專利名稱：糖peg化方法及由該方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)/肽的制作方法
背景技術(shù)：
大多數(shù)天然存在的肽含有在一級肽鏈的長度上通過與選定數(shù)目的氨基酸的特定鍵合而附著到肽上的糖類部分。因而，許多天然存在的肽稱為“糖肽”。任何給定的肽上的糖基化模式的可變性對于該肽的功能具有巨大的意義。例如，肽上N-連接的聚糖的結(jié)構(gòu)可影響肽的各種特征，包括細(xì)胞或生物中肽的蛋白酶敏感性、細(xì)胞內(nèi)運輸、分泌、組織定向、生物學(xué)半衰期和抗原性。這些特征的一種或多種的改變大大地影響了肽在其天然環(huán)境中的功效，且也影響了肽作為治療劑在一定狀況中的功效，在該狀況中該肽即是為該目的而生成的。
附著到肽鏈上的糖類結(jié)構(gòu)已知為“聚糖”分子。在肽上存在的特定的聚糖結(jié)構(gòu)影響該肽的可溶性和聚集特征、一級肽鏈的折疊及其功能或酶活性、該肽對蛋白水解攻擊的抗性和對導(dǎo)致肽的無活性形式向活性形式轉(zhuǎn)變的蛋白水解的控制。重要的是，存在于聚糖分子上的末端唾液酸殘基影響哺乳動物循環(huán)系統(tǒng)中肽的半衰期的長度。其聚糖不含有末端唾液酸殘基的肽將由肝快速從循環(huán)中去除，這是使肽的任何潛在的治療益處失效的事件。
天然發(fā)現(xiàn)存在于糖肽上的聚糖結(jié)構(gòu)一般分為兩類，即N-連接的和O-連接的。
在真核細(xì)胞中表達的肽一般是在肽一級結(jié)構(gòu)的位點上在天冬酰胺殘基上N-糖基化的，該位點含有天冬酰胺-X-絲氨酸/蘇氨酸的序列，其中X可為除脯氨酸和天冬氨酸之外的任何氨基酸。這種肽中的糖類部分已知為N-連接的聚糖。N-糖基化的早期事件發(fā)生于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中且在哺乳動物、植物、昆蟲和其他高等真核生物中是相同的。首先，包含14個糖殘基的寡糖鏈在脂質(zhì)載體上構(gòu)建。當(dāng)新生肽翻譯并轉(zhuǎn)位進入ER時，整個寡糖鏈則在膜結(jié)合的糖基轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)中轉(zhuǎn)移到天冬酰胺殘基的酰胺基團上。N-連接的聚糖進一步在ER和高爾基體兩者中進行加工。進一步的加工通常需要在由糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶催化的反應(yīng)中去除一些糖殘基并添加其他的糖殘基，其中所述酶對于去除和添加的糖殘基是特異性的。
一般地，N-連接的聚糖的最終結(jié)構(gòu)依賴于產(chǎn)生該肽的生物。例如，細(xì)菌產(chǎn)生的肽通常是完全無糖基化的。在昆蟲細(xì)胞中表達的肽含有高的甘露糖和paunci-甘露糖N-連接的寡糖鏈以及其它。哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的肽通常依賴于如物種和細(xì)胞培養(yǎng)條件而有差別地糖基化。即使在相同的物種中和在相同的條件下，有時也遇到糖基鏈中某些異質(zhì)性。進一步地，植物細(xì)胞中產(chǎn)生的肽包含顯著與那些動物細(xì)胞中產(chǎn)生的不同的聚糖結(jié)構(gòu)。在生產(chǎn)重組肽的領(lǐng)域(特別是當(dāng)該肽用作治療劑時)中的困境是能夠生成正確糖基化的肽，即能夠生成具有與存在于肽的天然形式中的相似或相同的聚糖結(jié)構(gòu)的肽。大多數(shù)重組方法產(chǎn)生的肽包含與天然存在的聚糖不同的聚糖結(jié)構(gòu)。
在本領(lǐng)域中已提出了多種方法來定制肽的糖基化模式，包括那些描述于WO 99/22764、WO 98/58964、WO 99/54342和美國專利No.5,047,335中的，以及其它。基本地，對肽的體外糖基化所必需的許多酶已進行了克隆和測序。在一些情況中，這些酶已在體外用于將特定的糖添加到肽上不完全的聚糖分子上。在另一些情況中，細(xì)胞已進行了基因工程加工以表達酶和想要的肽的組合，從而可在細(xì)胞中發(fā)生想要的糖部分向表達的肽中的添加。
肽也可通過添加O-連接的聚糖而修飾，該聚糖由于其在粘蛋白糖肽上的普遍存在也稱為粘蛋白類型的聚糖。與連接到天冬酰胺殘基上并通過整體從脂質(zhì)結(jié)合的中間體上轉(zhuǎn)移寡糖而形成的N-聚糖不同，O-聚糖主要連接到絲氨酸和蘇氨酸殘基上并通過逐步添加來自核苷酸糖類的糖而形成(Tanner等人，Biochim.Biophys.Acta.90681-91(1987)；和Hounsell等人，Glycoconj.J.1319-26(1996))。肽功能可受到在其上存在的O-連接聚糖結(jié)構(gòu)的影響。例如，P-選擇蛋白配體的活性受到其上存在的O-連接聚糖結(jié)構(gòu)的影響。對于O-連接聚糖結(jié)構(gòu)的綜述，參見Schachter和Brockhausen，The Biosynthesis ofBranched O-Linked Glycans，1989，Society for ExperimentalBiology，pp.1-26(英國)。其他糖基化模式是通過向蛋白質(zhì)羧基末端羧基基團連接糖基磷脂酰肌醇而形成的(Takeda等人，TrendsBiochem.Sci.20367-371(1995)；和Udenfriend等人，Ann.Rev.Biochem.64593-591(1995))。
盡管目前存在各種修飾肽的N-連接聚糖的技術(shù)，但本領(lǐng)域需要生成肽的通用方法，該肽具有想要的即定制的糖基化模式。本領(lǐng)域特別需要肽的定制(Customize)的體外糖基化，其中結(jié)果所得的肽可在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)。本發(fā)明可滿足這個和其他的需要。
給予糖基化和非糖基化的肽以產(chǎn)生特定的生理學(xué)反應(yīng)是醫(yī)藥領(lǐng)域眾所周知的。用于該目的的最知名的肽之一是胰島素，它用于治療糖尿病。酶也已因其治療益處而使用。限制了治療性肽的應(yīng)用的主要因素是大多數(shù)肽的免疫原性特性。在患者中，對給予的肽的免疫原性反應(yīng)可中和肽和/或?qū)е禄颊咧凶儜B(tài)反應(yīng)的發(fā)展。治療性肽的其他不足包括亞最優(yōu)的效力和快速的清除速率。在本領(lǐng)域中已認(rèn)識到肽治療劑固有的問題，且已研究了各種消除所述問題的方法。為了提供可溶性的肽治療劑，已將合成的聚合物附著到肽主鏈上。
聚(乙二醇)(“PEG”)是已與肽綴合的示例性的聚合物。已證明使用PEG來使肽治療劑衍生化可降低肽的免疫原性并延長從循環(huán)中的清除時間。例如，U.S.Pat.No.4,179,337(Davis等人)涉及無免疫原性的肽，如與聚乙二醇(PEG)或聚丙二醇偶聯(lián)的酶和肽激素。每摩爾肽使用了10～100摩爾的聚合物且維持了至少15％的生理學(xué)活性。
WO 93/15189(Veronese等人)涉及通過將蛋白水解酶連接到大分子化的抑制劑上而維持聚乙二醇修飾的蛋白水解酶活性的方法。該綴合物計劃用于醫(yī)學(xué)應(yīng)用。
PEG及其衍生物向肽附著的主要模式是通過肽氨基酸殘基的非特定的連接。例如，美國專利No.4,088,538公開了與PEG共價連接的酶的酶活性聚合物-酶綴合物。類似地，美國專利No.4,496,689公開了α-1蛋白酶抑制劑與聚合物如PEG或甲氧基聚(乙二醇)(“mPEG”)共價附著的復(fù)合物。Abuchowski等人(J.Biol.Chem.2523578(1977))公開了mPEG與牛血清白蛋白的氨基團的共價附著。美國專利No.4,414,147公開了通過將其與二羧酸的酸酐如聚(乙烯琥珀酸酐)的綴合而使干擾素疏水性較低的方法。PCT WO 87/00056公開了PEG和聚氧乙基化多元醇與蛋白質(zhì)如干擾素-β、白細(xì)胞介素-2和免疫毒素的綴合。EP 154,316公開并請求保護化學(xué)修飾的淋巴因子如含有直接與淋巴因子的至少一個一級氨基基團連接的PEG的IL-2。美國專利No.4,055,635公開了與聚合物質(zhì)如多糖共價連接的蛋白水解酶水溶性復(fù)合物的藥物組合物。
PEG與肽附著的另一種模式是通過肽上糖基殘基的非特定的氧化。氧化的糖可用作將PEG部分附著到肽上的座位。例如，M’Timkulu(WO94/05332)公開了肼-PEG或氨基-PEG將PEG添加到糖蛋白質(zhì)上的應(yīng)用。糖基部分隨機地氧化為相應(yīng)的醛，并隨后與氨基-PEG偶聯(lián)。也參見Bona等人(WO 96/40731)，其中通過酶促氧化免疫球蛋白上的聚糖然后使聚糖與氨基-PEG分子接觸而將PEG添加到免疫球蛋白分子上。
在上述每一種方法中，聚(乙二醇)是以隨機的非特異性的方式添加到肽主鏈的反應(yīng)性殘基上的。為了生產(chǎn)治療性的肽，明顯想要的是一種衍生化策略，該策略導(dǎo)致特定標(biāo)記的、易于表征的且基本均一的產(chǎn)物的形成。
在糖類合成中使用兩類主要的酶，即糖基轉(zhuǎn)移酶(如唾酸轉(zhuǎn)移酶、寡糖基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶)和糖苷酶。糖苷酶進一步分為外切糖苷酶(如β-甘露糖苷酶、β-葡糖苷酶)和內(nèi)切糖苷酶(如Endo-A、Endo-M)。這幾類酶的每一個已成功地合成用于制備糖類。對于一般綜述，參見Crout等人，Curr.Opin.Chem.Biol.298-111(1998)。
糖基轉(zhuǎn)移酶修飾肽上的寡糖結(jié)構(gòu)。糖基轉(zhuǎn)移酶對于以良好的立體化學(xué)和區(qū)域化學(xué)(regiochemical)控制產(chǎn)生特定產(chǎn)物是有效的。糖基轉(zhuǎn)移酶已用于制備寡糖和用于修飾末端的N-或O-連接的糖類結(jié)構(gòu)，特別是在哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的肽上的。例如，糖肽的末端寡糖已完全唾液酸化和/或巖藻糖基化已提供更堅固的糖結(jié)構(gòu)，這改善了糖肽的藥物動力學(xué)和各種其他的生物學(xué)特性。例如，β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶可用于合成乳糖胺，這是糖基轉(zhuǎn)移酶用于糖類合成的一個例子(參見如Wong等人，J.Org.Chem.475416-5418(1982))。此外，許多合成程序使用α-唾酸轉(zhuǎn)移酶以將唾液酸從胞苷-5’-單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸轉(zhuǎn)移到半乳糖的3-OH或6-OH(參見如Kevin等人，Chem.Eur.J.21359-1362(1996))。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶可用于合成途徑以將巖藻糖單位從鳥苷-5’-二磷酸巖藻糖轉(zhuǎn)移到糖受體的特定羥基上。例如，Ichikawa通過涉及唾液酸化的乳糖胺由克隆的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶進行巖藻糖基化的方法制備了唾酸Lewis-X(Ichikawa等人，J.Am.Chem.Soc.1149283-9298(1992))。對于用于治療用途的糖綴合物合成的最近進展的討論，參見Koeller等人，Nature Biotechnology 18835-841(2000)。也參見美國專利No.5,876,980、6,030,815、5,728,554、5,922,577和WO/9831826。
糖苷酶也可用于制備糖類。糖苷酶通常催化糖苷鍵的水解。然而，在適當(dāng)條件下，它們可用于形成該鍵。用于糖類合成的大多數(shù)糖苷酶是外切糖苷酶；糖基轉(zhuǎn)移發(fā)生于底物的非還原末端。糖苷酶在糖基-酶中間體中結(jié)合糖基供體，該中間體可由水劫取而產(chǎn)生水解產(chǎn)物，或由受體劫取生成新的糖苷或寡糖。應(yīng)用外切糖苷酶的一個示例性途徑是所有N-連接的糖肽的核心三糖的合成，包括由β-甘露糖苷酶作用形成的β-甘露糖苷鍵(Singh等人，Chem.Commun.993-994(1996))。
在應(yīng)用糖苷酶以形成糖苷鍵的另一個示例性應(yīng)用中，制備了突變的糖苷酶，其中活性位點的正常的親核氨基酸改變?yōu)榉怯H核氨基酸。該突變的酶不水解糖苷鍵，但仍可形成該鍵。這種突變的糖苷酶可用于用α-糖基氟化物供體和糖苷受體分子制備寡糖(Withers等人，美國專利No.5,716,812)。
盡管其應(yīng)用不如外切糖苷酶的普遍，但內(nèi)切糖苷酶也用于制備糖類?；趹?yīng)用內(nèi)切糖苷酶的方法具有可轉(zhuǎn)移寡糖而不是單糖的優(yōu)點。已用endo-β-N-乙酰葡糖胺如endo-F、endo-M將寡糖片段添加到底物上了(Wang等人，Tetrahedron Lett.371975-1978)；和Haneda等人，Carbohydr.Res.29261-70(1996))。
除其在制備糖類的應(yīng)用之外，上述的酶也可應(yīng)用于合成糖肽。已發(fā)表了核糖核酸酶B的均質(zhì)糖形式(glycoform)的合成(Witte K.等人，J.Am.Chem.Soc.1192114-2118(1997))。核糖核酸酶B的高甘露糖核心可通過用內(nèi)切糖苷酶H處理糖肽而切割。該切割特定地發(fā)生于兩個核心GlcNAc殘基之間。然后通過依次應(yīng)用β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、α-2，3-唾酸轉(zhuǎn)移酶和α-1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，四糖唾酸Lewis X可在均質(zhì)的蛋白質(zhì)上剩余的GlcNAc錨定位點上酶促重建。然而，盡管每一個酶催化步驟都以極好的產(chǎn)量進行，但這種程序不能適用于在工業(yè)規(guī)模上生成糖肽。
結(jié)合化學(xué)和酶合成元件的方法也是本領(lǐng)域中公知的。例如，Yamamoto及同事(Carbohydr.Res.305415-422(1998))報道了用內(nèi)切糖苷酶對糖肽、糖基化的肽T的化學(xué)酶促(chemoenzymatic)合成。N-乙酰葡糖胺肽是完全由化學(xué)方法合成的。該肽隨后精心用人類運鐵蛋白肽的寡糖進行酶處理。糖部分是通過用內(nèi)切-β-N-乙酰葡糖胺酶(acetylglucosaminidase)處理而添加到肽上的。結(jié)果所得的糖基化的肽與肽T和N-乙酰葡糖胺肽T相比是高度穩(wěn)定的并對蛋白水解有抗性。
也已探究了用于修飾具有報道基團的肽結(jié)構(gòu)的糖基轉(zhuǎn)移酶的應(yīng)用。例如，Brossmer等人(美國專利No.5,405,753)公開了唾液酸的熒光標(biāo)記的胞苷單磷酸(“CMP”)衍生物的形成和熒光糖苷在測定唾酸轉(zhuǎn)移酶活性和細(xì)胞表面、糖蛋白和肽的熒光標(biāo)記中的應(yīng)用。Gross等人(Analyt.Biochem.186127(1990))描述了類似的測定。Bean等人(美國專利No.5,432,059)公開了利用對不充分糖基化的蛋白質(zhì)的重新糖基化對糖基化缺陷病癥的測定。該缺陷蛋白質(zhì)是用熒光標(biāo)記的CMP糖苷重新糖基化的。每一個熒光唾液酸衍生物都用熒光部分在唾液酸中通常乙?；?-位置或胺上取代。應(yīng)用熒光唾液酸衍生物的方法是對糖基轉(zhuǎn)移酶或非糖基化的或不正確糖基化的糖蛋白是否存在的測定。該測定是在生物學(xué)來源的樣品中對少量的酶或糖蛋白進行的。在現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中尚未公開或提出利用修飾的唾液酸以制備或工業(yè)規(guī)模對糖基化的或非糖基化的肽進行酶促衍生化。
也已有相當(dāng)多的努力涉及通過改變由細(xì)胞表面呈現(xiàn)的糖基殘基而修飾該細(xì)胞表面。例如，F(xiàn)ukuda及同事已發(fā)展了將具有限定結(jié)構(gòu)的糖苷附著到細(xì)胞表面的方法。該方法利用巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶不嚴(yán)格的底物特異性，該酶可轉(zhuǎn)移巖藻糖和具有不同糖基底物的巖藻糖類似物(Tsuboi等人，J.Biol.Chem.27127213(1996))。
酶促方法也已用于活化糖肽上的糖基殘基以有助于隨后的化學(xué)處理。糖基殘基一般是用半乳糖氧化酶活化的，該酶將末端半乳糖殘基轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的醛。該醛隨后與含有氨的修飾基團偶聯(lián)。例如，Casares等人(Nature Biotech.19142(2001))已將阿霉素附著到重組的MHCII-肽嵌合體的氧化的半乳糖殘基上。
也已對糖基殘基進行修飾以使其含有酮基團。例如，Mahal及同事(Science 2761125(1997))已制備了N-乙酰丙酰甘露糖胺(“ManLev”)，它在天然底物中通常由乙?；鶊F占據(jù)的位置具有酮官能團。用ManLev處理細(xì)胞，從而將酮基團整合入細(xì)胞表面。也參見Saxon等人，Science 2872007(2000)；Hang等人，J.Am.Chem.Soc.1231242(2001)；Yarema等人，J.Biol.Chem.27331168(1998)；和Charter等人，Glycobiology 101049(2000)。
修飾細(xì)胞表面的方法尚未在不存在細(xì)胞時應(yīng)用于修飾糖基化的或非糖基化的肽。進一步地，細(xì)胞表面修飾方法未用于將修飾的糖基供體部分酶促整合入肽中。此外，沒有一種細(xì)胞表面修飾方法在以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)糖基修飾的肽中是可行的。
盡管有涉及對糖結(jié)構(gòu)酶促處理的努力，但仍需要有工業(yè)上可行的方法以用于用修飾基團對糖基化的和非糖基化的肽進行修飾，該修飾基團如水溶性聚合物、治療部分、生物分子等。特別感興趣的是其中修飾的肽具有改善的特性的方法，該改善的特性增強了該肽作為治療或診斷劑的應(yīng)用。本發(fā)明滿足了這些和其他的需要。
發(fā)明概述本發(fā)明包括多個對肽進行重構(gòu)以使其具有附著于其上的聚糖結(jié)構(gòu)的方法。盡管在此處描述了特定的聚糖結(jié)構(gòu)，但本發(fā)明不應(yīng)該理解為限制于任何一個特定的結(jié)構(gòu)。此外，盡管在此處描述了特定的肽，但本發(fā)明不應(yīng)該受所描述的肽的特性的限制，而應(yīng)該包含任何或所有適當(dāng)?shù)碾募捌渥凅w。
隨后的描述公開了本發(fā)明優(yōu)選的實施方案并提供了附加的權(quán)利要求的書面描述。本發(fā)明包含任何和所有這些實施方案的變體，該變體在閱讀了本發(fā)明的說明書之后是或者將是顯而易見的。
本發(fā)明包括對包含聚乙二醇的肽進行重構(gòu)的無細(xì)胞的體外方法，該肽具有如下分子式 其中AA是肽的末端或內(nèi)部氨基酸殘基；X1-X2是與AA共價連接的糖，其中X1是第一個糖基殘基；而X2是與X1共價連接的第二個糖基殘基，其中X1和X2選自單糖和寡糖殘基，該方法包含(a)從肽中去除X2或其糖亞單位，從而形成截短的聚糖。
在一方面，本發(fā)明進一步包含通過去除Sia殘基而形成截短的聚糖。
在本發(fā)明的一個實施方案中，肽具有分子式
其中X3、X4、X5、X6、X7和X17是獨立選擇的單糖或寡糖殘基；和a、b、c、d、e和x獨立地選自整數(shù)0、1和2。
在本發(fā)明的一個方面，寡糖殘基是選自GlcNAc-Gal-Sia和GlcNAc-Gal的成員。在另一方面，至少一個寡糖成員選自a、b、c、d，e和x是1或2。在另一方面，步驟(a)中的去除產(chǎn)生了其中a、b、c、e和x的至少一個為0的截短的聚糖。
本發(fā)明包括對肽進行重構(gòu)的方法，其中X3、X5和X7是獨立選自(甘露糖)z和(甘露糖)z-(X8)的成員其中X8是選自單-和寡-糖的糖基部分；和z是1和20之間的整數(shù)，其中當(dāng)z是3或更大時，每一個(甘露糖)z獨立地選自線性和分支的結(jié)構(gòu)。
在一方面，X4選自GlcNAc和木糖。在另一方面，X3、X5和X7是(甘露糖)u，其中u選自1和20之間的整數(shù)，且當(dāng)u是3或更大時，每一個(甘露糖)u獨立地選自線性和分支的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明也包括對肽進行重構(gòu)的方法，其中所述肽具有分子式
其中r、s和t是獨立選自0和1的整數(shù)。
在本發(fā)明的一個實施方案中，肽具有分子式 其中X9和X10是獨立選擇的單糖或寡糖殘基；和m、n和f是獨立選自0和1的整數(shù)。
在一方面，肽具有分子式 其中X16是選自以下分子式的成員 其中，
s和i是獨立地選自0和1的整數(shù)。
在另一方面，肽具有分子式其中 X13、X14和X15獨立地選自糖基殘基；和g、h、i、j、k和p獨立地選自整數(shù)0和1。
在本發(fā)明的另一方面，g、h、i、j、k和p的至少一個是1。在另一方面，X14和X15是獨立選自GlcNAc和Sia的成員，且i和k獨立地選自整數(shù)0和1。在另一方面，i和k的至少一個是1，且如果k是1，那么g、h和j是0。
本發(fā)明也包括對肽進行重構(gòu)的方法，其中該方法包括使截短的聚糖與至少一種糖基轉(zhuǎn)移酶和至少一種糖基供體在適合于將所述至少一種糖基供體轉(zhuǎn)移到截短的聚糖的條件下接觸，從而對包含聚乙二醇的肽進行重構(gòu)。
在一方面，糖基供體包含在其上共價連接的修飾基團。
本發(fā)明也包括對肽進行重構(gòu)的方法，該方法包括去除X1，從而暴露AA。在一方面，該方法包括使AA與至少一種糖基轉(zhuǎn)移酶和至少一種糖基供體在適合于將所述至少一種糖基供體轉(zhuǎn)移到AA的條件下接觸，從而對包含聚乙二醇的所述肽進行重構(gòu)。
在一方面，至少一個糖基供體包含在其上共價連接的修飾基團。在另一方面，修飾基團是聚乙二醇。在一個實施方案中，聚乙二醇具有基本單分散(homodisperse)的分子量分布。
本發(fā)明包括對肽進行重構(gòu)的方法，其中，在使截短的聚糖與至少一種糖基轉(zhuǎn)移酶和至少一種糖基供體在適合于將所述至少一種糖基供體轉(zhuǎn)移到截短的聚糖的條件下接觸，從而對包含聚乙二醇的肽進行重構(gòu)之前，將在翻譯后修飾過程中添加到糖的基團去除。
在一方面，去除的基團是選自磷酸、硫酸、羧酸及其酯的成員。
本發(fā)明包括對肽進行重構(gòu)的方法，其中所述肽具有分子式 其中Z是選自O(shè)、S、NH和交聯(lián)劑的成員。
本發(fā)明也包括對肽進行重構(gòu)的方法，其中所述肽具有分子式 其中X11和X12是獨立地選擇的糖基部分；且r和x是獨立選自0和1的整數(shù)。
在本發(fā)明的一方面，X11和X12是(甘露糖)q，其中q是選自1-20的整數(shù)，且當(dāng)q是3或更大時，(甘露糖)q選自線性和分支的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明包括藥物組合物，其包含藥物可接受的稀釋劑和根據(jù)對包含聚乙二醇的肽進行重構(gòu)的無細(xì)胞的體外方法重構(gòu)的肽，所述肽具有分子式 其中AA是肽的末端或內(nèi)部氨基酸殘基；X1-X2是與AA共價連接的糖基殘基，其中X1是第一個糖基殘基；且X2是與X1共價連接的第二個糖基殘基，其中X1和X2選自單糖和寡糖殘基；所述方法包含
(a)從所述肽去除X2或其糖亞基，從而形成截短的聚糖。
本發(fā)明也包括對包含聚乙二醇的肽進行重構(gòu)的無細(xì)胞的體外方法，所述肽具有分子式 其中AA是肽的末端或內(nèi)部氨基酸殘基；X1是與AA共價連接的糖基殘基，選自單糖和寡糖殘基；且u是選自0和1的整數(shù)，該方法包含使肽與至少一種糖基轉(zhuǎn)移酶和至少一種糖基供體在適合于將所述至少一種糖基供體轉(zhuǎn)移到截短的聚糖的條件下接觸，從而對肽進行重構(gòu)。
在一方面，至少一個糖基供體包含在其上共價連接的修飾基團。在另一方面，修飾基團是聚乙二醇。在另一方面，聚乙二醇具有基本單分散(homodisperse)的分子量分布。
本發(fā)明也包括藥物組合物，其包含藥物可接受的稀釋劑和根據(jù)對包含聚乙二醇的肽進行重構(gòu)的無細(xì)胞的體外方法重構(gòu)的肽，所述肽具有分子式 其中AA是肽的末端或內(nèi)部氨基酸殘基；X1是與AA共價連接的糖基殘基，選自單糖和寡糖殘基；且u是選自0和1的整數(shù)，該方法包含
使肽與至少一種糖基轉(zhuǎn)移酶和至少一種糖基供體在適合于將所述至少一種糖基供體轉(zhuǎn)移到截短的聚糖的條件下接觸，從而對肽進行重構(gòu)。
附圖簡述為了闡明本發(fā)明的目的，本發(fā)明的某些實施方案在附圖中進行了描述。然而，本發(fā)明不局限于在附圖中描述的實施方案的精確排列和工具。


圖1是描述三甘露糖基核心聚糖(左邊)和生成具有等分的(bisecting)GlcNAc的聚糖的酶方法(右邊)的示意圖。
圖2是描述基本的三甘露糖基核心結(jié)構(gòu)和各種完成程度的復(fù)雜鏈的示意圖。顯示了基本的三甘露糖基核心結(jié)構(gòu)從不含有等分的GlcNAc殘基的復(fù)雜糖類聚糖結(jié)構(gòu)的體外酶促生成方法以及含有等分的GlcNAc的聚糖結(jié)構(gòu)的生成。符號正方形GlcNAc；淺色圓圈Man；黑色圓圈Gal；三角形NeuAc。
圖3是從具有三甘露糖基核心和等分的GlcNAc(左邊)開始酶促生成唾液酸化的聚糖結(jié)構(gòu)(右邊)的示意圖。
圖4是高甘露糖含量的典型聚糖結(jié)構(gòu)(左邊)和將該結(jié)構(gòu)還原為基本的三甘露糖基核心結(jié)構(gòu)的酶方法的示意圖。在該示意圖中，X是作為單糖、寡糖或多糖的甘露糖。
圖5是一般在植物細(xì)胞中產(chǎn)生的含有巖藻糖和木糖的N-連接的聚糖結(jié)構(gòu)示意圖。
圖6是一般在昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的含有巖藻糖的N-連接的聚糖結(jié)構(gòu)示意圖。注意，聚糖可以不具有核心巖藻糖，其可以具有任意一種鍵的單核心巖藻糖，或者其可以具有一種鍵占優(yōu)勢的單核心巖藻糖。
圖7是描述修剪高甘露糖結(jié)構(gòu)的各種途徑和從其中合成復(fù)雜的糖鏈的示意圖。符號正方形GlcNAc；圓圈Man；菱形巖藻糖；五角形木糖。
圖8是描述從基本的三甘露糖基核心結(jié)構(gòu)合成復(fù)雜結(jié)構(gòu)的體外策略的示意圖。符號正方形GlcNAc；淺色圓圈Man；黑色圓圈Gal；黑色三角形NeuAc；GnTN-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶；GalT半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；ST唾酸轉(zhuǎn)移酶。
圖9是描述合成單觸角聚糖和任選對該聚糖進行糖PEG化的兩種體外策略的示意圖。黑色正方形GlcNAc；黑色圓圈Man；淺色圓圈Gal；黑色三角形唾液酸。
圖10是描述合成單觸角聚糖和任選對該聚糖進行糖PEG化的兩種體外策略的示意圖。黑色正方形GlcNAc；黑色圓圈Man；淺色圓圈Gal；黑色三角形唾液酸。
圖11是描述可從基本的三甘露糖基核心結(jié)構(gòu)合成的各種復(fù)雜結(jié)構(gòu)的示意圖。符號正方形GlcNAc；淺色圓圈Man；黑色圓圈Gal；三角形NeuAc；菱形巖藻糖；FT和FucT巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶；GalT半乳糖基轉(zhuǎn)移酶；ST唾酸轉(zhuǎn)移酶；LeLewis抗原；SLe唾液酸化的Lewis抗原。
圖12是制備源自絲氨酸或蘇氨酸的O-連接糖肽的示例性示意圖。任選地，將水溶性聚合物(WSP)如聚乙二醇添加到最終的聚糖結(jié)構(gòu)中。
圖13是一系列描述4類O-聚糖結(jié)構(gòu)的圖解，稱為核心1～4。核心結(jié)構(gòu)用虛線描繪。
圖14，包含
圖14A和
圖14B，是一系列表示本發(fā)明的示例性實施方案的示意圖，其中將包含復(fù)雜糖結(jié)構(gòu)和/或高甘露糖結(jié)構(gòu)的糖殘基修剪為第一代雙觸角(the first generation biantennary)的結(jié)構(gòu)。任選地，僅在與GnT I反應(yīng)之后添加巖藻糖。然后使具有水溶性聚合物(WSP)的修飾的糖與由修剪過程中暴露的一個或多個糖殘基綴合。
圖15是與圖4所示的相似的示意圖，其中將高甘露糖結(jié)構(gòu)(highmannose structure)或復(fù)合結(jié)構(gòu)“修剪”為甘露糖β-連接的核心，且然后使具有水溶性聚合物的修飾的糖與由修剪過程中暴露的一個或多個糖殘基綴合。糖用糖基轉(zhuǎn)移酶按順序添加。
圖16是與圖4所示的相似的示意圖，其中“修剪”高甘露糖結(jié)構(gòu)或復(fù)合結(jié)構(gòu)直至第一個甘露糖所附著的GlcNAc，且然后使具有水溶性聚合物的修飾糖與由修剪過程中暴露的一個或多個糖殘基綴合。糖用糖基轉(zhuǎn)移酶按順序添加。
圖17是與圖4所示的相似的示意圖，其中“修剪”高甘露糖結(jié)構(gòu)或復(fù)合結(jié)構(gòu)直至第一個附著到肽的Asn上的GlcNAc，然后使水溶性聚合物與隨后已添加的一個或多個糖殘基綴合。糖用糖基轉(zhuǎn)移酶按順序添加。
圖18包含
圖18A和
圖18B，是任選從高甘露糖結(jié)構(gòu)或復(fù)合結(jié)構(gòu)將N-連接的糖進行修剪并隨后用具有水溶性聚合物的修飾糖部分(Gal或GlcNAc)進行衍生化的示意圖。
圖19包含
圖19A和
