(gè)潔凈籠子的中央，該籠子在其它方面與小鼠的家籠相同。在它被置于那個(gè)籠子中后第一個(gè)30秒內(nèi)該小鼠嗅測(cè)試籠角的次數(shù)被記錄為CI。在獲得CI標(biāo)準(zhǔn)前明顯垂死的動(dòng)物和發(fā)展為可見(jiàn)的癲癇發(fā)作的動(dòng)物也被診斷為得病。為了控制日間活動(dòng)的差異，所有動(dòng)物要在14:30和18:30之間的時(shí)間內(nèi)測(cè)試。
對(duì)大鼠，可以使用Morris水迷宮測(cè)試(Morris，(1984)J.Neurosci.Meth.11:47)。對(duì)小鼠可以使用這個(gè)測(cè)試的一種改良形式。除了Morris水迷宮測(cè)試，可以使用Y-迷宮測(cè)試以研究空間記憶缺失，使用曠野測(cè)試以檢測(cè)最初的回避反應(yīng)(neophobic response)和隨后的探究行為，以及自發(fā)的非樣品匹配測(cè)試評(píng)價(jià)自發(fā)的客觀認(rèn)知(Ennaceur和Delacour，1988 Aggleton，1993)。
特別是要觀察已知受感興趣的癥狀影響的腦區(qū)域的變化。當(dāng)感興趣的疾病是AD時(shí)，觀察的區(qū)域包括皮質(zhì)一邊緣的(cortico-limbic)區(qū)域、扁桃體、嗅球，并且監(jiān)測(cè)的狀況包括膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)元死亡、NFT形成、膽堿能神經(jīng)傳遞受損、血液中神經(jīng)類(lèi)固醇的濃度和腦脊液、腦結(jié)構(gòu)中基因表達(dá)的改變、葡萄糖攝取和利用的變化以及Aβ斑的形成。但是，在壽命不長(zhǎng)的動(dòng)物品系中，并非所有的與特定疾病相關(guān)的行為和/或病理學(xué)改變都可以觀察到。這種動(dòng)物物種的短壽命未必會(huì)掩蓋較遲發(fā)癥狀的出現(xiàn)。涉及用于回答這個(gè)問(wèn)題的測(cè)試與那些已經(jīng)使用的或計(jì)劃用于表現(xiàn)該模型自身特征的測(cè)試相同。
本發(fā)明的動(dòng)物可以用于篩選感興趣的化合物，例如，認(rèn)為能夠預(yù)防和/或治療AD的抗氧化劑如維生素E或拉扎洛依?？梢越o予動(dòng)物感興趣的化合物，并且與未處理的動(dòng)物相比，降低的發(fā)病率或延遲的神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)作都被視為一種保護(hù)性指標(biāo)。優(yōu)選使用的指標(biāo)是那些能夠在活動(dòng)物中檢測(cè)到的，如學(xué)習(xí)和記憶測(cè)試中行為的變化。當(dāng)該動(dòng)物死亡或被處死時(shí)，該有效性可以通過(guò)對(duì)病理學(xué)改變的作用進(jìn)行確認(rèn)。該動(dòng)物進(jìn)一步可以用于篩選感興趣的認(rèn)為能夠改善或治療AD的化合物。有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動(dòng)物用感興趣的物質(zhì)進(jìn)行治療，并且與有神經(jīng)系統(tǒng)疾病的未治療的動(dòng)物相比，延遲死亡，或神經(jīng)行為、神經(jīng)膠質(zhì)增生、或葡萄糖攝取/利用的改善均被視為改善或治愈的一種表現(xiàn)。
