專利名稱：禽類物種中內(nèi)源性原生殖細胞的耗減的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)禽類中原生殖細胞(primordial germ cell)數(shù)的方法。更特別地，本發(fā)明涉及與原生殖細胞相關(guān)抗原結(jié)合的抗體在禽類胚胎發(fā)生期間調(diào)節(jié)原生殖細胞發(fā)育中的應(yīng)用?？梢詫⒐w原生殖細胞給予經(jīng)本發(fā)明方法處理的禽類所產(chǎn)的卵內(nèi)存在的禽類胚胎以產(chǎn)生嵌合禽類。
背景技術(shù)：
嵌合體是包含衍生自一個以上合子的細胞的復(fù)合生物體。實驗性嵌合體已經(jīng)用于在發(fā)育期間研究細胞之間的相互作用及進行細胞結(jié)局和譜系分析(McLaren，Mammalian Chimeras.Cambridge UniversityPress，Cambridge，England，United Kingdom，1976)。使用分離自非常早期胚胎的細胞產(chǎn)生嵌合體可產(chǎn)生這樣的生物體，該生物體發(fā)育成具有部分由所述分離的細胞的后代構(gòu)成的體細胞組織的完全互補體。如果起始材料包括早期生殖細胞或其前體，則所得嵌合體可產(chǎn)生供體和受體基因型雙方的配子。另外，嵌合體可以是種內(nèi)嵌合體(即含有衍生自同一物種的兩或多個合子的細胞)或種間嵌合體(即含有衍生自至少兩個不同物種的合子的細胞)。
通過用希望的供體PGC在生殖腺中進行種群恢復(fù)而產(chǎn)生種系嵌合體的效率可以通過減少受體生物體中的PGC數(shù)而增強。已經(jīng)不同程度地成功利用了許多減少PGC的方案。持續(xù)暴露于3.4和1.8R/hr劑量水平的γ輻射(0.3-3.4R/hr，60Co，20天)導(dǎo)致卵母細胞的完全破壞(Mraz & Woody，Radiation Res 5463-68，1973)。然而，在0.9R/hr或更高水平孵化頻率降低。為降低內(nèi)源性PGC數(shù)進行持續(xù)低水平γ射線的應(yīng)用受限，這是由于可以同時暴露的卵的數(shù)目相對較少、需要較長的暴露時間及輻射自身的潛在致畸作用所致。
也已經(jīng)嘗試了短期暴露于γ射線源(Carsience et al.，Development117669-75，1993；Thoraval et al.，Poultry Sci 731897-1905，1994；Maeda et al.，Poultry Sci 77905-07，1998)。在這些研究中，在即將注射X期胚盤細胞或透明區(qū)細胞之前將未孵育的卵暴露于500-700rads。在短期γ輻射之后，種系嵌合現(xiàn)象的跡象是高度可變的。這種不一致結(jié)果的基礎(chǔ)歸因于“供體細胞被注射進不適當(dāng)?shù)奈恢谩?Carsience et al.，Development 117669-75，1993)。
也已經(jīng)描述了嘗試使用紫外(UV)光使受體胚胎不育(Reynaud，JEmbryol Exp Morphol 21485-507，1969；Reynaud，J Roux＇s ArchDevelBiol 17985-110，1976；Aige-Gil & Simkiss，Br Poul Sci 32427-438，1991)。Aige-Gil & Simkiss斷定“照射生殖新月區(qū)、特別是在4期孵育時照射不可能不誘導(dǎo)明顯異常”。不育的程度看起來與發(fā)育異常正相關(guān)，因此限制了UV光作為降低內(nèi)源性PGC的工具的實際應(yīng)用。
種系嵌合體的產(chǎn)生對人類及對各種禽物種自身均產(chǎn)生一定的潛在有益作用。種系嵌合體可用作具有希望特性的配子的來源，其然后可與育種程序一起使用以增加禽基因庫。更簡便地生產(chǎn)特定禽物種的配子的能力對禽獸醫(yī)和家禽生產(chǎn)領(lǐng)域是有益的。對于瀕于滅絕的物種如鳴鶴而言，能夠提供現(xiàn)成的雄性精子是非常有益的。對于商業(yè)禽類如火雞而言，希望更迅速而經(jīng)濟地產(chǎn)生雄性精子。對于產(chǎn)肉禽群而言，希望具有增加禽群中雄性禽比率的方式。如此，需要獲得禽精子的新方式。
因此，人們長期及持續(xù)需要增加禽類中種系嵌合體產(chǎn)生的效率的方式。本發(fā)明致力于本領(lǐng)域中的這種及其它需要。
概述本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)禽胚胎中原生殖細胞數(shù)的方法。在一個實施方案中，所述方法包括用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫一個雌性禽，從而該雌性禽產(chǎn)生的卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的禽胚胎中內(nèi)源性PGC數(shù)。在一個實施方案中，所述雌性禽選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉、及沙丘鶴組成的一組。在另一個實施方案中，所述雌性禽是雞。在一個實施方案中，所述抗原包含選自如下一組的一個多肽表位SSEA-1，VASA，EMA-1，germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis，及DAZL。在一個實施方案中，所述免疫步驟導(dǎo)致禽胚胎中原生殖細胞數(shù)減少。在另一個實施方案中，所述免疫步驟導(dǎo)致禽胚胎中原生殖細胞數(shù)增加。
本發(fā)明還提供了一種調(diào)節(jié)禽胚胎中原生殖細胞發(fā)育的方法。在一個實施方案中，所述方法包括用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫一個雌性禽，從而由該雌性禽產(chǎn)生的卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的禽胚胎中PGC的發(fā)育。在一個實施方案中，所述抗原包含選自如下一組的一個多肽表位SSEA-1，VASA，EMA-1，germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis及DAZL。在一個實施方案中，所述雌性禽選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉、和沙丘鶴組成的一組。在另一個實施方案中，所述雌性禽是雞。在一個實施方案中，所述免疫步驟導(dǎo)致禽胚胎中原生殖細胞的發(fā)育抑制。在另一個實施方案中，所述免疫步驟導(dǎo)致禽胚胎中原生殖細胞的發(fā)育增強。
本發(fā)明還提供了一種產(chǎn)生嵌合禽的方法。在一個實施方案中，所述方法包括(a)用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫一個雌性禽；(b)該雌性禽產(chǎn)卵，其中卵中包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的受體胚胎中PGC發(fā)育、PGC數(shù)或其組合；及(c)將供體PGC經(jīng)卵內(nèi)給予受體胚胎以產(chǎn)生嵌合禽。在一個實施方案中，所述抗原包含選自如下一組的一個多肽表位SSEA-1，VASA，EMA-1，germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis，及DAZL。在一個實施方案中，供體PGC來自與受體胚胎相同的禽物種。在另一個實施方案中，供體PGC來自與受體胚胎不同的禽物種。在一個實施方案中，所述方法進一步包括孵育所述嵌合禽至孵化。
在本發(fā)明方法的一個實施方案中，所述雌性禽選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉、和沙丘鶴組成的一組。
在一個實施方案中，供體PGC來自選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉、和鳴鶴組成的一組的禽胚胎。在另一個實施方案中，供體PGC攜帶一對雄性決定(Z)染色體。在另一個實施方案中，供體PGC選自由生殖腺PGC、血PGC及生殖新月區(qū)(germinal crescent)PGC組成的一組。
在另一個實施方案中，供體PGC攜帶一個雌性決定(w)染色體。在一個實施方案中，所述給予是通過卵內(nèi)注射進行的。在一個實施方案中，當(dāng)受體胚胎在大約IX期(根據(jù)Eyal-Giladi & Kochav分期系統(tǒng))及大約30期(根據(jù)Hamburger & Hamilton分期系統(tǒng))之間時給予供體PGC。在另一個實施方案中，當(dāng)受體胚胎在14期(根據(jù)Hamburger& Hamilton分期系統(tǒng))之后時給予供體PGC。在另一個實施方案中，所述給予步驟是通過將胚盤細胞注射到受體胚胎進行的，并且其中胚盤細胞在受體胚胎中分化為供體PGC。
本發(fā)明還提供了一種增加眾多禽卵中雄性禽比例的方法。在一個實施方案中，所述方法包括(a)用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫一個雌性禽；(b)該雌性禽產(chǎn)卵，從而該卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的受體雌性禽中PGC的發(fā)育；(c)經(jīng)卵內(nèi)將雄性(ZZ)PGC給予受體雌性禽；(d)孵育該受體雌性禽直至孵化；(e)飼養(yǎng)該受體雌性禽至性成熟；及(f)該受體雌性禽產(chǎn)生大量禽卵，其中該受體雌性禽產(chǎn)生的大量禽卵中雄性禽的比例高于在未將雄性(ZZ)PGC經(jīng)卵內(nèi)給予受體雌性禽的情況中獲得的結(jié)果。在一個實施方案中，所述抗原包含選自如下一組的一個多肽表位SSEA-1，VASA，EMA-1，germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis，及DAZL。在一個實施方案中，所述雌性禽選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉、和沙丘鶴組成的一組。在一個實施方案中，供體PGC來自與受體胚胎相同的禽物種。在另一個實施方案中，供體PGC來自與受體胚胎不同的禽物種。在另一個實施方案中，所述PGC選自由生殖腺PGC，血PGC，及生殖新月區(qū)PGC組成的一組。在另一個實施方案中，供體PGC來自選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉、和鳴鶴組成的一組的禽胚胎。
在本發(fā)明方法的一個實施方案中，所述給予是經(jīng)卵內(nèi)注射。在另一個實施方案中，當(dāng)受體胚胎在大約IX期(根據(jù)Eyal-Giladi & Kochav分期系統(tǒng))及大約30期(根據(jù)Hamburger & Hamilton分期系統(tǒng))之間時給予供體PGC。在另一個實施方案中，當(dāng)受體胚胎在14期(根據(jù)Hamburger & Hamilton分期系統(tǒng))之后時給予供體PGC。在另一個實施方案中，所述給予步驟是通過將胚盤細胞注射到受體胚胎進行的，并且其中胚盤細胞在受體雌性禽中分化為供體PGC。
本發(fā)明還提供了一種在第一種禽物種中生產(chǎn)來自第二種禽物種的禽配子的方法。在一個實施方案中，所述方法包括(a)用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫雌性第一種禽物種，從而雌性禽產(chǎn)的卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的第一種禽物種的受體禽的PGC發(fā)育；(b)將分離自第二種禽物種的禽的供體PGC導(dǎo)入第一種禽物種的受體禽中；(c)孵育第一種禽物種的受體禽至孵化；及(d)飼養(yǎng)第一種禽物種的受體禽至性成熟，其中第一種禽物種的受體禽產(chǎn)生來自第二種禽物種的配子。在一個實施方案中，所述抗原包含選自如下一組的一個多肽表位SSEA-1，VASA，EMA-1，germcell-less，dead end，nanos，stella，fragilis，及DAZL。在一個實施方案中，所述第一種禽物種和第二種禽物種均選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉、沙丘鶴，和鳴鶴組成的一組。在一個實施方案中，所述第一種禽物種和第二種禽物種是相同的。在另一個實施方案中，所述第一種禽物種和第二種禽物種是不同的。
在本發(fā)明方法的一個實施方案中，所述給予是通過卵內(nèi)注射。在一個實施方案中，當(dāng)?shù)谝环N禽物種的受體禽在大約IX期(根據(jù)Eyal-Giladi & Kochav分期系統(tǒng))及大約30期(根據(jù)Hamburger &Hamilton分期系統(tǒng))之間時給予供體PGC。在另一個實施方案中，當(dāng)?shù)谝环N禽物種的受體禽在14期(根據(jù)Hamburger & Hamilton分期系統(tǒng))之后時給予供體PGC。在另一個實施方案中，所述給予步驟是通過將胚盤細胞注射到第一種禽物種的受體禽進行的，并且其中胚盤細胞在第一種禽物種的受體禽中分化為供體PGC。在一個實施方案中，所述PGC選自由生殖腺PGC、血PGC及生殖新月區(qū)PGC組成的一組。
本發(fā)明還提供了一種增強核酸分子在禽中種系傳遞的方法。在一個實施方案中，所述方法包括(a)用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫一個雌性禽，從而該雌性禽產(chǎn)生的卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的受體禽中PGC發(fā)育；(b)在足以使得眾多PGC的至少之一在受體禽的生殖腺建群(colonize)的條件下，將包含所述核酸分子的眾多供體PGC給予受體禽；(c)孵育該受體禽至孵化；及(d)飼養(yǎng)該受體禽至性成熟，其中該受體禽產(chǎn)生衍生自供體PGC的配子。在一個實施方案中，所述抗原包含選自如下一組的一個多肽表位SSEA-1，VASA，EMA-1，germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis，及DAZL。在一個實施方案中，所述受體禽和供體PGC均選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉、沙丘鶴和鳴鶴組成的一組。在一個實施方案中，供體PGC來自與受體禽相同的禽物種。在另一個實施方案中，供體PGC來自與受體禽不同的禽物種。在一個實施方案中，所述PGC選自由生殖腺PGC、血PGC、及生殖新月區(qū)PGC組成的一組。
在本發(fā)明方法的一個實施方案中，當(dāng)受體禽在大約IX期(根據(jù)Eyal-Giladi & Kochav分期系統(tǒng))及大約30期(根據(jù)Hamburger &Hamilton分期系統(tǒng))之間時給予供體PGC。在另一個實施方案中，當(dāng)受體禽在14期(根據(jù)Hamburger & Hamilton分期系統(tǒng))之后時給予供體PGC。在另一個實施方案中，所述給予步驟是通過將胚盤細胞注射到受體禽進行的，并且其中胚盤細胞在受體禽中分化為供體PGC。
本發(fā)明的這些及其它方面經(jīng)參考如下詳細描述和所附圖表將更加明了。另外，本發(fā)明參考了各種出版物。本發(fā)明引用的所有專利(包括公布的專利申請)和出版物(包括GENBANK序列參考)均以其全文并入?yún)⒖迹a充、解釋、提供背景或教導(dǎo)方法學(xué)，和/或應(yīng)用的組合物均并入?yún)⒖肌＿@些專利和出版物與本發(fā)明之間的任何矛盾之處以本發(fā)明為準。
附圖簡述


圖1-3描述了對暴露于對抗PGC相關(guān)抗原而產(chǎn)生的抗體的雞胚胎中SSEA-1+細胞的存在進行免疫組織化學(xué)分析的情況。對于每個圖而言，將發(fā)育中的生殖腺區(qū)域的雞胚胎橫切面用單克隆抗體MC-480染色，該抗體識別原生殖細胞上胚胎階段特異性胚胎抗原-1(stage specific embryonic antigen-1，SSEA-1)。將27期胚胎在4％低聚甲醛中固定，制備7μm石蠟切片，并用MC-480和一種堿性磷酸酶綴合的二級抗體免疫染色。使用NBT-BCIP酶底物檢測到陽性染色。
圖4是概括了
圖1-3中描述的切片檢測結(jié)果的條形圖。用各自的肽免疫母雞，其產(chǎn)的卵被收集并孵育至達到胚胎27期。將胚胎進行常規(guī)的組織學(xué)處理，連續(xù)切片并用單克隆抗體MC-480(抗SSEA-1)免疫染色以鑒別發(fā)育中的生殖腺中的生殖細胞。呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)表示來自用每個肽或肽組合免疫的3只母雞的卵內(nèi)胚胎的生殖腺嵴的10個切片中計數(shù)的PGC數(shù)的平均值。
序列表簡述SEQ ID NO1和2分別是雞VASA(CVH)可讀框的核酸和氨基酸序列(分別為GENBANKAccession No.AB004836和BAB12337)。