圖19B，是從高甘露糖結(jié)構(gòu)或復(fù)合結(jié)構(gòu)將N-連接的糖進行修剪并隨后用具有水溶性聚合物的唾液酸部分進行衍生化的示意圖。糖用糖基轉(zhuǎn)移酶按順序添加。
圖20是任選從高甘露糖結(jié)構(gòu)或復(fù)合結(jié)構(gòu)將N-連接的糖進行修剪并隨后用一種或多種唾液酸部分進行衍生化，并用水溶性聚合物衍生化的唾液酸終止的示意圖。糖用糖基轉(zhuǎn)移酶按順序添加。
圖21是將O-連接的糖進行“修剪”并隨后與具有水溶性聚合物的修飾糖綴合的示意圖。在示例性的示意圖中，“修剪”糖部分直至第一代雙觸角結(jié)構(gòu)。
圖22例示性顯示，對O-連接的糖肽的糖部分進行修剪以產(chǎn)生可用于與在其上附著了水溶性聚合物的修飾糖綴合的甘露糖。
圖23包含圖23A～圖23C，是一系列的示例性示意圖。圖23A是闡明添加PEG化的糖和隨后添加無修飾的糖的示意圖。圖23B是闡明將超過一種修飾的糖添加到一種聚糖上的示意圖。圖23C是闡明將不同的修飾的糖添加到O-連接的聚糖和N-連接的聚糖上的示意圖。
圖24是通過聚糖重構(gòu)(包括綴合)而改善肽的治療功能的各種方法的圖解。
圖25是一套對治療高歇(Gaucher)病的治療肽進行聚糖重構(gòu)的示意圖。
圖26是進行聚糖重構(gòu)以生成具有末端甘露糖-6-磷酸部分的聚糖的示意圖。
圖27是闡明經(jīng)唾液酸化后在CHO-產(chǎn)生的葡糖腦苷脂酶(CerezymeTM)上的聚糖結(jié)構(gòu)排列的圖解。
圖28包含圖28A～28Z和圖28AA～28CC，是本發(fā)明方法中所用的肽列表。
圖29包含圖29A～29G，提供了用于對粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖29A是描述G-CSF肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了聚糖所結(jié)合的氨基酸殘基。圖29B～29G是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖29A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟。
圖30包含圖30A～30EE，給出了對干擾素α上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖30A是描述干擾素α同種型14c肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了聚糖所結(jié)合的氨基酸殘基。圖30B～30D是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖30A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖30E是描述干擾素α同種型14c肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了聚糖所連接的氨基酸殘基。圖30F～30N是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖30E中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖300是描述干擾素α同種型2a或2b肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了聚糖所連接的氨基酸殘基。圖30P～30W是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖300中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖30X是描述干擾素α-粘蛋白融合肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖30Y～30AA是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖30X中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖30BB是描述干擾素α-粘蛋白融合肽和干擾素α肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖30CC～30EE是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖30BB中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖31包含圖31A～31S，給出了對干擾素β上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖31A是描述干擾素β肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了聚糖所連接的氨基酸殘基。圖31B～310是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖31A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖31P是描述干擾素β肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了聚糖所連接的氨基酸殘基。圖31Q～31S是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖31P中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖32包含圖32A～32D，給出了對凝血因子VII和凝血因子VIIa上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖32A是描述凝血因子VII和凝血因子VIIa肽A(實線)和B(虛線)及聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖32B～32D是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖32A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖33包含圖33A～33G，給出了對凝血因子IX上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖33A是描述凝血因子IX肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖33B～33G是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖33A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖34包含圖34A～34J，給出了對促卵泡激素(FSH)(包括α和β亞基)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖34A是描述促卵泡激素肽FSHα和FSHβ及在其上結(jié)合的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖34B～34J是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖34A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖35包含圖35A～35AA，給出了對紅細(xì)胞生成素(EPO)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖35A是描述EPO肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖35B～35S是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖35A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖35T是描述EPO肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖35U～35W是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖35T中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖35X是描述EPO肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖35Y～35AA是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖35X中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖36包含圖36A～36K，給出了對粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖36A是描述GM-CSF肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖36B～36G是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖36A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖36H是描述GM-CSF肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖36I～36K是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖36H中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖37包含圖37A～37N，給出了對干擾素γ肽上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖37A是描述干擾素γ肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖37B～37G是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖37A中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖37H是描述干擾素γ肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖37I～37N是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖37H中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖38包含圖38A～38N，給出了對α1-抗胰蛋白酶(ATT或α-1蛋白酶抑制劑)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖38A是描述ATT肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖38B～38F是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖38A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖38G是描述ATT肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖38H～38J是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖38G中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖38K是描述ATT肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖38L～38N是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖38K中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖39包含圖39A～39J，給出了對葡糖腦苷脂酶上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖39A是描述葡糖腦苷脂酶肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖39B～39F是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖39A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖39G是描述葡糖腦苷脂酶肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖39H～39K是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖39G中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖40包含圖40A～40W，給出了對組織型血纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖40A是描述TPA肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖40B～40G是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖40A中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖40H是描述TPA肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖40I～40K是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖40H中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖40L是描述突變的TPA肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖40M～400是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖40L中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖40P是描述突變的TPA肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖40Q～40S是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖40P中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖40T是描述突變的TPA肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖40U～40W是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖40T中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖41包含圖41A～41G，給出了對白細(xì)胞介素-2(IL-2)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖41A是描述白細(xì)胞介素-2肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了聚糖所結(jié)合的氨基酸殘基。圖41B～41G是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖41A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖42包含圖42A～42M，給出了對凝血因子VIII上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖42A是結(jié)合到凝血因子VIII肽的N-連接糖基化位點(A和A’)和O-連接位點(B)的聚糖的分子式。圖42B～42F是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖42A中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖42G是結(jié)合到凝血因子VIII肽的N-連接糖基化位點(A和A’)和O-連接位點(B)的聚糖的分子式。圖42H～42M是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖42G中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖43包含圖43A～43M，給出了對尿激酶上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖43A是描述尿激酶肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖43B～43F是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖43A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖43G是描述尿激酶肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖43H～43L是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖43G中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖44包含圖44A～44J，給出了對人DNase(hDNase)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖44A是描述人DNase肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖44B～44F是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖44A中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖44G是描述人DNase肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖44H～44J是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖44F中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖45包含圖45A～45L，給出了對胰島素上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖45A是描述突變后含有N糖基化位點的胰島素肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解。圖45B～45D是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖45A中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖45E是描述胰島素-粘蛋白融合肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖45F～45H是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖45E中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖45I是描述胰島素-粘蛋白融合肽和胰島素肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖45J～45L是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖45I中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖46包含圖46A～46K，給出了對乙型肝炎表面蛋白質(zhì)的M-抗原(preS和S)(HbsAg)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖46A是描述M-抗原肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖46B～46G是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖46A中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖46H是描述M-抗原肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖46I～46K是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖46H中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖47包含圖47A～47K，給出了對人生長激素(包括N、V及其變體)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖47A是描述人生長激素肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖47B～47D是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖47A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖47E是描述包含人生長激素肽和粘蛋白肽的部分或全部的3個融合肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖47F～47K是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖47E中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖48包含圖48A～48G，給出了對TNF受體-IgG Fc區(qū)域融合蛋白質(zhì)(EnbrelTM)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖48A是描述可進行突變以含有額外的N糖基化位點的TNF受體-IgG Fc區(qū)域融合肽及聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。TNF受體肽以粗線描述，而IgG Fc區(qū)域以普通線描述。圖48B～48G是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖48A中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖49，包含圖49A～49D，給出了抗-HER2單克隆抗體(HerceptinTM)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖49A是描述經(jīng)突變含有N糖基化位點的抗-HER2單克隆抗體及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的抗體重鏈上的殘基。圖49B～49D是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖49A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖50包含圖50A～50D，給出了對呼吸道合胞病毒蛋白質(zhì)F的單克隆抗體(SynagisTM)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖50A是描述經(jīng)突變含有N糖基化位點的蛋白質(zhì)F肽的單克隆抗體及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖50B～50D是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖50A中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖51包含圖51A～51D，給出了對TNF-α的單克隆抗體(RemicadeTM)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖51A是描述含有N糖基化位點的TNF-α的單克隆抗體及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖51B～51D是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖51A中肽進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖52包含圖52A～52L，給出了對糖蛋白IIb/IIIa的單克隆抗體(ReoproTM)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖52A是描述經(jīng)突變含有N糖基化位點的突變的糖蛋白IIb/IIIa肽的單克隆抗體及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖52B～52D是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖52E是描述糖蛋白IIb/IIIa-粘蛋白融合肽的單克隆抗體及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖52F～52H是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖52I是描述糖蛋白IIb/IIIa-粘蛋白融合肽的單克隆抗體和糖蛋白IIb/IIIa肽的單克隆抗體及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖52J～52L是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖53包含圖53A～53G，給出了對CD20的單克隆抗體(RituxanTM)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖53A是描述經(jīng)突變含有N糖基化位點的CD20的單克隆抗體及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖53B～53D是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖53A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖53E是描述經(jīng)突變含有N糖基化位點的CD20的單克隆抗體及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到預(yù)期進行重構(gòu)的聚糖上的殘基。圖53F～53G是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖53E中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖54包含圖54A～540，給出了對抗凝血酶III(ATIII)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖54A是描述抗凝血酶III肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到N-連接的聚糖上的氨基酸殘基。圖54B～54G是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖54A中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖54H是描述抗凝血酶III肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到N-連接的聚糖上的氨基酸殘基。圖54I～54K是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖54H中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。圖54L是描述抗凝血酶III肽及在其上連接的示例性聚糖的分子式的圖解，顯示了連接到N-連接的聚糖上的氨基酸殘基。圖54M～540是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)而對圖54L中肽的聚糖進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖55包含圖55A～55J，給出了對人絨毛膜促性腺激素(hCG)α和β亞基上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖55A是描述hCGα和hCGβ肽的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的N-連接的聚糖(A)和O-連接的聚糖(B)上的氨基酸殘基和聚糖的分子式。圖55B～55J是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖56包含圖56A～56J，給出了對α-半乳糖苷酶(FabrazymeTM)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖56A是描述α-半乳糖苷酶A肽的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的N-連接的聚糖(A)上的氨基酸殘基和聚糖的分子式。圖56B～56J是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖57包含圖57A～57J，給出了對α-艾杜糖苷酶(iduronidase)(AldurazymeTM)上的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性示意圖。圖57A是描述α-艾杜糖苷酶肽的圖解，顯示了結(jié)合到預(yù)期進行重構(gòu)的N-連接的聚糖(A)上的氨基酸殘基和聚糖的分子式。圖57B～57J是基于表達該肽的細(xì)胞的類型以及想要的重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)進行的預(yù)期重構(gòu)步驟的圖解。