通過(guò)使該動(dòng)物暴露于該化合物或情況，并把神經(jīng)行為的衰退、早亡、神經(jīng)膠質(zhì)增生和葡萄糖攝取/利用的減少確定為該測(cè)試材料或情況誘發(fā)AD的能力的指標(biāo)，本發(fā)明的動(dòng)物也可以用于篩選一種化合物或測(cè)試一種情況，例如被疑為加速或引發(fā)AD的氧化劑或腦損傷。通過(guò)使動(dòng)物暴露于一種疑為引發(fā)AD的化合物或情況并評(píng)價(jià)該治療性藥劑的作用，該方法可以進(jìn)一步包括篩選治療性藥劑。
本發(fā)明的動(dòng)物可以進(jìn)一步用于表征和明確可能感興趣的開(kāi)發(fā)一種診斷方法的參數(shù)，該診斷方法適于診斷受檢者中的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。該動(dòng)物可以用于檢測(cè)液體、組織等中的變化，這可以用于開(kāi)發(fā)一種人類(lèi)中的診斷分析。在表明認(rèn)知受損的癥狀出現(xiàn)之前，在早期檢測(cè)的情況中這可能特別重要。
基于這里的描述，相信本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以最充分地利用本發(fā)明。這里列舉的所有公開(kāi)內(nèi)容都整體引入作為參考。因此下文的特定實(shí)施例僅作為示例性解釋?zhuān)⒎菍?duì)以任何方式公開(kāi)的其它內(nèi)容進(jìn)行限制。
實(shí)施例I-在非人類(lèi)動(dòng)物中誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病。
動(dòng)物在隨意食用食物和水的一個(gè)自然晝夜循環(huán)后，重300-325克的Long-Evans雄性大鼠被裝進(jìn)籠子。
Morris水迷宮程序手術(shù)前，在一個(gè)黑色水罐(直徑200cm)中用標(biāo)準(zhǔn)Morris空間導(dǎo)航任務(wù)訓(xùn)練大鼠。用與水互溶的無(wú)毒白漆(CrayolaInc.)使得該水不透明。把大鼠放入四個(gè)不同的隨機(jī)指定的起始位置并訓(xùn)練去尋找一個(gè)在水罐中心固定位置的看不見(jiàn)的平臺(tái)(直徑20cm)。該水溫約24℃。試驗(yàn)持續(xù)到大鼠發(fā)現(xiàn)該平臺(tái)或直到120秒過(guò)去。如果大鼠在120秒內(nèi)沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該平臺(tái)，就把它在平臺(tái)上放20秒，然后移出該水罐。連續(xù)四天訓(xùn)練大鼠，每天四次試驗(yàn)，連續(xù)的試驗(yàn)間隔30分鐘。在第五天進(jìn)行手術(shù)過(guò)程。在四周灌注期結(jié)束時(shí)再次對(duì)大鼠進(jìn)行記憶保留測(cè)試。
手術(shù)過(guò)程麻醉的大鼠(equitesin，3ml/kg，i.p.)被放置在一個(gè)立體定位的框架上。使用電極顯微操作器，把滲透微泵(DurectCorp.，Cupertino，CA)的出口以坐標(biāo)D＝3.4mm、L＝1.4mm和AP＝0.92mm植入前鹵前的左腦室中。把滲透泵的罐插入在大鼠背部中肩胛區(qū)域內(nèi)的一個(gè)皮下袋中。手術(shù)后，把大鼠放在一個(gè)加熱的毯子上進(jìn)行復(fù)蘇。在整個(gè)過(guò)程中，監(jiān)測(cè)體溫并保持穩(wěn)定在37℃。
首先，使用一種洗滌液(NaCl 8g/l，葡萄糖4g/l，蔗糖8g/l，氯化鈣0.23g/l，無(wú)水二甲胂酸鈉0.25g/l，溶于去離子水)，其次，使用用于固定的二甲基胂酸鹽緩沖液(蔗糖40g/l，多聚甲醛40g/l，無(wú)水二甲胂酸鈉10.72g/l，溶于去離子水)對(duì)大鼠進(jìn)行心內(nèi)灌注，四周后摘除腦，大腦被儲(chǔ)存在用于固定的二甲基胂酸鹽緩沖液中直到進(jìn)行處理。