SEQ ID NO3和4是包含用于免疫雌性雞的雞VASA(CVH)多肽表位的肽序列。SEQ ID NO3是N末端肽(Vasa-N)，相應(yīng)于GENBANKAccession NoBAB12337的第42-57位氨基酸，SEQID NO4是C末端肽(Vasa-C)，相應(yīng)于GENBANKAccession NoBAB12337的第645-660位氨基酸。
SEQ ID NO5和6分別是雞DAZL可讀框的核酸和氨基酸序列(分別為GENBANKAccession No.AY211387和AAO26019)。
SEQ ID NO7和8是包含用于免疫雌性雞的雞DAZL多肽的表位的肽序列。SEQ ID NO7是N末端肽(Dazl-N)，相應(yīng)于GENBANKAccession NoAAO26019的第2-18位氨基酸，SEQ IDNO8是C末端肽(DAZL-C)，相應(yīng)于GENBANKAccession No.AAO26019的第266-282位氨基酸。
詳細描述I.定義除非特別說明，本文所用所有技術(shù)和學(xué)術(shù)術(shù)語均具有本領(lǐng)域技術(shù)人員通常理解的適合本發(fā)明的含義。為本說明書清楚起見，某些定義如下。
當(dāng)在本文、包括權(quán)利要求書中使用時，根據(jù)長久以來的專利法實踐，術(shù)語“一個”意味著“一或多個”。
如本文所用，術(shù)語“大約”當(dāng)指一個數(shù)值或者指質(zhì)量、重量、時間、體積、濃度或百分比的量時，涵蓋了與指定量有±20％或±10％的變化，在另一個例子中有±5％的變化，在再一個例子中有±1％的變化，在另一個實施例中有±0.1％的變化，這種變化對于實施本發(fā)明是適當(dāng)?shù)?。除非另外說明，在本說明書和權(quán)利要求書中使用的表示配料數(shù)量、反應(yīng)條件等等的所有數(shù)目在一切情況下均應(yīng)理解為在術(shù)語“大約”的范疇內(nèi)。因此，除非相反地指出，本說明書和所附權(quán)利要求書中列出的數(shù)字參數(shù)是近似值，其可以根據(jù)試圖通過本發(fā)明可獲得的希望性質(zhì)而變化。
在某些實施方案中，本發(fā)明應(yīng)用抗與原生殖細胞相關(guān)的抗原的抗體。術(shù)語“抗體”及其語法學(xué)上的變化用語是指免疫球蛋白分子及免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有特異性結(jié)合一種抗原的抗原結(jié)合位點的分子。同樣，該術(shù)語還指免疫球蛋白蛋白質(zhì)或其功能部分，包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、雜種抗體、單鏈抗體(例如，噬菌體文庫中表示的單鏈抗體)、經(jīng)過誘變的抗體、人源化抗體、及包含一個抗原結(jié)合位點的抗體片段(例如，F(xiàn)ab和Fv抗體片段)。因此，“抗體”包括但不限于單克隆抗體、嵌合抗體、重組抗體、合成抗體、半合成抗體，或者化學(xué)修飾的具有例如Fv、Fab、scFv或F(ab)2片段的完整抗體。本發(fā)明的免疫球蛋白分子可以是任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亞類的免疫球蛋白分子。
禽類產(chǎn)生可位于卵黃中的抗體，這些抗體稱為“IgY”(卵黃抗體，主要包含IgG型抗體)。通常見Bollen et al.，J Immunol Meth191113-120，1996；Schade et al.(eds.)，Chicken Egg Yolk Antibodies.Production and ApplicationIgY-Technology，Springer Verlag，NewYork，New York，United States of America，2000所述。在一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是禽IgY抗體。本發(fā)明的抗體可以來自任何禽類來源。在一些實施方案中，所述抗體是雞IgY抗體。
本發(fā)明的抗體結(jié)合與原生殖細胞相關(guān)的抗原。如本文所用，術(shù)語“與原生殖細胞相關(guān)”是指抗原包含一個表位，該表位或者由原生殖細胞表達的一個多肽(例如一個細胞表面標記)表達或者在翻譯后附著于該多肽，或者由能影響原生殖細胞遷移和/或發(fā)育的細胞表達(例如遷移因子、生長因子、及由在PGC存在或發(fā)育的微環(huán)境中存在的細胞表達的多肽)。這種抗原包括但不限于SSAE-1、卵粘蛋白樣蛋白(OLP)、Steel因子(c-試劑盒配體)、germ cell-less，dead end、VASA(包括但不限于雞VASA同系物，CVH)、DAZL、nanos、stella、及fragilis多肽上存在的表位，及由抗體EMA-1、QH-1、FC10.2、S-FC10.2、NC-1、2C9、QCR1、AGC5、AGC7和AGC13識別的抗原。參見Taiima，Avian Poultry Biol Rev 1315-20，2002所述。也參見Buehr，Exp Cell Res232，194-207，1997；D′Costa & Petitte，Intl J Devel Biol 43349-56，1999；Urven et al.，Development 103299-304，1988；Hay et al.，Cell55577-587，1988；Lasko & Ashburner，Nature 335611-617，1988；Raz，Nature Genetics 4690-700，2003Houston & King，Development 127447-56，2000；Cooke et al.，Hum Mol Genet 5513-516，1996Kimura etal.，Biochem Biophys Res Commun 262223-30，1999Weidinger et al.，Curr Biol 131429-34，2003；及本發(fā)明引用的參考文獻所述。
如本文所用，術(shù)語“SSEA-1抗體”和“抗SSEA-1抗體”可互換使用并且是指一種抗體，在一個實施方案中是IgY抗體，在另一個實施方案中是單克隆抗體，其結(jié)合胚胎階段特異性胚胎抗原-1(SSEA-1；Buehr，Exp Cell Res 232，194-207，1997)。SSEA-1是由半乳糖(β1→4)巖藻糖(α1→3)N-乙酰氨基葡萄糖鍵決定的一種碳水化合物表位(Gooi et al.，Nature 292156-158，1981)。一種SSEA-1的單克隆抗體是通過小鼠骨髓瘤細胞與已經(jīng)用F9畸胎癌細胞免疫的小鼠的脾細胞融合而產(chǎn)生(Solter & Knowles，Proc Natl AcadSci USA755565-5569，1978)。SSEA-1抗體是禽生殖細胞的一種已知的免疫組織化學(xué)標記(Karagenc et al.，Dev Genet 19290-301，1996)。在一個實施方案中，一種抗SSEA-1抗體是克隆MC 480，其可以得自Developmental Studies Hybridoma Bank，The University of lowa，lowaCity，lowa，United States of America。
如本文所用，術(shù)語“VASA抗體”和“抗VASA抗體”可互換使用并且是指一種抗體，在一個實施方案中是IgY抗體，其結(jié)合禽VASA多肽。VASA是一種ATP依賴性RNA解旋酶，是DEAD-box(Asp-Glu-Ala-Asp)家族的一個成員。VASA及其直向同源物在許多物種的生殖質(zhì)中表達，這些物種包括斑馬魚(Danio rerio)、果蠅(Drosophila melanogaster)、線蟲(Caenorhabditis elegans)，并且其已經(jīng)在其它物種包括非洲爪蟾(Xenopus laevis)、小鼠、及人的PGC中鑒別(參見綜述Raz，Nature Genetics 4690-700，2003)。在這些物種中，VASA及相關(guān)多肽參與生殖細胞發(fā)育，包括極(pole)PGC發(fā)育、增殖及分化，以及配子形成。參見上述文獻。雞VASA(也稱為CVH)的核酸和氨基酸序列可以分別在GENBANKAccessionNo.AB004836和BAB12337找到。
如本文所用，術(shù)語“DAZL抗體”和“抗DAZL抗體”可互換使用并且是指一種抗體，在一個實施方案中是IgY抗體，其結(jié)合禽DAZL多肽。DAZL的直向同源物已在許多物種中分離，這些物種包括斑馬魚(Danio rerio)、果蠅(Drosophila melanogaster)、線蟲(Caenorhabditiselegans)，并且其已經(jīng)在其它物種包括非洲爪蟾(Xenopus laevis)、小鼠、及人的PGC中鑒別(參見綜述Raz，Nature Genetics 4690-700，2003)。DAZL多肽(及其直向同源物)是一種RNA結(jié)合蛋白，其在斑馬魚卵的植物極、非洲爪蟾(Xenopus)的生殖質(zhì)以及若干不同生物體的卵巢和/或睪丸中表達。文獻同上。在非洲爪蟾(Xenopus)、小鼠和人中，DAZL在PGC中表達，并且其可能對于一種或兩種性別的生殖腺細胞的發(fā)育和存活是重要的。參見Raz，Nature Genetics 4690-700，2003；Xu et al..，Proc Natl Acad Sci USA987414-7419，2001；Houston &King，Development 127447-56，2000；Mita & Yamashita，Mech Dev94251-255，2000；Ruggiu et al.，Nature 38973-77，1997；Reijo et al.，Nature Genetics 10383-393，1995。雞DAZL的核酸和氨基酸序列可以分別在GENBANKAccession No.AY211387和AAO26019找到。
如本文所用，術(shù)語“禽”和“禽物種”是指任何禽物種，包括但不限于雞、火雞、鴨、鵝、鵪鶉、野雞、及鴕鳥。可以采用任何眾多的其它物種進行本發(fā)明，特別是當(dāng)用于保存瀕于滅絕的物種如鳴鶴時(這種情況中受體物種是沙丘鶴)。
如本文所用及除非特別修正，術(shù)語“卵”是指含有活的胎禽的禽卵。因此，術(shù)語“卵”是指已受精的禽卵，在一個實施方案中是指含有能經(jīng)歷正常胚胎發(fā)生的禽胚胎的卵。
如本文所用，術(shù)語“天然的”和“內(nèi)源的”是指細胞或核酸在胚胎中天然存在。同樣，“內(nèi)源性PGC”是在從未導(dǎo)入外源或供體PGC的受精卵中直接發(fā)育的胚胎中存在的PGC。相似地，當(dāng)就多肽而言時，“天然多肽”是由未轉(zhuǎn)化的禽的天然基因編碼的多肽。
如本文所用，術(shù)語“天然發(fā)生的”是指與人工產(chǎn)生的截然不同的在自然中發(fā)現(xiàn)的物體。例如，以其天然狀態(tài)在生物體(包括病毒)中存在的、未在實驗室中被故意人工修飾或分離的多肽或核苷酸序列是天然發(fā)生的。同樣，如果多肽或核苷酸序列是由重組分子編碼或存在于其內(nèi)，即使其氨基酸序列或核酸序列與在自然中發(fā)現(xiàn)的氨基酸或核酸序列相同，也認為其是“非天然發(fā)生的”。
如本文所用，術(shù)語“核酸”和“核酸分子”是指任何脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、由聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)生的片段、及通過任何連接、剪切、核酸內(nèi)切酶作用及核酸外切酶作用產(chǎn)生的片段。
術(shù)語“可操縱地連接”當(dāng)描述兩個核酸區(qū)域之間的關(guān)系時，是指一種并列狀態(tài)，使其中所述區(qū)域處于一種允許它們以指定方式發(fā)揮功能的關(guān)系。例如，一個控制序列與一個編碼序列“可操縱地連接”是以這樣的方式連接，即編碼序列的表達是在與控制序列相匹配的條件下達到的，如當(dāng)合適的分子(例如誘導(dǎo)劑和聚合酶)與控制或調(diào)節(jié)序列結(jié)合時。因此，在一個實施方案中，短語“可操縱地連接”是指一個啟動子與一個編碼序列以編碼序列的轉(zhuǎn)錄由啟動子控制和調(diào)節(jié)這樣的方式連接。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知將啟動子與編碼序列進行可操縱地連接的技術(shù)，相對于感興趣的編碼序列的精確方向和位置依賴于啟動子的特異性性質(zhì)及其他一些因素。
因此，術(shù)語“可操縱地連接”可以指一個啟動子區(qū)域與一個核苷酸序列以該核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄由該啟動子區(qū)域控制和調(diào)節(jié)這樣的方式連接。相似地，也就是說核苷酸序列在其可操縱地連接的啟動子的“轉(zhuǎn)錄控制”下。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知將一個啟動子區(qū)域與一個核苷酸序列可操縱地連接的技術(shù)。術(shù)語“可操縱地連接”也可以指一個轉(zhuǎn)錄終止序列或其它核酸與一個核苷酸序列以該核苷酸序列轉(zhuǎn)錄的終止由該轉(zhuǎn)錄終止序列控制這樣的方式連接。另外，術(shù)語“可操縱地連接”可以指一個增強子、沉默子或者其它核酸調(diào)節(jié)序列當(dāng)可操縱地與開放讀框連接時以正或負的方式調(diào)節(jié)該開放讀框的表達。
如本文所用，可互換使用的術(shù)語“多肽”、“蛋白質(zhì)”、和“肽”，是指20個蛋白質(zhì)氨基酸的聚合物，或者氨基酸類似物，無論其大小或功能如何。盡管“蛋白質(zhì)”通常用于指相對大的多肽，而“肽”通常用于小的多肽，但這些術(shù)語在本領(lǐng)域中的應(yīng)用有重疊和變化。本文所用術(shù)語“多肽”除非特別指出則是指肽、多肽和蛋白質(zhì)。如本文所用，術(shù)語“蛋白質(zhì)”、“多肽”和“肽”當(dāng)指基因產(chǎn)物時可互換使用。術(shù)語“多肽”涵蓋了所有功能的蛋白質(zhì)，包括酶。因此，典型的多肽包括基因產(chǎn)物、天然發(fā)生的蛋白質(zhì)、同系物、直向同源物、共生同源物、片段，及前述的其它等價物、變體和類似物。
如本文所用，術(shù)語“原生殖細胞”和“PGC”是指在早期胚胎中存在的二倍體細胞，其在成熟的禽中可分化/發(fā)育為單倍體配子(即精子和卵子)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的原生殖細胞可分離自不同的發(fā)育時期及分離自發(fā)育中的禽胚胎的各個部位，包括但不限于生殖嵴、發(fā)育中的生殖腺、血液和生殖新月區(qū)。見例如Chang et al.，Cell BiolInt 21495-9，1997；Chang et al.，Cell Biol Int 19143-9，1995；Allioli etal.，Dev Biol 16530-7，1994；Swift，Am JPhysiol 15483-516；及PCT國際出版物NOWO99/06533所述。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知生殖嵴是發(fā)育中的胚胎的一部分。見例如Strelchenko，Theriogenology45130-141，1996；Lavoir，JReprodDev 37413-424，1994所述。典型地，PGC在過碘酸-Schiff(PAS)技術(shù)中陽性染色。在一些物種中，PGC可以使用抗SSEA抗體(一個例外是火雞，其PGC不展示SSEA抗原)鑒別。本領(lǐng)域已知分離和純化PGC的各種技術(shù)，包括使用Ficoll密度梯度離心從血液中濃縮PGC(Yasuda et al.，J Reprod Fertil96521-528，1992)。
術(shù)語“啟動子”或“啟動子區(qū)域”均是指基因內(nèi)的一個核苷酸序列，其位于編碼序列的5’端并發(fā)揮指導(dǎo)編碼序列轉(zhuǎn)錄的功能。啟動子區(qū)域包含一個轉(zhuǎn)錄起始位點，并可另外包括一或多個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件。在一個實施方案中，本發(fā)明的方法應(yīng)用一個RNA聚合酶III啟動子。
“最小啟動子”是一個核苷酸序列，其具有使得基本水平轉(zhuǎn)錄發(fā)生所需的最小元件。同樣，最小啟動子是不完整的啟動子，而是能指導(dǎo)報道基因構(gòu)建體在一個實驗系統(tǒng)中基本水平轉(zhuǎn)錄的啟動子的亞序列。最小啟動子包括但不限于CMV最小啟動子、HSV-tk最小啟動子、猿猴病毒40(SV40)最小啟動子、人β-肌動蛋白最小啟動子、人EF2最小啟動子、腺病毒E1B最小啟動子、及熱激蛋白(hsp)70最小啟動子。最小啟動子通常用一或多個轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件增大以影響可操縱地連接的基因的轉(zhuǎn)錄。例如，細胞類型特異性或組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件可以加入到最小啟動子中以產(chǎn)生重組啟動子，其以細胞類型特異性或組織特異性方式指導(dǎo)可操縱地連接的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。