圖58包含圖58A和58B，是粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO1和2)。
圖59包含圖59A和59B，是干擾素α(IFN-α)的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO3和4)。
圖60包含圖60A和60B，是干擾素β(IFN-β)的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO5和6)。
圖61包含圖61A和61B，是凝血因子VIIa的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO7和8)。
圖62包含圖62A和62B，是凝血因子IX的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO9和10)。
圖63包含圖63A～63D，分別是促卵泡激素(FSH)的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO11～14)。
圖64包含圖64A和64B，是促紅細(xì)胞生成素(EPO)的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO15和16)。
圖65是成熟EPO即165個氨基酸的氨基酸序列(SEQ ID NO73)。
圖66包含圖66A和66B，是粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO17和18)。
圖67包含圖67A和67B，是干擾素γ(IFN-γ)的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO19和20)。
圖68包含圖68A和68B，是α-1蛋白酶抑制劑(A-1-PI或α-抗胰蛋白酶)的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO21和22)。
圖69包含圖69A-1～69A-2和69B，是葡糖腦苷脂酶的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO23和24)。
圖70包含圖70A和70B，是組織型血纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO25和26)。
圖71包含圖71A和71B，是白細(xì)胞介素-2(IL-2)的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO27和28)。
圖72包含圖72A-1～71A-4和72B-1～72B-4，分別為凝血因子VIII的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO29和30)。
圖73包含圖73A和73B，是尿激酶的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO33和34)。
圖74包含圖74A和74B，是人重組DNase(hrDNase)的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO39和40)。
圖75包含圖75A和75B，是胰島素分子的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO43和44)。
圖76包含圖76A和76B，是來自乙型肝炎病毒的S-蛋白質(zhì)(HBsAg)的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO45和46)。
圖77包含圖77A和77B，是人生長激素(hGH)的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO47和48)。
圖78包含圖78A和78D，是抗凝血酶III的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列。78A和78B是“野生型(WT)”抗凝血酶III的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO63和64)。
圖79包含圖79A～79D，是人絨毛膜促性腺激素(hCG)α和β亞基的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列。79A和79B是人絨毛膜促性腺激素α亞基的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO69和70)。79C和79D是人絨毛膜促性腺激素β亞基的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO71和72)。
圖80包含圖80A和80B，是α-艾杜糖苷酶的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列。(分別為SEQ ID NO65和66)。
圖81包含圖81A和81B，是α-半乳糖苷酶的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列。(分別為SEQ ID NO67和68)。
圖82包含圖82A和82B，是包含EnbrelTM的部分(腫瘤壞死因子受體(TNF-R)/IgG融合物)的75kDa腫瘤壞死因子(TNF-R)的示例性核苷酸和相應(yīng)的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO31和32)。
圖83包含圖83A和83B，分別為HerceptinTM(抗人表皮生長因子受體Her-2的單克隆抗體(MAb))的輕和重鏈的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO35和36)。
圖84包含圖84A和84B，分別為SynagisTM(呼吸道合胞病毒F肽的MAb)的重和輕鏈的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQID NO37和38)。
圖85包含圖85A和85B，是RemicadeTM(抗TNFα的MAb)的非人類的可變區(qū)的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO41和42)。
圖86包含圖86A和86B，是人IgG的Fc部分的示例性核苷酸和相應(yīng)氨基酸序列(分別為SEQ ID NO49和50)。
圖87是抗糖蛋白IIb/IIIa的鼠抗體成熟可變區(qū)輕鏈的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO52)。
圖88是抗糖蛋白IIb/IIIa的鼠抗體成熟可變區(qū)重鏈的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO54)。
圖89是人IgG可變區(qū)輕鏈的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO51)。
圖90是人IgG可變區(qū)重鏈的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO53)。
圖91是人IgG輕鏈的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO55)。
圖92是人IgG重鏈的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO56)。
圖93包含圖93A和93B，是抗-CD20的鼠抗體輕鏈的成熟可變區(qū)的示例性核苷酸和相應(yīng)的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO59和60)。
圖94包含圖94A和94B，是抗-CD20的鼠抗體重鏈的成熟可變區(qū)的示例性核苷酸和相應(yīng)的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO61和62)。
圖95包含圖95A～95E，是串聯(lián)嵌合抗體表達載體TCAE 8的核苷酸序列(SEQ ID NO57)。
圖96包含圖96A～96E，是包含抗-CD20的鼠抗體輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的串聯(lián)嵌合抗體表達載體TCAE 8的核苷酸序列(SEQ ID NO58)。
圖97包含圖97A～97C，是描述對通過PNGaseF從骨髓瘤表達的Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的2-AA HPLC分析的曲線圖。聚糖的結(jié)構(gòu)通過存留時間來確定G0糖形式(glycoform)在30分鐘洗脫，G1糖形式在～33分鐘洗脫，G2糖形式在大約37分鐘洗脫，且S1-G1糖形式在～70分鐘洗脫。圖97A描述了對DEAE抗體樣品的分析。圖97B描述了對SPA抗體樣品的分析。圖97C描述了對Fc抗體樣品的分析。在表14中總結(jié)了這些曲線圖中峰下的面積百分?jǐn)?shù)。
圖98包含圖98A～98C，是描述對通過PNGaseF從骨髓瘤表達的Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的MALDI分析的曲線圖。聚糖用2-AA進行衍生化然后通過MALDI進行分析。圖98A描述了對DEAE抗體樣品的分析。圖98B描述了對SPA抗體樣品的分析。圖98C描述了對Fc抗體樣品的分析。
圖99包含圖99A～99D，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的毛細(xì)管電泳分析的曲線圖，已對該抗體進行了糖重構(gòu)(glycoremodeled)以使其含有M3N2糖形式。在圖99A中顯示了對用APTS進行衍生化的聚糖標(biāo)準(zhǔn)物的毛細(xì)管電泳分析的曲線圖。圖99B描述了對DEAE抗體樣品的分析。圖99C描述了對SPA抗體樣品的分析。圖99D描述了對Fc抗體樣品的分析。在表15中總結(jié)了這些曲線圖中峰下的面積百分?jǐn)?shù)。
圖100包含
圖100A～100D，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的毛細(xì)管電泳分析的曲線圖，已對該抗體進行了糖重構(gòu)以使其含有G0糖形式。在
圖100A中顯示了用APTS進行衍生化的聚糖標(biāo)準(zhǔn)物的毛細(xì)管電泳分析的曲線圖。
圖100B描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖100C描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖100D描述了對Fc抗體樣品的分析。在表16中總結(jié)了這些曲線圖中峰下的面積百分?jǐn)?shù)。
圖101包含
圖101A～101C，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的2-AA HPLC分析的曲線圖，已對該抗體進行了糖重構(gòu)以使其含有G0糖形式。釋放的聚糖用2AA進行標(biāo)記，并通過HPLC在NH2P-50 4D氨基柱上進行分離。
圖101A描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖101B描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖101C描述了對Fc抗體樣品的分析。在表16中總結(jié)了這些曲線圖中峰下的面積百分?jǐn)?shù)。
圖102包含
圖102A～102C，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的MALDI分析的曲線圖，已對該抗體進行了糖重構(gòu)以使其含有G0糖形式。釋放的聚糖用2-AA進行衍生化然后通過MALDI進行分析。
圖102A描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖102B描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖102C描述了對Fc抗體樣品的分析。
圖103包含
圖103A～103D，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的毛細(xì)管電泳分析的曲線圖，已對該抗體進行了糖重構(gòu)以使其含有G2糖形式。在
圖103A中顯示了用APTS進行衍生化的聚糖標(biāo)準(zhǔn)物的毛細(xì)管電泳分析的曲線圖。
圖103B描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖103C描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖103D描述了對Fc抗體樣品的分析。在表17中總結(jié)了這些曲線圖中峰下的面積百分?jǐn)?shù)。
圖104包含
圖104A～104C，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的2-AA HPLC分析的曲線圖，已對該抗體進行了糖重構(gòu)以使其含有G2糖形式。釋放的聚糖用2AA進行標(biāo)記，并通過HPLC在NH2P-50 4D氨基柱上進行分離。
圖104A描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖104B描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖104C描述了對Fc抗體樣品的分析。在表17中總結(jié)了這些曲線圖中峰下的面積百分?jǐn)?shù)。
圖105包含
圖105A～105C，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的MALDI分析的曲線圖，已對該抗體進行了糖重構(gòu)以使其含有G2糖形式。釋放的聚糖用2-AA進行衍生化然后通過MALDI進行分析。
圖105A描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖105B描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖105C描述了對Fc抗體樣品的分析。
圖106包含
圖106A～106D，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的毛細(xì)管電泳分析的曲線圖，已通過對M3N2糖形式進行GnT-I處理對該抗體進行了糖重構(gòu)。在
圖106A中顯示了用APTS進行衍生化的聚糖標(biāo)準(zhǔn)物的毛細(xì)管電泳分析的曲線圖。
圖106B描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖106C描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖106D描述了對Fc抗體樣品的分析。
圖107包含
圖107A～107C，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的2-AA HPLC分析的曲線圖，已通過對M3N2糖形式進行GnT-I處理對該抗體進行了重構(gòu)。釋放的聚糖用2AA進行標(biāo)記，并通過HPLC在NH2P-504D氨基柱上進行分離。
圖107A描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖107B描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖107C描述了對Fc抗體樣品的分析。
圖108包含
圖108A～108C，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的MALDI分析的曲線圖，已通過對M3N2糖形式進行GnT-I處理對該抗體進行了糖重構(gòu)。釋放的聚糖用2-AA進行衍生化然后通過MALDI進行分析。
圖108A描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖108B描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖108C描述了對Fc抗體樣品的分析。
圖109包含
圖109A～109D，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的毛細(xì)管電泳分析的曲線圖，已通過對M3N2糖形式進行GnT-I、II和III處理對該抗體進行了糖重構(gòu)。在
圖109A中顯示了用APTS進行衍生化的聚糖標(biāo)準(zhǔn)物的毛細(xì)管電泳分析的曲線圖。
圖109B描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖109C描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖109D描述了對Fc抗體樣品的分析。在表18中總結(jié)了這些曲線圖中峰下的面積百分?jǐn)?shù)。
圖110包含
圖110A～110C，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的2-AA HPLC分析的曲線圖，已通過對M3N2糖形式進行GnT-I、II和III處理對該抗體進行了糖重構(gòu)。釋放的聚糖用2AA進行標(biāo)記，并通過HPLC在NH2P-504D氨基柱上進行分離。
圖110A描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖110B描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖110C描述了對Fc抗體樣品的分析。在表18中總結(jié)了這些曲線圖中峰下的面積百分?jǐn)?shù)。
圖111包含
圖111A～111C，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的MALDI分析的曲線圖，已通過對NGA2F糖形式進行半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理對該抗體進行了糖重構(gòu)。釋放的聚糖用2-AA進行衍生化然后通過MALDI進行分析。
圖111A描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖111B描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖111C描述了對Fc抗體樣品的分析。
圖112包含
圖112A～112D，是描述在GalT1處理前(
圖112A和112C)和GalT1處理后(
圖112B和112D)對從含有NGA2F同種型的Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的2-AA HPLC分析的曲線圖。
圖112A和112B描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖112C和112D描述了對Fc抗體樣品的分析。釋放的聚糖用2從進行標(biāo)記，并通過HPLC在NH2P-50 4D氨基柱上進行分離。
圖113包含
圖113A～113C，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的2-AA HPLC分析的曲線圖，已通過對G2糖形式進行ST3Gal3處理對該抗體進行了糖重構(gòu)。釋放的聚糖用2AA進行標(biāo)記，并通過HPLC在NH2P-50 4D氨基柱上進行分離。
圖113A描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖113B描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖113C描述了對Fc抗體樣品的分析。在表19中總結(jié)了這些曲線圖中峰下的面積百分?jǐn)?shù)。
圖114包含
圖114A～114C，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的MALDI分析的曲線圖，已通過對G2糖形式進行ST3Gal3處理對該抗體進行了糖重構(gòu)。釋放的聚糖用2-AA進行衍生化，然后通過MALDI進行分析。
圖114A描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖114B描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖114C描述了對Fc抗體樣品的分析。
圖115包含
圖115A～115D，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的毛細(xì)管電泳分析的曲線圖，已通過對G2糖形式進行ST6Gal1處理對該抗體進行了糖重構(gòu)。在
圖115A中顯示了用APTS進行衍生化的聚糖標(biāo)準(zhǔn)物的毛細(xì)管電泳分析的曲線圖。
圖115B描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖115C描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖115D描述了對Fc抗體樣品的分析。
圖116包含
圖116A～116C，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的2-AA HPLC分析的曲線圖，已通過對G2糖形式進行ST6Gal1處理對該抗體進行了糖重構(gòu)。釋放的聚糖用2AA進行標(biāo)記，并通過HPLC在NH2P-50 4D氨基柱上進行分離。
圖116A描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖116B描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖116C描述了對Fc抗體樣品的分析。
圖117包含
圖117A～117C，是描述對從Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的MALDI分析的曲線圖，已通過對G2糖形式進行ST6Gal1處理對該抗體進行了糖重構(gòu)。釋放的聚糖用2-AA進行衍生化然后通過MALDI進行分析。
圖117A描述了對DEAE抗體樣品的分析。
圖117B描述了對SPA抗體樣品的分析。
圖117C描述了對Fc抗體樣品的分析。
圖118包含
圖118A～118E，描述了在非還原條件下對用不同糖形式進行糖重構(gòu)的Cri-IgG1抗體的SDS-PAGE分析圖象。牛血清白蛋白(BSA)在非還原條件下運行作為定量標(biāo)準(zhǔn)物。顯示了蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)物，且其大小以kDa顯示。
圖118A描述對進行了糖重構(gòu)以含有G0和G2糖形式的DEAE、SPA和Fc Cri-IgG1抗體的SDS-PAGE分析。
圖118B描述對進行了糖重構(gòu)以含有NGA2F(二等分的)和GnT-I-M3N2(GnT1)糖形式的DEAE、SPA和Fc Cri-IgG1抗體的SDS-PAGE分析。
圖118C描述對進行了糖重構(gòu)以含有S2G2(ST6Gal1)糖形式的DEAE、SPA和Fc Cri-IgG1抗體的SDS-PAGE分析。
圖118D描述對進行了糖重構(gòu)以含有M3N2糖形式的DEAE、SPA和Fc Cri-IgG1抗體以及BSA的SDS-PAGE分析。
圖118E描述對進行了糖重構(gòu)以含有Gal-NGA2F(Gal-二等分的)糖形式的DEAE、SPA和Fc Cri-IgG1抗體以及BSA的SDS-PAGE分析。
圖119是描述唾液酸化前后TP10的FACE分析結(jié)果的丙烯酰胺凝膠圖象。BiNA0種類不具有唾液酸殘基。BiNA1種類具有1個唾液酸殘基。BiNA2種類具有2個唾液酸殘基。Bi＝雙觸角的；NA＝神經(jīng)氨酸。
圖120是注射入大鼠中的唾液酸化前后的TP10的血漿濃度(μg/ml)-時間曲線圖。
圖121是對于唾液酸化前后的TP10以μg/hr/ml描述血漿濃度-時間曲線下的面積(AUC)的曲線圖。
圖122是描述巖藻糖化前后TP10的FACE聚糖分析和CHO細(xì)胞產(chǎn)生的TP-20的FACE聚糖分析結(jié)果的丙烯酰胺凝膠圖象。BiNA2F2種類具有2個神經(jīng)氨酸(NA)殘基和2個巖藻糖殘基(F)。
圖123是描述在體外(菱形)和在Lecll CHO細(xì)胞中體內(nèi)(正方形)糖基化的TP20(sCR1sLeX)的體外結(jié)合的曲線圖。
圖124是描述對來自EPO的GlcNAc化的糖形式的2-AA HPLC分析的曲線圖。
圖125包含
圖125A和125B，是描述對2批EPO的2-AA HPLC分析的曲線圖，已向該EPO中加入了N-乙酰葡糖胺。
圖125A描述了對A批的分析，
圖125B描述了對B批的分析。
圖126是描述對用GnT-V向EPO引入第三個聚糖分支的反應(yīng)產(chǎn)物的2-AA HPLC分析的曲線圖。
圖127是描述用GnT-I、GnT-II、GnT-III、GnT-V和GalT1和適當(dāng)?shù)墓w處理后EPO制劑的聚糖的MALDI-TOF譜曲線圖。
圖128是描述天然EPO的聚糖MALDI譜的曲線圖。
圖129是用CMP-SA-PEG(1kDa)和CMP-SA-PEG(10kDa)的PEG化反應(yīng)產(chǎn)物的SDS-PAGE凝膠圖象。
圖130是描述PEG化的EPO體外生物測定結(jié)果的曲線圖。菱形代表來自不具有PEG分子的唾液酸化的EPO的數(shù)據(jù)。正方形代表用具有PEG(1kDa)的EPO獲得的數(shù)據(jù)。三角形代表用具有PEG(10kDa)的EPO獲得的數(shù)據(jù)。
圖131是CHO-表達的EPO的示意圖。EPO肽長度為165個氨基酸，沒有糖基化的分子量為18kDa。在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的糖基化形式的EPO分子量為約33kDa～39kDa。表示聚糖鏈中糖的形狀在圖底邊的框中給出。
圖132是昆蟲細(xì)胞表達的EPO的示意圖。表示聚糖鏈中糖的形狀在
圖131底邊的框中給出。
圖133是描述在昆蟲細(xì)胞中表達的EPO肽的分子量的條線圖，該EPO肽被進行重構(gòu)以形成完全的單-、雙-和三觸角聚糖，并任選用1kDa、10kDa或20kDa PEG進行糖PEG化。EpoetinTM是表達于哺乳動物細(xì)胞中而不進行進一步的聚糖修飾或PEG化的EPO。NESP(AranespTM，Amgen，Thousand Oaks，CA)是具有5個N-連接的聚糖位點的EPO形式，其也表達于哺乳動物細(xì)胞中而不進行進一步的聚糖修飾或PEG化。
圖134包含
圖134A和134B，描述對昆蟲細(xì)胞表達的EPO進行重構(gòu)和糖PEG化的一種方案。
圖134A描述將昆蟲表達的聚糖重構(gòu)為單觸角糖PEG化聚糖的重構(gòu)和糖PEG化步驟。
圖134B描述在多肽的每一個N-連接的聚糖位點均具有完全的糖PEG化單觸角聚糖的重構(gòu)的EPO肽。表示聚糖鏈中糖的形狀在
圖131底邊的框中給出，只是三角形代表唾液酸。
圖135是描述EPO-SA和EPO-SA-PEG構(gòu)建體體外生物活性的曲線圖。體外測定測量在加入10.0、5.0、2.0、1.0、0.5和0μg/ml EPO構(gòu)建體后在RBMI+PBS 10％+GM-CSF(12ng/ml)中維持48小時的TF-1紅白血病細(xì)胞的增殖。Tri-SA指聚糖為三觸角的且具有SA的EPO構(gòu)建體。Tri-SA 1K PEG指聚糖為三觸角的且具有Gal并然后用SA-PEG1kDa糖PEG化的EPO構(gòu)建體。Di-SA 10K PEG指聚糖為雙觸角的且具有Gal并然后用SA-PEG 10kDa糖PEG化的EPO構(gòu)建體。Di-SA 1K PEG指聚糖為雙觸角的且具有Gal并然后用SA-PEG 1kDa糖PEG化的EPO構(gòu)建體。Di-SA指聚糖為雙觸角的且構(gòu)建到SA的EPO構(gòu)建體。EpogenTM是表達于CHO細(xì)胞中并不具有進一步的聚糖修飾的EPO。