灌注如表1中提供的，根據(jù)滲透微泵水罐內(nèi)包含的溶液的成分將大鼠分成6組。組I作為對(duì)照組且僅接受人造腦脊髓液(“CSF”)。
表1
免疫組織化學(xué)為了處理用于免疫組化和染色，十六個(gè)腦被立即包埋在凝膠塊中并切割成40μm厚的切片(Neurosciences Associates，Knoxville，TN)。40μm厚的腦切片用不同的第一抗體處理識(shí)別磷酸化的Ser202的抗磷酸化Tau蛋白(BioSource International，Inc.，Camarillo，CA)、針對(duì)活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞的抗-GFAP(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)、特異性識(shí)別肽C末端第33-42個(gè)氨基酸的抗Aβ42(Signet Laboratories，Inc.，Dedham，MA)和針對(duì)活化的小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的抗-CD11b(克隆OX42)(Novus Biologicals，Inc.)。
ELISA使用ELISA試劑盒INNOTESTTM(Innogenetics，Belgium)檢測(cè)CSF中的高磷酸化的Tau蛋白。
染色連續(xù)的40μm厚的腦切片用(1)用含水的固定介質(zhì)固定前用0.5％、pH＝3.7的甲酚紫染色10分鐘；(2)De Olmos氨基銅銀染色；和(3)Campbell-Switzer銀染色。甲酚紫染色神經(jīng)元中的尼氏體和細(xì)胞核。當(dāng)神經(jīng)元死亡時(shí)尼氏體丟失，導(dǎo)致染色減少或缺乏。用De Olmos氨基銅銀染色，死亡神經(jīng)元的細(xì)胞體、樹(shù)突、軸突和突觸末端顯示染成黑色。Campbell-Switzer銀染色特異性顯示神經(jīng)炎斑塊和NFT(Neuroscience Associate，Knoxville，TN)(Switzer III等.，美國(guó)專(zhuān)利No.5,192,688(1993))。
統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用單因素方差分析，隨后使用多重比較Dunnett檢驗(yàn)對(duì)Morris水迷宮數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果僅給予Aβ42不足以誘發(fā)記憶損傷和CSF中磷酸化Tau蛋白的出現(xiàn)，即人類(lèi)AD的充分鑒定的指標(biāo)。(Green A.J.E.阿爾茨海默病和克-雅二氏病診斷中的來(lái)自腦的腦脊液蛋白。Neuropathol.Appl.Neurobiol.28，427-440(2002)；Mulder C.，et al.與阿爾茨海默病的病理機(jī)制相關(guān)的CSF指標(biāo)。J.Neural.Transm.109，1491-1498(2002))。這些數(shù)據(jù)也質(zhì)疑Aβ42和淀粉樣蛋白生成假說(shuō)為AD的全部原因。
將二價(jià)鐵加入灌注溶液中，因?yàn)殍F是神經(jīng)炎斑塊的一種組份(Lovell M.A，等.，阿爾茨海默病老年斑中的鐵和鋅。J.Neurol.Sci.158(1)，47-52(1998))，并且它的出現(xiàn)是造成大腦中類(lèi)固醇形成改變的原因，從而改變組織中的內(nèi)分泌平衡的原因。(Brown R.C.，等.阿爾茨海默病病理學(xué)中氧化應(yīng)激介導(dǎo)的DHEA形成。Neurobiol.Aging 24(1)，57-65(2003))。然而，具有二價(jià)鐵的Aβ42對(duì)動(dòng)物記憶的影響并不顯著，且不能在腦脊液內(nèi)誘發(fā)磷酸化Tau蛋白的出現(xiàn)(