不同的啟動子具有不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件組合。一個基因在細胞中表達與否依賴于特定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的組合，其由該基因的啟動子和細胞核內(nèi)存在的不同的轉(zhuǎn)錄因子組成。同樣，啟動子根據(jù)其在體內(nèi)或體外的功能活性而通常分為“組成型”、“組織特異性”、“細胞類型特異性”、或“可誘導(dǎo)的”啟動子。例如，組成型啟動子是能在多種細胞類型中指導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄的啟動子。典型的組成型啟動子包括編碼某些組成型或“管家”功能的如下基因的啟動子次黃嘌呤轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(HPRT)，二氫葉酸還原酶(DHFR；Scharfmann et al.，1991)，腺苷脫氨酶，磷酸甘油酸激酶(PGK)，丙酮酸激酶，磷酸甘油酸變位酶，β-肌動蛋白啟動子(見例如，Williams et al.，1993)，及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它組成型啟動子。另一方面，“組織特異性”或“細胞類型特異性”啟動子在一些組織和細胞類型中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄，但在其它組織和細胞類型中則無活性。典型的組織特異性啟動子包括在下文詳細描述的那些啟動子，以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它組織特異性和細胞類型特異性啟動子。
當(dāng)就啟動子而言時，本文所用術(shù)語“連接”是指啟動子元件的物理性接近，由此它們一起發(fā)揮指導(dǎo)可操縱地連接的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄功能。
如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列”或“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件”均是指啟動子區(qū)域內(nèi)的一個核苷酸序列，其可以啟動對調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的應(yīng)答。應(yīng)答可涵蓋轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量的減少或增加，并且是由轉(zhuǎn)錄因子與包含轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的DNA分子的結(jié)合而介導(dǎo)。在一個實施方案中，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列是一個轉(zhuǎn)錄終止序列，或者在此稱為轉(zhuǎn)錄終止信號。
如本文所用，關(guān)于概率的統(tǒng)計學(xué)分析術(shù)語“顯著性”或“顯著的”是兩或多個實體之間的非隨機相關(guān)性。為確定一種關(guān)系是否“顯著”或具有“顯著性”，可以對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理以計算概率，以“p-值”表示。降到用戶定義的截斷(cutoff)點以下的那些p-值認為是顯著的。在一個例子中，p-值低于或等于0.05，在另一個例子中低于0.01、在另一個例子中低于0.005、在又一個例子中低于0.001被認為是顯著的。
術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”是在本說明書中普遍使用的一個專業(yè)術(shù)語，是指多核苷酸序列如起始信號、增強子、調(diào)節(jié)子、啟動子，及終止序列，其是影響與其可操縱地連接的編碼序列和非編碼序列表達所必需或希望的序列。典型調(diào)節(jié)序列如Goeddel，1990所述，包括例如猿猴病毒40(SV40)的早期和晚期啟動子、腺病毒或巨細胞病毒立即早期啟動子、lac系統(tǒng)、trp系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)、T7啟動子(其表達由T7RNA聚合酶指導(dǎo))、噬菌體λ的主要操縱子和啟動子區(qū)域、fd外被蛋白的控制區(qū)、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶的啟動子如Pho5、酵母a-交配因子的啟動子、桿狀病毒系統(tǒng)的多角體啟動子及其它已知控制原核細胞或真核細胞或其病毒的基因表達的序列，及這些序列的各種組合。這種控制序列的性質(zhì)和應(yīng)用根據(jù)宿主生物體而有所不同。在原核生物中，這種調(diào)節(jié)序列一般包括啟動子、核糖體結(jié)合位點、及轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語“調(diào)節(jié)序列”是指最小程度包括可影響表達的成分，及也可以包括有益的額外成分，例如前導(dǎo)序列和融合配體序列。
在某些實施方案中，多核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄在啟動子序列(或其它調(diào)節(jié)序列)的控制下，所述啟動子序列控制多核苷酸在指定細胞類型中表達。還要理解多核苷酸可以在與那些控制天然發(fā)生形式的多核苷酸的表達的序列是相同或不同的調(diào)節(jié)序列的控制下。
術(shù)語“報道基因”是指一種核酸，包含編碼通過存在或活性而易于檢測的蛋白質(zhì)的核苷酸序列，包括但不限于熒光素酶、熒光蛋白(例如綠色熒光蛋白)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、β-半乳糖苷酶、分泌的胎盤堿性磷酸酶、β-內(nèi)酰胺酶、人生長激素、及其它分泌的酶報道基因。通常地，報道基因編碼宿主細胞不另外產(chǎn)生的多肽，其可通過分析細胞而檢測，例如通過對細胞進行直接熒光分析、放射性同位素分析或分光光度分析及典型地不需要殺傷細胞進行信號分析。在某些情況中，報道基因編碼一種酶，其使得宿主細胞的熒光性質(zhì)發(fā)生改變，這可通過定性、定量或半定量功能或轉(zhuǎn)錄激活而檢測。典型酶包括酯酶、β-內(nèi)酰胺酶、磷酸酶、過氧化物酶、蛋白酶(組織纖溶酶原激活物或尿激酶)及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或在將來揭示的其功能可通過適當(dāng)?shù)纳驘晒獾孜餀z測的其它酶。
如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)錄因子”是指已知胞質(zhì)或核蛋白，其與基因結(jié)合，或者與基因的RNA轉(zhuǎn)錄物結(jié)合，或者與另一種蛋白質(zhì)結(jié)合，該另一種蛋白質(zhì)結(jié)合基因或RNA轉(zhuǎn)錄物或與此另一種蛋白質(zhì)依次結(jié)合基因或RNA轉(zhuǎn)錄物的又一種蛋白質(zhì)，從而調(diào)節(jié)基因的表達。這種調(diào)節(jié)可另外通過其它機制達到，“基因的轉(zhuǎn)錄因子”的實質(zhì)是以某種方式改變基因轉(zhuǎn)錄水平的因子。術(shù)語“轉(zhuǎn)錄因子”一般也可以指一種蛋白質(zhì)，其通過與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件和進行轉(zhuǎn)錄的細胞成分包括RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄相關(guān)因子(TAF)、染色質(zhì)重塑蛋白及影響基因轉(zhuǎn)錄的任何其它相關(guān)蛋白相互作用而調(diào)節(jié)基因表達。
術(shù)語“載體”是指能運輸其已經(jīng)連接的另一個核酸的一種核酸。根據(jù)本發(fā)明可使用的一種類型的載體是一種附加體，即能在染色體外復(fù)制的核酸。其它載體包括那些能使得它們連接的核酸自主復(fù)制和表達的那些載體。能指導(dǎo)與其可操縱地連接的基因表達的載體在本文稱作“表達載體”。通常地，在重組DNA技術(shù)中有效的表達載體通常是質(zhì)粒形式。在本說明書中，“質(zhì)粒”和“載體”可互換使用，因為質(zhì)粒是載體最常用的形式。然而，本發(fā)明包括同等作用并隨后為本領(lǐng)域所已知的這種其它形式的表達載體。
本文所用術(shù)語“表達載體”是指在適當(dāng)?shù)乃拗骷毎心苤笇?dǎo)特定核苷酸序列表達的DNA序列，包含與感興趣的核苷酸序列可操縱地連接的一個啟動子，所述感興趣的核苷酸序列與轉(zhuǎn)錄終止序列可操縱地連接。其還典型地包含核苷酸序列正確翻譯所需的序列。包含感興趣的核苷酸序列的構(gòu)建體可以是嵌合的。該構(gòu)建體也可以是天然發(fā)生的但已經(jīng)以用于異源表達的重組形式獲得的構(gòu)建體。感興趣的核苷酸序列，包括設(shè)計為導(dǎo)致核苷酸序列正確表達的任何額外的序列，也可以稱作“表達彈夾”。
如本文所用，術(shù)語“異源基因”，“異源DNA序列”，“異源核苷酸序列”，“外源核酸分子”或者“外源DNA節(jié)段”均是指源自與指定宿主細胞無關(guān)的來源，或者如果來自相同來源則是對其原始形式加以修飾的序列。因此，宿主細胞中的異源基因包括與特定的宿主細胞是內(nèi)源的但已經(jīng)修飾的基因，例如通過誘變或通過分離自天然的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列。該術(shù)語還包括天然發(fā)生核苷酸序列的非天然發(fā)生的多個拷貝。因此，該術(shù)語是指一個DNA節(jié)段，其與細胞是外源或異源的，或者與細胞同源但位于宿主細胞核酸內(nèi)該元件不常發(fā)現(xiàn)的位置。
當(dāng)兩個核酸的每個序列在子代核酸中組合時，則這兩個核酸是“重組的”。當(dāng)兩個核酸均是重組的底物時，則這兩個序列是“直接重組的”。當(dāng)序列是使用一個中間物如交換寡核苷酸重組時，則這兩個序列是“間接重組的”。對于間接重組，只是這些序列之一是重組的實際底物，在一些情況中，無一序列是重組底物。
如本文所用，術(shù)語“調(diào)節(jié)元件”是指參與控制核苷酸序列表達的核苷酸序列。調(diào)節(jié)元件可包含與感興趣的核苷酸序列可操縱地連接的啟動子和終止信號。調(diào)節(jié)序列還包括增強子和沉默子。它們還典型地包含該核苷酸序列正確翻譯所需的序列。
如本文所用，術(shù)語“顯著增加”是指數(shù)量(例如PGC數(shù))的增加高于測定技術(shù)中固有的誤差幅度，在一個實施方案中在基線數(shù)量(例如在未處理的野生型胚胎的特異發(fā)育時期在特異的位置存在的PGC的平均數(shù))上增加大約10％或更高，在另一個實施方案中增加大約25％或更高，及在另一個實施方案中增加大約50％或更高。
如本文所用，術(shù)語“顯著少于”和“顯著降低”是指數(shù)量(例如PGC數(shù))的降低高于測定技術(shù)中固有的誤差幅度，在一個實施方案中在基線數(shù)量(例如在未處理的野生型胚胎的特異性發(fā)育時期在特異的位置存在的PGC的平均數(shù))上降低大約10％或更高，在另一個實施方案中降低大約25％或更高，及在另一個實施方案中降低大約50％或更高。
如本文所用，術(shù)語“特異性結(jié)合”及其語法學(xué)上的變化用語是指抗體與關(guān)聯(lián)表位的結(jié)合親和性。就揭示的方法而言，“特異性結(jié)合”是指涵蓋了在生理學(xué)條件(例如在禽胚胎中可發(fā)現(xiàn)PGC的位置內(nèi))下抗體(例如IgY分子)與抗原之間的結(jié)合，導(dǎo)致包含該表位的大分子的正常生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)。換句話說，在一個實施方案中，如果在發(fā)育中的胚胎中IgY分子結(jié)合的大分子的生物學(xué)活性相對于在另一個發(fā)育中的胚胎中在無IgY分子的情況中在相似胚胎期中的活性改變，則IgY分子與表位之間的相互作用被認為是特異性的。
同樣，短語“與抗體特異性(或選擇性)結(jié)合”及“與…特異性免疫反應(yīng)”當(dāng)對于多肽或肽上存在的表位而言時，是指在存在異源多肽群及其它生物制劑的情況中確定多肽存在的結(jié)合反應(yīng)。因此，在設(shè)計的免疫分析條件下，指定的抗體結(jié)合特定的多肽但不以顯著量結(jié)合樣品中存在的其它多肽。在這種條件下與抗體的特異性結(jié)合可需要根據(jù)其對特定多肽的特異性而選擇的抗體。例如，可以選擇針對PGC相關(guān)的抗原產(chǎn)生的抗體以獲得與該抗原特異性免疫反應(yīng)而與其它抗原則否的抗體?？梢允褂枚喾N免疫分析方式以選擇與特定多肽特異性免疫反應(yīng)的抗體。例如，通常使用固相ELISA免疫分析、Western印跡、或免疫組織化學(xué)，以選擇與某個多肽特異性免疫反應(yīng)的單克隆抗體。見Harlow & Lane，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratories，Cold Spring Harbor，New York，United States ofAmerica，1988，其描述了可用于確定特異性免疫反應(yīng)的免疫檢測方式和條件。典型地，特異性或選擇性反應(yīng)是背景信號或噪音的至少兩倍，及更典型地是背景的10-100倍以上。
如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指將異源DNA導(dǎo)入禽細胞、禽組織或禽內(nèi)的方法。轉(zhuǎn)化的禽細胞、禽組織和禽應(yīng)理解為不僅涵蓋了轉(zhuǎn)化過程的終產(chǎn)物，而且還包含其轉(zhuǎn)基因子代。
如本文所用，術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”、“轉(zhuǎn)基因的”及“重組的”是指其中已經(jīng)導(dǎo)入異源核酸分子的宿主生物體如禽PGC。核酸分子可以穩(wěn)定整合入宿主的基因組中，或者核酸分子也可以作為染色體外分子存在。這種染色體外分子可以是自主復(fù)制的。轉(zhuǎn)化的細胞、組織、或細胞應(yīng)理解為不僅涵蓋了轉(zhuǎn)化方法的終產(chǎn)物，而且還包含其轉(zhuǎn)基因子代。“非轉(zhuǎn)化的”、“非轉(zhuǎn)基因的”或“非重組的”宿主是指野生型生物體，例如野生型禽PGC，其不含有異源核酸分子。
II.免疫禽類及在卵黃中抗體的沉積禽類，尤其是雞，由于在卵產(chǎn)生期間大量抗體被從血清移至卵黃的事實而逐漸成為大規(guī)模生產(chǎn)多克隆抗體的常用原料。見Rose et al.，Eur J Immunol 4521，1974所述。本發(fā)明利用這種現(xiàn)象通過用在卵黃內(nèi)收集的PGC相關(guān)的抗原免疫雌性禽而在胚胎內(nèi)實現(xiàn)PGC發(fā)育。這些抗體然后在禽胚胎發(fā)生期間結(jié)合其關(guān)聯(lián)抗原，從而影響與PGC發(fā)育相關(guān)的多肽的生物學(xué)活性。
A.抗原和表位本發(fā)明涵蓋了包含或者由多肽表位組成的多肽，可用于產(chǎn)生與該表位結(jié)合的IgY抗體。在另一個非限制性實施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO2或6所示氨基酸序列，表位存在于具有SEQ ID NO3、4、7或8所示氨基酸序列的肽抗原上。然而，應(yīng)注意本文揭示的肽如Vasa-N、Vasa-C、Dazl-N和Dazl-C只是代表性的，其它抗原肽和多肽，包括全長形式的與PGC發(fā)育相關(guān)的多肽(包括但不限于包含SEQ ID NO2或6所示氨基酸序列的多肽)可用作免疫原。
如本文所用，術(shù)語“表位”是指在禽中具有抗原或免疫原性活性的多肽的一部分，在一個實施方案中是在雞中。在一個實施方案中，本發(fā)明涵蓋了包含一個表位的多肽，以及編碼這個多肽的多核苷酸。如本文所用，“免疫原性表位”是指在禽中激發(fā)抗體應(yīng)答的蛋白質(zhì)的一部分，這通過本領(lǐng)域已知的任何方法確定，例如通過產(chǎn)生本文所述抗體的方法確定。如本文所用，術(shù)語“抗原性表位”是指抗體可免疫特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)的一部分，這通過本領(lǐng)域已知的任何方法確定，例如，通過本文所述的免疫分析確定。免疫特異性結(jié)合不包括非特異性結(jié)合，但不必然排除與其它抗原的交叉反應(yīng)?？乖员砦徊恍枰仨毷敲庖咴缘?。應(yīng)理解如本文所用術(shù)語“表位”涵蓋了在禽中具有抗原或免疫原性活性的多肽的任何部分，包括但不限于多肽自身的氨基酸亞群(在本文也稱為肽抗原)，但也包括在該多肽中摻入額外組分的多肽的任何修飾物(例如翻譯后加入一或多個碳水化合物基團)。