圖136是描述大鼠中EPO構(gòu)建體的藥物代謝動力學(xué)的曲線圖。將大鼠用[I125]-標(biāo)記的糖PEG化和非糖PEG化EPO進行推注。曲線圖顯示注射后0～約72分鐘的大鼠血流中放射性標(biāo)記的EPO的濃度?！癇iant-10K”指具有雙觸角聚糖結(jié)構(gòu)的EPO，該雙觸角聚糖結(jié)構(gòu)具有末端的10kDa PEG部分。“Mono-20K”指具有單觸角聚糖結(jié)構(gòu)的EPO，該單觸角聚糖結(jié)構(gòu)具有末端的20kDa PEG部分。NESP指商業(yè)上可購得的Aranesp?！癇iant-1K”指具有雙觸角聚糖結(jié)構(gòu)的EPO，該雙觸角聚糖結(jié)構(gòu)具有末端的1kDa PEG部分?！癇iant-SA”指具有雙觸角聚糖結(jié)構(gòu)的EPO，該雙觸角聚糖結(jié)構(gòu)具有末端的1kDa部分。72小時時血流中EPO構(gòu)建體的濃度如下Biant-10K，5.1cpm/ml；Mono-20K，3.2cpm/ml；NESP，1cpm/ml；及Biant-1K，0.2cpm/ml；Biant-SA，0.1cpm/ml。EPO構(gòu)建體中曲線下的相對面積如下Biant-10K，2.9；Mono-20K，2.1；NESP，1；Biant-1K，0.5；及Biant-SA，0.2。
圖137是描述EPO構(gòu)建體在體內(nèi)刺激網(wǎng)狀細(xì)胞增多(reticulocytosis)能力的條線圖。每一個處理組由8只小鼠組成。給予小鼠10μg蛋白質(zhì)/kg體重的單次皮下注射。在96小時時測量網(wǎng)狀細(xì)胞增多百分?jǐn)?shù)。三觸角-SA2，3(6)構(gòu)建體具有以2，3或2，6鍵結(jié)合的SA分子(參見本文的制備實施例18)，其中EPO上的聚糖是在其上附著有SA-PEG 10K的三觸角聚糖。類似地，雙觸角-10K PEG是具有在其上附著有10K PEG的SA-PEG的雙觸角N-聚糖的EPO。
圖138是描述EPO構(gòu)建體在體內(nèi)增加小鼠血液的血細(xì)胞比容能力的曲線圖。對CD-1雌性小鼠用2.5μg蛋白質(zhì)/kg體重進行腹膜內(nèi)(i.p.)注射。在EPO注射后的第15日測量小鼠的血細(xì)胞比容。Bi-1K指聚糖為雙觸角的且構(gòu)建到(built out to)Gal并然后用SA-PEG 1kDa糖PEG化的EPO構(gòu)建體。Mono-20K指聚糖為單觸角的且構(gòu)建到Gal并然后用SA-PEG 20kDa糖PEG化的EPO構(gòu)建體。
圖139包含
圖139A和139B，描述從在昆蟲細(xì)胞中表達的EPO(Protein Sciences，Lot#060302)酶促釋放的聚糖的分析。
圖139A描述對釋放的聚糖的HPLC分析。
圖139B描述對釋放的聚糖的MALDI分析。菱形表示巖藻糖，正方形表示GlcNAc，圓圈表示甘露糖。
圖140描述在GnT-I/GalT-1反應(yīng)后從EPO釋放的聚糖的MALDI分析。聚糖的結(jié)構(gòu)通過與標(biāo)準(zhǔn)聚糖進行峰譜的比較來確定。聚糖的結(jié)構(gòu)描繪在峰的旁邊。菱形表示巖藻糖，及正方形表示GlcNAc，圓圈表示甘露糖，星形表示半乳糖。
圖141描述在GnT-I/GalT-1反應(yīng)、Superdex 75純化、與SA-PEG(10kDa)和SA-PEG(20kDa)的ST3Gal3反應(yīng)后，對EPO的SDS-PAGE分析。
圖142描述對PEG化單觸角EPO的TF-1細(xì)胞體外生物測定的結(jié)果。
圖143包含
圖143A和143B，描述在GnT-I/GnT-II反應(yīng)后從EPO釋放的聚糖的分析。
圖143A描述對釋放的聚糖的HPLC分析，其中峰3表示雙觸角GlcNAc聚糖。
圖143B描述對釋放的聚糖的MALDI分析。聚糖的結(jié)構(gòu)通過與標(biāo)準(zhǔn)聚糖進行峰譜的比較來確定。聚糖的結(jié)構(gòu)描繪在峰的旁邊。菱形表示巖藻糖，及正方形表示GlcNAc，圓圈表示甘露糖。
圖144包含
圖144A和144B，描述在GalT-1反應(yīng)后從EPO釋放的聚糖的HPLC分析。
圖144A描述在小規(guī)模GalT-1反應(yīng)后釋放的聚糖。
圖144B描述在大規(guī)模GalT-1反應(yīng)后釋放的聚糖。在兩個圖中，峰1是具有末端半乳糖部分的雙觸角聚糖，而峰2是不具有末端半乳糖部分的雙觸角聚糖。
圖145描述在GalT-1反應(yīng)后對EPO種類的Superdex 75層析分離。峰2含有具有雙觸角聚糖的EPO，該聚糖具有末端的半乳糖部分。
圖146描述對制備具有末端半乳糖部分的雙觸角聚糖的糖重構(gòu)過程的每一產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。
圖147描述在ST3Gal3唾液酸化或用SA-PEG(1kDa)和SA-PEG(10kDa)進行PEG化后，對EPO的SDS-PAGE分析。
圖148描述在GnT-I/GnT-II反應(yīng)后從EPO釋放的聚糖的HPLC分析。聚糖的結(jié)構(gòu)通過與標(biāo)準(zhǔn)聚糖進行峰滯留的比較來確定。聚糖的結(jié)構(gòu)描繪在峰的旁邊。菱形表示巖藻糖，及正方形表示GlcNAc，圓圈表示甘露糖。
圖149描述在GnT-V反應(yīng)后從EPO釋放的聚糖的HPLC分析。聚糖的結(jié)構(gòu)通過與標(biāo)準(zhǔn)聚糖進行峰滯留的比較來確定。聚糖的結(jié)構(gòu)描繪在峰的旁邊。菱形表示巖藻糖，及正方形表示GlcNAc，圓圈表示甘露糖。
圖150描述在GalT-1反應(yīng)后從EPO釋放的聚糖的HPLC分析。聚糖的結(jié)構(gòu)通過與標(biāo)準(zhǔn)聚糖進行峰滯留的比較來確定。聚糖的結(jié)構(gòu)描繪在峰的旁邊。菱形表示巖藻糖，及正方形表示GlcNAc，圓圈表示甘露糖，空心圓圈表示半乳糖，且三角形表示唾液酸。
圖151描述在ST3Gal3反應(yīng)后從EPO釋放的聚糖的HPLC分析。聚糖的結(jié)構(gòu)通過與標(biāo)準(zhǔn)聚糖進行峰滯留的比較來確定。聚糖的結(jié)構(gòu)描繪在峰的旁邊。菱形表示巖藻糖，及正方形表示GlcNAc，圓圈表示甘露糖，空心圓圈表示半乳糖，且三角形表示唾液酸。
圖152描述在ST6Gal1反應(yīng)后從EPO釋放的聚糖的HPLC分析。聚糖的結(jié)構(gòu)通過與標(biāo)準(zhǔn)聚糖進行峰滯留的比較來確定。聚糖的結(jié)構(gòu)描繪在峰的旁邊。
圖153描述對具有雙觸角和三觸角聚糖的EPO的TF-1細(xì)胞體外生物測定的結(jié)果。“Di-SA”指末端為唾液酸的具有雙觸角聚糖的EPO。“Di-SA 10K PEG”指末端為用PEG(10kDa)衍生化的唾液酸的具有雙觸角聚糖的EPO。“Di-SA 1K PEG”指末端為用PEG(1kDa)衍生化的唾液酸的具有雙觸角聚糖的EPO?！癟ri-SA ST6+ST3”指末端為用2，3-SA加帽的2，6-SA的具有三觸角聚糖的EPO?！癟ri-SA ST3”指末端為2，3-SA的具有三觸角聚糖的EPO。
圖154是描述脫唾液酸化程序的產(chǎn)物的pI的IEF凝膠圖象。泳道1和5是IEF標(biāo)準(zhǔn)物。泳道2是凝血因子IX蛋白質(zhì)。泳道3是rfactorIX蛋白質(zhì)。泳道4是rFactor IX蛋白質(zhì)在20小時的脫唾液酸反應(yīng)。
圖155是描述在與CMP-SA-PEG反應(yīng)后與SA-PEG(1kDa)或SA-PEG(10kDa)綴合的凝血因子IX的分子量的SDS-PAGE凝膠圖象。泳道1和6是SeeBlue+2分子量標(biāo)準(zhǔn)。泳道2是rF-IX。泳道3是脫唾液酸化的rF-IX。泳道4是與SA-PEG(1kDa)綴合的rFactor IX。泳道5是與SA-PEG(10kDa)綴合的rFactor IX。
圖156是描述凝血因子IX的直接唾液酸化和凝血因子IX-SA-PEG的唾液酸加帽反應(yīng)產(chǎn)物的SDS-PAGE凝膠圖象。泳道1是蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物，泳道2是空白；泳道3是rFactor-IX；泳道4是SA加帽的rFactor-IX-SA-PEG(10kDa)；泳道5是rFactor-IX-SA-PEG(10kDa)；泳道6是ST3Gal1；泳道7是ST3Gal3；泳道8、9、10是未進行唾液酸酶預(yù)先處理的rFactor-IX-SA-PEG(10kDa)。
圖157是脫唾液酸(asialo)-凝血因子VIIa的等電聚焦凝膠(pH3-7)的圖象。泳道1是rFactor VIIa；泳道2-5是脫唾液酸-凝血因子VIIa。
圖158是凝血因子VIIa的MALDI譜的曲線圖。
圖159是凝血因子VIIa-PEG(1kDa)的MALDI譜的曲線圖。
圖160是描述凝血因子VIIa-PEG(10kDa)的MALDI譜的曲線圖。
圖161是PEG化的凝血因子VIIa的SDS-PAGE凝膠圖象。泳道1是脫唾液酸-凝血因子VIIa。泳道2是脫唾液酸-凝血因子VIIa和CMP-SA-PEG(1kDa)與ST3Gal3在反應(yīng)48小時后的產(chǎn)物。泳道3是脫唾液酸-凝血因子VIIa和CMP-SA-PEG(1kDa)與ST3Gal3在反應(yīng)48小時后的產(chǎn)物。泳道4是脫唾液酸-凝血因子VIIa和CMP-SA-PEG(10kDa)與ST3Gal3在反應(yīng)96小時后的產(chǎn)物。
圖162是描述人垂體FSH脫唾液酸化反應(yīng)產(chǎn)物的等電聚焦(IEF)凝膠的圖象。泳道1和4是等電聚焦(IEF)的標(biāo)準(zhǔn)物。泳道2是天然的FSH。泳道3是脫唾液酸化的FSH。
圖163是制備PEG-唾液酸化的rFSH的反應(yīng)的產(chǎn)物的SDS-PAGE凝膠圖象。泳道1和8是SeeBlue+2分子量標(biāo)準(zhǔn)物。泳道2是15μg天然的FSH。泳道3是15μg脫唾液酸-FSH(AS-FSH)。泳道4是15μgAS-FSH與CMP-SA反應(yīng)的產(chǎn)物。泳道5是15μgAS-FSH與CMP-SA-PEG(1kDa)反應(yīng)的產(chǎn)物。泳道6是15μg AS-FSH與CMP-SA-PEG(5kDa)反應(yīng)的產(chǎn)物。泳道7是15μg AS-FSH與CMP-SA-PEG(10kDa)反應(yīng)的產(chǎn)物。
圖164是制備PEG-唾液酸化的FSH的反應(yīng)的產(chǎn)物的等電聚焦凝膠圖象。泳道1和8是IEF標(biāo)準(zhǔn)物。泳道2是15μg天然的FSH。泳道3是15μg脫唾液酸-FSH(AS-FSH)。泳道4是15μg AS-FSH與CMP-SA反應(yīng)的產(chǎn)物。泳道5是15μg AS-FSH與CMP-SA-PEG(1kDa)反應(yīng)的產(chǎn)物。泳道6是15μg AS-FSH與CMP-SA-PEG(5kDa)反應(yīng)的產(chǎn)物。泳道7是15μg AS-FSH與CMP-SA-PEG(10kDa)反應(yīng)的產(chǎn)物。
圖165是在人垂體細(xì)胞中產(chǎn)生的天然非重組FSH的SDS-PAGE凝膠圖象。泳道1、2和5是SeeBlueTM+2分子量標(biāo)準(zhǔn)物。泳道3和4分別為5μg和25μg的天然FSH。
圖166是描述rFSH的脫唾液酸化反應(yīng)的產(chǎn)物的等電聚焦凝膠(pH3-7)圖象。泳道1和4是IEF標(biāo)準(zhǔn)物。泳道2是天然的rFSH。泳道3是脫唾液酸-rFSH。
圖167是描述脫唾液酸-rFSH的PEG-唾液酸化的結(jié)果的SDS-PAGE凝膠圖象。泳道1是天然的rFSH。泳道2是脫唾液酸-FSH。泳道3是脫唾液酸-FSH與CMP-SA反應(yīng)的產(chǎn)物。泳道4-7是脫唾液酸-FSH與0.5mM CMP-SA-PEG(10kDa)分別在2小時、5小時、24小時和48小時反應(yīng)的產(chǎn)物。泳道8是脫唾液酸-FSH與1.0mM CMP-SA-PEG(10kDa)在48小時反應(yīng)的產(chǎn)物。泳道9是脫唾液酸-FSH與1.0mM CMP-SA-PEG(1kDa)在48小時反應(yīng)的產(chǎn)物。
圖168是表示脫唾液酸-rFSH用CMP-SA-PEG(1kDa)進行PEG-唾液酸化的產(chǎn)物的等電聚焦凝膠圖象。泳道1是天然的rFSH。泳道2是脫唾液酸-rFSH。泳道3是脫唾液酸-rFSH與CMP-SA在24小時反應(yīng)的產(chǎn)物。泳道4-7是脫唾液酸-rFSH與0.5mM CMP-SA-PEG(1kDa)分別在2小時、5小時、24小時和48小時反應(yīng)的產(chǎn)物。泳道8是空白。泳道9和10是脫唾液酸-rFSH分別與0.5mM和1.0mM CMP-SA-PEG(10kDa)在48小時反應(yīng)的產(chǎn)物。
圖169是rFSH和rFSH-SA-PEG(1KDa和10KDa)的藥物代謝動力學(xué)的曲線圖。該曲線圖闡明了糖PEG化的rFSH與非PEG化的rFSH相比，rFSH化合物在大鼠血流中的時間和rFSH化合物在血液中的平均濃度之間的關(guān)系。
圖170是利用支持細(xì)胞的FSH生物測定結(jié)果的曲線圖。該曲線圖闡明了支持細(xì)胞溫育培養(yǎng)基中FSH的濃度和從支持細(xì)胞釋放的17-β雌二醇量之間的關(guān)系。
圖171是描述對糖PEG化和非糖PEG化FSH的Steelman-Pohley生物測定結(jié)果的曲線圖。用人絨毛膜促性腺激素和各種量的FSH在3日內(nèi)對大鼠進行皮下注射，在第4日確定處理組的平均卵巢重量。rFSH-SA-PEG指已用PEG(1kDa)進行糖PEG化的重組FSH。rFSH指非糖PEG化的FSH。每一個處理組含有10只大鼠。
圖172包含
圖172A和172B，描述從Superdex-75柱的INF-β洗脫的層析譜。
圖172A描述整個層析譜。
圖172B更詳細(xì)地描述
圖172A中含有峰4和5的框形區(qū)域。
圖173包含
圖173A和173B，描述從INF-β酶促釋放的聚糖的MALDI分析。
圖173A描述對從天然INF-β釋放的聚糖的MALDI分析。
圖173B描述對從脫唾液酸化的INF-β釋放的聚糖的MALDI分析。聚糖的結(jié)構(gòu)通過與標(biāo)準(zhǔn)聚糖進行峰譜的比較來確定。聚糖的結(jié)構(gòu)描繪在峰的旁邊。正方形表示GlcNAc，三角形表示巖藻糖，圓圈表示甘露糖，菱形表示半乳糖和星形表示唾液酸。
圖174描述對脫唾液酸化的INF-β進行唾液酸化的凝集素印跡分析。右側(cè)的印跡用進行了洋地黃毒苷(digoxogenin)(DIG)(RocheApplied Science，Indianapolis，IL)標(biāo)記的懷槐(Maackia amurensis)凝集素(MAA)進行探測，以探測α2，3-唾液酸化。左側(cè)的印跡用進行了生物素(Vector Laboratories，Burlingame，CA)標(biāo)記的Erthrinacristagalli凝集素(ECL)進行探測，以探測暴露的半乳糖殘基。
圖175描述INF-β的PEG(10kDa)PEG化反應(yīng)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。“-PEG”指在PEG化反應(yīng)之前的INF-β?！?PEG”指在PEG化反應(yīng)之后的INF-β。
圖176描述INF-β的PEG(20kDa)PEG化反應(yīng)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。“未修飾的”指在PEG化反應(yīng)之前的INF-β?！癙EG化的”指在PEG化反應(yīng)之后的INF-β。
圖177描述從Superdex-200柱的PEG(10kDa)PEG化的INF-β洗脫的層析譜。
圖178描述示于圖INF-PEG6層析譜中的PEG(10kDa)PEG化的INF-β峰級分生物測定的結(jié)果。
圖179描述從Superdex-200柱的PEG(20kDa)PEG化的INF-β洗脫的層析譜。
圖180包含
圖180A和180B，是描述RNaseB的MALDI-TOF譜(
圖180A)和由N-聚糖酶從RNaseB中切割的寡糖的HPLC特征(
圖180B)的兩個曲線圖。該肽的大多數(shù)N-糖基化位點是用由5～9個甘露糖殘基組成的高甘露糖寡糖修飾的。
圖181是描述高甘露糖N-聚糖向雜合N-聚糖轉(zhuǎn)變的示意圖。酶1是來自里氏木霉(Trichodoma reesei)或Aspergillus saitoi的α1，2-甘露糖苷酶。酶2是GnT-I(β-1，2-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶I)。酶3是GalT-I(β-1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1)。酶4是α2，3-唾酸轉(zhuǎn)移酶或α2，6-唾酸轉(zhuǎn)移酶。
圖182包含
圖182A和182B，是描述用重組里氏木霉α1，2-甘露糖苷酶處理的RNaseB的MALDI-TOF譜(
圖182A)和由N-聚糖酶從修飾的RNaseB中切割的寡糖的HPLC特征(
圖182B)的兩個曲線圖。
圖183是描述用從A.saitoi純化的商業(yè)上可購得的α1，2-甘露糖苷酶(Glyko & CalBioChem)處理的RNaseB的MALDI-TOF譜的曲線圖。
圖184是描述通過用重組GnT-I(GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I)處理
圖182所示的產(chǎn)物得到的修飾的RNaseB的MALDI-TOF譜的曲線圖。
圖185是描述通過用重組GalT-1(半乳糖基轉(zhuǎn)移酶1)處理
圖184所示的產(chǎn)物得到的修飾的RNaseB的MALDI-TOF譜的曲線圖。
圖186是描述通過CMP-SA作為轉(zhuǎn)移酶供體用重組ST3Gal III(α2，3-唾酸轉(zhuǎn)移酶III)處理
圖185所示的產(chǎn)物得到的修飾的RNaseB的MALDI-TOF譜的曲線圖。
圖187是描述通過以CMP-SA-PEG(10kDa)作為轉(zhuǎn)移酶供體用重組ST3Gal III(α2，3-唾酸轉(zhuǎn)移酶III)處理
圖185所示的產(chǎn)物得到的修飾的RNaseB的MALDI-TOF譜的曲線圖。
圖188是高甘露糖N-聚糖向復(fù)合的N-聚糖轉(zhuǎn)變的一系列方案。酶1是來自里氏木霉或Aspergillus saitoi的α1，2-甘露糖苷酶。酶2是GnT-I。酶3是GalT1。酶4是α2，3-唾酸轉(zhuǎn)移酶或α2，6-唾酸轉(zhuǎn)移酶。酶5是α甘露糖苷酶II。酶6是α甘露糖苷酶。酶7是GnT-II。酶8是α1，6-甘露糖苷酶。酶9是α1，3-甘露糖苷酶。
圖189是由N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶I～VI(GnT-I～VI)催化的連接的圖解。R＝GlcNAcβ1，4GlcNAc-Asn-X。
圖190是SDS-PAGE凝膠的圖象標(biāo)準(zhǔn)物(泳道1)；天然運鐵蛋白(泳道2)；脫唾液酸運鐵蛋白(泳道3)；脫唾液酸運鐵蛋白和CMP-SA(泳道4)；泳道5和6，脫唾液酸運鐵蛋白和分別為0.5mM和5mM的CMP-SA-PEG(1kDa)；泳道7和8，脫唾液酸運鐵蛋白和分別為0.5mM和5mM的CMP-SA-PEG(5kDa)；泳道9和10，脫唾液酸運鐵蛋白和分別為0.5mM和5mM的CMP-SA-PEG(10kDa)。
圖191是IEF凝膠的圖象天然運鐵蛋白(泳道1)；脫唾液酸運鐵蛋白(泳道2)；脫唾液酸運鐵蛋白和CMP-SA，24小時(泳道3)；脫唾液酸運鐵蛋白和CMP-SA，96小時(泳道4)；泳道5和6，分別在24和96小時的脫唾液酸運鐵蛋白和CMP-SA-PEG(1kDa)；泳道7和8，分別在24和96小時的脫唾液酸運鐵蛋白和CMP-SA-PEG(5kDa)；泳道9和10，分別在24和96小時的脫唾液酸運鐵蛋白和CMP-SA-PEG(10kDa)。
發(fā)明詳述本發(fā)明包括以這樣的方式向肽分子中添加和/或從肽分子中去除糖的無細(xì)胞體外方法和組合物，從而提供具有特定定制的或想要的糖基化模式的糖肽分子，其中該糖肽是以工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)的。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，這樣制備的糖肽在其上附著了修飾的糖，該修飾的糖是通過酶促反應(yīng)添加到肽上的。本發(fā)明的一個關(guān)鍵的特性是獲取由任何細(xì)胞類型產(chǎn)生的肽并在該肽上生成核心聚糖結(jié)構(gòu)，隨后將聚糖結(jié)構(gòu)在體外進行重構(gòu)以生成具有適合于在哺乳動物中的治療應(yīng)用的糖基化模式的糖肽。更特定地，根據(jù)本發(fā)明可能的是制備具有修飾的糖分子或在其上綴合的其他化合物的糖肽分子，從而綴合的分子賦予該肽有益的特征。根據(jù)本發(fā)明，因為綴合物分子向肽的基于酶的添加具有區(qū)域選擇性和立體選擇性的優(yōu)點，所以將綴合物分子酶促地添加到肽中。糖綴合物可在糖基化完成之前或之后添加到肽上的聚糖上。換句話說，糖綴合和糖基化的順序可以如本文別處所述的那樣有變化。因此可能的是利用在此處提供的方法和組合物對肽進行重構(gòu)以賦予該肽想要的聚糖，該聚糖優(yōu)選地為在其上附著有修飾糖的。同樣可能的是利用本發(fā)明的方法和組合物在工業(yè)規(guī)模上生成具有想要的和或修飾的聚糖結(jié)構(gòu)的肽分子，因此，第一次向本領(lǐng)域提供了有效生成改善的治療性肽的實踐解決方案。
定義除非另外有定義，在此處所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語一般具有與本發(fā)明所屬的領(lǐng)域中技術(shù)人員普遍理解的相同的意義。通常，在此處所用的名稱和細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、有機化學(xué)和核酸化學(xué)和雜交中的實驗室程序是那些本領(lǐng)域中眾所周知的和普遍采用的。標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)應(yīng)用于核酸和肽合成。該技術(shù)和程序通常是根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法和各種普通的參考文獻進行的(如Sambrook等人，1989，MolecularCloningA Laboratory Manual，2d ed.Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)，該方法和參考文獻是提供于本文件全文中的。在此處所用的名稱和用于下述的分析化學(xué)和有機合成的實驗室程序是那些本領(lǐng)域中眾所周知的和普遍采用的。將標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)或其經(jīng)修飾的方法用于化學(xué)合成和化學(xué)分析。
冠詞“a”和“an”在此處用于指一種或超過一種(即至少一種)該冠詞的語法對象。作為例子，“an element”指一個元件或超過一個元件。
如在此處所用的，術(shù)語“抗體”指能夠特異性地與抗原上特定的抗原決定部位結(jié)合的免疫球蛋白分子?？贵w可為源自天然來源或重組來源的完整免疫球蛋白，且也可為完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性部分。抗體一般是免疫球蛋白分子的四聚體。本發(fā)明中的抗體可以各種形式存在，包括如多克隆抗體、單克隆抗體、Fv、Fab和F(ab)2以及單鏈抗體和人源化的抗體(Harlow等人，1999，Using AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press NY；Harlow等人，1989，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York；Houston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；Bird等人，1988，Science 242423-426)。
如在此處所用的，術(shù)語“合成抗體”指用重組DNA技術(shù)生成的抗體，例如由在此處所述的噬菌體表達的抗體。該術(shù)語也可解釋為指通過合成編碼抗體的DNA分子(該DNA分子表達抗體蛋白質(zhì))或編碼該抗體的氨基酸序列而生成的抗體，其中該DNA或氨基酸序列已用本領(lǐng)域可用的且眾所周知的合成DNA或氨基酸序列的技術(shù)獲得。
如在此處所用的，術(shù)語“有功能的”生物學(xué)分子是一定形式的生物學(xué)分子，其中在該形式下該分子展示了對其進行表征所依據(jù)的特征。例如，有功能的酶是展示對該酶進行表征所依據(jù)的特征性催化活性的酶。
如在此處所用的，結(jié)構(gòu) 是肽鏈中氨基酸或氨基酸側(cè)鏈和聚糖結(jié)構(gòu)連接的點。
“N-連接的”寡糖是那些通過天冬酰胺以天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺連接的方式與肽主鏈連接的寡糖。N-連接的寡糖也稱為“N-聚糖”。所有N-連接的寡糖都具有共同的五糖核心Man3GlcNAc2。它們差別在外周糖分支(也稱為觸角)的存在與否和數(shù)目中，如N-乙酰葡糖胺、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、巖藻糖和唾液酸?？蛇x擇地，該結(jié)構(gòu)也可含有核心的巖藻糖分子和/或木糖分子。
“基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)”指只包含三甘露糖核心結(jié)構(gòu)的聚糖部分，而在其上無額外的糖附著。當(dāng)術(shù)語“基本的”不包括于“三甘露糖核心結(jié)構(gòu)”的描述中時，那么該聚糖包含在其上附著有額外的糖的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)?？蛇x擇地，該結(jié)構(gòu)也可含有核心的巖藻糖分子和/或木糖分子。
術(shù)語“基本的三甘露糖核心糖肽”在此處用于指具有主要包含基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)的聚糖結(jié)構(gòu)的糖肽?？蛇x擇地，該結(jié)構(gòu)也可含有核心的巖藻糖分子和/或木糖分子。
“O-連接的”寡糖是那些通過蘇氨酸、絲氨酸、羥脯氨酸、酪氨酸或其他含有羥基的氨基酸連接到肽主鏈上的寡糖。
所有在此處描述的寡糖都是以非還原糖的名稱或縮寫(即Gal)來表示的，其后為糖苷鍵的構(gòu)型(α或β)，環(huán)鍵(1或2)，鍵中涉及的還原糖的環(huán)位置(2、3、4、6或8)然后為還原糖的名稱或縮寫(即GlcNAc)。每一個糖都優(yōu)選地為吡喃糖。對于標(biāo)準(zhǔn)糖生物學(xué)命名法綜述，參見Essentials of Glycobiology Varki等人eds.，1999，CSHL Press。
術(shù)語“唾液酸”指九碳的羧化的糖家族的任何成員。唾液酸家族中最普通的成員是N-乙酰神經(jīng)氨酸(2-酮-5-乙酰氨基-3，5-雙脫氧-D-甘油-D-galactononulopyranos-1-onic acid(?？s寫為Neu5Ac、NeuAc或NANA))。該家族的第二個成員是N-乙醇酰-神經(jīng)氨酸(Neu5Gc或NeuGc)，其中NeuAc的N-乙酰基是羥基化的。第三個唾液酸家族成員是2-酮-3-脫氧-nonulosonic acid(KDN)(Nadano等人，(1986)J.Biol.Chem.26111550-11557；Kanamori等人，J.Biol.Chem.26521811-21819(1990))。同樣包括的是9-取代的唾液酸如9-O-C1-C6?；?Neu5Ac，如9-O-乳酰基-Neu5Ac或9-O-乙?；?Neu5Ac、9-脫氧-9-氟-Neu5Ac和9-疊氮-9-脫氧-Neu5Ac。對于唾液酸家族的綜述，參見Varki，Glycobiology 225-40(1992)；Sialic AcidsChemistry，Metabolism and Function，R.Schauer，Ed.(Springer-Verlag，NewYork(1992))。唾液酸化合物在唾液酸化過程中的合成和應(yīng)用公開于1992年10月1日發(fā)表的國際申請WO 92/16640中。
如在此處所用的，具有“想要的糖基化”的肽是包含該肽有效的生物學(xué)活性所必需的一種或多種寡糖分子的肽。
“疾病”是動物的一種健康狀況，其中動物不能維持體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，且其中如果疾病不得到改善，那么動物的健康將繼續(xù)惡化。
如在此處向患者給予肽藥物中所用的，“曲線下的面積”或“AUC”定義為曲線下的總面積，該曲線描述作為從0到無窮大的時間的函數(shù)的患者全身循環(huán)中藥物的濃度。
如在此處向患者給予肽藥物中所用的，術(shù)語“半衰期”或“t1/2”定義為患者中藥物的血漿濃度減少一半所需的時間。依賴于多種清除機制、重新分配和其他本領(lǐng)域中眾所周知的機制，可以有超過一個與肽藥物相關(guān)的半衰期。通常，定義了α半衰期和β半衰期，從而α期與重新分配相關(guān)，而β期與清除相關(guān)。然而，對于絕大部分限制于血流中的蛋白質(zhì)藥物有至少2個清除半衰期。對于一些糖基化的肽，快速的β期清除可以通過識別末端半乳糖、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰葡糖胺、甘露糖或巖藻糖的內(nèi)皮細(xì)胞或巨噬細(xì)胞上的受體介導(dǎo)。慢速的β期清除可以通過對有效半徑＜2nm的分子(約68kD)的腎小球過濾和/或在組織中特異性或非特異性的攝取和代謝介導(dǎo)。糖PEG化可對末端糖(如半乳糖或N-乙酰半乳糖胺)進行加帽，從而阻斷通過識別這些糖的受體的快速α期清除。它也可賦予較大的有效半徑，從而降低了分配體積和組織攝取，從而延長了晚β期。因而，糖PEG化對α期和β期半衰期的精確影響將依賴于大小、糖基化狀態(tài)和其他參數(shù)而變化，如在本領(lǐng)域中眾所周知的。對“半衰期”的進一步解釋可發(fā)現(xiàn)于Pharmaceutical Biotechnology(1997，DFA Crommelin and RDSindelar，eds.，Harwood Publisher，Amsterdam，pp 101-120)。