圖1B)。
Aβ42/二價(jià)鐵溶液作用的缺乏通過(guò)降低腦抗氧化防御得以矯正，并且隨后誘發(fā)氧化應(yīng)激。這可以通過(guò)向Aβ42/二價(jià)鐵溶液中添加buthionine sulfoximine(BSO)，一種谷胱甘肽合成的抑制劑獲得。在Morris水迷宮測(cè)試中，灌注了Fe2+-Aβ42-BSO(FAB)的大鼠表現(xiàn)出明顯增長(zhǎng)的找到平臺(tái)所經(jīng)歷的時(shí)間，表明記憶處理的改變(
圖1A)。FAB誘發(fā)的記憶損傷伴隨著CSF中高磷酸化Tau蛋白濃度的顯著增加(
圖1B)，恰巧復(fù)制出已經(jīng)對(duì)AD患者所描述的。(Green和Mulder等.，同上)。如在人類(lèi)，該參數(shù)可以用于診斷和評(píng)估候選藥物的活性。另外，該記憶損傷與前面通過(guò)各種組織學(xué)方法產(chǎn)生的AD樣組織學(xué)改變相關(guān)。灌注一個(gè)月后，大部分FAB大鼠在海馬的CA1區(qū)域(圖2C-2E)形成了神經(jīng)炎斑塊，眾所周知該區(qū)域是一個(gè)對(duì)Aβ42毒性高度敏感的區(qū)域，如同Campbell-Switzer銀染法所揭示的。也可以在海馬的CA2和CA3區(qū)域(分別是圖2F和2G)，以及扣帶回和顳皮質(zhì)(分別是圖2K和2M-2O)看到斑塊。使用一種特異性抗Aβ42的C-末端(第33-42個(gè)氨基酸)的抗體進(jìn)一步確定了這些腦區(qū)域中Aβ42的出現(xiàn)(圖3E-3H)。此外，特異性的Campbell-Spitzer染色證實(shí)了海馬中的包含Aβ42的吞噬性小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元內(nèi)的淀粉樣變性。
與CSF中高磷酸化Tau蛋白水平升高相一致，在海馬的不同結(jié)構(gòu)中FAB大鼠表現(xiàn)出強(qiáng)的NFT染色，如同Campbell-Switzer染色(圖2A-2P)所表明的及免疫染色(圖3A-3D)所證實(shí)的。包含NFT的神經(jīng)元也可在頂葉和扣帶回皮質(zhì)(分別是圖2P、2J和2K)中觀察到(Sigurdsson E.M.，等，向幼年Fischer大鼠扁桃體內(nèi)雙側(cè)注射淀粉樣蛋白-β25-35行為、神經(jīng)化學(xué)和時(shí)間依賴(lài)性組織病理學(xué)效應(yīng)。Neurobiol.Aging 18(6)，591-608(1997))，這表明了Aβ42誘發(fā)NFT形成的能力。
只有與一種重要的氧化應(yīng)激相關(guān)聯(lián)時(shí)Aβ42才在年輕成年大鼠腦中誘發(fā)NFT形成的發(fā)現(xiàn)至少部分重現(xiàn)了老齡腦中的顱內(nèi)狀況。(Floyd R.A.& HensleyK.腦老化中的氧化應(yīng)激神經(jīng)變性疾病治療的意義。Neurobiol.Aging 23，795-807(2002))。AD的生理病理學(xué)具有一個(gè)與血管性癡呆中所描述的相似的血管成份。(De La Torre J.C.阿爾茨海默病發(fā)病的血管基礎(chǔ)。Ann.N.Y.Acad.Sci.977，196-215(2002)；Miyakawa T.阿爾茨海默病的血管病理學(xué)。Ann.N.Y.Acad.Sci.977，303-305(2002))。這種血管成份可以用于該病的預(yù)后和診斷。已經(jīng)在死后AD人類(lèi)腦標(biāo)本的脈管系統(tǒng)中描述了血管淀粉樣蛋白沉積。但是，表達(dá)高水平神經(jīng)炎斑塊的轉(zhuǎn)基因小鼠并不形成血管淀粉樣變性。(Janus C.(2000)；Janus C.&Westaway D.(2001))。與轉(zhuǎn)基因相反，F(xiàn)AB模型在顳皮質(zhì)中出現(xiàn)血管淀粉樣變性，如Campbell-Switzer染色所示(圖2M-2O)，進(jìn)一步加強(qiáng)了這種模型的有效性。