起表位作用的片段可以通過任何常規(guī)方法產(chǎn)生。見例如Houghten，Proc Natl AcadSci USA825131-5135，1985所述；及另外見U.S.專利NO4,631,211所述。
在本發(fā)明中，抗原性表位在一個實施方案中含有至少4個氨基酸的一個序列，在另一個實施方案中含有至少5個，在另一個實施方案中含有至少6個，在另一個實施方案中含有至少7個，在另一個實施方案方案中至含有少8個，在另一個實施方案中含有至少9個，在另一個實施方案中含有至少10個，在另一個實施方案中含有至少15個，在另一個實施方案中含有至少20個，在另一個實施方案中含有至少25個，及在另一個實施方案中含有大約15-30個氨基酸的序列。包含免疫原性或抗原性表位的代表性多肽的長度為至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個氨基酸?？乖员砦挥糜诶绠a(chǎn)生抗體，包括IgY抗體，其特異性結(jié)合該表位。抗原性表位可用作在免疫分析中靶定分子。見例如Wilson et al.，Cell 37767-778，1984；Sutcliffe et al.，Science 219660-666，1983所述。
相似地，可以使用免疫原性表位例如根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法誘導(dǎo)抗體。見例如Sutcliffe et al.，如前；Wilson et al.，如前；Chow et al.，Proc Natl Acad Sci USA82910-914，1985；及Bittle et al.，J GenVirol662347-2354，1985所述。包含一或多個免疫原性表位的多肽可以與一個載體蛋白如白蛋白一起呈遞給禽系統(tǒng)(例如雞)以激發(fā)抗體應(yīng)答，或者如果該多肽足夠長(至少大約25個氨基酸)，則該多肽可以不用載體而呈遞。然而，包含少如8-10個氨基酸的免疫原性表位已經(jīng)示出足以產(chǎn)生至少能結(jié)合變性的多肽中的線性表位的抗體(例如在Western印跡中)。
本發(fā)明的具有表位的多肽可用于誘導(dǎo)抗體，根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法進行，包括但不限于體內(nèi)免疫方法。見例如Sutcliffe et al.，如前；Wilson et al.，如前；及Bittle et al.，如前所述。如果使用體內(nèi)免疫方法，則禽可以用游離肽免疫；然而，抗肽抗體效價可以通過將所述肽與大分子載體偶聯(lián)而加強，所述載體如匙孔嘁血藍蛋白(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破傷風(fēng)毒素。例如，含有半胱氨酸殘基的肽可以使用一個接頭如馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)與載體偶聯(lián)，而其它肽可以使用更一般的連接劑如戊二醛與載體偶聯(lián)。禽如雞用游離的或載體偶聯(lián)的肽免疫，例如通過肌內(nèi)注射(例如注入胸大肌)含有大約10-1000微克的肽或載體蛋白及Freund′s佐劑或已知刺激免疫應(yīng)答的任何其它佐劑的乳液進行免疫。一些加強注射可以例如在間隔大約2周應(yīng)用，以提供使用吸附于固體表面的游離肽通過ELISA分析可以檢測的抗肽抗體的有效效價。免疫的動物的血清中抗肽抗體的效價可以通過抗肽抗體的選擇而增加，例如根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法通過肽在固體表面上的吸附及選擇的抗體的洗脫而進行。
B.綴合物和佐劑如本領(lǐng)域所熟知，給定的組合物其免疫原性可以改變。因此通常必須加強宿主免疫系統(tǒng)，這可以通過將肽或多肽免疫原與載體綴合而實現(xiàn)。代表性的載體是匙孔血藍蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)。其它白蛋白如卵清蛋白、小鼠血清白蛋白或兔血清白蛋白也可用作載體。多肽與載體蛋白綴合的方法為本領(lǐng)域所熟知，包括戊二醛、m-馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯、碳二亞胺及雙-二氮化對二氨基聯(lián)苯的使用。
也如本領(lǐng)域所熟知，特定的免疫原組合物的免疫原性可以通過使用免疫應(yīng)答的非特異性刺激物(已知為佐劑)而增強。代表性佐劑包括完全Freund′s佐劑(含有滅活的Mycobacteriun tuberculosis的免疫應(yīng)答非特異性刺激物)、不完全的Freund′s佐劑、氫氧化鋁、及TITERMAX佐劑(TMA；CytRx Corp.，Norcross，Georgia，UnitedStates of America)。
多克隆抗體的生產(chǎn)中使用的免疫原組合物的數(shù)量根據(jù)免疫原的性質(zhì)以及用于免疫的動物而變化?？梢允褂迷S多途徑給予免疫原(經(jīng)皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)給予)。在一個實施方案中，禽是通過胸大肌肌內(nèi)注射抗原制品而免疫。多克隆抗體的產(chǎn)生可以通過在免疫后的各個時間點取免疫的動物血樣而監(jiān)測。隨后也可以給予加強注射。重復(fù)加強和效價測定的程序直至達到合適的效價。當(dāng)獲得希望水平的免疫原性時，使免疫的動物血液流出，分離血清并貯存。
C.抗體從卵黃中的分離結(jié)合與PGC相關(guān)的抗原的抗體在用抗原(例如用包含抗原的肽)免疫的雌性禽產(chǎn)生的卵的卵黃中沉積。在一些實施方案中，抗體可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)從卵黃中分離。見例如Akita et al.，JImmunol Meth 160207-214，1993；Akita et al.，J FoodSci57629-634，1992；U.S.Patent NO4,357,272所述。如U.S.PatentNO4,357,272所教導(dǎo)，IgY可以通過用聚乙二醇(PEG)沉淀而從卵黃中純化。簡而言之，收集卵黃并在蒸餾水中洗滌以除去蛋清。卵黃可經(jīng)過一個玻璃漏斗進入量筒中，使得卵黃囊破裂并釋出卵黃，在該量筒中收集卵黃。測定卵黃的體積并加入相當(dāng)于2體積卵黃的緩沖液(例如磷酸鹽緩沖鹽水；PBS)并徹底混和。加入PEG(例如PEG 6000)至終濃度為3.5％(重量體積；w∶v)。攪拌該混合物直至PEG完全溶解。然后將該混合物在12,000g離心10分鐘。離心步驟導(dǎo)致離心管中產(chǎn)生三個相。頂層是黃色脂肪層，中間層是清澈的上清層，底層是由卵黃塊和蛋白質(zhì)“沉淀”組成的。可將含有IgY的上清液和脂肪層輕輕倒入在漏斗頸部含有脫脂棉塞的漏斗中。該棉塞除去脂質(zhì)層。然后測定清澈的過濾物的體積并輕輕攪拌加入PEG，至終濃度為12gPEG/100ml卵黃提取物。在這個濃度，PEG使得IgY完全置換。然后將沉淀如前所述離心。沉淀物可以在磷酸鹽緩沖液中再溶解為原始體積，并用12％PEG再沉淀一次IgY并離心。剩余的PEG可以通過再離心和抽吸任何液體的兩次循環(huán)而除去(IgY在沉淀中發(fā)現(xiàn))。之后，將最終的沉淀物以相當(dāng)于半體積的得到沉淀物的卵黃的磷酸鹽緩沖液進行溶解，盡管以較小的體積溶解沉淀物，但如果需要可以獲得更濃縮的溶液。對于注射進希望更完全除去PEG的動物中，IgY可以通過用半飽和的硫酸銨沉淀IgY隨后離心而除去微量的PEG。PEG在硫酸銨水溶液相中形成液相，而IgY形成在離心管底部的第三相。
通過這種方式或本領(lǐng)域已知的任何其它方法純化的IgY可用于使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)的免疫分析中，包括但不限于酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫沉淀等。標準的二級試劑如抗IgY二級抗體可得自許多生產(chǎn)商，包括Research Diagnostics Inc.，F(xiàn)landers，New Jersey，United States of America，及Aves Labs，Inc.，Tigard，Oregon，UnitedStates of America。
III.調(diào)節(jié)PGC增殖和發(fā)育的方法本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)禽胚胎中PGC發(fā)育的方法。本發(fā)明的方法提供的調(diào)節(jié)可表現(xiàn)為胚胎中PGC的性質(zhì)或數(shù)量上的差異，包括但不限于發(fā)育中的胚胎中存在的PGC數(shù)相對于在未進行本發(fā)明方法處理的相同物種的相同胚胎期的胚胎中正常發(fā)現(xiàn)的PGC數(shù)的減少或增加。或者，所述調(diào)節(jié)可表現(xiàn)為干擾胚胎中PGC的正常發(fā)育，由此PGC在遷移至生殖腺或者一旦其進入胚胎生殖腺的微環(huán)境即發(fā)育方面均不能正常發(fā)育。
一些研究小組已經(jīng)報道了化學(xué)制品和放射在調(diào)節(jié)禽胚胎中PGC水平中的應(yīng)用。用于降低內(nèi)源性PGC水平的一種特殊的化學(xué)制品是白消安(busulfan)(見Aige-Gil & Simkiss，Res VetSci 50139，1991；Vick et al.，J Reprod Fert 98637；Bresler et al.，Br Poutry Sci35241，1994；Hallett & Wentworth，Poultr Sci 701619，1991；U.S.PatentApplication Publication NO20030111016所述)。化合物白消安(1，4-二甲磺酸丁酯，BU)在白血病的治療中用作化療劑(Bhagwatwar et al.，Cancer，Chemother Pharmacol 37401-08，1996)。在1963年，Hemsworth和Jackson論證了在大鼠中給予BU可明顯削弱PGC的發(fā)育(Hemsworth & Jackson，J Reprod Dev 6229-33，1963)。將BU注射進雞胚胎的卵黃囊中導(dǎo)致多重畸形(Swartz，Teratology 211-8，1980)。Hallett和Wentworth(Poult Sci 701619-23，1991)也報道了在將BU的蛋白懸浮液注射進鵪鶉卵中之后孵化能力顯著降低。在一些BU處理的鵪鶉中，表現(xiàn)為生殖腺中生殖細胞缺少，而其它相似處理的禽表現(xiàn)正常。作者提示“BU輸送至胚胎中的不一致”也許可以解釋觀測的變化。他們推斷揭示一種非毒性的溶劑系統(tǒng)對消除使用懸浮液相關(guān)的不一致的結(jié)果是必需的。Aige-Gil & Simkiss(Br Poult Sci32427-438，1991)在雞胚胎中使用BU的鹽水或芝麻油懸浮液，或者溶解于二甲基亞砜(DMSO)中的BU。單獨給予DMSO產(chǎn)生使用鹽水未觀測到的胚胎死亡、發(fā)育延緩及畸形。當(dāng)BU懸浮于芝麻油中并注射進卵黃中時，致畸效應(yīng)顯著最小化。注射處于芝麻油中的100μg BU導(dǎo)致不育指數(shù)為95+％。在隨后的實驗中，Vick及其同事(J ReprodFertil 98637-41，1993)報道了注射25、50及250μg BU顯著減少雞胚胎中生殖腺生殖細胞。他們估計當(dāng)與未用BU處理的胚胎相比時，BU處理使種系嵌合率提高3.5倍。Bresler等(Br Poult Sci 35241-47，1994)論證了用BU處理及隨后注射PGC可導(dǎo)致生殖腺顯著種群恢復(fù)。注射懸浮于芝麻油中的50μg BU，使得6天齡的雞胚胎的左側(cè)和右側(cè)生殖腺中PGC分別減少75％和78％。在將生殖新月區(qū)細胞的懸浮液注射進BU處理的胚胎中之后，左側(cè)和右側(cè)生殖腺中PGC數(shù)分別增加到對照組的72％和115％。輸送BU至生殖腺的可變性及所產(chǎn)生的降低PGC數(shù)的有效性中的不一致，限制了這種技術(shù)的應(yīng)用。
在美國專利申請出版物NO20030111016中，發(fā)明人在給予供體PGC之前使用白消安降低內(nèi)源性PGC。簡而言之，在一個玻璃瓶中將15mg白消安溶解于5ml二甲基甲酰胺(DMF)。向此溶液中加入5ml芝麻油。將混合物完全旋動以產(chǎn)生乳液。該乳液中白消安的濃度為1.5μg/μl。為每個批次注射制備新鮮的白消安乳液。將受精卵在37.5℃，60％相對濕度下孵育22小時。然后將卵水平置于孵育器中2小時。每個卵的鈍端用70％乙醇清潔。使用彎曲鑷子在覆蓋氣室的殼上做一小孔，而不破壞外部殼膜。使用皮下注射器針頭(21G×1.5英寸)，將501μl白消安乳液(含有75μg白消安)通過氣室水平注射進卵黃中。將乳液在使用之前完全旋動。在整個注射程序中將卵保持水平。殼上的孔用透明膠帶密封。注射后將卵垂直孵育。
在27期(H & H)收集白消安處理的胚胎并在4％低聚甲醛中固定。將胚胎包埋于石蠟中，以7μm厚度切片，并用SSEA-1抗體進行免疫組織化學(xué)染色。計數(shù)每個胚胎的10個隨機選擇的切片中左側(cè)和右側(cè)生殖腺中的PGC數(shù)，并使用等式IS＝(N--X)/N計算不育指數(shù)(IS)，其中N是對照生殖腺的PGC數(shù)，X是白消安處理的胚胎的PGC數(shù)(Reynaud，J Embryol Exp Morphol 21485-507，1969)。確定芝麻油、DMF和白消安對27期的雞胚胎存活力的作用，并還評定給予白消安后處理的禽的孵化能力。顯示出白消安降低了PGC數(shù)，特別是以75μg劑量在芝麻油和DMF中乳化時尤其如此，盡管處理的胚胎的存活力是未處理的對照組的1/4至1/2。
在一些實施方案中，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)禽胚胎中原生殖細胞數(shù)的方法，所述方法包括用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫雌性禽，從而該雌性禽生產(chǎn)的卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的禽胚胎中內(nèi)源性PGC數(shù)。
如本文所用，術(shù)語“調(diào)節(jié)”是指一個生物化學(xué)實體如PGC的任何或所有化學(xué)和生物學(xué)活性或性質(zhì)的增加、降低或其它改變。同樣，術(shù)語“調(diào)節(jié)”可以指發(fā)育中的胚胎中存在的PGC數(shù)相對于相同物種相同胚胎期的非嵌合胚胎而變化。例如，術(shù)語“調(diào)節(jié)”可以意味著“抑制”、“降低”或“阻抑”，但術(shù)語“調(diào)節(jié)”的應(yīng)用不限于這種解釋。如本文所用，術(shù)語“抑制”、“降低”、“阻抑”、“負調(diào)節(jié)”及語法學(xué)上的變化用語可互換使用，是指一種活性，其可使胚胎中存在的PGC數(shù)或發(fā)育降低至低于在沒有PGC相關(guān)多肽上存在的抗原的抗體的情況下觀測到的結(jié)果。在一個實施方案中，抗體分子(例如抗VASA、DAZL、EMA-1等的IgY)的抑制導(dǎo)致在用供體PGC種群恢復(fù)之前的胚胎中存在的PGC數(shù)減少。
在另一個實施方案中，禽胚胎中存在的PGC數(shù)在存在PGC相關(guān)多肽上存在的抗原的抗體情況中高于不存在該抗體的情況。
本文所用術(shù)語“調(diào)節(jié)”是指在用供體PGC種群恢復(fù)之前胚胎中PGC數(shù)(或其發(fā)育)的正調(diào)節(jié)(即激活、增強或刺激)和負調(diào)節(jié)(即抑制、降低或阻抑)。因此，術(shù)語“調(diào)節(jié)”當(dāng)對于功能性質(zhì)或生物學(xué)活性或過程(例如PGC的發(fā)育，包括但不限于增殖)而言時，是指正調(diào)節(jié)(例如激活、增強或刺激)、負調(diào)節(jié)(例如抑制、降低或阻抑)、或另外改變一些這種性質(zhì)、活性或過程(例如PGC發(fā)育和增殖)的能力。
在本發(fā)明特殊的實施方案中，受體禽中內(nèi)源性PGC數(shù)在導(dǎo)入供體PGC之前是降低的。在這種方式中，供體PGC可在受體禽的生殖腺進行種群恢復(fù)，并可以提高產(chǎn)生嵌合禽的效率及衍生自供體禽的配子(和子代)的比例。內(nèi)源性PGC可降低至少大約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或者更多。在其它的特殊實施方案中，受體禽基本不育，這個術(shù)語在本文已解釋。受體禽中內(nèi)源性PGC數(shù)的定向減少可以基于許多考慮因素，包括但不限于希望的數(shù)目和衍生自供體禽的配子比例，與達到內(nèi)源性PGC降低的方法相關(guān)的任何不利作用的最小化，等等。
換而言之，可以實踐本發(fā)明揭示的方法，以便衍生自供體PGC的配子(和/或子代)與受體禽的PGC的比率可以是大約10/90、20/80、30/70、40/60、50/50、60/40、70/30、80/20、90/10或更高。在一些實施方案中，可以實踐本發(fā)明的方法以便少于50％的配子(和/或子代)衍生自供體PGC。衍生自供體PGC相對低比例的配子和/或子代在那些應(yīng)用中是可接受的，其中只需要來自嵌合禽的相對較少數(shù)的供體配子和/或子代，和/或來自嵌合禽的供體配子和/或子代是有商業(yè)價值的。