如在此處向患者給予肽藥物中所用的，術(shù)語“保留時間”定義為在服藥后藥物在患者體內(nèi)存留的平均時間。
“分離的核酸”指已從在天然存在的狀態(tài)時在兩側(cè)與其相接的序列中分離的核酸區(qū)段或片段，如已從正常時在側(cè)面與該片段相接的序列中取出的DNA片段，該序列如在天然存在的基因組中與該片段在側(cè)面相接的序列。該術(shù)語也應(yīng)用于已基本從天然地與核酸伴隨的其他成分中純化的核酸，如在細(xì)胞中天然與核酸伴隨的RNA或DNA或蛋白質(zhì)。因此該術(shù)語也包括如整合入載體中的、或整合入自主復(fù)制質(zhì)?；虿《局械摹⒒蛘先朐松锘蛘婧松锘蚪MDNA中的、或作為不依賴于其他序列的單獨分子(如由PCR或限制性酶消化產(chǎn)生的cDNA或基因組或cDNA片段)存在的重組DNA。它也包括作為編碼額外的肽序列的雜交核酸的一部分的重組DNA。
“多核苷酸”指單鏈或平行和反平行鏈的核酸。因而，多核苷酸可為單鏈的或雙鏈的核酸。
術(shù)語“核酸”一般指大的多核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸”一般指短的多核苷酸，通常不超過約50個核苷酸。
在此處將常規(guī)符號用于描述多核苷酸序列單鏈多核苷酸序列的左手末端是5’-末端；雙鏈多核苷酸序列的左手方向稱為5’-方向。從5’到3’向新生RNA轉(zhuǎn)錄物添加核苷酸的方向稱為轉(zhuǎn)錄方向。與mRNA具有相同序列的DNA鏈稱為“編碼鏈”；DNA鏈上位于DNA上參考位點5’的序列稱為“上游序列”；DNA鏈上位于DNA上參考位點3’的序列稱為“下游序列”。
“編碼”指多核苷酸(如基因、cDNA或mRNA)中特定核苷酸序列充當(dāng)模板用于在生物學(xué)過程中合成其他聚合物和大分子的固有特征，該聚合物和大分子具有限定的核苷酸序列(即rRNA、tRNA和mRNA)或限定的氨基酸序列和從中產(chǎn)生的生物學(xué)特征。因而，如果相應(yīng)于核酸的mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯在細(xì)胞或其他生物學(xué)系統(tǒng)中產(chǎn)生了蛋白質(zhì)，則該核酸序列編碼該蛋白質(zhì)。編碼鏈和非編碼鏈均可以稱為編碼該核酸或cDNA的蛋白質(zhì)或其他產(chǎn)物，其中編碼鏈的核苷酸序列與mRNA的序列相同且通常在序列表中提供，而非編碼鏈用作模板以轉(zhuǎn)錄基因或cDNA。
除非另外有定義，“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有編碼相同氨基酸序列的相互為簡并形式的核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和RNA的核苷酸序列可包括內(nèi)含子。
如在此處所用的，“同源”指兩個聚合物分子之間的亞基序列相似性，如兩個核酸分子之間，如兩個DNA分子或兩個RNA分子之間，或兩個肽分子之間的。當(dāng)兩個分子中的亞基位置由相同的單體亞基占據(jù)時，例如，如果兩個DNA分子中的某一位置都由腺嘌呤占據(jù)時，則它們在該位置是同源的。兩個序列之間的同源性是匹配數(shù)或同源位置數(shù)的正函數(shù)，例如，如果兩個化合物序列中一半的位置(如長度為10個亞基的聚合物中的5個位置)是同源的，那么兩個序列是50％同源的，如果90％的位置如10個中的9個是匹配或同源的，則兩個序列具有90％的同源性。例如，DNA序列3’ATTGCC5’和3’TATGGC具有50％的同源性。
如在此處所用的，“同源性”是與“一致性”同義使用的。
對兩個核苷酸或氨基酸序列之間百分比一致性的確定可用數(shù)學(xué)算法來實現(xiàn)。例如，用于比較兩個序列的數(shù)學(xué)算法是Karlin和Altschul(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268)的算法，進一步被Karlin和Altschul修改(1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA905873-5877)。該算法整合入Altschul等人(1990，J.Mol.Biol.215403-410)的NBLAST和XBLAST程序中，且可從如國家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI)的全球互聯(lián)網(wǎng)站點上獲取，該站點具有通用資源位置http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。BLAST核苷酸搜索可用NBLAST程序(在NCBI互聯(lián)網(wǎng)站點上命名為“blastn”)進行，應(yīng)用如下參數(shù)缺口罰分＝5；缺口延伸罰分＝2；錯配罰分＝3；匹配獎分＝1；預(yù)期值10.0；和字串大?。?1，以獲得與在此處描述的核酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白質(zhì)搜索可用XBLAST程序(在NCBI互聯(lián)網(wǎng)站點上命名為“blastn”)或NCBI的“blastp”程序進行，應(yīng)用如下參數(shù)預(yù)期值10.0；BLOSUM62記分矩陣，以獲得與在此處描述的蛋白質(zhì)分子同源的氨基酸序列。為了獲得用于比較目的的有缺口的比對，可應(yīng)用如在Altschul等人(1997，Nucleic Acids Res.253389-3402)中描述的Gapped BLAST?？蛇x擇地，可將PSI-Blast或PHI-Blast用于進行重復(fù)的搜索，該重復(fù)搜索探測分子間較遠(yuǎn)的關(guān)系(Id.)和具有共同模式的分子間的關(guān)系。當(dāng)應(yīng)用BLAST、Gapped BLAST、PSI-Blast和PHI-Blast程序時，可應(yīng)用各個程序(如XBLAST和NBLAST)的默認(rèn)參數(shù)。參見http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
兩個序列間的百分比一致性可用與上述那些相似的允許或不允許缺口的技術(shù)確定。在計算百分比一致性時，計算典型的精確匹配。
編碼肽的“異源核酸表達單位”定義為具有可操作地與一種或多種表達控制序列如啟動子和/或抑制物序列連接的目標(biāo)肽編碼序列的核酸，且其中至少一個序列是異源的，即通常不發(fā)現(xiàn)于宿主細(xì)胞中。
兩個多核苷酸“可操作地連接”指兩個多核苷酸在核酸部分中以這樣的方式排列，從而兩個多核苷酸的至少一個能夠?qū)α硪粋€發(fā)揮其特征性的生理學(xué)作用。例如，可操作地連接到核酸編碼區(qū)的啟動子能夠啟動編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄。
如在此處所用的，術(shù)語“啟動子/調(diào)節(jié)序列”指可操作地與該啟動子/調(diào)節(jié)序列連接的基因產(chǎn)物的表達所必需的核酸序列。在一些例子中，該序列可為核心啟動子序列，而在其他例子中，該序列也可包括基因產(chǎn)物表達所必需的增強子序列和其他調(diào)節(jié)元件。例如，啟動子/調(diào)節(jié)序列可為以組織特異性方式表達基因產(chǎn)物的序列。
“組成型”啟動子是在細(xì)胞中以不變的方式啟動與其可操作地連接的基因的表達的啟動子。例如，啟動細(xì)胞的管家基因的表達的啟動子可認(rèn)為是組成型啟動子。
“誘導(dǎo)型”啟動子是一種核苷酸序列，當(dāng)該核苷酸序列與編碼或限定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地連接時，基本上僅當(dāng)相應(yīng)于該啟動子的誘導(dǎo)物存在于細(xì)胞中時可導(dǎo)致基因產(chǎn)物在活細(xì)胞中產(chǎn)生。
“組織特異性”啟動子是核苷酸序列，當(dāng)該核苷酸序列與編碼或限定基因產(chǎn)物的多核苷酸可操作地連接時，基本上僅當(dāng)該細(xì)胞是相應(yīng)于該啟動子的組織類型的細(xì)胞時可導(dǎo)致基因產(chǎn)物在活細(xì)胞中產(chǎn)生。
“載體”是包含分離的核酸且可用于將分離的核酸送遞入細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)組成。本領(lǐng)域中已知有許多載體，包括但不局限于線性多核苷酸、與離子型或兩性分子的化合物相關(guān)的多核苷酸、質(zhì)粒和病毒。因而，術(shù)語“載體”包括自主復(fù)制的質(zhì)粒或病毒。該術(shù)語也可解釋為包括能夠促進核酸向細(xì)胞轉(zhuǎn)移的非質(zhì)粒和非病毒化合物，如多賴氨酸化合物、脂質(zhì)體等。病毒載體的例子包括但不局限于腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體等。
“表達載體”指包含重組多核苷酸的載體，該重組多核苷酸包含可操作地與要表達的核苷酸序列連接的表達控制序列。表達載體包含足夠的用于表達的順式作用元件；其他用于表達的元件可由宿主細(xì)胞或在體外表達系統(tǒng)中提供。表達載體包括所有那些本領(lǐng)域中公知的，如整合了重組多核苷酸的粘粒、質(zhì)粒(如裸露的或包含于脂質(zhì)體中的)和病毒。
“基因工程加工的”或“重組的”細(xì)胞是對細(xì)胞的遺傳材料進行了一種或多種修飾的細(xì)胞。這種修飾可包括但不局限于插入遺傳材料、刪除遺傳材料和插入不管能否穩(wěn)定保持的染色體外的遺傳材料。
“肽”是寡肽、多肽、肽、蛋白質(zhì)或糖蛋白。當(dāng)糖分子在其上附著時，此處術(shù)語“肽”的應(yīng)用包括具有在其上附著的糖分子的肽。
如在此處所用的，“天然形式”指由細(xì)胞和/或生物產(chǎn)生的肽的形式，其中在天然狀態(tài)下所述肽是發(fā)現(xiàn)于所述細(xì)胞或生物中的。當(dāng)該肽由多個細(xì)胞和/或生物產(chǎn)生時，該肽可具有各種天然形式。
“肽”指其中單體為氨基酸且通過酰胺鍵連接在一起的聚合物，該酰胺鍵可選擇地稱為肽鍵?？蛇x擇地，也包括非天然的氨基酸如β-丙氨酸、苯甘氨酸和高精氨酸。非核酸編碼的氨基酸也可用于本發(fā)明中。此外，在本發(fā)明中也可應(yīng)用已進行修飾而包括反應(yīng)基團、糖基化位點、聚合物、治療部分、生物分子等的氨基酸。在本發(fā)明中所用的所有氨基酸可為其D-或L-異構(gòu)體。L-異構(gòu)體通常是優(yōu)選的。此外，在本發(fā)明中也可應(yīng)用其他肽模擬物。如在此處所用的，“肽”指糖基化的和非糖基化的肽。同樣包括的是由表達該肽的系統(tǒng)不完全糖基化的肽。對于一般的綜述，參見Spatola，A F.，Chemistry and Biochemistryof Amino Acids，Peptides and Proteins，B.Weinstein，eds.，MarcelDekker，New York，p.267(1983)。
術(shù)語“肽綴合物”指本發(fā)明的種類(species)，其中肽與在此處提出的修飾的糖綴合。
術(shù)語“氨基酸”指天然存在的和合成的氨基酸，以及以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮功能的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸是那些由遺傳密碼編碼的，以及那些后來進行修飾的氨基酸，如羥脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸絲氨酸。氨基酸類似物指與天然氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，即與氫連接的α碳、羧基、氨基和R基團，如高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸甲基锍。這種類似物具有修飾的R基團(如正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保持了與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。氨基酸模擬物指具有與氨基酸的普遍化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)的化學(xué)化合物，但該化合物以與天然存在的氨基酸相似的方式發(fā)揮功能。
如在此處所用的，氨基酸以其完整名稱、相應(yīng)的三字母編碼或相應(yīng)的單字母編碼表示，如在下面表1中所示的表1.氨基酸及三字母和單字母編碼
本發(fā)明也提供了包含上述蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)或肽的類似物。類似物與天然存在的蛋白質(zhì)或肽差別在于保守的氨基酸序列的差異或不影響序列的修飾，或者為兩者。例如，可進行保守的氨基酸改變，該改變盡管改變了蛋白質(zhì)或肽的一級序列，但通常不改變其功能。保守的氨基酸替代一般包括下面組內(nèi)的替代甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；苯丙氨酸、酪氨酸。
修飾(通常不改變一級序列)包括肽的體內(nèi)或體外化學(xué)衍生化，如乙?；螋然?。同樣包括的是糖基化修飾，如通過在其合成和加工或在進一步的加工步驟中對肽的糖基化模式進行修飾而進行的；如通過將肽暴露于影響糖基化的酶如哺乳動物糖基化或脫糖基化酶而進行的。同樣包含的是具有磷酸化的氨基酸殘基的序列，如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸。
當(dāng)然，應(yīng)該理解的是肽可整合進行了修飾但不影響活性的氨基酸殘基。例如，可對末端進行衍生化以包括封閉基團，即適合于保護和/或穩(wěn)定N-和C-末端不受“不想要的降解”的化學(xué)取代基，該“不想要的降解”是包含在末端進行的可能影響化合物功能的任何類型的對化合物的酶促、化學(xué)或生物化學(xué)破壞，即在化合物的末端依次進行的降解。
封閉基團包括常規(guī)地用于肽化學(xué)領(lǐng)域的保護基團，該基團不對肽的體內(nèi)活性產(chǎn)生不利影響。例如，適當(dāng)?shù)腘-末端封閉基團可通過對N-末端的烷基化或酰基化而引入。適當(dāng)?shù)腘-末端封閉基團的例子包括C1-C5分支或不分支的烷基基團、?；鶊F如甲?；鸵阴；鶊F及其取代的形式，如乙酰氨基甲基(Acm)、Fmoc或Boc基團。氨基酸的脫氨類似物也是有用的N-末端封閉基團，且可與肽的N-末端偶聯(lián)或用于替代N-末端殘基。適當(dāng)?shù)腃-末端封閉基團包括酯、酮和酰胺，其中整合了或未整合C-末端的羧基基團。形成酯或酮的烷基基團，特別是低級烷基基團如甲基、乙基和丙基，和形成酰胺的氨基基團如伯胺(-NH2)，以及單-和雙-烷基氨基基團如甲基氨基、乙基氨基、二甲基氨基、二乙基氨基、甲基乙基氨基等是C-末端封閉基團的例子。脫羧基的氨基酸類似物如精胺也是有用的C-末端封閉基團且可用于與肽的C-末端偶聯(lián)或用于替代該末端。進一步地，應(yīng)該理解的是末端的游離氨基和羧基基團可一起從肽中去除以獲得其脫氨基和脫羧基的形式而不影響肽活性。
也可整合其他的修飾而不不利地影響活性，且這些修飾包括但不局限于D-異構(gòu)型氨基酸對一個或多個天然的L-異構(gòu)型氨基酸的取代。因而，肽可包括一個或多個D-氨基酸殘基，或可包含全部為D-形式的氨基酸。根據(jù)本發(fā)明的肽的反轉(zhuǎn)型(retro-inverso)也可使用，例如反向(inverted)的肽(其中所有的氨基酸均被D-氨基酸形式取代)。
也預(yù)期本發(fā)明的酸加成鹽是功能等價物。因而用無機酸或有機酸處理本發(fā)明的肽以提供肽的水溶性鹽適用于本發(fā)明，其中無機酸如氫氯酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，有機酸如乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、蘋果酸、琥珀酸、馬來酸、延胡索酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、桂皮酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、唾液酸等。
同樣包括的是已用普通的分子生物學(xué)技術(shù)進行修飾的肽，從而改善其對蛋白酶降解的抗性或使溶解性質(zhì)最適化或使其更適合于用作治療劑。這種肽的類似物包括那些含有除天然存在的L-氨基酸之外的殘基的，如D-氨基酸或非天然存在的合成氨基酸。本發(fā)明的肽不局限于在此處所列的任何特定的示例性方法的產(chǎn)物。
如在此處所用的，術(shù)語“MALDI”是基質(zhì)輔助的激光解吸電離的縮寫。在電離中，SA-PEG(唾液酸-聚(乙二醇))可部分地從糖蛋白的N-聚糖結(jié)構(gòu)上去除。
如在此處所用的，術(shù)語“糖基轉(zhuǎn)移酶”指具有將供體糖轉(zhuǎn)移到受體部分上的能力的任何酶/蛋白質(zhì)。
如在此處所用的，術(shù)語“修飾的糖”指在本發(fā)明的方法中酶促添加到氨基酸或肽的糖基殘基上的天然或非天然存在的糖。修飾的糖選自許多酶底物，包括但不局限于糖核苷酸(單-、二-和三-磷酸)、活化的糖(如糖基鹵化物、糖基甲磺酸)和既非活化的也非核苷酸的糖。
“修飾的糖”是用“修飾基團”共價地功能化的。有用的修飾基團包括但不局限于水溶性聚合物、治療部分、診斷部分、生物分子等。用修飾基團進行功能化的位置是這樣選擇的，從而不防止“修飾的糖”酶促地添加到肽上。
術(shù)語“水溶性”指在水中具有一些可探測的溶解性程度的部分。探測和/或定量水溶性的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。示例性的水溶性聚合物包括肽、糖、聚(醚)、多(胺)、聚(羧酸)等。肽可具有混合的序列或只由單種氨基酸組成，如聚(賴氨酸)。類似地，糖可為混合的序列或只由單種糖亞單位組成，如葡聚糖、直鏈淀粉、脫乙酰殼多糖和聚(唾液酸)。示例性的聚(醚)是聚(乙二醇)。聚(乙烯亞胺)是示例性的多胺，且聚(天冬氨)酸是代表性的聚(羧酸)。
“聚環(huán)氧烷”指具有聚醚主鏈的一類化合物。在本發(fā)明中應(yīng)用的聚環(huán)氧烷種類包括如直鏈和支鏈種類。此外，示例性的聚環(huán)氧烷的末端可以為一個或多個反應(yīng)性的、可活化的或惰性的部分。例如，聚環(huán)氧烷是由重復(fù)的環(huán)氧乙烷亞單位組成的聚環(huán)氧烷，其在每一末端包括或不包括額外的反應(yīng)性的、可活化的或惰性的部分。有用的聚環(huán)氧烷種類包括那些一個末端被惰性基團“加帽”的種類，如單甲氧基-聚環(huán)氧烷。當(dāng)分子是分支的種類時，在環(huán)氧烷鏈的末端可包括多個反應(yīng)性的、可活化的或惰性的基團，且反應(yīng)性基團可以相同或不同。異雙功能的直鏈聚環(huán)氧烷種類的衍生物也是本領(lǐng)域中公知的。
如在此處所用的，術(shù)語“糖基連接基團”指試劑(如水溶性聚合物、治療部分、生物分子)共價附著的糖基殘基。在本發(fā)明的方法中，“糖基連接基團”共價附著到糖基化的或非糖基化的肽上，從而將試劑連接到肽上的氨基酸和/或糖基殘基上。“糖基連接基團”通常通過“修飾的糖”向肽上的氨基酸和/或糖基殘基上的酶促附著而源自“修飾的糖”。更具體的，如在此處所用的，“糖基連接基團”指共價結(jié)合如此處所討論的“修飾基團”和肽的氨基酸殘基的部分。糖基連接基團-修飾基團加成物具有作為酶底物的結(jié)構(gòu)。以糖基連接基團-修飾基團加成物為底物的酶通常是那些能夠?qū)⑻腔糠洲D(zhuǎn)移到肽的氨基酸殘基上的酶，如糖基轉(zhuǎn)移酶、酰胺酶、糖苷酶、反式唾液酸酶等。“糖基連接基團”插入“修飾基團”和肽的氨基酸殘基之間并與其共價結(jié)合。
“完整的糖基連接基團”指源自糖基部分的連接基團，其中與綴合物連接的單個糖單體不是降解的，如氧化的(如通過偏高碘酸鈉)。本發(fā)明的“完整的糖基連接基團”可通過添加糖基單位或從親體糖結(jié)構(gòu)上去除一個或多個糖基單位而源自天然存在的寡糖。示例性的“完整的糖基連接基團”包括至少一個完整的(如非降解的)糖基部分，該部分共價附著于肽上的氨基酸殘基上?！斑B接基團”的剩余部分可以具有基本任何結(jié)構(gòu)。例如，修飾基團任選直接與完整的糖基部分連接?？蛇x擇地，修飾基團通過連接體臂連接于完整的糖基部分。連接體臂可具有可用于選擇的實施方案中的基本任何結(jié)構(gòu)。在一個示例性實施方案中，連接體臂是一個或多個完整的糖基部分，即，“完整的糖基連接基團”類似一個寡糖。另一個示例性完整的糖基連接基團是其中直接或間接附著于完整的糖基部分的糖基部分被降解或衍生化(如，高碘酸鹽氧化，隨后為還原性氨基化)的基團。另一個連接體臂包括直接或間接通過交聯(lián)劑附著于完整的糖基部分的修飾基團，如那些在此處所述的基團及其類似物。
如在此處所用的，“降解”指從糖基部分去除一個或多個碳原子。
如在此處所用的，術(shù)語“導(dǎo)向部分”和“導(dǎo)向試劑”指選擇性地定位于身體的特定組織或區(qū)域的種類。該定位是由對分子決定因素的特定識別、導(dǎo)向試劑或綴合物的分子大小、離子相互作用、疏水相互作用等介導(dǎo)的。其他將試劑導(dǎo)向到特定組織或區(qū)域的機制是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。
如在此處所用的，“治療部分”指任何用于治療的試劑，包括但不局限于抗生素、抗炎癥劑、抗腫瘤藥物、細(xì)胞毒素和放射性試劑。“治療部分”包括生物活性劑的前體藥物，即一種構(gòu)建體，其中超過一種治療部分連接到載體如多價試劑上。治療部分也包括肽和包括該肽的構(gòu)建體。示例性的肽包括那些在此處公開于圖28和表6和7中的。因而，“治療部分”意思為任何用于治療的試劑，包括但不局限于抗生素、消炎劑、抗腫瘤藥物、細(xì)胞毒素和放射性試劑?！爸委煵糠帧卑ㄉ锘钚栽噭┑那绑w藥物，即其中超過一種治療部分連接于載體的構(gòu)建體如多價試劑。
如在此處所用的，“抗腫瘤藥物”指任何用于對抗癌癥的試劑，包括但不局限于細(xì)胞毒素和如抗代謝物、烷基化劑、安慈拉環(huán)素、抗生素、抗有絲分裂劑、普魯芐肼、羥脲、天冬酰胺酶、皮質(zhì)類固醇、干擾素和放射性試劑之類的試劑。同樣包含于術(shù)語“抗腫瘤藥物”范疇內(nèi)的是肽與抗腫瘤活性物如TNF-α的綴合物。綴合物包括，但不局限于那些在治療性蛋白質(zhì)和本發(fā)明的糖蛋白質(zhì)之間形成的。代表性的綴合物是在PSGL-1和TNF-α之間形成的。
如在此處所用的，“細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒素劑”指任何對細(xì)胞有害的試劑。例子包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、表鬼臼毒吡喃葡糖苷、表鬼臼毒噻吩糖苷(tenoposide)、長春花新堿、長春花堿、秋水仙素、阿霉素、道諾紅菌素、二羥anthracinedione、米托蒽醌、普卡霉素、放線菌素D、1-脫氫睪甾酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利度卡因、普萘洛爾和嘌羅霉素及其類似物或同系物。其他毒素包括如蓖麻毒蛋白、CC-1065和類似物倍癌霉素。另外其他的毒素包括白喉毒素和蛇毒液(如眼鏡蛇毒液)。
如在此處所用的，“放射性試劑”包括任何在診斷或破壞腫瘤中有效的放射性同位素。例子包括但不局限于銦-111、鈷-60和锝。此外，一般代表放射性同位素混合物的天然存在的放射性元素如鈾、鐳和釷是放射性試劑的適當(dāng)?shù)睦?。金屬離子一般是與有機螯合部分螯合的。
許多有用的螯合基團、冠醚、穴狀配體等是本領(lǐng)域中公知的且可整合入本發(fā)明的化合物中(如EDTA、DTPA、DOTA、NTA、HDTA等及其磷酸鹽類似物如DTPP、EDTP、HDTP、NTP等)。參見如Pitt等人，“TheDesign of Chelating Agents for the Treatment of Iron Overload”，Inorgnic Chemistry in Biology and Medicine；Martell，Ed.；American Chemistry Society，Washington，D.C.，1980，pp.279-312；Lindoy，The Chemistry of Macrocyclic Ligand Complexes；CambridgeUniversity Press，Cambridge，1989；Dugas，Bioorganic Chemistry；Springer-Verlag，New York，1989，及在其中含有的參考文獻。
此外，使得螯合劑、冠醚和環(huán)化糊精向其他分子附著的多種途徑是本領(lǐng)域技術(shù)人員可獲得的。參見如Meares等人，“Properties of InVivo Chelate-Tagged Proteins and Polypeptides”，Modification ofProteinsFood，Nutritional and Pharmacological Aspects；Feeney等人，Eds.，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982，pp.370-387；Kasina等人，Bioconjugate Chem.，9108-117(1998)；Song等人，Bioconjugate Chem.，8249-255(1997)。
如在此處所用的，“藥物可接受的載體”包括任何材料，該材料當(dāng)與綴合物結(jié)合時保持綴合物的活性，且與被試者的免疫系統(tǒng)是非反應(yīng)性的。例子包括但不局限于任何標(biāo)準(zhǔn)的藥物載體，如磷酸緩沖的鹽溶液、水、乳劑如油/水乳劑和各種類型的潤濕劑。其他載體也可包括無菌的溶液、片劑(包括包被的片劑)和膠囊。一般這種載體含有賦形劑，如淀粉、奶、糖、某些類型的粘土、明膠、硬脂酸及其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石、植物脂肪或油、樹膠、乙二醇或其他已知的賦形劑。這種載體也可包括香料和顏色添加劑或其他成分。包含這種載體的組合物是用眾所周知的常規(guī)方法制備的。
如在此處所用的，“給予”指向被試者的口服給予、作為栓劑的給予、局部接觸、靜脈內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、肌內(nèi)的、病灶內(nèi)的(intralesional)、鼻內(nèi)的或皮下的給予、鞘內(nèi)給予或緩慢釋放設(shè)備的植入，如小滲透泵(mini-osmotic pump)。
術(shù)語“分離的”指基本上不含有用于制備該材料的成分的材料。對于本發(fā)明的肽綴合物，術(shù)語“分離的”指基本上不含有通常在用于制備肽綴合物的混合物中與該材料相伴的成分的材料?！胺蛛x的”和“純的”可互換使用一般地，本發(fā)明分離的肽綴合物具有優(yōu)選地表達為一個范圍的純度水平。該純度范圍的下限是約60％、約70％或約80％，而該純度范圍的上限是約70％、約80％、約90％或超過約90％。
當(dāng)肽綴合物為超過約90％純時，其純度也優(yōu)選地表達為一個范圍。該純度范圍的下限是約90％、約92％、約94％、約96％或約98％，而該純度范圍的上限是約92％、約94％、約96％、約98％或約100％。
純度是用任何本領(lǐng)域認(rèn)可的分析方法確定的(如銀染凝膠上的條帶亮度、聚丙烯酰胺凝膠電泳、HPLC或類似的方法)。
如在從此處所用的，“商業(yè)規(guī)?！敝冈诜椒ㄖ挟a(chǎn)生約1克或幾克終產(chǎn)物。
如在此處所用的，“群體的基本每一個成員”指本發(fā)明肽綴合物群體的特征，其中將添加到肽上的選定百分比的修飾的糖添加到肽上多個相同的受體位點上。“群體的基本每一個成員”提及與修飾的糖綴合的肽上位點的“同質(zhì)性”，并涉及本發(fā)明至少約80％、優(yōu)選地為至少約90％且更優(yōu)選地為至少約95％同質(zhì)的綴合物。
“同質(zhì)性”指修飾的糖所綴合的受體部分群體中的結(jié)構(gòu)一致性。因而，在本發(fā)明的肽綴合物中，其中每一個修飾的糖部分與受體位點綴合，并且該受體位點具有與每一個其他的修飾的糖所綴合的受體位點相同的結(jié)構(gòu)，該肽綴合物則稱為是約100％同質(zhì)的。同質(zhì)性一般表達為一個范圍。肽綴合物同質(zhì)性范圍的下限是約60％、約70％或約80％，而純度范圍的上限是約70％、約80％、約90％或超過約90％。
當(dāng)肽綴合物為超過或等于約90％同質(zhì)的時，其同質(zhì)性也優(yōu)選地表達為一個范圍。該同質(zhì)性范圍的下限是約90％、約92％、約94％、約96％或約98％，而該純度范圍的上限是約92％、約94％、約96％、約98％或約100％。肽綴合物的純度一般用一種或多種本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法確定，如液相層析-質(zhì)譜分析法(LC-MS)、基質(zhì)輔助的激光解吸飛行時間質(zhì)譜分析法(MALDI-TOF)、毛細(xì)管電泳等。
當(dāng)涉及糖肽時，“基本統(tǒng)一的糖形式”或“基本統(tǒng)一的糖基化模式”指由目標(biāo)糖基轉(zhuǎn)移酶(如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)進行糖基化的受體部分的百分比。例如，在α1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的情況下，如果本發(fā)明的肽綴合物中基本所有的(如在下面定義的)Galβ1，4-GlcNAc-R及其唾液酸化類似物均被巖藻糖基化，則存在基本統(tǒng)一的巖藻糖基化模式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解起始材料可含有糖基化的受體部分(如巖藻糖基化的Galβ1，4-GlcNAc-R部分)。因而，計算的糖基化百分比將包括由本發(fā)明的方法糖基化的受體部分以及在起始材料中已經(jīng)糖基化的那些受體部分。