在海馬的CA1、CA3和齒狀回區(qū)域內(nèi)(圖2C-E、2G、2H-2I和4B-4C)，大部分在神經(jīng)炎斑塊的臨近區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)的大量星形膠質(zhì)細(xì)胞增生(astrogliosis)和小膠質(zhì)細(xì)胞增生(microgliosis)反映了在FAB灌注的大鼠腦中出現(xiàn)的一種重要炎性過(guò)程。在FAB灌注的大鼠腦中描述的這些組織病理學(xué)改變伴隨著重要的通過(guò)氨基銅銀和甲酚紫染色檢測(cè)到的神經(jīng)元死亡(圖5A-5H)。盡管也能在CA3區(qū)域和扣帶回皮質(zhì)內(nèi)觀察到死亡神經(jīng)元體，神經(jīng)元死亡主要出現(xiàn)在CA1海馬區(qū)域內(nèi)。
提供的數(shù)據(jù)表明向年輕成年大鼠的左腦室中連續(xù)四周灌注一種包含淀粉樣蛋白生成肽Aβ42、促氧化陽(yáng)離子Fe2+和谷胱甘肽合成抑制劑BSO，具有產(chǎn)生見(jiàn)于AD中的記憶喪失、CSF中磷酸化Tau蛋白水平升高以及包括神經(jīng)元喪失的組織病理學(xué)表現(xiàn)的能力。因此，F(xiàn)AB大鼠模型提供了一種反映AD病理學(xué)的動(dòng)物模型，利于理解參與該病發(fā)作和進(jìn)展的分子機(jī)制，且是一個(gè)用于快速篩選診斷、預(yù)防和治療AD的新方法的有用工具。
基于上述概念的FAB溶液的任何改變和添加也包含在本發(fā)明之內(nèi)。
實(shí)施例2-篩選預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。本發(fā)明的動(dòng)物可以用于測(cè)試化合物賦予抗神經(jīng)系統(tǒng)疾病，例如AD的發(fā)生的保護(hù)能力。表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動(dòng)物用一種測(cè)試化合物處理，與表現(xiàn)出該神經(jīng)系統(tǒng)疾病的未處理的對(duì)照動(dòng)物平行。處理過(guò)的動(dòng)物中相對(duì)低的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病率被視為一種保護(hù)性指標(biāo)。分析處理過(guò)的和未處理過(guò)的動(dòng)物的學(xué)習(xí)/探究/運(yùn)動(dòng)行為減少(CI測(cè)試)，以及2-脫氧葡萄糖的攝取/利用減少、神經(jīng)元的死亡、膽堿能神經(jīng)傳遞受損、神經(jīng)炎斑塊、NFT形成和腦皮質(zhì)一邊緣結(jié)構(gòu)中肥大的膠質(zhì)細(xì)胞增生。為了確定治療是否能夠預(yù)防或延遲疾病的發(fā)作，可以隨機(jī)指定一窩中的一半動(dòng)物，例如來(lái)自一個(gè)已知能夠發(fā)展神經(jīng)系統(tǒng)疾病的鼠系的小鼠，。以接受治療，而另一半接受安慰劑，從給定鼠系已知的最早疾病發(fā)作年齡之前開(kāi)始。使用的窩數(shù)將依據(jù)觀察到的處理過(guò)的與未處理過(guò)的小鼠之間的差異量而定。