在一個實施方案中，受體禽中PGC數(shù)由于存在卵黃中沉積的母代抗體而降低。這些抗體通常稱為IgY，當(dāng)它們結(jié)合PGC相關(guān)的多肽上呈遞的抗原時能影響胚胎中PGC的發(fā)育，在一個實施方案中抗原存在于與PGC遷移或發(fā)育相關(guān)的多肽上。
PGC中的降低是通過用與PGC相關(guān)的抗原免疫雌性禽而達到的?？乖梢猿蔬f在與PGC發(fā)育相關(guān)的多肽上(例如VASA多肽)，包括但不限于肽抗原(例如VASA多肽的4或多個氨基酸的一段序列)和碳水化合物抗原(例如翻譯后加入PGC表面上的多肽的碳水化合物組分)。當(dāng)雌性禽用這個抗原(或眾多這種抗原)免疫時，禽可以產(chǎn)生對該抗原的免疫應(yīng)答。當(dāng)免疫的禽產(chǎn)卵時，抗原的抗體沉積在卵黃中。然后這些抗體能結(jié)合在卵中發(fā)育的胚胎中存在的其關(guān)連抗原，從而調(diào)節(jié)含有該抗原的發(fā)育中的胚胎內(nèi)存在的大分子的生物學(xué)活性。
IV.產(chǎn)生嵌合禽的方法本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)嵌合禽的方法。在一些實施方案中，本發(fā)明方法包括(a)用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫雌性禽；(b)該雌性禽產(chǎn)卵，其中該卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的受體胚胎中PGC發(fā)育、PGC數(shù)，或其組合；(c)將供體PGC經(jīng)卵內(nèi)給予受體胚胎以產(chǎn)生嵌合禽。
嵌合禽通過將供體胚盤細胞移至受體禽胚盤中而產(chǎn)生。參見Etches et al.，Poult Sci 761075，1997所述。嵌合禽，特別是種系嵌合物，也已經(jīng)通過將PGC移至受體胚胎中而產(chǎn)生，所述PGC包括衍生自生殖新月區(qū)的PGC、在血液中發(fā)現(xiàn)的循環(huán)PGC及在生殖嵴中發(fā)現(xiàn)的生殖腺PGC。參見Tajima，Avian Poult Biol Rev 1315-30，2002所述。已經(jīng)報道了胚盤細胞含有假定的PGC(Kagami et al.，Mol ReprodDev 48501，1997；Ginsburg & Eyal-Giladi，J Embryol Exp Morphol9553，1986)，如果是真的則可以解釋通過胚盤細胞轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生種系嵌合禽的能力。在本發(fā)明的一些實施方案中，胚盤細胞和/或PGC可以通過本領(lǐng)域熟知的技術(shù)導(dǎo)入發(fā)育中的禽胚胎中，包括將細胞注射進終竇，注射進大動脈，注射進生殖新月區(qū)，注射進胚胎體腔中，等等。
大多數(shù)禽嵌合物產(chǎn)生應(yīng)用雞。見例如Naito et al.，Mol ReprodDev39153-161，1994所述。然而嵌合禽的產(chǎn)生不限于雞。嵌合物也已經(jīng)在鵪鶉中通過將來自鵪鶉的早期胚盤細胞移至鵪鶉的胚胎中而產(chǎn)生。見Ono et al.，Jpn Poult Sci 31119，1994所述。
另外，種間嵌合物已經(jīng)通過將鵪鶉胚盤細胞導(dǎo)入雞胚盤中(Watanabe et al.，Development 114331-338，1992)及通過將解離的火雞生殖新月區(qū)細胞和/或PGC導(dǎo)入雞胚胎中(Reynaud，J Exbryol ExpMorphol 21485-507，1969；U.S.Patent No.6,354,242；U.S.PatentApplication Publication 20030111016)而產(chǎn)生。
本領(lǐng)域技術(shù)人員意識到供體PGC可以遺傳修飾之后給予受體禽，例如通過基因破壞和/或?qū)胍换蚨鄠€異源核苷酸序列而修飾。本領(lǐng)域已知將異源序列瞬時導(dǎo)入或穩(wěn)定導(dǎo)入禽細胞的方法(見例如Bosselman等的美國專利NO5,162,215所述)。在一個實施方案中，將異源核苷酸序列穩(wěn)定摻入PGC中。本領(lǐng)域已知將感興趣的核酸導(dǎo)入受體細胞中的方法，包括脂轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染、顯微注射、轉(zhuǎn)化、微粒技術(shù)，等等?？梢允褂萌魏魏线m的載體，包括質(zhì)粒、病毒(包括逆轉(zhuǎn)錄病毒)、噬菌體，等等，無論是天然形式還是其衍生物形式。
供體PGC可加以遺傳修飾以在受體禽中產(chǎn)生希望的結(jié)果(例如表達決定性別的轉(zhuǎn)基因)?；蛘?，可以指定遺傳修飾傳遞至嵌合禽的子代并產(chǎn)生希望的作用。
導(dǎo)入一或多個異源核苷酸序列(例如外源序列或額外的或修飾的內(nèi)源序列的拷貝)可以用于許多應(yīng)用中，例如在禽中產(chǎn)生感興趣的多肽(例如在這種禽的血漿或卵中以方便地收集和純化)。根據(jù)這個實施方案，該禽可基本用作生物反應(yīng)物。感興趣的多肽包括治療性多肽(例如獸醫(yī)或醫(yī)學(xué)應(yīng)用)或免疫原性多肽(例如疫苗)、抗體(包括但不限于抗體片段和單鏈抗體)、酶(例如工業(yè)酶)、激素和生長因子，或者任何其它感興趣的蛋白質(zhì)。
或者，多肽可以是報道基因多肽，其作為供體細胞的標記(例如綠色熒光蛋白、β-半乳糖苷酶、堿性磷酸酶、β-內(nèi)酰胺酶、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶、及氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)。標記可用于監(jiān)測胚胎發(fā)育和/或分析細胞結(jié)局和遷移等目的(見例如Mozdziak et al.Dev Dynamics 226439-445，2003所述)。這個參考文獻論證了對于細胞命運分析的第一個成功的轉(zhuǎn)基因禽品系。
在其它實施方案中，多肽是治療性或免疫原性多肽或者是對受體禽具有希望的或有益作用的任何其它多肽，例如具有希望的表型作用或增強生長性能(包括但不限于增加的肌肉和/或減少的脂肪沉積和/或改良的飼養(yǎng)/收獲比率)，卵產(chǎn)生，疾病耐受性，等等的多肽。
另外，感興趣的異源核酸可編碼反義核酸、核酶(例如美國專利NO5,877,022所述)或者任何其它非翻譯RNA。
本領(lǐng)域技術(shù)人員理解感興趣的異源核苷酸序列可以與合適的控制序列可操縱地連接。例如，異源核酸可以與表達控制元件可操縱地連接，所述表達控制元件包括但不限于轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號、復(fù)制源點、聚腺苷酸化信號、及內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)、啟動子、增強子，等等。
進一步意識到根據(jù)希望的水平和組織特異性表達可使用多種啟動子/增強子元件。根據(jù)希望的表達模式，啟動子/增強子可以是組成型或可誘導(dǎo)的。啟動子/增強子可以是天然或外源的并可以是天然或合成的序列。外源是指轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域在導(dǎo)入該轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域的野生型宿主中未發(fā)現(xiàn)。在特殊的實施方案中，異源核苷酸序列與卵清蛋白啟動子或溶菌酶啟動子可操縱地連接。
在一個實施方案中，應(yīng)用與靶細胞或處理對象是天然的啟動子/增強子元件。在另一個實施方案中，應(yīng)用與異源核酸序列是天然的啟動子/增強子元件。選擇啟動子/增強子元件以便其在感興趣的靶細胞中起作用。在另一個實施方案中，應(yīng)用禽啟動子/增強子元件。啟動子/增強子元件可以是組成型或可誘導(dǎo)的。
在希望提供調(diào)節(jié)異源核酸序列過表達的那些應(yīng)用中，可應(yīng)用可誘導(dǎo)的表達控制元件。用于基因輸送的可誘導(dǎo)的啟動子/增強子元件可以是細胞或組織特異性啟動子/增強子元件。其它可誘導(dǎo)的啟動子/增強子元件包括激素可誘導(dǎo)的元件和金屬可誘導(dǎo)的元件。典型的可誘導(dǎo)的啟動子/增強子元件包括但不限于Tet on/off元件、RU486-可誘導(dǎo)的啟動子、蛻皮激素可誘導(dǎo)的啟動子、納巴霉素可誘導(dǎo)的啟動子、及金屬硫蛋白啟動子。
在其中異源核酸序列在靶細胞中被轉(zhuǎn)錄及然后翻譯的實施方案中，通常需要特異性起始信號以有效翻譯插入的蛋白質(zhì)編碼序列。這些外源翻譯控制序列，包括ATG起始密碼子和相鄰序列，其可以是各種來源的，天然的及合成的來源均可。
在眾多禽卵中增加雄性禽的比例的方法在禽中，與哺乳動物不同，雄性是同配性別(ZZ)，雌性是異配性別(Zw)。因此在禽中是雌性決定了子代的性別，因為雌性產(chǎn)生攜帶性別決定染色體的卵即Z或w染色體。因此，如本文所述，通過將雄性原生殖細胞移至雌性胚胎宿主，則由該宿主產(chǎn)生的攜帶Z的卵的百分比增加及雄性子代的百分比增加。肉用禽的雄性子代百分比增加對于相應(yīng)更高的飼養(yǎng)轉(zhuǎn)換比率及由此獲得的更有效的肉產(chǎn)量更有經(jīng)濟學(xué)價值。
當(dāng)ZZ PGC給予雄性胚胎時，在受體子代中應(yīng)無性別比率改變發(fā)生，不管供體PGC在受體生殖腺建群程度如何。只有當(dāng)ZZ PGC給予雌性(Zw)受體胚胎時才發(fā)生性別比率傾斜。因此，本發(fā)明的方法當(dāng)將ZZ PGC給予雌性(Zw)胚胎時可產(chǎn)生性別比率傾斜。
一旦達到性成熟時攜帶Z的卵在受體雌性胚胎中產(chǎn)生的程度，及因此受體產(chǎn)生雄性子代的程度，可依賴于供體ZZ PGC在受體胚胎的生殖腺建群的程度。可以發(fā)生一些可能的結(jié)果。在譜(spectrum)的一端，供體PGC不在胚胎生殖腺建群，并因此受體預(yù)期產(chǎn)生50％Z卵和50％w卵(即無性別比率傾斜發(fā)生)。在譜的另一端，供體PGC在胚胎生殖腺完全建群以排除內(nèi)源性PGC，受體預(yù)期僅產(chǎn)生Z卵，并因此受體所有的子代均是雄性的。因此，期望受體雌性禽產(chǎn)生的雄性子代的百分比可以計算為50％+(ZZ PGC在胚胎生殖腺建群的百分比除以2)，假定供體PGC和內(nèi)源性PGC相等地能獨立地產(chǎn)生卵(即產(chǎn)生的反映胚胎生殖腺內(nèi)存在的內(nèi)源和供體PGC百分比的卵)。
如此期望，最大化ZZ PGC在胚胎生殖腺的建群百分比應(yīng)可以使受體雌性禽的雄性子代百分比達到最大化?？梢允褂靡恍┓椒ㄟ_到這個目標。一種這樣的方法是將足夠數(shù)的供體PGC給予受體，由此供體PGC數(shù)顯著超過內(nèi)源性PGC。當(dāng)受體胚胎處于PGC遷移至胚胎生殖腺的胚胎期之前的胚胎期時，期望這個方法是最有效的。
另一種方法是在給予供體PGC之前除去內(nèi)源性PGC或者抑制其在胚胎生殖腺建群的能力。這可以通過從胚胎中物理性的除去內(nèi)源性PGC而達到，例如當(dāng)內(nèi)源性PGC在胚胎血液中循環(huán)時的胚胎期通過從胚胎中除去血液而達到。見Naito et al.，Mol Reprod Develop 39153，1994；Tajima et al，J Exp Zool 280265，1998所述。然而，這是一種技術(shù)要求苛刻的操作，要冒對胚胎自身發(fā)生實質(zhì)損害的危險。另一種方法是防止內(nèi)源性PGC到達和/或在胚胎生殖腺建群。一些報道描述了應(yīng)用化學(xué)制劑或放射以達到這個目標，包括使用白消安(見Aige-Gil& Simkiss，Res Vet Sci 50139，1991；Vick et al.，J Reprod Fert 98637；Bresler et al.，Br Poutry Sci 35241，1994；Hallett & Wentworth，PoultrSci 701619，1991)，伴刀豆球蛋白-A(Lee et al.，J Embryol Exp Morph465，1978)，及紫外線(uv)或γ放射(Reynaud，J Embryol Exp Morphol21485-507，1969；Reynaud，J Roux′s Arch Devel Biol 17985-110，1976；Aige-Gil & Simkiss，Br Poul Sci 32427-438，1991；Reynaud，C R HebdSeances AcadSci-DSci Natur 2821195，1976；Mraz & Woody，RadiationRes 5463-68，1973；Carsience et al.，Development 117669-75，1993；Thoraval et al.，Poultry Sci 731897-1905，1994；Maeda et al.，Poultry Sci77905-07，1998所述)。然而，使用毒性化學(xué)制劑和輻射不是最理想的，特別是對于農(nóng)業(yè)重要的禽物種。
本文揭示了另一種方法，其中識別PGC相關(guān)的抗原的抗體沉積在卵黃中，其中受體胚胎由于用該抗原免疫的母雞產(chǎn)卵的結(jié)果而發(fā)育。在這個實施方案中，雌性禽用PGC相關(guān)的抗原免疫。該抗原的抗體沉積在免疫的雌性禽產(chǎn)生的卵黃內(nèi)?？贵w然后可用于調(diào)節(jié)在卵內(nèi)生長的胚胎中PGC的發(fā)育。在一個實施方案中，抗體使胚胎生殖腺中存在的PGC數(shù)降低，由此當(dāng)供體PGC給予受體胚胎中時，供體PGC能在生殖腺建群并在此發(fā)育。然后孵育受體胚胎至孵化，使其達到性成熟。
當(dāng)用于增加從一組卵中孵化的雄性禽的數(shù)目或比率時，本發(fā)明包括經(jīng)卵內(nèi)給予雌性禽雄性(即ZZ)禽原生殖細胞。卵內(nèi)禽的性別可預(yù)先確定或在孵化后確定。然后將該禽孵育至孵化，如果需要則確定禽的性別，飼養(yǎng)至性成熟，并根據(jù)已知技術(shù)將該禽與合適的雄性種禽交配而繁殖。然后收集由這個禽產(chǎn)生的眾多受精卵，典型地孵育至孵化，飼養(yǎng)所得禽至少2-3周。由這個雌性禽產(chǎn)生的雄性與雌性禽卵(或禽)的比率高于在未經(jīng)卵內(nèi)將雄性原生殖細胞給予該禽的情況下獲得的相應(yīng)比率。這種方法典型地用于產(chǎn)肉禽物種，如雞、火雞、鴨，等等。
VI.生產(chǎn)禽配子的方法本發(fā)明還提供了生產(chǎn)禽配子的方法。在一個實施方案中，所述方法用于在第一種禽物種中生產(chǎn)來自第二種禽物種的禽配子。在一個實施方案中，所述方法包括(a)用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫第一種禽物種雌性禽，從而雌性禽產(chǎn)的卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的第一種禽物種的受體禽的PGC發(fā)育；(b)將分離自第二種禽物種的禽的供體PGC導(dǎo)入第一種禽物種的受體禽中；(c)孵育第一種禽物種的受體禽至孵化；及(d)飼養(yǎng)第一種禽物種的受體禽至性成熟，其中第一種禽物種的受體禽產(chǎn)生來自第二種禽物種的配子。
當(dāng)用于生產(chǎn)和收集禽配子(精子，卵)時，經(jīng)卵內(nèi)給予受體禽物種的原生殖細胞可以與從中獲得供體PGC的供體禽物種不同。然后孵育受體至孵化并飼養(yǎng)至性成熟，從受體動物中收集供體禽物種的精子細胞或卵，所有這些均根據(jù)標準技術(shù)進行。例如，在瀕于滅絕的物種的情況中，供體禽物種可以是鳴鶴，受體禽物種可以是沙丘鶴。在關(guān)于商業(yè)禽生產(chǎn)的另一個實施例中，供體禽物種可以是火雞，受體禽物種可以是雞。
美國專利申請出版物NO20030111016描述了在一種禽物種的胚胎生殖腺中由另一種禽物種的供體PGC進行種群恢復(fù)的方法。孵育Barred Plymouth Rock(BPR)雞胚胎直至27-28期(H & H)。BarredPlymouth Rock供體胚胎用作顏色標記，因為它們在I基因座是純合隱性的(ii)并在其羽毛中表達色素。將雄性胚胎的生殖腺收集在補加了10％FBS、谷氨酰胺、抗生素和抗真菌溶液的DMEM中。通過利用Petitte & Kegelmeyer的方法(Animal Biotechnol 619-30，1995)確定胚胎的性別。然后將生殖腺在PBS中漂洗兩次并在37℃在0.02％EDTA中孵育15分鐘。加入新鮮的培養(yǎng)基并破碎生殖腺。收集細胞懸浮液并在450g旋轉(zhuǎn)5分鐘。更換培養(yǎng)基并使用臺盼藍排除確定細胞存活力。取細胞懸浮液等分并用SSEA-1抗體染色以確定注射的PGC數(shù)。將含有100-500個PGC的大約2-3μl細胞懸浮液注射進發(fā)育14-17期(H & H)的White Leghorn(WL)胚胎的血管中。WL胚胎作為受體，因為已知它們是純合顯性的(II)。這個基因型編碼羽毛中無色素。在注射PGC之后，將卵回置入孵育器中至完全發(fā)育。在孵化時，表型WL雞系上帶子做標記，隨后飼養(yǎng)至性成熟。隨后進行測試交配以確定是否存在種系嵌合物雄性BPR×雌性WL和雄性WL×雌性BPR。隨后評價這些測試交配的子代以確定雄性BPR生殖腺PGC是否摻入WL中。由于僅用雄性BPR胚胎作為供體，因此衍生自雄性BPR×雌性WL測試交配的所有“黑色”雞(BPR表型)是雄性的。