在上述對“基本統(tǒng)一的”定義中的術(shù)語“基本”通常指特定糖基轉(zhuǎn)移酶的受體部分的至少約40％、至少約70％、至少約80％、或更優(yōu)選地至少約90％且更加優(yōu)選地至少約95％是糖基化的。
發(fā)明描述I.重構(gòu)聚糖鏈的方法本發(fā)明包括以這樣的方式在體外向糖肽分子添加糖和/或從糖肽分子中刪除糖的方法和組合物，從而提供具有特定定制的或想要的糖基化模式的肽分子，優(yōu)選地包括在其上添加修飾的糖。因此本發(fā)明的一個關(guān)鍵特征是獲取由任何細(xì)胞類型產(chǎn)生的肽并在該肽上生成核心聚糖結(jié)構(gòu)，隨后將聚糖結(jié)構(gòu)在體外進行重構(gòu)以生成具有適合于在哺乳動物中的治療應(yīng)用的糖基化模式的肽。
肽的糖基化模式的重要性是本領(lǐng)域中眾所周知的，正如現(xiàn)有的生產(chǎn)適當(dāng)糖基化的肽的體內(nèi)方法的局限性也是眾所周知的，特別是當(dāng)這些肽用重組DNA方法生產(chǎn)時。此外，直到本發(fā)明，尚不可能生成在其上具有想要的聚糖結(jié)構(gòu)的糖肽，其中該肽可在工業(yè)規(guī)模上生產(chǎn)。
在本發(fā)明中，將由細(xì)胞產(chǎn)生的肽在體外通過系統(tǒng)地添加適當(dāng)?shù)拿讣捌涞孜锒M行酶處理，從而不應(yīng)該存在于肽上的糖部分可被去除，而應(yīng)該添加到肽上的糖部分(可選擇地包括修飾的糖)則以這樣的方式添加到肽上，從而提供具有如在別處所定義的“想要的糖基化”的糖肽。
A.重構(gòu)N-連接聚糖的方法在一方面，本發(fā)明利用如下事實，即大多數(shù)具有商業(yè)意義或藥物意義的肽包含共同的在此處稱為三甘露糖核心的五糖結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與肽鏈上Asn-X-Ser/Thr序列中的天冬酰胺進行N-連接?；镜娜事短呛诵幕居筛街诫纳系?個N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和3個甘露糖(Man)殘基組成，即它包含這5個糖殘基而無額外的糖，例外是它可選擇地可包括一個巖藻糖殘基。第一個GlcNAc附著到天冬酰胺的酰胺基團上，而第二個GlcNAc通過β1，4-鍵附著到第一個上。1個甘露糖殘基通過β1，4-鍵附著到第二個GlcNAc上，且2個甘露糖分別通過α1，3和α1，6鍵附著到該甘露糖上。對三甘露糖核心結(jié)構(gòu)的示意性描述顯示于
圖1左邊。盡管大多數(shù)肽上的聚糖結(jié)構(gòu)包含除三甘露糖核心之外的其他糖，但三甘露糖核心結(jié)構(gòu)代表了哺乳動物肽上N-連接的聚糖的基本特征。
本發(fā)明包括生成以三甘露糖核心結(jié)構(gòu)作為在其上含有的聚糖分子的基本結(jié)構(gòu)元件的肽。假定有各種用于生產(chǎn)肽的細(xì)胞系統(tǒng)，不管該系統(tǒng)本身是天然存在的還是涉及重組DNA方法學(xué)的，本發(fā)明均提供了使在任何細(xì)胞類型中產(chǎn)生的肽上的聚糖結(jié)構(gòu)可還原為基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)的方法。一旦生成了基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)，那么可能的是利用在此處描述的方法在體外生成肽上想要的聚糖結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)賦予該肽一種或多種增強其治療功效的性質(zhì)。
從此處的討論中可以看出術(shù)語“三甘露糖核心”用于描述在
圖1左邊所示的聚糖結(jié)構(gòu)。具有三甘露糖核心結(jié)構(gòu)的糖肽也具有在其上添加的額外的糖，且在極大程度上，具有在其上添加的額外結(jié)構(gòu)，而不管該糖是否使肽具有想要的聚糖結(jié)構(gòu)。術(shù)語“基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)”在別處定義。當(dāng)術(shù)語“基本的”不包括于“三甘露糖核心結(jié)構(gòu)”的描述中時，那么該聚糖包含在甘露糖上附著有額外的糖的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)。
術(shù)語“基本的三甘露糖核心糖肽”在此處用于指具有主要包含基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)的聚糖結(jié)構(gòu)的糖肽。然而，它也可選擇地含有在其上附著的巖藻糖殘基。如在此處所討論的，基本的三甘露糖核心糖肽是最適的，且因此是優(yōu)選的用于本發(fā)明的聚糖重構(gòu)過程的起始材料。
另一種最適的用于本發(fā)明的聚糖重構(gòu)過程的起始材料是具有三甘露糖核心的聚糖結(jié)構(gòu)，其中一個或多個額外的GlcNAc殘基添加到甘露糖殘基的α1，3和α1，6的每一個上(參見如圖2中第二條線上的結(jié)構(gòu)，從圖的左邊起第二個結(jié)構(gòu))。該結(jié)構(gòu)在此處稱為“Man3GlcNAc4”。當(dāng)該結(jié)構(gòu)為單觸角時，該結(jié)構(gòu)在此處稱為“Man3GlcNAc3”可選擇地，該結(jié)構(gòu)也可含有核心巖藻糖分子。一旦生成了Man3GlcNAc3或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)，那么可能的是利用在此處描述的方法在體外生成肽上想要的聚糖結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)賦予該肽一種或多種增強其治療功效的性質(zhì)。
在其天然形式中，本發(fā)明N-連接的糖肽，特別是用于本發(fā)明的哺乳動物和人類的糖肽是用在其上附著一個或多個糖的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)進行N-連接糖基化的。
術(shù)語“糖肽”和“糖多肽”在此處同義地用于指具有在其上附著的糖部分的肽鏈。在此處對小的糖多肽或糖肽與大的糖多肽或糖肽未作區(qū)分。因而，在其肽鏈中具有非常少的氨基酸(如常少至3個氨基酸)的激素分子和其他非常大的肽均包括于通用術(shù)語“糖多肽”和“糖肽”中，只要它們具有在其上附著的糖部分。然而，術(shù)語“肽”的使用不排除該肽為糖肽。
具有想要的糖基化的N-連接糖肽的例子是具有N-連接的聚糖的肽，該聚糖具有在其上附著至少一個GlcNAc殘基的三甘露糖核心。該殘基是用N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶I(GnT-I)添加到三甘露糖核心上的。如果添加第二個GlcNAc，則應(yīng)用N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶II(GnT-II)?？蛇x擇地，可用GnT-IV和/或GnT-V添加額外的GlcNAc殘基，且第三個等分的GlcNAc殘基可用N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶III(GnT-III)附著到三甘露糖核心的β1，4甘露糖上?？蛇x擇地，該結(jié)構(gòu)可用β1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理進行延伸以向每一個非等分的GlcNAc上添加半乳糖殘基，且進一步可選擇地，利用α2，3或α2，6-唾酸轉(zhuǎn)移酶可將唾液酸殘基添加到每一個半乳糖殘基上。等分的GlcNAc向聚糖的添加不是隨后添加半乳糖和唾液酸殘基所必需的；然而，對于大鼠和人類GnT-III酶的底物親和力，聚糖上一個或多個半乳糖殘基的存在排除了等分的GlcNAc的添加，這是因為含有半乳糖的聚糖不是這些形式的GnT-III的底物。因而，在等分的GlcNAc想要存在和應(yīng)用這些形式的GnT-III的情況下，重要的是如果聚糖含有添加的半乳糖和/或唾液酸，那么它們應(yīng)該在添加等分的GlcNAc之前去除。其他形式的GnT-III的活性可能不需要這種特定的底物順序。在更優(yōu)選的反應(yīng)中，將GnT-I、GnT-II和GnT-III的混合物加入到反應(yīng)混合物中，從而GlcNAc殘基可以以任何順序添加。
代表具有“想要的糖基化”的肽的各個方面的聚糖結(jié)構(gòu)的例子在此處提供的附圖中顯示。體外生成具有“想要的糖基化”的肽的精確過程在別處描述。然而，本發(fā)明決不應(yīng)該解釋為只是局限于在此處公開的任何一個聚糖結(jié)構(gòu)。本發(fā)明更合適地應(yīng)該解釋為包括可用在此處提供的方法制備的任何一個或全部的聚糖結(jié)構(gòu)。
在一些情況下，基本的三甘露糖核心單獨可構(gòu)成肽的想要的糖基化。例如，已顯示僅具有三甘露糖核心的肽是用于治療高歇病的酶的有用成分(Mistry等人，1966，Lancet 3481555-1559；Bijsterbosch等人，1966，Eur.J.Biochem.237344-349)。
根據(jù)本發(fā)明，下面描述生成具有想要的糖基化的肽的程序。
a)起始于具有一個或多個聚糖分子的糖肽，該聚糖分子的共同特征為具有三甘露糖核心結(jié)構(gòu)和在其上添加的一個或多個糖的至少一種或多種異質(zhì)的或同質(zhì)的混合物，可能的是增加具有基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)作為唯一聚糖結(jié)構(gòu)的或具有Man3GlcNAc3或Man3GlcNAc4作為唯一聚糖結(jié)構(gòu)的糖肽的比例。這是在體外通過以適當(dāng)?shù)捻樞蛳到y(tǒng)地向糖肽添加適當(dāng)數(shù)目的酶而實現(xiàn)，該酶可切割聚糖結(jié)構(gòu)上的糖的異質(zhì)的或同質(zhì)的混合物直到其減少到基本的三甘露糖核心或Man3GlcNAc3或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)。這些如何實現(xiàn)的特定例子將依賴于各種因素，在很大部分上包括產(chǎn)生肽的細(xì)胞類型及因此在最初由細(xì)胞產(chǎn)生的肽上存在的聚糖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性程度。復(fù)雜的聚糖結(jié)構(gòu)如何減少為基本三甘露糖核心或Man3GlcNAc3或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)的例子在圖2中顯示，或在別處有詳細(xì)描述。
b)可能的是通過分離天然存在的細(xì)胞而生成具有基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)作為唯一聚糖結(jié)構(gòu)的肽，其中該細(xì)胞的糖基化機器產(chǎn)生這種肽。然后將編碼目標(biāo)肽的DNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，在其中DNA進行轉(zhuǎn)錄、翻譯和糖基化，從而目標(biāo)肽具有基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)作為唯一聚糖結(jié)構(gòu)。例如，缺乏有功能的GnT-I酶的細(xì)胞將產(chǎn)生幾種類型的糖肽。在一些情況下，這些將是不具有附著到三甘露糖核心上的額外糖的糖肽。然而，在其他的情況下，產(chǎn)生的肽可具有附著到三甘露糖核心上的2個額外的甘露糖殘基，從而結(jié)果得到Man5聚糖。這也是用于本發(fā)明的重構(gòu)過程的想要的起始材料。生成這種聚糖結(jié)構(gòu)的特定例子在此處描述。
c)可選擇地，可能的是對細(xì)胞進行基因工程加工以賦予該細(xì)胞特定的糖基化機器，從而可產(chǎn)生具有基本三甘露糖核心或Man3GlcNAc3或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)作為肽上唯一聚糖結(jié)構(gòu)的肽。然后將編碼目標(biāo)肽的DNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，在其中DNA進行轉(zhuǎn)錄、翻譯和糖基化，從而目標(biāo)肽具有增加數(shù)目的單獨包含基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)的聚糖。例如，進行基因工程加工而缺乏GnT-I的某些類型的細(xì)胞將產(chǎn)生具有基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)的聚糖，或者依賴于該細(xì)胞，可產(chǎn)生具有三甘露糖核心以及在其上附著的2個額外的甘露糖殘基的聚糖(Man5)。當(dāng)細(xì)胞產(chǎn)生Man5聚糖結(jié)構(gòu)時，可對細(xì)胞進一步進行基因工程加工以表達甘露糖苷酶3，該甘露糖苷酶3切割2個額外的甘露糖殘基以生成三甘露糖核心?？蛇x擇地，Man5聚糖可在體外與甘露糖苷酶3進行溫育以達到相同的效果。
d)當(dāng)肽在昆蟲細(xì)胞中表達時，肽上的聚糖包含部分復(fù)合的鏈。昆蟲細(xì)胞也在細(xì)胞中表達氨基己糖苷酶，該酶將部分復(fù)合的鏈修剪為三甘露糖核心結(jié)構(gòu)，然后該結(jié)構(gòu)如在此處所述進行重構(gòu)。
e)從b)、c)和d)中的討論看顯而易見的是細(xì)胞不需要僅產(chǎn)生在其上附著有基本三甘露糖核心或Man3GlcNAc3或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)的肽。更適當(dāng)?shù)氖浅莃)和c)中描述的細(xì)胞產(chǎn)生具有100％的基本三甘露糖核心結(jié)構(gòu)(即不具有在其上附著的額外的糖)或100％的Man3GlcNAc3或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)，細(xì)胞事實上產(chǎn)生肽的異質(zhì)的混合物，該肽除具有基本三甘露糖核心結(jié)構(gòu)或Man3GlcNAc3或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)的組合作為唯一的聚糖結(jié)構(gòu)之外，還具有在其上附著有其它糖的這些結(jié)構(gòu)。具有在其上附著有額外的糖的三甘露糖核心或Man3GlcNAc3或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)的肽對那些僅具有一種結(jié)構(gòu)的肽的比例將依賴于產(chǎn)生它們的細(xì)胞而變化。聚糖的復(fù)雜性(即何種及多少糖附著于三甘露糖核心上)也將依賴于產(chǎn)生它們的細(xì)胞。
f)一旦根據(jù)本發(fā)明通過a)、b)或c)產(chǎn)生了具有基本的三甘露糖核心或在其上附著有一個或多個GlcNAc殘基的三甘露糖核心的糖肽，那么在體外可將額外的糖分子添加到三甘露糖核心結(jié)構(gòu)上以生成具有想要的糖基化的肽(即具有在體外定制的聚糖結(jié)構(gòu)的肽)。
g)然而，當(dāng)產(chǎn)生了具有在其上附著有一些但不是全部想要的糖的基本三甘露糖核心或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)的肽時，那么僅需要添加剩余的想要的糖，而不用將聚糖結(jié)構(gòu)減少為基本三甘露糖核心或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)。因此，在一些情況下，具有在其上附著有額外的糖的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)的聚糖結(jié)構(gòu)的肽將是進行重構(gòu)的適當(dāng)?shù)孜铩?br> 基本三甘露糖核心糖肽的分離如果需要，本發(fā)明的基本三甘露糖核心或Man3GlcNAc3或Man3GlcNAc4糖肽可用肽純化領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)進行分離和純化。適當(dāng)?shù)募夹g(shù)包括層析技術(shù)、等電聚焦技術(shù)、超濾技術(shù)等。利用任何這樣的技術(shù)，可制備本發(fā)明的組合物，其中本發(fā)明的糖肽是與其他肽和與其他通常發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞培養(yǎng)基中的成分分離的。相對于其它肽，純化的程度可為如90％、或95％或更高，如98％。參見如Deutscher等人(ed.，1990，Guide to Protein Purification，Harcourt Brace Jovanovich，San Diego)。
存在于由現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域的方法產(chǎn)生的糖肽中的N-連接聚糖的異質(zhì)性通常僅允許小部分目標(biāo)糖肽的分離，該目標(biāo)糖肽可進行修飾以產(chǎn)生想要的糖肽。在本發(fā)明的方法中，可產(chǎn)生大量的基本三甘露糖核心糖肽和其他想要的糖肽，包括Man3GlcNAc3或Man3GlcNAc4糖肽，這些糖肽然后可進一步進行修飾以生成大量具有想要的糖基化的肽。
連接到肽上的任何特定類型的聚糖的特異性富集可用對想要的聚糖具有親和力的凝集素來實現(xiàn)。這種技術(shù)是糖生物學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的。
在下面更詳細(xì)描述的本發(fā)明的關(guān)鍵特征是一旦在任何肽上生成了聚糖結(jié)構(gòu)，那么該聚糖結(jié)構(gòu)可在體外進行重構(gòu)以生成具有想要的糖基化的肽，該肽在哺乳動物中具有改善的治療應(yīng)用。哺乳動物可為任何類型的適當(dāng)哺乳動物，且優(yōu)選地為人。
生成具有想要的糖基化的肽的各種情形和精確的方法和組合物在隨后的公開內(nèi)容中將變?yōu)轱@而易見的。
生產(chǎn)用于哺乳動物中治療應(yīng)用的肽的最終目的是該肽應(yīng)該包含促進而不是取消該肽的治療益處的聚糖結(jié)構(gòu)。如貫穿本說明書所公開的，在細(xì)胞中產(chǎn)生的肽可在體外用各種酶進行處理，該酶催化不應(yīng)該存在于聚糖上的糖的切割和應(yīng)該存在于聚糖上的糖的添加，從而則產(chǎn)生了具有想要的糖基化并因而適合于哺乳動物中的治療應(yīng)用的肽。細(xì)胞中肽的不同糖形式的生成在上文描述。現(xiàn)在描述了各種生成具有想要的糖基化的肽的機制，其中起始材料即由細(xì)胞產(chǎn)生的肽依細(xì)胞類型而有差異。如從本發(fā)明的公開內(nèi)容中將顯而易見的，在其聚糖組成方面，起始材料不必是統(tǒng)一的。然而，優(yōu)選地是富集某些糖形式的起始材料以產(chǎn)生大量的終產(chǎn)物，即正確糖基化的肽。
在根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，結(jié)果得到具有想要的糖基化的肽的降解和合成事件在一些時候涉及肽上基本三甘露糖核心結(jié)構(gòu)或Man3GlcNAc3或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)的生成。
本發(fā)明也提供了向肽添加一個或多個選擇的糖基殘基的方法，其后將修飾的糖綴合到肽上至少一個選擇的糖基殘基上。本實施方案當(dāng)例如想要將修飾的糖與選擇的糖基殘基綴合時是有用的，其中該選擇的糖基殘基不存在于肽上或不以想要的量存在。因而，在使修飾的糖與肽進行偶聯(lián)之前，將選擇的糖基殘基與肽通過酶促或化學(xué)偶聯(lián)進行綴合。在另一個實施方案中，肽的糖基化模式是在修飾的糖的綴合之前通過從肽中去除糖殘基而改變的。參見如WO 98/31826。
存在于肽上的任何糖部分的添加或去除是化學(xué)地或酶促實現(xiàn)的?；瘜W(xué)脫糖基化優(yōu)選地是通過將肽變體暴露于化合物三氟甲磺酸或等價的化合物而發(fā)生的。該處理導(dǎo)致除連接糖(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外大多數(shù)或全部糖的切割，而剩下完整的肽?；瘜W(xué)降解描述于Hakimuddin等人，1987，Arch.Biochem.Biophys.25952和Edge等人，1981，Anal.Biochem.118131。肽變體上糖部分的酶促切割可通過應(yīng)用各種內(nèi)切-和外切-糖苷酶而實現(xiàn)，如由Thotakura等人，1987，Meth.Enzymol.138350所描述的。
糖基部分的化學(xué)添加是通過任何本領(lǐng)域認(rèn)可的方法實施的。糖基部分的酶促添加優(yōu)選地是用對在此處提出的方法的修改方法實現(xiàn)的，即用天然的糖基單位替代用于本發(fā)明中的修飾的糖。其他添加糖部分的方法描述于美國專利No.5,876,980、6,030,815、5,728,554和5,922,577。
選擇的糖基殘基的示例性附著位點包括但不局限于(a)N-和O-糖基化位點；(b)作為糖基轉(zhuǎn)移酶受體的末端糖基部分；(c)精氨酸、天冬酰胺和組氨酸；(d)游離羧基；(e)游離巰基基團如半胱氨酸的；(f)游離羥基如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的；(g)芳族殘基如那些苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的；或(h)谷氨酰胺的酰胺基團。用于本發(fā)明的示例性方法描述于1987年9月11日發(fā)表的WO 87/05330和Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)中。
特定地涉及到在此處提供的幾個圖中所示的例子，現(xiàn)在提供了對在肽上產(chǎn)生想要的聚糖結(jié)構(gòu)的體外酶促反應(yīng)順序的描述。在下面描述的每一個酶促轉(zhuǎn)變的精確反應(yīng)條件是糖生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的且因此不在此進行重復(fù)。對于這些類型反應(yīng)的反應(yīng)條件的綜述，參見Sadler等人，1982，Methodsin Enzymology 83458-514及在其中引用的參考文獻。
在
圖1中左邊顯示了基本的三甘露糖核心聚糖的結(jié)構(gòu)?？赡艿氖峭ㄟ^GnT-I隨后為GnT-II且進一步隨后為GnT-III和包含UDP-GlcNAc的糖供體存在時溫育基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)而將該結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂械确值腉lcNAc的完整聚糖結(jié)構(gòu)，其中將GlcNAc依次添加到基本三甘露糖核心結(jié)構(gòu)上以生成具有等分的GlcNAc的三甘露糖核心。在一些情況中，例如當(dāng)如在此處所述對Fc聚糖進行重構(gòu)時，添加GnT-I、GnT-II和GnT-III的順序可以與文獻中報道的相反。可以通過向反應(yīng)混合物中添加GnT-I、GnT-II和GnT-III以及UDP-GlcNAc來產(chǎn)生等分的GlcNAc結(jié)構(gòu)。
在圖3中顯示了含有等分的GlcNAc的三甘露糖核心聚糖向包含半乳糖和N-乙酰神經(jīng)氨酸的復(fù)雜聚糖結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變。首先將含有等分的GlcNAc的三甘露糖核心聚糖與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和作為供體分子的UDP-Gal進行溫育，其中將兩個半乳糖殘基添加到分子上的外周GlcNAc殘基上。然后將NeuAc-轉(zhuǎn)移酶用于向每一個半乳糖殘基各添加一個NeuAc，共兩個NeuAc。
在圖4中顯示了高甘露糖聚糖結(jié)構(gòu)向基本的三甘露糖核心聚糖的轉(zhuǎn)變。使高甘露糖聚糖(Man9)依次在甘露糖苷酶1存在時進行溫育以生成Man5結(jié)構(gòu)，然后在甘露糖苷酶3存在時進行溫育，其中除3個甘露糖殘基之外的所有甘露糖殘基將從聚糖上去除?？蛇x擇地，Man9結(jié)構(gòu)的溫育可僅通過在甘露糖苷酶3存在時進行溫育而修剪到三甘露糖核心結(jié)構(gòu)。根據(jù)在上述
圖1和3中提供的方案，然后該基本的三甘露糖核心聚糖向復(fù)雜的聚糖分子的轉(zhuǎn)變則是可能的。
在圖5中顯示了植物細(xì)胞中產(chǎn)生的典型的復(fù)雜N-連接的聚糖結(jié)構(gòu)。重要的是注意當(dāng)植物細(xì)胞缺失GnT-I酶活性時，木糖和巖藻糖不能添加到聚糖中。因而，GnT-I基因敲除細(xì)胞的應(yīng)用提供了本發(fā)明中特別的優(yōu)點，即這些細(xì)胞可產(chǎn)生具有基本的三甘露糖核心的肽，在該基本的三甘露糖核心上可添加額外的糖而不用進行任何“修剪”反應(yīng)。類似地，在植物細(xì)胞中產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)為聚糖的Man5變體的情況下，如果在這些細(xì)胞中無GnT-I，那么木糖和巖藻糖則不能添加到該結(jié)構(gòu)中。在這種情況下，可將Man5結(jié)構(gòu)用甘露糖苷酶3修剪為基本的三甘露糖核心(Man3)。根據(jù)在此處提供的方法，目前可能的是將糖部分添加到三甘露糖核心以生成想要的聚糖結(jié)構(gòu)。
在圖6中顯示了昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的典型的復(fù)雜N-連接的聚糖結(jié)構(gòu)。明顯的是額外的糖如巖藻糖也可存在。盡管未進一步在此處顯示，但昆蟲細(xì)胞可產(chǎn)生具有多達9個甘露糖殘基的且可在其上附著有額外的糖的高甘露糖聚糖。同樣的情況是在昆蟲細(xì)胞中，GnT-I基因敲除的細(xì)胞防止了巖藻糖向聚糖上的添加。因而，昆蟲細(xì)胞中肽的產(chǎn)生優(yōu)選地可以在GnT-I基因敲除細(xì)胞中實現(xiàn)。因而如果需要，如此產(chǎn)生的聚糖然后可用在此處描述的任何方法和方案進行體外修剪，且額外的糖也可用在此處描述的方法和方案在體外添加到其上。
在圖2中顯示了各種完成程度的聚糖結(jié)構(gòu)。特定地，顯示了基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)從不含有等分的GlcNAc殘基的復(fù)雜糖聚糖結(jié)構(gòu)的體外酶促生成。同樣顯示的是由此生成的含有等分的GlcNAc的聚糖結(jié)構(gòu)。顯示了幾個可產(chǎn)生的中間聚糖結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)可由細(xì)胞產(chǎn)生，或可在此處描述的體外修剪反應(yīng)中產(chǎn)生。糖部分可在體外添加到基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)上，或添加到任何適當(dāng)?shù)闹虚g結(jié)構(gòu)上以產(chǎn)生想要的聚糖。
在圖7中顯示了一系列可能的體外反應(yīng)，該反應(yīng)可執(zhí)行對起始于高甘露糖結(jié)構(gòu)的聚糖的修剪和添加。例如，Man9聚糖可用甘露糖苷酶1進行修剪以生成Man5聚糖，或它可用甘露糖苷酶3或一種或多種微生物甘露糖苷酶修剪為三甘露糖核心。然后可將GnT-I和或GnT-II用于將額外的GlcNAc殘基轉(zhuǎn)移到聚糖上。進一步地，顯示了當(dāng)聚糖分子在不具有GnT-I的細(xì)胞中產(chǎn)生時不發(fā)生的狀況(參見陰影框)。例如，巖藻糖和木糖僅當(dāng)GnT-I是活性的且促進GlcNAc向分子的轉(zhuǎn)移時可添加到聚糖上。
圖8描述起始于三甘露糖核心結(jié)構(gòu)合成雙觸角的、三觸角的和甚至四觸角的聚糖結(jié)構(gòu)的眾所周知的策略。根據(jù)本發(fā)明的方法，可能的是用糖生物學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的適當(dāng)?shù)拿负头磻?yīng)條件在體外合成這些結(jié)構(gòu)的每一個。
圖9描述從高甘露糖(6～9個甘露糖部分)聚糖結(jié)構(gòu)開始合成單觸角聚糖結(jié)構(gòu)的兩種方法。根據(jù)此處所述的糖PEG化方法，可添加末端唾液酸-PEG部分以替代唾液酸部分。在第一個方法中，endo-H用于將肽上的聚糖結(jié)構(gòu)切割到第一個GlcNAc殘基。然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶添加半乳糖，而如本文別處所述添加唾液酸化的PEG。在第二個方法中，甘露糖苷酶I用于從肽中的聚糖結(jié)構(gòu)切割甘露糖殘基。將半乳糖殘基添加到剩余的甘露糖殘基的一個臂上，該甘露糖殘基是用刀豆α-甘露糖苷酶從聚糖中切除的。然后如所述的將唾液酸化的PEG添加到該結(jié)構(gòu)上。