每天觀察小鼠；使用CI測(cè)試有助于它們的診斷，CI測(cè)試由不知道試驗(yàn)組的人每周進(jìn)行三次。從收集的臨床數(shù)據(jù)計(jì)算存活曲線(xiàn)與疾病發(fā)作和死亡的平均年齡。
通過(guò)對(duì)試驗(yàn)組和對(duì)照組樣品進(jìn)行神經(jīng)病理學(xué)和葡萄糖攝取的研究確證臨床前的結(jié)果。在免疫組織學(xué)研究中使用針對(duì)膠質(zhì)原纖維酸性蛋白和CD11b(克隆OX-42)的抗體評(píng)價(jià)膠質(zhì)細(xì)胞增生。運(yùn)用Chmielowska等人在(1986)Exp.BrainRes.63607闡述的Sokoloff法的一種改良進(jìn)行葡萄糖攝取的研究。
實(shí)施例3-測(cè)試治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物。本發(fā)明的動(dòng)物可以用于測(cè)試化合物改善或治愈神經(jīng)系統(tǒng)疾病的能力。表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)疾病的動(dòng)物用一種測(cè)試物質(zhì)進(jìn)行治療，與表現(xiàn)出該神經(jīng)系統(tǒng)疾病的未處理的對(duì)照動(dòng)物平行。相對(duì)遲發(fā)的死亡或?qū)υ摷膊〉纳窠?jīng)行為、病理學(xué)、或功能指標(biāo)的改善都被視為一種保護(hù)的指征。分析治療過(guò)的和未治療的動(dòng)物的學(xué)習(xí)/探究/運(yùn)動(dòng)行為減少，以及2-脫氧葡萄糖的攝取/利用減少、神經(jīng)元的死亡、膽堿能神經(jīng)傳遞受損、神經(jīng)炎斑塊、NFT形成和大腦皮質(zhì)一邊緣的結(jié)構(gòu)中肥大的膠質(zhì)細(xì)胞增生。
如上面結(jié)果表明的，在非人類(lèi)FAB哺乳動(dòng)物中的臨床前和病理學(xué)發(fā)現(xiàn)顯示出與具有神經(jīng)系統(tǒng)紊亂例如AD的人類(lèi)中的那些發(fā)現(xiàn)出乎意料地，但驚人地平行。AD的行為、生化和病理學(xué)異常記憶的這種關(guān)聯(lián)表現(xiàn)為研究非人類(lèi)動(dòng)物AD的病理生理學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)提供了新的機(jī)遇。
已經(jīng)闡述了本發(fā)明的許多實(shí)施方案。然而，應(yīng)當(dāng)明白可以進(jìn)行各種改變而不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍。因此，其它實(shí)施例是在以下權(quán)利要求之內(nèi)，并且因?yàn)榭梢詫?duì)以上的組合、制劑、聯(lián)合和方法進(jìn)行各種改變而不偏離本發(fā)明的范圍，因此包含在以上描述中的所有事實(shí)都應(yīng)被解釋為說(shuō)明性的而并非限制性意義。這里列出的所有專(zhuān)利文獻(xiàn)和參考文獻(xiàn)都結(jié)合作為參考。
權(quán)利要求
1.具有通過(guò)下面方法誘發(fā)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的非人類(lèi)動(dòng)物將藥理學(xué)有效劑量的Aβ化合物與至少一種促氧化化合物和至少一種抗氧化劑抑制劑的組合灌注該非人類(lèi)動(dòng)物，其中該灌注損傷動(dòng)物在記憶和學(xué)習(xí)測(cè)試中的行為并在該動(dòng)物的腦中誘發(fā)異常的神經(jīng)病理學(xué)，其中所述的受損傷的行為和異常的神經(jīng)病理學(xué)是與對(duì)照的非人類(lèi)動(dòng)物相比。