將受精的火雞卵在38.5℃孵育8-8.5天(27-28期，H & H)。切開胚胎以獲得生殖腺。然后將含有大約150個PGC的2-3μl生殖腺細胞懸浮液注射進14期(H & H)雞胚胎的血管中。將受體卵密封并回置于孵育器中。收集不同孵育階段(19-25期)的受體胚胎。將胚胎在PBS中漂洗3次，然后在4％低聚甲醛中在4℃固定過夜。將樣品在PBS中洗滌3次，然后置于50％乙醇中。將組織脫水，包埋于石蠟中并切片。所得切片隨后通過SSEA-1和過碘酸-Schiff(PAS)染色進行免疫組織化學(xué)分析。先前的研究已經(jīng)鑒別了火雞和雞PGC對SSEA-1表達中的物種差異。這種抗原性變化結(jié)合標準PAS測試可用于鑒別火雞-雞種系嵌合物。對雙重染色的雞胚胎切片的觀測證實了雞PGC是PAS和SSEA-1雙陽性的。用PAS和SSEA-1對24期的火雞切片雙重染色證實通過背部腸系膜遷移并在生殖腺建群的火雞PGC是PAS陽性的，并且不表達SSEA-1表位。因此，對雞和火雞胚胎的雙重染色證實該雙重染色可用作區(qū)分火雞PGC對雞PGC的標記。
WL(II)×BPR(ii)雜交的子代可典型地表達WL表型(li)并呈現(xiàn)在羽毛中沒有黑色素。將雄性BPR PGC導(dǎo)入WL受體中產(chǎn)生表現(xiàn)BPR的黑色素模式的子代。這些數(shù)據(jù)支持了這樣的觀點，即沒有生物學(xué)屏障阻止通過用分離自雄性胚胎生殖腺的PGC注射雌性雞胚胎而增加的雄性子代的產(chǎn)生。然而，種系傳遞的發(fā)生率低于1％。這個系統(tǒng)中供體衍生的子代的低發(fā)生率可能涉及當(dāng)與注射的供體PGC對比時內(nèi)源性PGC呈現(xiàn)的顯著數(shù)量優(yōu)勢。用BU+DMF+SO乳液處理胚胎之后注射供體PGC使內(nèi)源性PGC數(shù)降低多至97％。當(dāng)與單獨的BU+SO處理對比時，加入DMF使內(nèi)源性PGC的降低大約15％。
在用SSEA-1和PAS雙重染色后，雞和火雞PGC基于不同的染色模式而在雞胚胎生殖腺中鑒別。由于糖原的存在，雞和火雞PGC在PAS染色之后均染成品紅色。然而，火雞PGC當(dāng)位于發(fā)育中的生殖腺中時不再是SSEA-1陽性的，這將其與在這個發(fā)育階段是SSEA-1陽性的雞PGC區(qū)分開。這些結(jié)果提示分離自胚胎火雞生殖腺的PGC可用于在雞生殖腺種群恢復(fù)。
繼續(xù)參考美國專利應(yīng)用出版物NO20030111016，將白色來亨雞(WL)胚胎在卵內(nèi)用白消安乳液(BU+DMF+芝麻油)處理以耗竭內(nèi)源性PGC。收集雄性Barred Plymouth Rock(BPR)胚胎的生殖腺，分離PGC，并將該分離的PGC經(jīng)卵內(nèi)給予白消安處理的禽和對照組未處理的禽，基本如前述實施例所述進行。在孵化后，雄性WL嵌合禽飼養(yǎng)至性成熟并與雌性BPR禽雜交。黑色子代的產(chǎn)生是衍生自BPRPGC的配子通過嵌合雄性WL親代傳遞的指征。結(jié)果表明25％(4/16)WL雄性傳遞衍生自BPR PGC的配子。在這4個嵌合禽中，傳遞比率在大約2％-23％之間。在對照禽中未進行白消安處理，僅有一個禽僅有可檢測的衍生自BPR PGC的配子的傳遞。
在一些實施方案中，本發(fā)明進行了在一種禽物種的胚胎生殖腺中用來自另一種禽物種的供體PGC進行種群恢復(fù)的方法，如美國專利應(yīng)用出版物NO20030111016所述。當(dāng)然，在這種實施方案中，本發(fā)明還進行了用原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫第一種禽物種的雌性禽，從而由該雌性禽產(chǎn)生的卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的第一種禽物種的受體禽的PGC發(fā)育。
VII.增強核酸分子種系傳遞的方法本發(fā)明還提供了一種增強核酸分子在禽中種系傳遞的方法。在一個實施方案中，所述方法包括(a)用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫一個雌性禽，從而該雌性禽產(chǎn)生的卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的受體禽中PGC孵育；(b)在足以使得眾多PGC的至少之一在受體禽的生殖腺建群的條件下，將包含該核酸分子的眾多供體PGC給予受體禽；(c)孵育該受體禽至孵化；及(d)飼養(yǎng)該受體禽至性成熟，其中該受體禽產(chǎn)生衍生自供體PGC的配子。在這個實施方案中，種系傳遞比本領(lǐng)域現(xiàn)有方法更有效，其中種系嵌合體的有效產(chǎn)生是本領(lǐng)域持續(xù)需要的。
本發(fā)明的方法基于上述揭示的關(guān)于種系嵌合體產(chǎn)生的相同原理。然而，在這個實施方案中，供體PGC在體外通過導(dǎo)入一個外源核酸分子(即轉(zhuǎn)基因)進行處理之后給予受體胚胎。這個方法不受核酸自身(例如與啟動子可操縱地連接的一個感興趣的開放讀框)或者導(dǎo)入方法(例如電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，等等)的限制。更合適地，感興趣的核酸分子使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)導(dǎo)入眾多供體PGC中，然后該供體PGC給予在用PGC相關(guān)的抗原免疫的雌性禽產(chǎn)生的卵中發(fā)育的受體胚胎。然后使得供體PGC在胚胎的生殖腺建群，當(dāng)其達到性成熟時可將該核酸傳遞至其子代。
VIII.給予可以提供并配制原生殖細胞(PGC)以通過合適的技術(shù)進行本發(fā)明，并在根據(jù)需要使用之前加以貯存、冷凍、培養(yǎng)等。
例如，原生殖細胞可以在合適的胚胎期從供體胚胎中收集。禽發(fā)育的時期在此由兩種本領(lǐng)域公認的分期系統(tǒng)之一劃分Eyal-Giladi &Kochav系統(tǒng)(EG & K；見Eyal-Giladi & Kochav，Dev Biol 49321-327，1976)，其使用羅馬數(shù)字表示發(fā)育的pre-primitive streak時期，及Hamburger & Hamilton分期系統(tǒng)(H & H；見例如Hamburger &Hamilton，J Morphol 8849-92，1951)，其使用阿拉伯?dāng)?shù)字表示產(chǎn)卵后時期。除非特別說明，本文的胚胎期是按照H&H分期系統(tǒng)劃分的胚胎期。
例如，PGC可以在4期、或者生殖新月區(qū)時期、一直到30期分離，從血液、生殖嵴或晚期的生殖腺中收集細胞。原生殖細胞的大小一般是體細胞的兩倍，基于其大小易于從中區(qū)分并分離。雄性(或同型配子的)原生殖細胞(ZZ)可以通過任何合適的技術(shù)與異型配子的原生殖細胞(Zw)區(qū)分，如從特定的供體中收集生殖細胞并對來自該供體的其它細胞進行分型，收集的細胞與分型的細胞是相同染色體類型的。
可以通過分離細胞(例如通過機械分離)并將該細胞與藥物學(xué)可接受的載體(例如磷酸鹽緩沖的鹽水溶液)密切混和而配制PGC以給予動物。原生殖細胞在一個實施方案中是生殖腺原生殖細胞，在另一個實施方案中是血液原生殖細胞(“生殖腺”或“血液”是指在原始胚胎供體中其所來源的組織)。根據(jù)給予的特定目的給予的原生殖細可以是異型配子的(Zw)或同型配子的(ZZ)。PGC可以在生理學(xué)可接受的載體中給予，在一個實施方案中是在pH為大約6-8或8.5，以合適的量給予以達到希望的作用(例如，100-1000個PGC/個胚胎)。PGC可以沒有其它成分或細胞而給予，或者可以與其它細胞或成分一起給予。
將原生殖細胞在卵內(nèi)給予受體動物可以在任何合適的時間(此時PGC仍可遷移至發(fā)育中的生殖腺)進行。在一個實施方案中，給予是在大約IX期(根據(jù)Eyal-Giladi & Kochav(EG & K)分期系統(tǒng))至大約30期(根據(jù)Hamburger & Hamilton分期系統(tǒng))進行，在另一個實施方案中，在15期進行。對于雞而言，給予時間因此在胚胎發(fā)育的第1、2、3或4天，在一個實施方案中在第2-2.5天。給予典型地是注射進任何合適的靶部位，如羊膜(包括胚胎)、卵黃囊，等區(qū)域。在一個實施方案中，注射是進入胚胎自身(包括胚胎體壁)，在另外的實施方案中，可以應(yīng)用血管內(nèi)注射或體腔內(nèi)注射進胚胎中。本發(fā)明的方法可以用先前卵內(nèi)絕育的受體禽進行(“絕育”是指部分或完全不能產(chǎn)生衍生自內(nèi)源性PGC的配子)。當(dāng)從這種受體中收集供體配子時，它們可以是供體和受體的配子混合物。這種混合物可以直接使用，或者該混合物可以進一步處理以富集其中供體配子的比例。
PGC的給予可以通過給予PGC自身或者通過給予在對象中發(fā)育為PGC的前體細胞(特別是使用本文所揭示的方法以改變子代的性比率之處)進行。例如，給予可通過將胚盤細胞注射進禽而進行，其中胚盤細胞的一個亞群在該禽體內(nèi)分化為原生殖細胞。
卵內(nèi)給予原生殖細胞可以通過任何合適的技術(shù)進行，以手工或自動方式進行。在一個實施方案中，卵內(nèi)給予是通過注射進行。卵內(nèi)給予的機械裝置不是關(guān)鍵的，但該機械裝置應(yīng)不過度損害胚胎的組織和器官或者其周圍的胚胎外膜，以便所述處理不過度降低孵化率。裝備大約18-26號針頭的皮下注射器適于這個目的。根據(jù)胚胎的精確發(fā)育時期和位置，在小雞上方的液體或小雞自身內(nèi)進針1英寸停止。在插入針頭之前在殼上打鉆通殼的定位孔以防止針頭損害或變鈍。如果需要，卵可以用細菌基本不能透過的密封材料密封，如用蠟等密封，以防止隨后不利的細菌進入。預(yù)期禽胚胎的高速注射系統(tǒng)特別適于實踐本發(fā)明。眾多這種設(shè)備是可利用的，例如EMBREX INOVOJECTTM系統(tǒng)(見Hebrank的美國專利No.4,681,063和4,903,625所述)，以及Miller的美國專利Nos.4,040,388、4,469,047和4,593,646所描述的設(shè)備。本文引用的所有美國專利的揭示在此均以其全文并入?yún)⒖?。適于實踐本發(fā)明方法的所有這種設(shè)備包含一個含有所述原生殖細胞配制品的注射器，將注射器定位以注射進由該設(shè)備攜帶的如上述卵內(nèi)的適當(dāng)位置。另外，可以提供與注射設(shè)備可操縱地連接的一個密封設(shè)備，以在注射后密封卵上的孔。
實施例現(xiàn)在參考所附實施例對本發(fā)明加以更充分的描述，其中示出了本發(fā)明的代表性實施方案。然而，本發(fā)明可以不同形式進行，不應(yīng)限于本文所述實施方案。提供這些實施方案是使得本發(fā)明的揭示更徹底和全面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可充分理解本發(fā)明的范圍。
實施例1雌性禽的免疫鑒別、合成雞DAZL和雞VASA同系物蛋白質(zhì)的抗原性肽區(qū)域，并與匙孔嘁血藍蛋白(KLH)綴合。選擇的肽示于表1。
表1所選擇的用于綴合及免疫產(chǎn)卵母雞使其具有對雞VASA和DAZL抗性的肽段


將各種綴合的肽的原液(1,000μg/ml)保持在4℃。在立即進行免疫之前，使用通過雙軸(double hub)乳化針頭連接的兩個注射器由0.5ml綴合的肽和0.5ml的TITERMAX佐劑(TMA；CytRx Corp.，Norcross，Georgia，United States of America)產(chǎn)生穩(wěn)定的乳液。TMA是聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的一種合成的非離子嵌段共聚物。
將性成熟的雌性Leghorn肌內(nèi)(胸大肌)注射100-200μg單獨的綴合肽或肽組合進行免疫。在免疫后取血樣，使其在4℃凝集過夜，并將所得血清樣品貯存在-20℃以進行隨后的抗體確定。14天后進行二次免疫(50-100μg綴合肽+TMA)。在二次攻擊3天后從免疫的母雞和未注射的對照物中獲得血樣。將所得血清樣品貯存在-20℃以進行隨后的抗體確定。
抗肽抗體的效價使用間接ELISA技術(shù)確定?？乖?即KLH綴合的肽)溶液通過將抗原溶解在蒸餾水中而制備，濃度為20μg/ml(1mg于50ml中)。如果該抗原不立即溶解，則用1N NaOH或1N HCl調(diào)節(jié)pH直至抗原溶解。為制備ELISA平板，將抗原溶液(0.1ml)加入96孔高結(jié)合微滴定平板的每個孔中。然后將平板用膠膜覆蓋并在室溫保溫過夜或者在37℃保溫2小時。在保溫之后，將平板用200μl的0.05％Tween-20/PBS(pH7.4，vol∶vol)洗滌3次。然后將平板在紙巾上吸干以除去過量的Tween-20/PBS。然后向每個孔中加入封閉溶液(于PBS中的1％BSA，pH7.4，在4℃貯存)(150μl)。將平板用膠膜覆蓋并在室溫保溫至少2小時或者在37℃保溫1小時或者在4-8℃不確定保溫。
然后將平板用200μl的0.05％Tween-20/PBS(pH7.4，vol∶vol)再洗滌3次，并在紙巾上吸干以除去過量的洗滌溶液。將于1％BSA/PBS緩沖液中的測試的或天然的動物血清系列稀釋(1∶100-1∶1,000,000)。一式兩份加入100μl測試的或?qū)φ盏?未免疫的)雞血清稀釋液。將平板覆蓋并在4-8℃保溫過夜或者在37℃保溫2小時。
將平板用200μl的0.05％Tween-20/PBS(pH7.4，vol∶vol)洗滌3次，并在紙巾上吸干以除去過量的洗滌溶液。向每個孔中加入于1％BSA/PBS緩沖液中的100μl山羊或驢抗雞(IgM+IgG)HRP綴合溶液(1∶6000稀釋液)。將平板用膠膜覆蓋并在室溫保溫至少4小時或者在37℃保溫2小時或者在4-8℃保溫過夜。在保溫后，將平板再一次用200μl的0.05％Tween-20/PBS(pH7.4，vol∶vol)洗滌3次，并在紙巾上吸干以除去過量的洗滌溶液。
最后，向每個孔中加入100μl底物溶液。該底物溶液是通過向10ml 0.05M檸檬酸鹽緩沖液(pH4.0)中加入200μl的2，2′-連氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)染料溶液(將15mg ABTS染料溶解于1ml去離子水中而制備)和10μl H2O2而制備的。在加入底物后，將平板在室溫保溫，然后在平板讀數(shù)器上在405nm分析。在405nm產(chǎn)生統(tǒng)計學(xué)顯著高于背景(即分離自未免疫的對照母雞的血清)的信號的最后的稀釋度確定為效價。來自代表性母雞的抗體的效價示于表2。
表2產(chǎn)卵母雞免疫后抗雞VASA和DAZL肽綴合物的血清效價


實施例227胚胎期的胚胎中PGC的評價在免疫后，收集卵，貯存最多14天，并孵育至27期(H & H)。處死27期(H & H)的胚胎并在4℃在4％低聚甲醛中固定過夜。然后將胚胎在石蠟中包埋并以7μm厚度對生殖腺進行連續(xù)橫截切片。從其它玻片中選擇含有生殖腺區(qū)域的玻片，并使用識別胚胎階段特異性胚胎抗原-1(SSEA-1)的單克隆抗體MC-480(Developmental StudiesHybridoma Bank，The University of Iowa，Iowa City，Iowa，United Statesof America)通過免疫組織學(xué)染色進行鑒別。該免疫組織化學(xué)染色使用抗生物素蛋白-生物素綴合的堿性磷酸酶(VECTASTAINABC-APkit，Vector Laboratories，Burlingame，California，United States ofAmerica)和BCIP/NBT(5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/硝基藍四唑)底物(Amresco，Inc.，Solon，Ohio，United States of America)進行。簡而言之，在于PBS中1.5％正常山羊血清中封閉30分鐘以消除非特異性染色之后，將切片相繼在室溫與原始抗體(1∶1000稀釋的腹水)一起保溫60分鐘并用PBS漂洗3次，與生物素酰化的二級抗體保溫30分鐘并用PBS漂洗3次，及與ABC試劑保溫30分鐘。在PBS中最后洗滌之后，將切片在堿性磷酸酶底物(NBT/BCIP溶液，Amresco)中染色15分鐘，然后在液相封固劑中封固。代表性切片示于
圖1-3。
在
圖1中，產(chǎn)生所述胚胎在其中發(fā)育的卵的母雞用衍生自雞VASA多肽的肽免疫。A組對照組(未免疫)；B組用Vasa-C肽(SEQID NO4)免疫；C組用Vasa-N肽(SEQID NO3)免疫；D組用Vasa-N和Vasa-C免疫。SSEA-1+細胞(染成深色的細胞)在對照胚胎中與暴露于抗VASA抗體的任何胚胎相比均更加豐富。
在圖2中，產(chǎn)生所述胚胎在其中發(fā)育的卵的母雞用衍生自雞DAZL多肽的肽免疫。A組對照組(未免疫)；B組用DAZL-C肽(SEQID NO8)免疫；C組用DAZL-N肽(SEQ ID NO7)免疫；D組用DAZL-N和DAZL-C免疫。SSEA-1+細胞(染成深色的細胞)在對照胚胎中與暴露于抗DAZL抗體的任何胚胎相比均更加豐富。