圖10描述從高甘露糖(6～9個甘露糖部分)聚糖結(jié)構(gòu)開始合成單觸角聚糖結(jié)構(gòu)的另外兩種方法。與圖9中的一樣，根據(jù)此處所述的糖PEG化方法，添加末端唾液酸-PEG部分以替代唾液酸部分。在此處所述的情形中，從未添加唾液酸化的PEG的臂去除一些甘露糖殘基。
在
圖11中顯示了起始于三甘露糖核心結(jié)構(gòu)合成更復(fù)雜的糖結(jié)構(gòu)的方案。例如，顯示了體外生產(chǎn)唾液酸化或非唾液酸化的Lewisx和Lewi s a抗原結(jié)構(gòu)的方案。這種結(jié)構(gòu)當(dāng)存在于肽上時可賦予肽免疫學(xué)的優(yōu)點，以用于增量調(diào)節(jié)或減量調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。此外，這種結(jié)構(gòu)可用于肽向特定細(xì)胞的導(dǎo)向，這是因為這類結(jié)構(gòu)參與與細(xì)胞附著肽等的結(jié)合。
圖12是用于制備源自絲氨酸或蘇氨酸的O-連接的肽陣列的示例性方案。
圖13是一系列描述稱為核心1～4的4類O-連接的聚糖結(jié)構(gòu)的圖解。核心結(jié)構(gòu)以虛線描述。也可包括于該結(jié)構(gòu)中的糖包括添加到半乳糖殘基上的唾液酸殘基和添加到GlcNAc殘基上的巖藻糖殘基。
因而，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了制備N-連接的糖基化糖肽的方法，該方法為提供在其上附著了基本的三甘露糖核心或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)的分離的和純化的糖肽，使糖肽與糖基轉(zhuǎn)移酶和具有糖基部分的供體分子在適合于將糖基部分轉(zhuǎn)移到糖肽中的條件下接觸。然后定制基本的三甘露糖核心或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)以產(chǎn)生具有想要的糖基化模式的肽，這可通過用本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)依次添加想要的糖部分而實現(xiàn)。
聚糖一級結(jié)構(gòu)的確定當(dāng)N-連接的糖肽由細(xì)胞產(chǎn)生時，如在別處提到的，它可包含聚糖結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性混合物，該聚糖結(jié)構(gòu)必須在向其上添加其他的糖部分之前減少為共有的和普通的基本的三甘露糖核心或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)。為了精確確定應(yīng)將哪個糖從特定的聚糖結(jié)構(gòu)上去除，有時必需的是鑒定一級聚糖結(jié)構(gòu)。確定聚糖一級結(jié)構(gòu)的技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的，且詳細(xì)描述于如Montreuil，“Structure and Biosynthesis ofGlycopeptides”，Polysaccharides in Medicinal Applications，pp.273-327，1996，Eds.Severian Damitriu，Marcel Dekker，NY。因此對于糖生物學(xué)領(lǐng)域中的技術(shù)人員而言分離由細(xì)胞產(chǎn)生的肽群體和確定在其上附著的聚糖結(jié)構(gòu)是簡單的事情。例如，對于下面部分有可用的有效方法(i)通過化學(xué)切割如水解、乙酸酐分解、肼解或通過亞硝酸脫氨而使糖苷鍵斷裂；(ii)完全甲基化，隨后進行水解或甲醇分解并隨后進行對部分甲基化的單糖的氣-液層析法和質(zhì)譜分析法分析；和(iii)用外切糖苷酶對單糖之間異頭鍵的確定，這也通過依次降解提供了對一級聚糖結(jié)構(gòu)的認(rèn)識。特別地，質(zhì)譜分析法和核磁共振(NMR)譜測定法特別是高場的NMR可成功用于確定聚糖一級結(jié)構(gòu)。
用于糖分析的試劑盒和設(shè)備也是商業(yè)上可購得的。熒光團輔助的糖電泳(FACE_)可購自Glyko，Inc.(Novato，CA)。在FACE分析中，將糖綴合物用針對N-連接聚糖的內(nèi)切H或N-聚糖酶(PNGaseF)或針對Ser/Thr連接聚糖的肼從肽中釋放。然后將該聚糖用熒光團以非結(jié)構(gòu)區(qū)分的方式在還原末端進行標(biāo)記。然后將熒光團標(biāo)記的聚糖基于糖的荷/質(zhì)比以及流體動力學(xué)體積而在聚丙烯酰胺凝膠上分離。在UV光下獲取凝膠圖象，且聚糖的組成是通過與標(biāo)準(zhǔn)物相比較的遷移距離確定的。寡糖可以以這種方式通過分析歸因于用外切糖苷酶消化的依次去除糖的遷移變化而測序。
示例性實施方案N-連接的糖基化的重構(gòu)參照下面分子式1進行了最好的闡明 其中X3、X4、X5、X6、X7和X17是(獨立選擇的)單糖或寡糖殘基；且a、b、c、d、e和x是(獨立選擇的)0、1或2，前提是選自a、b、c、d、e和x的至少一個成員是1或2。
分子式1描述了包含三甘露糖核心的聚糖結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)優(yōu)選地是共價連接到肽主鏈上的天冬酰胺殘基上的。優(yōu)選的表達系統(tǒng)將表達并分泌具有包含三甘露糖核心的N-連接聚糖的外源性肽。利用本發(fā)明的重構(gòu)方法，這些肽上的聚糖結(jié)構(gòu)可方便地重構(gòu)為任何想要的聚糖結(jié)構(gòu)。示例性的反應(yīng)條件可發(fā)現(xiàn)于實施例和文獻中。
在優(yōu)選的實施方案中，對聚糖結(jié)構(gòu)進行了重構(gòu)，從而在分子式1中描述的結(jié)構(gòu)具有特定的決定簇(determinate)?？蛇x擇聚糖的結(jié)構(gòu)以增強肽的生物學(xué)活性、賦予肽新的生物學(xué)活性、去除肽的生物學(xué)活性或更好地近似化(approximate)天然肽的糖基化模式，以及其它。
在第一個優(yōu)選的實施方案中，對肽N-連接的聚糖進行了重構(gòu)以更好地近似化天然人類蛋白質(zhì)的糖基化模式。在該實施方案中，對描述于分子式1中的聚糖結(jié)構(gòu)進行了重構(gòu)以具有下面的部分X3和X5＝|-GlcNAc-Gal-SA；a和c＝1；d＝0或1；b、e和x＝0。
該實施方案對于表達于異源細(xì)胞表達系統(tǒng)中的人類肽是特別有利的。通過將N-連接的聚糖結(jié)構(gòu)重構(gòu)為該構(gòu)型，該肽可為在人患者中較低免疫原性的和/或更穩(wěn)定的，以及具有其它特性。
在第二個優(yōu)選的實施方案中，對肽N-連接的聚糖進行了重構(gòu)以在三甘露糖核心上具有等分的GlcNAc。在該實施方案中，對描述于分子式1中的聚糖結(jié)構(gòu)進行了重構(gòu)以具有下面的部分X3和X5是|-GlcNAc-Gal-SA；a和c＝1；X4是GlcNAc；b＝1；d＝0或1；e和x＝0。
該實施方案對于表達于異源細(xì)胞系統(tǒng)中的重組抗體是特別有利的。當(dāng)抗體分子包括Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性時，公知的是與Fc結(jié)構(gòu)域連接的等分的寡糖的存在巨大地增加了抗體依賴性細(xì)胞毒性。
在第三個優(yōu)選的實施方案中，對肽N-連接的聚糖進行了重構(gòu)以具有唾液酸化的Lewis X部分。在該實施方案中，對描述于分子式1中的聚糖結(jié)構(gòu)進行了重構(gòu)以具有下面的部分X3和X5是
a、c和d＝1；b、e和x＝0；X6是巖藻糖。
該實施方案當(dāng)進行重構(gòu)的肽想要導(dǎo)向到選擇蛋白分子和展示相同分子的細(xì)胞中時是特別有利的。
在第四個優(yōu)選的實施方案中，對肽N-連接的聚糖進行了重構(gòu)以具有綴合的部分。該綴合的部分可為PEG分子、另一個肽、小分子如藥物，以及其它。在該實施方案中，對描述于分子式1中的聚糖結(jié)構(gòu)進行了重構(gòu)以具有下面的部分X3和X5是|-GlcNAc-Gal-SA-R；a和c＝1或2；d＝0或1；b、d、e和x＝0。
其中R＝綴合基團。
綴合的部分可為PEG分子、另一個肽、小分子如藥物，以及其它。因此該實施方案可用于將肽與減慢肽從患者血流中清除的PEG分子綴合，與將兩個肽導(dǎo)向到特定的組織或細(xì)胞中的肽綴合，或與具有互補的治療應(yīng)用的另一個肽綴合。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是本發(fā)明不局限于上述的優(yōu)選的聚糖分子。優(yōu)選的實施方案僅是可用本發(fā)明的重構(gòu)方法制備的許多有用的聚糖分子中的少數(shù)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員知道如何設(shè)計其他有用的聚糖。
在第一個示例性的實施方案中，肽是根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的方法在CHO(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)中表達的。當(dāng)具有N-連接的聚糖一致位點的肽在CHO細(xì)胞中表達并分泌時，該N-連接的聚糖將具有描述于圖2頂行但也包含核心巖藻糖的結(jié)構(gòu)。盡管可能存在所有這些結(jié)構(gòu)，但迄今最普遍的結(jié)構(gòu)是在右邊的兩個。在分子式1的術(shù)語中，X3和X5是|-GlcNAc-Gal-(SA)；a和c＝1；b、e和x＝0，和d＝0或1。
因此，在一個示例性的實施方案中，將表達于CHO細(xì)胞中的肽的N-連接聚糖通過使該肽與糖基轉(zhuǎn)移酶的接觸而重構(gòu)為優(yōu)選的人源化的聚糖，該糖基轉(zhuǎn)移酶對于半乳糖受體分子和唾液酸供體分子是特異性的。該過程闡述于圖2和實施例17中。在另一個示例性的實施方案中，將在CHO細(xì)胞中表達并分泌的肽的N-連接聚糖重構(gòu)為優(yōu)選的PEG化的結(jié)構(gòu)。使該肽首先與對唾液酸特異性的糖苷酶接觸以去除末端的SA部分，然后與對半乳糖受體部分和唾液酸受體部分特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶在PEG-唾液酸-核苷酸供體分子存在時接觸。可選擇地，然后可使該肽與糖基轉(zhuǎn)移酶在唾液酸-核苷酸供體分子存在時進行接觸以確保完成所有聚糖分子的SA加帽，其中糖基轉(zhuǎn)移酶是對半乳糖受體部分和唾液酸受體部分特異性的。
在另一個示例性的實施方案中，肽是根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的方法在昆蟲細(xì)胞中表達的，如sf9細(xì)胞系。當(dāng)具有N-連接的聚糖一致位點的肽在sf9細(xì)胞中表達并分泌時，該N-連接的聚糖常具有描述于圖6頂行的結(jié)構(gòu)。在分子式1的術(shù)語中X3和X5是|-GlcNAc；a和c＝0或1；b＝0；X6是巖藻糖；d＝0、1或2；且e和x＝0。
三甘露糖核心存在于由昆蟲細(xì)胞制備的絕大多數(shù)N-連接的聚糖中，且有時也存在觸角GlcNAc和/或巖藻糖殘基。注意，聚糖可以不具有核心巖藻糖，其可以具有任意一種鍵的單核心巖藻糖，或者其可以具有一種鍵占優(yōu)勢(perponderance)的單核心巖藻糖。在一個示例性的實施方案中，對在昆蟲細(xì)胞中表達并分泌的肽的N-連接的聚糖重構(gòu)為優(yōu)選地人源化的聚糖，這是通過以下步驟實現(xiàn)的首先使聚糖與對巖藻糖特異性的糖苷酶接觸，然后使聚糖與糖基化轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-GlcNAc分子存在時進行接觸，該糖基轉(zhuǎn)移酶對三甘露糖核心的每一個觸角上的甘露糖受體分子、GlcNAc供體分子是特異性的；然后使聚糖與對GlcNAc受體分子、Gal供體分子特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-Gal分子存在時進行接觸；然后使聚糖與對半乳糖受體分子、唾液酸供體分子特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-SA分子存在時進行接觸。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解如果存在一些巖藻糖分子，那么它們可在該過程的任何時候去除，且如果核心巖藻糖具有與在人聚糖中發(fā)現(xiàn)的相同的α1，6鍵，則可以使其保持完整。在另一個示例性的實施方案中，將前面例子中人源化的聚糖進一步通過使聚糖進一步與糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-巖藻糖分子存在時進行接觸以重構(gòu)為唾液酸化的Lewis X聚糖，該糖基轉(zhuǎn)移酶是對GlcNAc受體分子、巖藻糖供體分子特異性的。該過程在
圖11和實施例39中闡明。
在另外一個示例性的實施方案中，肽是根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的方法在酵母中表達的，如啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)。當(dāng)具有N-連接的聚糖一致位點的肽在啤酒糖酵母細(xì)胞中表達并分泌時，該N-連接的聚糖將具有描述于圖4中左邊的結(jié)構(gòu)。N-連接的聚糖將常常具有三甘露糖核心，這將通常由甘露糖或多達1000個殘基的相關(guān)多糖來詳細(xì)說明。在分子式1的術(shù)語中X3和X5是|-Man-Man-(Man)0-1000；a和c＝1或2；b、d、e和x＝0。
在一個示例性的實施方案中，將在酵母細(xì)胞中表達并分泌的肽的N-連接的聚糖重構(gòu)為基本的三甘露糖核心，這是通過以下步驟實現(xiàn)的首先使聚糖與對α2甘露糖分子特異性的糖苷酶接觸，然后使聚糖與對α6甘露糖分子特異性的糖苷酶接觸。該過程在圖4和實施例38中闡明。
在另一個示例性的實施方案中，對N-連接的聚糖進一步重構(gòu)以制備聚糖，該聚糖適合用于具有Fc-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性功能的重組抗體，上述重構(gòu)是通過以下步驟實現(xiàn)的使基本的三甘露糖核心聚糖與糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-GlcNAc分子存在時接觸，其中該糖基轉(zhuǎn)移酶對三甘露糖核心的每一個觸角上的甘露糖受體分子、GlcNAc供體分子是特異性的。然后使聚糖與對三甘露糖核心中部的受體甘露糖分子、GlcNAc供體分子特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-GlcNAc分子存在時進行接觸，并進一步使聚糖與對GlcNAc受體分子、Gal供體分子特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-Gal分子存在時進行接觸；然后任選地使聚糖與對半乳糖受體分子、并進一步任選對唾液酸供體分子特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-SA分子存在時進行接觸。該過程在
圖1、2和3中闡明。
在另外一個示例性的實施方案中，肽是根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的方法在細(xì)菌中表達的，特別是在大腸桿菌(E.coli)細(xì)胞中。當(dāng)具有N-連接的聚糖一致位點的肽在大腸桿菌細(xì)胞中表達時，該N-連接的一致位點將不是糖基化的。在一個示例性的實施方案中，人源化的聚糖分子是從肽主鏈中構(gòu)造的，這是通過以下步驟實現(xiàn)的使肽與對N-連接的一致位點和GlcNAc供體分子特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-GlcNAc存在時接觸；且進一步依次使生長的聚糖與對受體和供體部分特異的糖基轉(zhuǎn)移酶在必需的供體部分存在時接觸直到完成想要的聚糖結(jié)構(gòu)。當(dāng)具有N-連接的聚糖的肽在真核細(xì)胞中表達，但不具有將新生肽導(dǎo)向到高爾基體中的適當(dāng)前導(dǎo)肽時，成熟的肽可能不被糖基化。同樣在這種情況下，該肽可通過從如上述的肽N-連接的一致位點構(gòu)造N-連接的糖基化。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)用糖部分進行化學(xué)修飾時，它可如上述地進行構(gòu)造。
這些例子想要闡明本發(fā)明而不是進行限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在每一個例子中進行的步驟在一些情況下能夠以不同的順序進行而取得相同的結(jié)果。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將理解不同的步驟也可產(chǎn)生相同的聚糖。優(yōu)選地重構(gòu)的聚糖決不對表達該肽的表達系統(tǒng)是特異性的。重構(gòu)的聚糖僅是闡明性的，且本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道如何從這些例子中取得原則并將其應(yīng)用于在不同表達系統(tǒng)中產(chǎn)生的肽以制備在此處未特定描述的聚糖。
B.重構(gòu)O-連接聚糖的方法O-糖基化特征在于以O(shè)-糖苷鍵向羥基氨基酸附著了各種單糖。O-糖基化是動物和植物界中普遍的翻譯后修飾。與蛋白質(zhì)O-連接的聚糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了N-連接的聚糖。新翻譯的肽的絲氨酸或蘇氨酸殘基在高爾基體的內(nèi)側(cè)到外側(cè)區(qū)室中基本由肽基GalNAc轉(zhuǎn)移酶修飾。O-糖基化的位點不僅是由糖基轉(zhuǎn)移酶的序列特異性確定的，而且是由不同底物位點之間的競爭和與其他負(fù)責(zé)形成聚糖的糖基轉(zhuǎn)移酶之間的競爭介導(dǎo)的外遺傳調(diào)節(jié)(epigenetic regulation)確定的。
已將O-連接的聚糖人為地定義為具有3個區(qū)域核心、主鏈和外周區(qū)域。O-連接聚糖的“核心”區(qū)域是最接近肽的聚糖鏈的最內(nèi)部的2個或3個糖。主鏈區(qū)域主要組成由統(tǒng)一的延伸形成的聚糖鏈的長度。外周區(qū)域展示高度的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性。O-連接聚糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性開始于核心結(jié)構(gòu)。在大多數(shù)情況下，在O-連接聚糖一致位點添加的第一個糖殘基是GalNAc；然而該糖也可為GlcNAc、葡萄糖、甘露糖、半乳糖或巖藻糖等。
圖12是一些已知的O-連接聚糖核心結(jié)構(gòu)和負(fù)責(zé)其體內(nèi)合成的酶的圖解。
在哺乳動物細(xì)胞中，至少發(fā)現(xiàn)了8個不同的O-連接的核心結(jié)構(gòu)，全部是基于核心-α-GalNAc殘基的。在
圖13中描述的4個核心結(jié)構(gòu)是最普遍的。核心1和核心2是哺乳動物細(xì)胞中最豐富的結(jié)構(gòu)，而核心3和核心4發(fā)現(xiàn)于更加限制性和器官特征性的表達系統(tǒng)中。O-連接聚糖的綜述有Montreuil，Structure and Synthesis ofGlycopeptides，Polysaccharides in Medicinal Applications，pp.273-327，1996，Eds.Severian Damitriu，Marcel Dekker，NY，和Schachter和Brockhausen，The Biosynthesis of Branced O-LinkedGlycans，1989，Society for Experimental Biology，pp.1-26(英國)。
從本發(fā)明的公開內(nèi)容看顯而易見的是O-糖基化的肽的聚糖結(jié)構(gòu)可用與對N-連接的聚糖描述的相似的技術(shù)進行重構(gòu)。O-聚糖與N-聚糖區(qū)別在于它們連接到絲氨酸或蘇氨酸而不是天冬酰胺殘基上。如在此處關(guān)于N-聚糖重構(gòu)所描述的，水解酶可用于切割O-連接聚糖上不想要的糖部分，且額外的想要的糖然后可添加到其上，從而在肽上構(gòu)造定制的O-聚糖結(jié)構(gòu)(參見
圖12和13)。
哺乳動物細(xì)胞中O-糖基化的起始步驟是用至少11個已知的α-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶家族的任何一個附著N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，該酶的每一個均具有嚴(yán)格的受體肽特異性。通常，由每一個酶識別的受體肽組成至少10個氨基酸的序列。含有由一個特定的GalNAc-轉(zhuǎn)移酶識別的氨基酸序列的肽如果在表達該酶的細(xì)胞中表達且如果它們大致位于UDP-GalNAc也存在的高爾基體上時則變成O-糖基化的。
然而，在重組蛋白質(zhì)的情況下，GalNAc的起始附著可能不會發(fā)生。表達細(xì)胞的天然α-N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶可具有與表達的重組肽不同的一致序列特異性。
想要的重組肽可表達于不合成聚糖鏈的細(xì)菌細(xì)胞中，如大腸桿菌中。在這些情況下，在體外添加起始的GalNAc部分是有利的。一旦重組肽以可溶性的形式回收，則GalNAc部分可通過使肽與適當(dāng)?shù)腉alNAc轉(zhuǎn)移酶在UDP-GalNAc存在時接觸而在體外引入到肽上。
在一個實施方案中，可存在額外的氨基酸序列，該氨基酸序列組成用于轉(zhuǎn)移O-連接的糖的有效受體。這種氨基酸序列是由在讀框內(nèi)與肽的編碼序列融合的DNA序列編碼的，或者可選擇地可由化學(xué)方法引入。該肽另外可能缺乏聚糖鏈?？蛇x擇地，該肽可能具有N-和/或O-連接的聚糖鏈，但需要額外的糖基化位點，如當(dāng)需要額外的聚糖取代基時。
在一個示例性的實施方案中，添加氨基酸序列PTTTK-COOH作為融合標(biāo)記，該氨基酸序列是人粘蛋白MUC-1中的天然GalNAc受體序列。然后使融合蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達并純化。使該肽然后與重組的人GalNAc-轉(zhuǎn)移酶T3或T6在UDP-GalNAc存在時接觸以將GalNAc殘基在體外轉(zhuǎn)移到肽中。
肽上的聚糖鏈然后可進一步用在此處對于N-連接的或O-連接的聚糖描述的方法進行延伸?？蛇x擇地，GalNAc轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)可在UDP-GalNAc存在時進行，在UDP-GalNAc上PEG共價取代了O-3、4或6位置或N-2位置。糖綴合在別處有詳細(xì)描述。由新的肽序列引入的任何抗原性可方便地由對相關(guān)聚糖的PEG化而掩蓋。受體位點融合技術(shù)可用于不僅引入PEG部分，而且引入其他的聚糖和非聚糖部分，包括但不局限于毒素、抗感染藥、細(xì)胞毒性劑、放射性核苷酸的螯合劑和具有其他功能如組織導(dǎo)向的聚糖。
示例性實施方案O-連接糖基化的重構(gòu)是用下面分子式2進行最好的闡明的 分子式2描述了包含優(yōu)選地與肽主鏈上的絲氨酸或蘇氨酸殘基共價連接的GalNAc的聚糖結(jié)構(gòu)。盡管該結(jié)構(gòu)用于闡明最普通形式的O-連接聚糖，但不應(yīng)解釋為它將本發(fā)明僅僅局限于這些O-連接的聚糖。其他形式的O-連接聚糖闡明于
圖12中。用于本發(fā)明的優(yōu)選的表達系統(tǒng)表達并分泌具有包含GalNAc殘基的O-連接聚糖的外源肽。利用本發(fā)明的重構(gòu)方法，可對這些肽上的聚糖結(jié)構(gòu)方便地進行重構(gòu)以生成任何想要的聚糖結(jié)構(gòu)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解O-連接聚糖可用與本領(lǐng)域中一旦由本發(fā)明的公開內(nèi)容提供即可用的相同的原則、酶和反應(yīng)條件進行重構(gòu)。示例性的反應(yīng)條件可發(fā)現(xiàn)于實施例的始終。
在優(yōu)選的實施方案中，對聚糖結(jié)構(gòu)進行了重構(gòu)從而分子式2中描述的結(jié)構(gòu)具有特定的部分?？蛇x擇聚糖的結(jié)構(gòu)以增強肽的生物學(xué)活性、賦予肽新的生物學(xué)活性、去除或改變肽的生物學(xué)活性或更好地近似化天然肽的糖基化模式，以及其它。
在第一個優(yōu)選的實施方案中，對肽O-連接的聚糖進行了重構(gòu)以更好地近似化天然人類蛋白質(zhì)的糖基化模式。在該實施方案中，對描述于分子式2中的聚糖結(jié)構(gòu)進行了重構(gòu)以具有下面的部分X2是|-SA；或|-SA-SA；f和n＝0或1；X10是SA；m＝0。
該實施方案對于表達于異源細(xì)胞表達系統(tǒng)中的人類肽是特別有利的。通過將O-連接的聚糖結(jié)構(gòu)重構(gòu)為具有該構(gòu)型，可使得該肽在人患者中為較低免疫原性的和/或更穩(wěn)定的。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，對肽O-連接的聚糖進行了重構(gòu)以展示唾液酸化的Lewis X抗原。在該實施方案中，對描述于分子式2中的聚糖結(jié)構(gòu)進行了重構(gòu)以具有下面的部分X2是|-SA；X10是Fuc或|-GlcNAc(Fuc)-Gal-SA；f和n＝1m＝0。
該實施方案當(dāng)進行重構(gòu)的肽在導(dǎo)向到選擇蛋白分子和展示相同分子的細(xì)胞中最有效時是特別有利的。
在另外一個優(yōu)選的實施方案中，對肽O-連接的聚糖進行了重構(gòu)以具有綴合的部分。該綴合的部分可為PEG分子、另一個肽、小分子如藥物，以及其它。在該實施方案中，對描述于分子式2中的聚糖結(jié)構(gòu)進行了重構(gòu)以具有下面的部分X2是|-SA-R；f＝1；n和m＝0。
其中R＝綴合基團。
該實施方案可用于將肽與減慢肽從患者血流中清除的PEG分子綴合，與將兩個肽導(dǎo)向到特定的組織或細(xì)胞中的肽綴合，或與具有互補的治療應(yīng)用的另一個肽綴合。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是本發(fā)明不局限于上述的優(yōu)選的聚糖分子。優(yōu)選的實施方案僅是可用本發(fā)明的重構(gòu)方法制備的許多有用的聚糖分子中的少數(shù)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員一旦讀了本發(fā)明后則知道如何設(shè)計其他有用的聚糖。
在第一個示例性的實施方案中，肽是根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的方法在CHO(中國倉鼠卵巢細(xì)胞)中表達的。當(dāng)具有O-連接的聚糖一致位點的肽在CHO細(xì)胞中表達并分泌時，該O-連接聚糖的大多數(shù)將通常具有下面的結(jié)構(gòu)，即在分子式2的術(shù)語中，X2是|-SA；f＝1；m和n＝0。
因此，大多數(shù)CHO細(xì)胞中的聚糖不需要進行重構(gòu)以適用于人患者。在一個示例性的實施方案中，將在CHO細(xì)胞中表達并分泌的肽的O-連接聚糖通過使該聚糖與糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-巖藻糖存在時接觸而重構(gòu)為含有唾液酸化的Lewis X結(jié)構(gòu)，該糖基轉(zhuǎn)移酶對GalNAc受體部分和巖藻糖供體部分是特異性的。該過程闡述于
圖11和實施例39的N-連接聚糖中。
在另一個示例性的實施方案中，肽是根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的方法在昆蟲細(xì)胞如sf9中表達的系。當(dāng)具有O-連接的聚糖一致位點的肽在大多數(shù)sf9細(xì)胞中表達并分泌時，該O-連接聚糖的大多數(shù)具有分子式2的結(jié)構(gòu)，其中X2＝H；f＝0或1；n和m＝0。
參見如Marchal等人，(2001，Biol.Chem.382151-159)。在一個示例性的實施方案中，對在昆蟲細(xì)胞中表達的肽的O-連接聚糖通過以下步驟重構(gòu)為人源化的聚糖首先使聚糖與對GlcNAc受體分子和半乳糖供體分子特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-Gal存在時進行接觸；然后使聚糖與對Gal受體分子和SA供體分子特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-SA存在時進行接觸。在另一個示例性的實施方案中，將O-連接聚糖進一步通過使聚糖與糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-巖藻糖存在時進行接觸以從人源化的形式重構(gòu)為唾液酸化的Lewis X形式，其中該糖基轉(zhuǎn)移酶是對GalNAc受體分子和巖藻糖供體分子特異性的。
在另外一個示例性的實施方案中，肽是根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的方法在真菌中表達的，特別是啤酒糖酵母細(xì)胞中。當(dāng)具有O-連接的聚糖一致位點的肽在啤酒糖酵母細(xì)胞中表達并分泌時，該O-連接聚糖的大多數(shù)具有下面的結(jié)構(gòu)|-AA-Man-Man1-2.