2.權(quán)利要求1的非人類(lèi)動(dòng)物，其中該Aβ化合物包括Aβ42。
3.權(quán)利要求1的非人類(lèi)動(dòng)物，其中該Aβ化合物包括Aβ42的肽片段。
4.權(quán)利要求3的非人類(lèi)動(dòng)物，其中Aβ42的該肽片段包括Aβ1-40或Aβ24-35中的至少一種。
5.權(quán)利要求1的非人類(lèi)動(dòng)物，其中該Aβ化合物包括一種模擬Aβ42的肽模擬物。
6.權(quán)利要求1的非人類(lèi)動(dòng)物，其中至少一種促氧化化合物選自硫酸亞鐵、硫酸銅、硫酸鈷、硫酸錳和硫酸鋅。
7.權(quán)利要求1的非人類(lèi)動(dòng)物，其中至少一種促氧化化合物包括硫酸亞鐵。
8.權(quán)利要求1的非人類(lèi)動(dòng)物，其中至少一種抗氧化劑抑制劑包括buthionine sulfoximine。
9.權(quán)利要求1的非人類(lèi)動(dòng)物，其中該方法進(jìn)一步包括用有效劑量的磷酸酶抑制劑灌注該非人類(lèi)動(dòng)物。
10.權(quán)利要求9的非人類(lèi)動(dòng)物，其中該磷酸酶抑制劑選自岡田酸、1-正-岡田酮、反丙烯除蟲(chóng)菊酯、花萼海綿誘癌素A、斑蝥酸、斑蝥素、氯氰菊酯、溴氰菊酯、草藻滅、草藻滅硫代酸酐、氰戊菊酯、okadol、氯菊酯、氧化苯砷、焦磷酸鹽或酯、氟化鈉和釩酸鹽。
11.權(quán)利要求9的非人類(lèi)動(dòng)物，其中該磷酸酶抑制劑包括岡田酸。
12.權(quán)利要求1的非人類(lèi)動(dòng)物，其中該方法進(jìn)一步包括用有效劑量的促炎化合物灌注該非人類(lèi)動(dòng)物。
13.權(quán)利要求12的非人類(lèi)動(dòng)物，其中該促炎化合物選自TNF-α、IL-6和IL-1b。
14.權(quán)利要求12的非人類(lèi)動(dòng)物，其中該促炎化合物包括TNF-α。
15.一種在非人類(lèi)動(dòng)物中誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，包括用藥理學(xué)有效劑量的Aβ化合物、至少一種促氧化化合物和至少一種抗氧化劑抑制劑的組合的灌注該非人類(lèi)動(dòng)物。
16.權(quán)利要求15的方法，其中該Aβ化合物包括Aβ42。
17.權(quán)利要求15的方法，其中該Aβ化合物包括Aβ42的肽片段。
18.權(quán)利要求17的方法，其中Aβ42的該肽片段包括Aβ1-40或Aβ24-35中的至少一種。
19.權(quán)利要求15的方法，其中該Aβ化合物包括一種模擬Aβ42的肽模擬物。
20.權(quán)利要求15的方法，其中至少一種促氧化化合物選自硫酸亞鐵、硫酸銅、硫酸鈷、硫酸錳和硫酸鋅。
21.權(quán)利求15的方法，其中至少一種促氧化合物包括硫酸亞鐵。
22.權(quán)利要求15的方法，其中至少一種抗氧化劑抑制劑包括buthioninesulfoximine。
23.權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包括用有效劑量的磷酸酶抑制劑灌注該非人類(lèi)動(dòng)物。
24.權(quán)利要求23的方法，其中該磷酸酶抑制劑選自由岡田酸、1-正-岡田酮、反丙烯除蟲(chóng)菊酯、花萼海綿誘癌素A、斑蝥酸、斑蝥素、氯氰菊酯、溴氰菊酯、草藻滅、草藻滅硫代酸酐、氰戊菊酯、okadol、氯菊酯、氧化苯砷、焦磷酸鹽或酯、氟化鈉和釩酸鹽。
25.權(quán)利要求23的方法，其中該磷酸酶抑制劑包括岡田酸。
26.權(quán)利要求15的方法，進(jìn)一步包括用有效劑量的促炎化合物灌注該非人類(lèi)動(dòng)物。