在圖3中，產(chǎn)生所述胚胎在其中發(fā)育的卵的母雞用衍生自雞VASA和DAZL多肽的肽免疫。A組對照組(未免疫)；B組用Vasa-N、Vasa-C、DAZL-N和DAZL-C肽(SEQ ID NO3、4、7和8)免疫。SSEA-1+細胞(染成深色的細胞)在對照胚胎中與暴露于抗VASA和抗DAZL抗體的任何胚胎相比均更加豐富PGC的降低通過計數(shù)每個胚胎的左側(cè)和右側(cè)生殖腺的10個切片中免疫組織化學(xué)染色的PGC而確定。這個10個切片選自生殖腺的中間區(qū)域。在任兩個選擇的切片之間跳過至少3個切片以避免不止一次地計數(shù)各個PGC。這個分析的結(jié)果示于圖4。如圖4所示，每個肽抗原Vasa-N、Vasa-C、Dazl-N和Dazl-C在雞內(nèi)均能誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，導(dǎo)致由免疫的雌性禽產(chǎn)生的卵黃中抗抗原的抗體沉積。卵中抗體的存在降低處于發(fā)育27期的胚胎中PGC數(shù)。用各個肽免疫雌性禽導(dǎo)致內(nèi)源性PGC數(shù)降低大約35-55％，而用兩或多種肽同時免疫導(dǎo)致內(nèi)源性PGC降低大約55-70％。
統(tǒng)計學(xué)分析PGC/胚胎的平均數(shù)的處理差異使用SAS系統(tǒng)的GLM程序(SAS InstituteInc.，Caw，North Carolina，United States ofAmerica)分析。模型為PGC＝處理母雞。處理差異是顯著的，p＜0.0002。平均值使用Duncan′s Multiple Range Test計算。所有處理與對照組均顯著不同，除了Vasa-N之外。
實施例3在處理的胚胎中生殖細胞種群恢復(fù)將根據(jù)實施例1和2產(chǎn)生的禽用作受體，并給予來自供體禽的內(nèi)源性PGC。
A.供體細胞的制備將5.5天齡的雞胚胎的生殖腺收集在PBS中。將分離的生殖腺集合在35mm培養(yǎng)皿的250μl的0.02％EDTA中并在37℃孵育10分鐘。在平皿中用針頭破碎生殖腺并在37℃孵育5分鐘以上。將細胞收集在含有20％FBS的DMEM中，并在450g離心5分鐘。洗滌細胞并再懸浮于DMEM中。確定細胞數(shù)和存活率。存活細胞的終濃度調(diào)節(jié)為大約1000個細胞/μl。
B.受體胚胎的制備受體雞胚胎如實施例1和2所述制備。將胚胎置于孵化器中直至14-17期(H & H)。
C.供體PGC注射進受體胚胎中將含有大約100PGC的2-3μl的生殖腺細胞懸浮液注射進14-17期(H & H)的受體雞胚胎的血管中。將受體卵密封并在37.5℃在60％相對濕度孵育。
D.PGC種群恢復(fù)的評定收集27期(H & H)的胚胎并在4℃在4％低聚甲醛中固定過夜。將該胚胎在石蠟中包埋，以7μm厚度切片并用SSEA-1抗體進行免疫組織化學(xué)染色。計數(shù)從對照組和經(jīng)PGC注射的胚胎中隨機選擇的10個切片中左側(cè)和右側(cè)生殖腺中的PGC數(shù)。結(jié)果通過應(yīng)用t-檢驗進行統(tǒng)計學(xué)分析，測試分別是兩個樣品來源的群體的平均值之間的差異等于0.0的假說，及測試所述差異不等于0.0的另一個假說。如果這個測試的p-值小于0.05，則虛假說可以在95.0％信賴水平否決。還確定了群體平均值之間的95.0％可靠區(qū)間。在重復(fù)抽樣中，所有這種區(qū)間的95.0％含有真正的差異。
實施例4在內(nèi)源性PGC耗竭后種內(nèi)雞種系嵌合物的產(chǎn)生使用如下程序以生產(chǎn)種內(nèi)種系嵌合物。
A.種內(nèi)雞種系嵌合物的產(chǎn)生孵育Barred Plymouth Rock(BPR)雞胚胎直至27-28期(H &H)。Barred Plymouth Rock供體胚胎用作顏色標記，因為它們在I基因座是純合隱性的(ii)并在其羽毛中表現(xiàn)顏色。將雄性胚胎的生殖腺收集在補加了10％FBS、谷氨酰胺、抗生素和抗真菌溶液的的DMEM中。胚胎的性別確定利用Petitte & Kegelueyer的方法(AnimalBiotechnol 619-30，1995)完成。然后將生殖腺在PBS中漂洗兩次，并在37℃在0.02％EDTA中孵育15分鐘。加入新鮮培養(yǎng)基并破碎生殖腺。收集細胞懸浮液并在450×g旋轉(zhuǎn)5分鐘。
更換培養(yǎng)基并使用臺盼藍排除確定細胞存活力。取等份細胞懸浮液并用SSEA-1抗體染色以確定注射的PGC數(shù)。將含有100-500個PGC的大約2-3μl的細胞懸浮液注射進發(fā)育14-17期(H & H)的White Leghorn(WL)胚胎的血管中。WL胚胎作為受體，因為已知它們是純合顯性的(II)。這個基因型編碼羽毛中無色素。在注射PGC之后，將卵回置于孵育器中以完全發(fā)育。在孵化時，將WL表型的雞系上帶子，隨后飼養(yǎng)至性成熟。進行如下測試交配以確定是否存在種系嵌合物雄性BPR×雌性WL(BPR PGC)及雄性WL(BPR PGC)×雌性BPR。隨后評估這些測試交配的子代以確定雄性BPR生殖腺PGC是否摻入WL中。由于僅用雄性BPR胚胎作為供體，因此衍生自雄性BPR×雌性WL(BPR PGC)測試交配的所有“黑色”雞(BPR表型)均是雄性的。
B.受體胚胎的制備如實施例1和2所述制備受體雞胚胎。收集27期(H & H)的胚胎并在4℃在4％低聚甲醛中固定過夜。將胚胎包埋在石蠟中，以7μm厚度切片并用SSEA-1抗體進行免疫組織化學(xué)染色。計數(shù)每個胚胎的10個隨機選擇的切片中左側(cè)和右側(cè)生殖腺中的PGC數(shù)。不育指數(shù)(IS)使用等式IS＝(N-X)/N計算，其中N是對照組生殖腺的PGC數(shù)，X是處理的胚胎的PGC數(shù)(Reynaud，J Embryol Exp Morphol21485-507，1969)。
C.種間火雞-雞胚胎種系嵌合體的產(chǎn)生將受精的火雞卵在38.5℃孵育8-8.5天(27-28期，H & H)。切開胚胎以獲得生殖腺。然后將含有大約150個PGC的2-3μl生殖腺細胞懸浮液注射進14期(H & H)雞胚胎的血管中。將受體卵密封及回送至孵化器中。在孵育的不同階段(19-25時期)收集受體胚胎。將該胚胎在PBS中漂洗3次，然后在4℃在4％低聚甲醛中固定過夜。將樣品在PBS中洗滌3次，然后置于50％乙醇中。將組織脫水，包埋于石蠟中，切片。所得切片隨后通過SSEA-1及過碘酸-Schiff(PAS)染色進行免疫組織化學(xué)分析。
D.結(jié)果在用SSEA-1和PAS雙重染色之后，基于不同的染色模式在雞胚胎生殖腺中鑒別雞和火雞PGC。由于糖原的存在，雞和火雞PGC在PAS染色之后均染成品紅色。然而，火雞PGC當(dāng)位于發(fā)育中的生殖腺中時不再是SSEA-1陽性的，這樣將其與雞PGC區(qū)分開來，雞PGC在此發(fā)育時期是SSEA-1陽性的。
WL(II)×BPR(ii)交配的子代典型地表達WL表型(li)并表現(xiàn)在羽毛中無黑色素存在。
實施例5種內(nèi)嵌合體的產(chǎn)生及測試交配使用與前述實施例所述相似的方案，將白色來亨雞(WL)胚胎進行處理以耗竭內(nèi)源性PGC。
收集來自雄性Barred Plymouth Rock(BPR)胚胎的生殖腺，分離PGC，并將分離的PGC經(jīng)卵內(nèi)給予處理的禽和對照的未處理的禽，基本如前述實施例所述進行。在孵化后，將雄性WL(BPR PGC)嵌合禽飼養(yǎng)至性成熟并與雌性BPR禽交配。黑色子代的產(chǎn)生表示衍生自BPR PGC的配子通過嵌合的雄性WL(BPR PGC)親代的傳遞。
應(yīng)理解在不偏離本發(fā)明范圍的前提下可以對本發(fā)明各種具體內(nèi)容加以改變。另外，前述描述只是舉例示出了本發(fā)明而無限制之意。
序列表<110>北卡羅來納州大學(xué)<120>禽類物種中內(nèi)源性原生殖細胞的耗減<130>297/204PCT<150>US60/440,424<151>2003-01-16<160>8<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1989<212>DNA<213>Gallus gallus<220>
<221>CDS<222>(1)..(1989)<400>1atg gag gag gac tgg gac acg gag ctg gag cag gag gcg gca gcg gct 48Met Glu Glu Asp Trp Asp Thr Glu Leu Glu Gln Glu Ala Ala Ala Ala1 5 10 15tcc cag ggg cgt tct gag gag cag gcg tgg atg gct aac tct ggc aga 96Ser Gln Gly Arg Ser Glu Glu Gln Ala Trp Met Ala Asn Ser Gly Arg20 25 30cca aac agc cca tcc ctc cgc ttc tcc agc aga cca agc agc ccc ttg 144Pro Asn Ser Pro Ser Leu Arg Phe Ser Ser Arg Pro Ser Ser Pro Leu35 40 45tct ggc ttc cca ggc aga cca aac agc ccc ttc ttt ggc ttt agt cag 192Ser Gly Phe Pro Gly Arg Pro Asn Ser Pro Phe Phe Gly Phe Ser Gln50 55 60aat aaa ggc tca ctt ggt gct aat gaa gga ctt aac aga agt ctg cct 240Asn Lys Gly Ser Leu Gly Ala Asn Glu Gly Leu Asn Arg Ser Leu Pro65 70 75 80gtg cag cat gac att gga gga tat tct ggg agc aga gag tct gtt gta 288Val Gln His Asp Ile Gly Gly Tyr Ser Gly Ser Arg Glu Ser Val Val85 90 95cgt caa aac aga gaa gat caa cca gtg act aga ttt ggt aga ggg agg 336Arg Gln Asn Arg Glu Asp Gln Pro Val Thr Arg Phe Gly Arg Gly Arg100 105 110agt tct gga agc aga gat ttt caa gag agg aac tct gca aat gat cct 384Ser Ser Gly Ser Arg Asp Phe Gln Glu Arg Asn Ser Ala Asn Asp Pro115 120 125ggt atg caa gat caa ggt ttt aga aga gtt cct ggc atc ttt ggg caa 432Gly Met Gln Asp Gln Gly Phe Arg Arg Val Pro Gly Ile Phe Gly Gln
130 135 140agc aag tgt ttt aac agt gag gaa aga aat agt cct ctg cgt ggc agc 480Ser Lys Cys Phe Asn Ser Glu Glu Arg Asn Ser Pro Leu Arg Gly Ser145 150 155 160cct ttt gcc cca gga gga aga gga gca gtt gga ggt cct gca gga gtt 528Pro Phe Ala Pro Gly Gly Arg Gly Ala Val Gly Gly Pro Ala Gly Val165 170 175ctc aaa gga cgc tct gaa gaa att gat tct gga aga ggt cca aag gtg 576Leu Lys Gly Arg Ser Glu Glu Ile Asp Ser Gly Arg Gly Pro Lys Val180 185 190act tat gtc ccc cct cct cca cct gaa gat gaa cag tcc atc ttt gca 624Thr Tyr Val Pro Pro Pro Pro Pro Glu Asp Glu Gln Ser Ile Phe Ala195 200 205tgt tat cag tca gga att aat ttt gac aag tat gat gaa tgt gct gtt 672Cys Tyr Gln Ser Gly Ile Asn Phe Asp Lys Tyr Asp Glu Cys Ala Val210 215 220gag atg tca gga ctt gac cct cca gca cca tta ctg gct ttt gaa gaa 720Glu Met Ser Gly Leu Asp Pro Pro Ala Pro Leu Leu Ala Phe Glu Glu225 230 235 240gct aac ttt gct cag act tta agg aag aat ata tct aaa act gga tat 768Ala Asn Phe Ala Gln Thr Leu Arg Lys Asn Ile Ser Lys Thr Gly Tyr245 250 255tca aaa ctt act cca gtg cag aag cac agc att cct gtt ata caa gca 816Ser Lys Leu Thr Pro Val Gln Lys His Ser Ile Pro Val Ile Gln Ala260 265 270ggg cgg gat tta atg tca tgt gcc cag aca gga tca gga aaa aca gca 864Gly Arg Asp Leu Met Ser Cys Ala Gln Thr Gly Ser Gly Lys Thr Ala275 280 285gct ttt ctt cta cca att gtg gac cgg atg atg aaa gat ggt gta act 912Ala Phe Leu Leu Pro Ile Val Asp Arg Met Met Lys Asp Gly Val Thr290 295 300gca agc ttc cca aag cag caa gac cca caa tgc att att gtt gca cca 960Ala Ser Phe Pro Lys Gln Gln Asp Pro Gln Cys Ile Ile Val Ala Pro305 310 315 320act aga gaa ctg ata aat cag atc ttc tta gaa gca agg aag ttt gtg 1008Thr Arg Glu Leu Ile Asn Gln Ile Phe Leu Glu Ala Arg Lys Phe Val325 330 335tat ggg act tgt ata agg cct gtt gtg atc tat gga ggt aca cag aca 1056Tyr Gly Thr Cys Ile Arg Pro Val Val Ile Tyr Gly Gly Thr Gln Thr340 345 350ggt cat tca atc cgt caa ata atg caa ggc tgt aat ata tta tgt gcc 1104Gly His Ser Ile Arg Gln Ile Met Gln Gly Cys Asn Ile Leu Cys Ala355 360 365act cct gga agg ctt ctt gac att att gaa aaa ggg aag atc agt ttg 1152Thr Pro Gly Arg Leu Leu Asp Ile Ile Glu Lys Gly Lys Ile Ser Leu
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Val Ala Glu Trp Asn Pro Arg Glu Met Arg Met Ser Tyr Ser Glu Thr645 650 655Thr Phe Lys Ser Trp Glu660<210>3<211>16<212>PRT<213>Gallus gallus<400>3Ser Arg Pro Ser Ser Pro Leu Ser Gly Phe Pro Gly Arg Pro Asn Ser1 5 10 15<210>4<211>16<212>PRT<213>Gallus gallus<400>4Asn Pro Arg Glu Met Arg Met Ser Tyr Ser Glu Thr Thr Phe Lys Ser1 5 10 15<210>5<211>1882<212>DNA<213>Gallus gallus<220>
<22l>CDS<222>(174)..(1043)<400>5cctctttcac acccctctta aaaaagaaaa gaaagaaaaa aaagacaaaa aaaaatacaa 60acacaaaaaa gtggggttct ttagtatctg ttttcccaac actcctattg tttttgtctt120gaaggcctcg tttgttttta agtgtgcggg cgctgtcaca gctccgggga acg atg 176Met1tct gca aat gcg gaa gcc cag tgt gga agt atc tca gag gat aat acc 224Ser Ala Asn Ala Glu Ala Gln Cys Gly Ser Ile Ser Glu Asp Asn Thr5 10 15cat tcg tca aca acc tgc caa gga tat gtt tta cca gaa gga aaa atc 272His Ser Ser Thr Thr Cys Gln Gly Tyr Val Leu Pro Glu Gly Lys Ile20 25 30atg cca aat aca gtc ttt gtt ggt gga att gat ata agg atg aat gaa 320