27.權(quán)利要求27的方法，其中該促炎化合物選自TNF-α、IL-6和IL-1b。
28.權(quán)利要求27的方法，其中該促炎化合物包括TNF-α。
29.一種篩選能夠減輕神經(jīng)系統(tǒng)疾病的癥狀的藥劑的方法，所述方法包括比較接觸該藥劑的第一個(gè)非人類(lèi)動(dòng)物與不接觸該藥劑的第二個(gè)非人類(lèi)動(dòng)物在記憶和學(xué)習(xí)測(cè)試中的表現(xiàn)，其中該第一個(gè)和所述第二個(gè)非人類(lèi)動(dòng)物已經(jīng)共同灌注了藥理學(xué)有效量的Aβ、至少一種促氧化化合物和至少一種抗氧化劑抑制劑，其中該共同灌注使記憶和學(xué)習(xí)測(cè)試中的行為受損并在該第一個(gè)和第二個(gè)非人類(lèi)動(dòng)物的腦中產(chǎn)生了異常的神經(jīng)病理學(xué)，其中該受損行為和異常神經(jīng)病理學(xué)是和對(duì)照的非人類(lèi)動(dòng)物相比較，由此通過(guò)所述第一個(gè)非人類(lèi)動(dòng)物比第二個(gè)非人類(lèi)動(dòng)物在記憶和學(xué)習(xí)測(cè)試中具有好的表現(xiàn)來(lái)鑒定能夠減輕癥狀的藥劑。
30.一種篩選用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥劑的方法，所述方法包括比較接觸該藥劑的第一個(gè)非人類(lèi)動(dòng)物與不接觸該藥劑的第二個(gè)非人類(lèi)動(dòng)物在記憶和學(xué)習(xí)測(cè)試中的表現(xiàn)，其中該第一個(gè)和所述第二個(gè)非人類(lèi)動(dòng)物已經(jīng)共同灌注了藥理學(xué)有效量的Aβ和至少一種促氧化化合物及至少一種抗氧化劑抑制劑，其中該共同灌注使記憶和學(xué)習(xí)測(cè)試中的行為受損并在該第一個(gè)和第二個(gè)非人類(lèi)動(dòng)物的腦中產(chǎn)生了異常的神經(jīng)病理學(xué)，其中該受損行為和異常神經(jīng)病理學(xué)是和對(duì)照的非人類(lèi)動(dòng)物相比較；并且當(dāng)與第二個(gè)非人類(lèi)動(dòng)物相比，所述第一個(gè)非人類(lèi)動(dòng)物在記憶和學(xué)習(xí)測(cè)試中顯示出好的表現(xiàn)時(shí)，比較第一個(gè)和第二個(gè)非人類(lèi)動(dòng)物腦中的神經(jīng)病理學(xué)，由此通過(guò)第一個(gè)非人類(lèi)動(dòng)物與第二個(gè)非人類(lèi)動(dòng)物相比神經(jīng)病理學(xué)發(fā)現(xiàn)的減少來(lái)鑒定用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種藥理學(xué)的非人類(lèi)動(dòng)物模型的開(kāi)發(fā)，該模型使在具有阿爾茨海默病的受檢者的腦中發(fā)現(xiàn)的組織病理學(xué)特征與記憶喪失相關(guān)聯(lián)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在年輕的成年Long－Evans大鼠的左腦室內(nèi)連續(xù)四周灌注一種Fe
文檔編號(hào)A01K67/027GK1781019SQ200480006554
公開(kāi)日2006年5月31日 申請(qǐng)日期2004年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月12日
發(fā)明者L·萊卡努, J·格里森, V·帕帕多普洛斯 申請(qǐng)人:薩馬里坦藥品公司, 喬治敦大學(xué)