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1.一種調(diào)節(jié)禽胚胎中原生殖細胞數(shù)的方法，所述方法包括用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫雌性禽類，從而該雌性禽產(chǎn)生的卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵中存在的禽胚胎中內(nèi)源性PGC數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中雌性禽類選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉及沙丘鶴組成的一組。
3.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述雌性禽是雞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原包含選自如下一組的一個多肽表位SSEA-1、VASA、EMA-1、germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis及DAZL。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫步驟導(dǎo)致禽胚胎中原生殖細胞數(shù)減少。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述免疫步驟導(dǎo)致禽胚胎中原生殖細胞數(shù)增加。
7.一種調(diào)節(jié)禽胚胎中原生殖細胞發(fā)育的方法，所述方法包括用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫雌性禽，從而由該雌性禽產(chǎn)生的卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的禽胚胎中PGC的發(fā)育。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述抗原包含選自如下一組的一個多肽表位SSEA-1，VASA，EMA-1，germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis及DAZL。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述雌性禽選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉和沙丘鶴組成的一組。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述雌性禽是雞。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所述免疫步驟導(dǎo)致對禽胚胎中原生殖細胞的發(fā)育的抑制。
12.權(quán)利要求7的方法，其中所述免疫步驟導(dǎo)致禽胚胎中原生殖細胞的發(fā)育增強。
13.一種產(chǎn)生嵌合禽的方法，所述方法包括(a)用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫雌性禽；(b)被免疫的雌性禽產(chǎn)卵，其中該卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的受體胚胎中PGC發(fā)育、PGC數(shù)或其組合；及(c)將供體PGC經(jīng)卵內(nèi)給予受體胚胎以產(chǎn)生嵌合禽。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述抗原包含選自如下一組的一個多肽表位SSEA-1，VASA，EMA-1，germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis及DAZL。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述供體PGC來自與受體胚胎相同的禽物種。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述供體PGC來自與受體胚胎不同的禽物種。
17.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其進一步包括孵育該嵌合禽至孵化。
18.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述雌性禽選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉和沙丘鶴組成的一組。
19.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述供體PGC來自選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉和鳴鶴組成的一組的禽胚胎。
20.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述供體PGC攜帶一對雄性決定(Z)染色體。
21.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述供體PGC攜帶一個雌性決定(w)染色體。
22.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述給予是通過卵內(nèi)注射進行的。
23.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中當(dāng)受體胚胎在根據(jù)Eyal-Giladi& Kochav分期系統(tǒng)大約為IX期及根據(jù)Hamburger & Hamilton分期系統(tǒng)大約為30期之間時給予供體PGC。
24.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中當(dāng)受體胚胎在根據(jù)Hamburger& Hamilton分期系統(tǒng)為14期之后時給予供體PGC。
25.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中供體PGC選自由生殖腺PGC、血PGC及生殖新月區(qū)PGC組成的一組。
26.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述給予步驟是通過將胚盤細胞注射到受體胚胎進行的，并且其中胚盤細胞在受體胚胎中分化為供體PGC。
27.一種增加眾多禽卵中雄性禽比例的方法，所述方法包括(a)用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫一個雌性禽；(b)從該雌性禽產(chǎn)卵，從而該卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的受體雌性禽中PGC發(fā)育；(c)將雄性(ZZ)PGC經(jīng)卵內(nèi)給予受體雌性禽；(d)孵育該受體雌性禽至孵化；(e)飼養(yǎng)該受體雌性禽至性成熟；及(f)從該受體雌性禽產(chǎn)生大量卵，其中由該受體雌性禽產(chǎn)生的大量禽卵中雄性禽的比例高于不將雄性(ZZ)PGC經(jīng)卵內(nèi)給予受體雌性禽的情況中獲得的比例。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述抗原包含選自如下一組的一個多肽表位SSEA-1，VASA，EMA-1，germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis及DAZL。
29.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述供體PGC來自與受體胚胎相同的禽物種。
30.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述供體PGC來自與受體胚胎不同的禽物種。
31.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述雌性禽選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉和沙丘鶴組成的一組。
32.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述供體PGC來自選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉和鳴鶴組成的一組的禽胚胎。
33.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述給予是通過卵內(nèi)注射進行的。
34.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中當(dāng)受體胚胎在根據(jù)Eyal-Giladi& Kochav分期系統(tǒng)大約為IX期及(根據(jù)Hamburger & Hamilton分期系統(tǒng)大約為30期之間時給予供體PGC。
35.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中當(dāng)受體胚胎在根據(jù)Hamburger& Hamilton分期系統(tǒng)為14期之后時給予供體PGC。
36.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中PGC選自由生殖腺PGC、血PGC及生殖新月區(qū)PGC組成的一組。
37.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中所述給予步驟是通過將胚盤細胞注射到受體胚胎進行的，并且其中胚盤細胞在受體雌性禽中分化為供體PGC。
38.一種在第一種禽物種中產(chǎn)生來自第二種禽物種的禽配子的方法，所述方法包括(a)用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫第一種禽物種，從而雌性禽產(chǎn)的卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的第一種禽物種的受體禽的PGC發(fā)育；(b)將分離自第二種禽物種的禽的供體PGC導(dǎo)入第一種禽物種的受體禽中；(c)孵育第一種禽物種的受體禽至孵化；及(d)飼養(yǎng)第一種禽物種的受體禽至性成熟，其中第一種禽物種的受體禽產(chǎn)生來自第二種禽物種的配子。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述抗原包含選自如下一組的一個多肽表位SSEA-1，VASA，EMA-1，germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis及DAZL。
40.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中第一種禽物種與第二種禽物種均選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉、沙丘鶴及鳴鶴組成的一組。
41.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中第一種禽物種和第二種禽物種是相同的。
42.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中第一種禽物種和第二種禽物種是不同的。
43.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述給予是通過卵內(nèi)注射進行的。
44.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中當(dāng)?shù)谝环N禽物種的受體禽在根據(jù)Eyal-Giladi & Kochav分期系統(tǒng)大約為IX期及根據(jù)Hamburger &Hamilton分期系統(tǒng)大約為30期之間時給予供體PGC。
45.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中當(dāng)?shù)谝环N禽物種的受體禽在根據(jù)Hamburger & Hamilton分期系統(tǒng)為14期之后時給予供體PGC。
46.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中PGC選自由生殖腺PGC、血PGC及生殖新月區(qū)PGC組成的一組。
47.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中所述給予步驟是通過將胚盤細胞注射到第一種禽物種的受體禽進行的，并且其中胚盤細胞在第一種禽物種的受體禽中分化為供體PGC。
48.一種增強核酸分子在禽中種系傳遞的方法，所述方法包括(a)用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫一個雌性禽，從而該雌性禽產(chǎn)生的卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)存在的受體禽中PGC發(fā)育；(b)在足以使得眾多PGC的至少之一在受體禽的生殖腺建群的條件下，將包含所述核酸分子的眾多供體PGC給予受體禽；(c)孵育該受體禽至孵化；及(d)飼養(yǎng)該受體禽至性成熟，其中該受體禽產(chǎn)生衍生自供體PGC的配子。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述抗原包含選自如下一組的一個多肽表位SSEA-1，VASA，EMA-1，germ cell-less，dead end，nanos，stella，fragilis及DAZL。
50.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述受體禽和供體PGC均選自由雞、火雞、鴨、鵪鶉、沙丘鶴和鳴鶴組成的一組。
51.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述供體PGC來自與受體禽相同的禽物種。
52.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述供體PGC來自與受體禽不同的禽物種。
53.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述給予是通過卵內(nèi)注射進行的。
54.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中當(dāng)受體禽在根據(jù)Eyal-Giladi &Kochav分期系統(tǒng)大約為IX期及根據(jù)Hamburger & Hamilton分期系統(tǒng)大約為30期之間時給予供體PGC。
55.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中當(dāng)受體禽在根據(jù)Hamburger &Hamilton分期系統(tǒng)為14期之后時給予供體PGC。
56.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中PGC選自由生殖腺PGC、血PGC及生殖新月區(qū)PGC組成的一組。
57.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述給予步驟是通過將胚盤細胞注射到受體禽進行的，并且其中所述胚盤細胞在受體禽中分化為供體PGC。
全文摘要
本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)禽類中原生殖細胞(PGC)數(shù)和/或發(fā)育的方法。在一個實施方案中，本發(fā)明提供了一種在禽類胚胎中調(diào)節(jié)原生殖細胞數(shù)的方法，包括用與原生殖細胞相關(guān)的抗原免疫雌性禽，從而該雌性禽產(chǎn)生的卵包含足夠高濃度的特異于該抗原的抗體，以調(diào)節(jié)該卵內(nèi)禽類胚胎中存在的內(nèi)源性PGC數(shù)。本發(fā)明還提供了產(chǎn)生嵌合禽類的方法，增加眾多卵中雄性禽的比例的方法，產(chǎn)生禽類配子的方法，及增強核酸在禽類中種系傳遞的方法。
文檔編號A01K67/00GK1761756SQ200480007059
公開日2006年4月19日 申請日期2004年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月16日
發(fā)明者詹姆斯·N·派蒂特, 塞繆爾·勞埃德·帕杜 申請人:北卡羅來納州大學(xué)