參見Gemmill和Trimble(1999，Biochim.Biophys.Acta 1426227-237)。為了重構(gòu)這些O-連接聚糖以用于人類中，優(yōu)選地是將聚糖在氨基酸水平進行切割并從那里進行重構(gòu)。
在一個示例性的實施方案中，聚糖是在真菌細(xì)胞中表達的肽的O-連接聚糖，且重構(gòu)為人源化的聚糖，這是通過以下步驟實現(xiàn)的使聚糖與對氨基酸-GalNAc鍵特異性的內(nèi)切糖基化酶接觸；然后使聚糖與對O-連接的一致位點和GalNAc供體分子特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-GalNAc存在時接觸；然后使聚糖與對GalNAc受體分子和半乳糖供體分子特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-Gal存在時進行接觸；然后使聚糖與對Gal受體分子和SA供體分子特異性的糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-SA存在時進行接觸。
可選擇地，在另一個示例性的實施方案中，聚糖是在真菌細(xì)胞中表達的肽的O-連接聚糖，且重構(gòu)為人源化的聚糖，這是通過以下步驟實現(xiàn)的使聚糖與蛋白質(zhì)O-甘露糖β-1，2-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(POMGnTI)在GlcNac-核苷酸存在時接觸；然后使聚糖與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-Gal存在時接觸；然后使聚糖與唾酸轉(zhuǎn)移酶在核苷酸-SA存在時進行接觸。
在另一個示例性的實施方案中，肽是根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的方法在細(xì)菌中表達的，特別是在大腸桿菌細(xì)胞中。當(dāng)具有O-連接的聚糖一致位點的肽在大腸桿菌細(xì)胞中表達時，該O-連接的一致位點將不是糖基化的。在該情況下，想要的聚糖分子必須以與上文對啤酒糖酵母表達所描述的相似的方式從肽主鏈中構(gòu)造。進一步地，當(dāng)具有O-連接聚糖的肽在真核細(xì)胞中表達，但不具有將新生肽導(dǎo)向到高爾基體中的適當(dāng)前導(dǎo)肽時，成熟的肽可能不被糖基化。同樣在這種情況下，可通過直接從肽O-連接一致位點構(gòu)造聚糖而使O-連接的糖基結(jié)構(gòu)添加到該肽中。進一步地，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)用糖部分進行化學(xué)修飾時，它也可如上述地進行重構(gòu)。
這些例子想要闡明本發(fā)明而決不是進行限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解在每一個例子中進行的步驟在一些情況下能夠以不同的順序進行而取得相同的結(jié)果。本領(lǐng)域的技術(shù)人員也將理解不同的步驟也可產(chǎn)生相同的聚糖。進一步地，優(yōu)選地重構(gòu)的聚糖決不對表達該肽的表達系統(tǒng)是特異性的。重構(gòu)的聚糖僅是闡明性的，且本領(lǐng)域的技術(shù)人員將知道如何從這些例子中取得原則并將其應(yīng)用于在不同表達系統(tǒng)中產(chǎn)生的肽中以制備在此處未特定描述的聚糖。
C.糖綴合，一般性描述本發(fā)明提供了制備糖基化的或非糖基化的肽的綴合物的方法。本發(fā)明的綴合物是在肽和不同種類如水溶性聚合物、治療部分、診斷部分、導(dǎo)向部分等之間形成的。同樣提供的是包括通過連接體臂連接在一起的兩個或多個肽的綴合物，即多功能綴合物。本發(fā)明的多功能綴合物可包括相同肽的兩個或多個拷貝或具有不同結(jié)構(gòu)和/或性質(zhì)的不同肽的集合。
本發(fā)明的綴合物也可通過修飾的糖向糖基化的或非糖基化的肽的酶促附著而形成。當(dāng)在肽和糖上修飾基團之間插入時，該修飾的糖則變?yōu)樵诖颂幩Q的“完整糖基連接基團”。利用酶如糖基轉(zhuǎn)移酶的精確的選擇性，本發(fā)明的方法提供了在一個或多個特定位置具有想要的基團的肽。因而，根據(jù)本發(fā)明，修飾的糖是直接附著到肽鏈上選擇的位置的，或可選擇地，修飾的糖是附加到肽的糖部分上的。其中修飾的糖連接到肽的糖上和直接連接到肽主鏈的氨基酸殘基兩者上的肽也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
與已知的化學(xué)和酶促肽處理策略相反，本發(fā)明的方法使得可能組裝具有基本同質(zhì)的衍生化模式的肽和糖肽；用于本發(fā)明的酶通常對肽上特定的氨基酸殘基或氨基酸殘基的組合或者特定的聚糖結(jié)構(gòu)是選擇性的。該方法對于修飾的肽和糖肽的大規(guī)模生產(chǎn)也是可行的。因而，本發(fā)明的方法提供了大規(guī)模制備具有預(yù)選的基本統(tǒng)一的衍生化模式的肽的實用方法。該方法特別適合于對治療性肽的修飾，該治療性肽包括但不局限于在細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞(如哺乳動物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞、酵母細(xì)胞或原核細(xì)胞)或轉(zhuǎn)基因植物或動物細(xì)胞中的生產(chǎn)過程中不完全糖基化的肽。
本發(fā)明的方法也提供了具有增加的半衰期的糖基化的和非糖基化的肽綴合物，該增加的半衰期歸因于如由免疫或網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)降低的清除速率或降低的攝取速率。此外，本發(fā)明的方法提供了掩蓋肽上抗原決定簇的方法，因而降低或消除了宿主對肽的免疫反應(yīng)。導(dǎo)向劑的選擇性附著也可用于將肽導(dǎo)向?qū)υ撎囟ǖ膶?dǎo)向劑特異性的特定組織或細(xì)胞表面受體。此外，提供了一類特定地用治療部分修飾的肽。
1.綴合物在第一方面，本發(fā)明提供了肽和選擇的部分之間的綴合物。肽和選擇的部分之間的連接包括在肽和選擇的部分之間插入的完整糖基連接基團。如在此處討論的，選擇的部分基本是可附著到糖單位上的任何種類，結(jié)果導(dǎo)致可由適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)移酶識別的“修飾的糖”，該酶將修飾的糖附加到肽上。當(dāng)在肽和選擇的部分之間插入時，該修飾的糖的糖成分則變?yōu)椤巴暾腔B接基團”。該糖基連接基團是從任何單或寡糖形成的，該單或寡糖在用選擇的部分修飾之后為適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)移酶的底物。
本發(fā)明的綴合物一般將相應(yīng)于下面的通常結(jié)構(gòu)
其中符號a、b、c、d和s代表正的非0的整數(shù)；且t是0或正整數(shù)?！霸噭笔侵委焺?、生物活性試劑、可探測的標(biāo)記、水溶性部分等。該“試劑”可為肽，如酶、抗體、抗原等。連接體可為下文中廣泛的連接基團的任何一個?？蛇x擇地，該連接體可為單鍵或“零級連接體(zero order linker)”。該肽的特征是不受限制的。示例性的肽在圖28中提供。
在一個示例性的實施方案中，選擇的部分為水溶性的聚合物。該水溶性聚合物是通過完整糖基連接基團共價附著到肽上的。該糖基連接基團是共價附著到肽的氨基酸殘基或糖基殘基上的?？蛇x擇地，糖基連接基團附著到糖肽的一個或多個糖基單位上。本發(fā)明也提供了其中糖基連接基團附著到氨基酸殘基和糖基殘基兩者上的綴合物。
除提供通過酶促添加的完整糖基連接基團而形成的綴合物之外，本發(fā)明提供了其取代模式高度同質(zhì)的綴合物。利用本發(fā)明的方法，可能的是形成如下肽綴合物，其中基本所有在本發(fā)明綴合物群體中的修飾的糖部分均附著在結(jié)構(gòu)相同的氨基酸或糖基殘基的多個拷貝上。因而，在第二方面，本發(fā)明提供了具有水溶性聚合物部分群體的肽綴合物，該部分是通過完整糖基連接基團共價連接到肽上的。在本發(fā)明優(yōu)選的綴合物中，基本每一個群體成員均是通過糖基連接基團連接到肽的糖基殘基上的，且糖基連接基團所附著的肽的每一個糖基殘基均具有相同的結(jié)構(gòu)。
同樣提供的是在其上具有通過完整糖基連接基團共價連接的水溶性聚合物部分群體的肽綴合物。在優(yōu)選的實施方案中，水溶性聚合物部分群體的基本每一個成員均是通過完整糖基連接基團連接到肽的氨基酸殘基上的，且在其上附著有完整糖基連接基團的每一個氨基酸殘基均具有相同的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明也提供了與上述的類似的綴合物，其中肽是通過完整糖基連接基團與治療部分、診斷部分、導(dǎo)向部分、毒素部分等綴合的。每一個上述的部分可為小分子、天然聚合物(如肽)或合成的聚合物。
在一個示例性的實施方案中，白細(xì)胞介素-2(IL-2)是通過雙功能的連接體與運鐵蛋白綴合的，該雙功能的連接體在PEG部分的每一個末端均包括完整糖基連接基團(方案1)。例如，PEG連接體的一個末端用與運鐵蛋白附著的完整唾液酸連接體官能化，而另一個末端用與IL-2附著的完整GalNAc連接體官能化。
在另一個示例性的實施方案中，EPO與運鐵蛋白綴合。在另一個示例性的實施方案中，EPO與膠質(zhì)衍生的神經(jīng)營養(yǎng)生長因子(GDNF)綴合。在這些實施方案中，每一個綴合都是通過前述雙功能的連接體實現(xiàn)的，該雙功能的連接體在PEG部分的每一個末端均包括完整糖基連接基團。運鐵蛋白轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)通過血-腦屏障。
如在附圖中提出的，本發(fā)明的綴合物可包括單或多價(如觸角結(jié)構(gòu))的完整糖基連接基團，參見
圖14-22。本發(fā)明的綴合物也包括源自絲氨酸或蘇氨酸的O-連接聚糖的糖基連接基團(
圖11)。因而，本發(fā)明的綴合物包括兩個種類，其中選擇的部分通過單價糖基連接基團附著到肽上。本發(fā)明中同樣包括的是其中超過一個選擇的部分通過多價連接基團附著到肽上的綴合物。一種或多種蛋白質(zhì)可綴合在一起以利用其生物物理學(xué)和生物學(xué)性質(zhì)。
在另外進一步的實施方案中，本發(fā)明提供了由于作為綴合物成分的導(dǎo)向劑的存在而選擇性地定位于特定組織中的綴合物。在一個示例性的實施方案中，該導(dǎo)向劑是蛋白質(zhì)。示例性的蛋白質(zhì)包括運鐵蛋白(腦，血液庫(blood pool))、人血清(HS)-糖蛋白(骨骼，腦，血液庫)、抗體(腦，具有抗體特異性抗原的組織，血液庫)、凝固因子V-XII(損傷組織，凝塊，癌，血液庫)、血清蛋白質(zhì)如α-酸性糖蛋白、胎球蛋白、α-胎兒蛋白質(zhì)(腦，血液庫)、β2-糖蛋白(肝，動脈粥樣斑塊，腦，血液庫)、G-CSF、GM-CSF、M-CSF和EPO(免疫刺激，癌癥，血液庫，紅血細(xì)胞超量生產(chǎn)，神經(jīng)保護)及白蛋白(半衰期的增加)。
除上面討論的綴合物之外，本發(fā)明提供了制備這些和其他的綴合物的方法。因而，在進一步的方面，本發(fā)明提供了在選擇的部分和肽之間形成共價綴合物的方法。此外，本發(fā)明提供了將本發(fā)明的綴合物導(dǎo)向到身體的特定組織或區(qū)域的方法。
在示例性的實施方案中，綴合物是在水溶性聚合物、治療部分、導(dǎo)向部分或生物分子和糖基化或非糖基化的肽之間形成的。聚合物、治療部分或生物分子是通過完整糖基連接基團與肽綴合的，該完整糖基連接基團在肽和修飾基團(如水溶性聚合物)之間插入并共價地與兩者連接。該方法包括使肽與含有修飾的糖和以該修飾的糖為底物的糖基轉(zhuǎn)移酶的混合物接觸。該反應(yīng)是在足以在修飾的糖和肽之間形成共價鍵的條件下進行的。修飾的糖的糖部分優(yōu)選地選自核苷酸糖、活化的糖和既非核苷酸糖也非活化的糖的糖。
在一個實施方案中，本發(fā)明提供了通過連接基團連接兩個或多個肽的方法。連接基團具有任何有用的結(jié)構(gòu)且可選自直鏈或支鏈的結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，附著到肽上的連接體的每一個末端都包括修飾的糖(即新生的完整糖基連接基團)。
在本發(fā)明示例性的方法中，兩個肽是通過包括PEG連接體的連接體部分連接在一起的。該構(gòu)建體與在上文圖中提出的一般結(jié)構(gòu)一致。如在此處所描述的，本發(fā)明的構(gòu)建體包括兩個完整糖基連接基團(即s+t＝1)。重點描述包括兩個糖基基團的PEG連接體是為了簡明的目的，而不應(yīng)理解為限制用于本發(fā)明該實施方案中的連接體臂的特征。
因而，PEG部分在第一個末端用第一個糖基單位官能化，而在第二個末端用第二個糖基單位官能化。第一個和第二個糖基單位優(yōu)選地為不同轉(zhuǎn)移酶的底物，從而使得第一個肽和第二個肽能夠分別直角地附著到第一個和第二個肽上。在實踐中，使(糖基)1-PEG-(糖基)2連接體與第一個肽和以第一個糖基單位為底物的第一個轉(zhuǎn)移酶接觸，從而形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2。然后可選擇地將第一個轉(zhuǎn)移酶和/或未反應(yīng)的肽從反應(yīng)混合物中去除。將第二個肽和以第二個糖基單位為底物的第二個轉(zhuǎn)移酶加入到(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2綴合物中，從而形成(肽)1-(糖基)1-PEG-(糖基)2-(肽)2。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解上述的方法也可應(yīng)用于通過用如分支的PEG、dendrimer、聚(氨基酸)、多糖等在超過兩個肽之間形成綴合物。
如在前文所述的，在一個示例性的實施方案中，白細(xì)胞介素-2(IL-2)是通過雙功能的連接體與運鐵蛋白綴合的，該雙功能的連接體在PEG部分的每一個末端均包括完整糖基連接基團(方案1)。該IL-2綴合物利用綴合物更大的分子大小而具有比IL-2自身增加的體內(nèi)半衰期。此外，IL-2與運鐵蛋白的綴合選擇性地將綴合物導(dǎo)向到腦中。例如，PEG連接體的一個末端用CMP-唾液酸官能化，而另一個用UDP-GalNAc官能化。使該連接體在GalNAc轉(zhuǎn)移酶存在時與IL-2組合，從而導(dǎo)致連接體臂上的GalNAc附著到IL-2上的絲氨酸和/或蘇氨酸殘基上。
在另一個示例性的實施方案中，運鐵蛋白與核酸進行綴合以用于基因治療方案1 上述過程可進行多次循環(huán)，且不局限于用單個連接體在兩個肽之間形成綴合物。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解使位于肽的PEG(或其他的)連接體末端的完整糖基連接基團功能化的反應(yīng)可在相同的反應(yīng)容器中同時發(fā)生，或者可以逐步的方式進行。當(dāng)該反應(yīng)以逐步的方式進行時，在每一個步驟中產(chǎn)生的綴合物是可選擇地從一種或多種反應(yīng)成分(如酶、肽)中純化的。
進一步的示例性實施方案在方案2中提出。方案2表示制備將選擇的蛋白質(zhì)如EPO導(dǎo)向骨骼并增加選擇的蛋白質(zhì)的循環(huán)半衰期的綴合物的方法。
方案2 應(yīng)用PEG(或其他連接體)的反應(yīng)性衍生物將一個或多個肽部分附著于連接體上是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的。本發(fā)明不受反應(yīng)性PEG類似物的特征的限制。聚(乙二醇)的許多活化的衍生物都是商業(yè)上和文獻中可獲得的。同樣在技術(shù)人員能力范圍內(nèi)的是選擇及如果需要時合成適當(dāng)活化的PEG衍生物，利用該PEG衍生物可制備用于本發(fā)明的底物。參見Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.，7175-186(1984)；Abuchowski等人，J.Biol.Chem.，2523582-3586(1977)；Jackson等人，Anal.Biochem.，165114-127(1987)；Koide等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，111659-667(1983))，二氟乙磺酸(Nilsson等人，Methods Enzymol.，10456-69(1984)；Delgado等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，12119-128(1990))；N-羥基琥珀酰亞胺衍生的活性酯(Buckmann等人，Makromol.Chem.，1821379-1384(1981)；Joppich等人，Makromol.Chem.，1801381-1384(1979)；Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.，7175-186(1984)；Katre等人，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.，841487-1491(1987)；Kitamura等人，Cancer Res.，514310-4315(1991)；Boccu等人，Z.Naturforsch.，38C94-99(1983))、碳酸鹽(Zalipsky等人，Poly(ethylene glycol)ChemistryBiotechnical andBiomedical Applications，Harris，Ed.，Plenum Press，New York，1992，pp.347-370；Zalipsky等人，Biotechnol.Appl.Biochem.，15100-114(1992)；Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11141-152(1985))，咪唑基甲酸酯(Beauchamp等人，Anal.Biochem.，13125-33(1983)；Berger等人，Blood，711641-1647(1988))，4-二硫吡啶(Woghiren等人，Bioconjugate Chem.，4314-318(1993))，異氰酸鹽(Byun等人，ASAIO Journal，M649-M-653(1992))和環(huán)氧化物(授予Noishiki等人(1989)的U.S.Pat.No.4,806,595)。其他連接基團包括氨基基團和活化的PEG之間的氨基甲酸乙酯連接。參見Veronese等人，Appl.Biochem.Biotechnol.，11141-152(1985)。
在另一個利用反應(yīng)性PEG衍生物的示例性實施方案中，本發(fā)明提供了延伸選擇的肽的血液循環(huán)半衰期并基本上將肽導(dǎo)向到血液庫中的方法，這是通過使肽與大小足以阻礙腎小球?qū)Φ鞍踪|(zhì)(如白蛋白)的過濾的合成或天然的聚合物進行綴合而實現(xiàn)的。本發(fā)明的實施方案在方案3中闡明，其中促紅細(xì)胞生成素(EPO)利用化學(xué)和酶促修飾通過PEG連接體與白蛋白綴合。
方案3 因而，如在方案3中所示的，白蛋白的氨基酸殘基是用反應(yīng)性PEG衍生物修飾的，如X-PEG-(CMP-唾液酸))，其中X是活化基團(如活性酯、異硫氰酸酯等)。使PEG衍生物和EPO組合并與以CMP-唾液酸作為底物的轉(zhuǎn)移酶接觸。在進一步的闡明性實施方案中，使賴氨酸的ε-氨基與PEG-連接體的N-羥基琥珀酰亞胺酯反應(yīng)以形成白蛋白綴合物。使連接體的CMP-唾液酸與EPO上適當(dāng)?shù)臍埢鏕al酶促地綴合，從而形成綴合物。技術(shù)人員將理解上述方法不局限于所提出的反應(yīng)物。此外，該方法實際上可利用如具有超過兩個末端的分支連接體形成包括超過兩個蛋白質(zhì)的綴合物。
2.修飾的糖修飾的糖基供體種類(“修飾的糖”)優(yōu)選地選自修飾的糖核苷酸、活化的修飾的糖和既非核苷酸也未活化的修飾單糖的糖。任何想要的糖結(jié)構(gòu)都可用本發(fā)明的方法添加到肽上。一般地，該結(jié)構(gòu)為單糖，但本發(fā)明不局限于應(yīng)用修飾的單糖；寡糖和多糖也可應(yīng)用。
修飾的基團是通過酶方法、化學(xué)方法或其組合附著到糖部分上的，從而產(chǎn)生修飾的糖。糖是在任何使得能夠附著修飾的部分的位置取代的，且這仍然使得該糖能夠充當(dāng)用于將修飾的糖連接到肽上的酶的底物。在一個優(yōu)選的實施方案中，當(dāng)唾液酸是該糖時，使唾液酸在Pyruvyl側(cè)鏈上的9-位置或在胺部分上的5-位置用修飾基團取代，該胺部分在唾液酸中通常是乙?；?。
在本發(fā)明某些實施方案中，將修飾的糖核苷酸用于將修飾的糖添加到肽上。以其修飾的形式用于本發(fā)明中的示例性糖核苷酸包括單、二或三磷酸核苷酸或其類似物。在一個優(yōu)選的實施方案中，修飾的糖核苷酸選自UDP-糖苷、CMP-糖苷或GDP-糖苷。甚至更優(yōu)選地，修飾的糖核苷酸選自UDP-半乳糖、UDP-半乳糖胺、UDP-葡萄糖、UDP-葡糖胺、GDP-甘露糖、GDP-巖藻糖、CMP-唾液酸或CMP-NeuAc。糖核苷酸的N-乙酰胺衍生物也用于本發(fā)明的方法中。
本發(fā)明也提供了用修飾的糖合成修飾的肽的方法，如修飾的半乳糖、修飾的巖藻糖和修飾的唾液酸。當(dāng)應(yīng)用修飾的唾液酸時，唾酸轉(zhuǎn)移酶或反式唾液酸酶(僅針對α2，3-連接的唾液酸)可用于這些方法中。
在另一個實施方案中，修飾的糖是活化的糖。用于本發(fā)明的活化的修飾的糖一般為已進行合成改變以包括活化的離去基團的糖苷。如在此處所用的，術(shù)語“活化的離去基團”指那些在酶調(diào)節(jié)的親核取代反應(yīng)中易于置換的部分。許多活化的糖是本領(lǐng)域中公知的。參見如Vocadlo等人，Carbohydrate Chemistry and Biology，卷2，Ernst等人，Wiley-VCH VerlagWeinheim，德國，2000；Kodama等人，Tetrahedron Lett.346419(1993)；Lougheed等人，J.Biol.Chem.27437717(1999))。
活化基團(離去基團)的例子包括氟、氯、溴、甲苯磺酸酯(tosylate)、甲磺酸酯(mesylate)、三氟甲基磺酸酯等。用于本發(fā)明的優(yōu)選的活化的離去基團是那些不顯著地空間阻礙糖苷向受體的酶促轉(zhuǎn)移的。因此，活化的糖苷衍生物的優(yōu)選實施方案包括糖基氟化物和糖基甲磺酸酯，其中糖基氟化物是特別優(yōu)選的。在糖基氟化物中，最優(yōu)選的是α-半乳糖基氟化物、α-甘露糖基氟化物、α-葡糖基氟化物、α-巖藻糖基氟化物、α-木糖基氟化物、α-唾液酸氟化物、α-N-乙酰葡糖胺氟化物、α-N-乙酰半乳糖胺氟化物、β-半乳糖基氟化物、β-甘露糖基氟化物、β-葡糖基氟化物、β-巖藻糖基氟化物、β-木糖基氟化物、β-唾液酸氟化物、β-N-乙酰葡糖胺氟化物、β-N-乙酰半乳糖胺氟化物。
舉例來說，糖基氟化物可通過首先使糖乙?；⑷缓笥肏F/吡啶對其進行處理而從游離糖制備。這生成了熱力學(xué)上最穩(wěn)定的保護的(乙?；?糖基氟化物的異頭物(即α-糖基氟化物)。如果想要較不穩(wěn)定的異頭物(即β-糖基氟化物)，那么它可通過用HBr/HOAc或用HCl將過乙?；奶寝D(zhuǎn)變?yōu)楫愵^的溴化物或氯化物而制備。使該中間物與氟化物鹽如氟化銀反應(yīng)以生成糖基氟化物。乙酰化的糖基氟化物可通過與甲醇中溫和的(催化性的)堿(如NaOMe/MeOH)反應(yīng)而去保護。此外，許多糖基氟化物是商業(yè)上可購得的。
其他活化的糖基衍生物可用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法制備。例如，糖基甲磺酸酯可通過用甲磺酰基氯化物對糖的完全芐化的半縮醛形式進行處理并隨后通過催化加氫作用去除苯甲基基團而制備。
在進一步的示例性實施方案中，修飾的糖是具有觸角結(jié)構(gòu)的寡糖。在一個優(yōu)選的實施方案中，觸角的一個或多個末端具有修飾部分。當(dāng)一個或多個修飾部分附著到具有觸角結(jié)構(gòu)的寡糖上時，該寡糖可用于“擴增”修飾部分；每一個綴合到肽上的寡糖單位均將修飾基團的多個拷貝附著在肽上。如在上面圖中提出的本發(fā)明螯合物的一般結(jié)構(gòu)包含多價種類，該多價種類是從用觸角結(jié)構(gòu)制備本發(fā)明的綴合物中結(jié)果得到的。許多觸角糖結(jié)構(gòu)是本領(lǐng)域中公知的，且本發(fā)明的方法可不受限制地對它們實施。
示例性的修飾基團在下文討論。該修飾基團可根據(jù)一種或多種想要的性質(zhì)進行選擇。示例性的性質(zhì)包括但不局限于增強的藥物代謝動力學(xué)、增強的藥物動力學(xué)、改善的生物分配、提供多價種類、改善的水溶性、增強的或減小的親脂性和組織導(dǎo)向。
D.肽綴合物a)水溶性聚合物選擇的肽的親水性是通過與極性分子如含有胺、酯、羥基和多羥基的分子綴合而增強的。代表性的例子包括但不局限于聚賴氨酸、聚乙烯亞胺、聚(乙二醇)和聚(丙二醇)。優(yōu)選的水溶性聚合物基本為非熒光的，或僅放射少量的熒光，從而它們不適合于用作測定中的熒光標(biāo)記?？墒褂檬翘烊徊淮嬖诘奶堑木酆衔?。此外，也可應(yīng)用其他通過共價附著其他實體(如，聚(乙二醇)、聚(丙二醇)、聚(天冬氨酸)、生物分子、治療部分、診斷部分等)而修飾的天然存在的糖。在另一個示例性實施方案中，治療性的糖部分是綴合到連接體臂上的，且該糖-連接體臂隨后通過本發(fā)明的方法綴合到肽上。
使水溶性聚合物和糖活化的方法和化學(xué)物以及用于使糖和聚合物與各個種類綴合的方法描述于文獻中。常用的活化聚合物的方法包括用溴化氰、過碘酸鹽、戊二醛、二環(huán)氧化物(biepoxides)、表氯醇、二乙烯砜、碳二亞胺、磺酰鹵、三氯三嗪等對官能基團的活化(參見R.F.Taylor，(1991)，Protein ImmobilisationFundamentals andApplications，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)Chemistryof Protein Conjugation and Crosslinking，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等人，(1993)，Immobilized Affinity LigandTechniques，Academic Press，N.Y.；Dunn，R.L.等人，Eds.PolymericDrugs and Drug Delivery Systems，ACS Symposium Series Vol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)。
制備反應(yīng)性PEG分子和用反應(yīng)性分子形成綴合物的途徑是本領(lǐng)域中公知的。例如，美國專利No.5,672,662公開了聚合物酸的活性酯的水溶性和可分離的綴合物，該聚合物酸選自線性或分支的聚環(huán)氧烷、聚(氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(丙烯嗎啉)，其中聚合物具有約44個或更多的重復(fù)單位。
美國專利No.6,376,604提出了制備水溶性和非肽的聚合物的水溶性1-苯并三唑基碳酸酯的方法，該方法通過使聚合物的末端羥基與二(1-苯并三唑基)碳酸酯在有機溶劑中反應(yīng)而完成。該活性酯可用于與生物學(xué)活性劑如蛋白質(zhì)或肽形成綴合物。
WO 99/45964描述了包含生物學(xué)活性劑和活化的水溶聚合物的綴合物，所述聚合物包含具有至少一個通過穩(wěn)定鍵與聚合物主鏈連接的末端的聚合物主鏈，其中至少一個末端包含具有與分支部分連接的近端反應(yīng)性基團的分支部分，在其中生物學(xué)活性劑連接到至少一個近端反應(yīng)性基團上。其他分支的聚(乙二醇)描述于WO 96/21469中，美國專利No.5,932,462描述了與包括分支末端的分支PEG分子形成的綴合物，該分支末端包括反應(yīng)性的官能基團。游離的反應(yīng)性基團能夠與生物學(xué)活性種類如蛋白質(zhì)或肽進行反應(yīng)，從而在聚(乙二醇)和生物學(xué)活性種類之間形成綴合物。美國專利No.5,446,090描述了雙功能的PEG連接體及其在形成綴合物中的應(yīng)用，該綴合物在每一個PEG連接體末端均具有肽。
包括可降解的PEG連接的綴合物描述于WO 99/34833中和WO99/14259以及美國專利No.6,348,558中。這種可降解的連接可應(yīng)用于本發(fā)明中。
盡管反應(yīng)性的PEG衍生物和用該衍生物形成的綴合物兩者在本領(lǐng)域中均是公知的，但直到本發(fā)明，人們尚未認(rèn)識到在PEG(或其他聚合物)和其他種類如肽或糖肽之間可以通過完整糖基連接基團形成綴合物。
許多水溶性聚合物是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的且可用于本發(fā)明的實踐中。術(shù)語水溶性聚合物包含以下種類，如糖(如葡聚糖、直鏈淀粉、透明質(zhì)酸、聚(唾液酸)、類肝素、肝素等)；聚(氨基酸)，如聚(谷氨酸)；核酸；合成的聚合物(如聚(丙烯酸))；聚(醚)如聚(乙二醇)；肽；蛋白質(zhì)等。本發(fā)明可用任何水溶性的聚合物來進行，唯一的限制是該聚合物必須包括綴合物的剩余部分可附著的位點。
使聚合物活化的方法也發(fā)現(xiàn)于WO 94/17039、U.S.Pat.No.5,324,844、WO 94/18247、WO 94/04193、U.S.Pat.No.5,219,564、U.S.Pat.No.5,122,614、WO 90/13540、U.S.Pat.No.5,281,698中，且更多的為WO 93/15189，且也有方法是針對活化的聚合物和肽之間的綴合物的，如凝固因子VIII(WO 94/15625)、血紅蛋白(WO94/09027)、攜帶氧的分子(U.S.Pat.No.4,412,989)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.11141-145(1985))。
優(yōu)選的水溶性聚合物是那些其中聚合物樣品中大量比例的聚合物分子具有大約相同的分子量；這種聚合物是“單分散的”。
本發(fā)明進一步用聚(乙二醇)綴合物進行了闡明。對PEG的官能化和綴合的幾個綜述和專著是可獲得的。參見如Harris，Macronol.Chem.Phys.C25325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology13530-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol.14866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic DrugCarrier Systems 9249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6150-165(1995)；和Bhadra等人，Pharmazie，575-29(2002)。
適用于本發(fā)明的聚(乙二醇)包括但不局限于那些由下面分子式3所描述的分子式3 R＝H、烷基、芐基、芳基、縮醛、OHC-、H2N-CH2CH2-、HS-CH2CH2-、 -糖-核苷酸、蛋白質(zhì)、甲基、乙基；X、Y、W、U(獨立選擇的)＝O、S、NH、H-R’；R’、R_(獨立選擇的)＝烷基、芐基、芳基、烷基芳基、吡啶基、取代的芳基、芳基烷基、?；榛籲＝1～2000；m、q、p(獨立選擇的)＝0～20；o＝0～20；Z-HO、NH2、鹵素、S-R_、活化酯、 -糖-核苷酸、蛋白質(zhì)、咪唑、HOBT、四唑、鹵化物；和V＝HO、NH2、鹵素、S-R_、活化酯、活化酰胺、-糖-核苷酸、蛋白質(zhì)。
在優(yōu)選的實施方案中，聚(乙二醇)分子選自下面的 用于形成本發(fā)明綴合物的聚(乙二醇)是線性的或分支的。適用于本發(fā)明的分支的聚(乙二醇)包括但不局限于那些由下面分子式描述的分子式4 R’、R”、R_(獨立選擇的)＝H、烷基、芐基、芳基、縮醛、OHC-、H2N-CH2CH2-、HS-CH2CH2-、-(CH2)qCY-Z、-糖-核苷酸、蛋白質(zhì)、甲基、乙基、雜芳基、?；榛?、酰基芳基、?；榛蓟籜、Y、W、A、B(獨立選擇的)＝O、S、NH、H-R’、(CH2)1；n、p(獨立選擇的)＝1～2000；m、q、o(獨立選擇的)＝0～20；Z＝HO、NH2、鹵素、S-R_、活化酯、
-糖-核苷酸、蛋白質(zhì)；V＝HO、NH2、鹵素、S-R_、活化酯、活化酰胺、-糖-核苷酸、蛋白質(zhì)。
治療劑的體內(nèi)半衰期、曲線下面積和/或保留時間也可用水溶性聚合物如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG)來增強。例如，用PEG對蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾(PEG化)增加了其分子大小并減小了其表面可接近性和功能基團可接近性，這均依賴于在蛋白質(zhì)上附著的PEG的大小。這導(dǎo)致了血漿半衰期和蛋白水解穩(wěn)定性的改善及免疫原性和肝攝取的降低(Chaffee等人，J.Clin.Invest.891643-1651(1992)；Pyatak等人，Res.Commun.Chem.Pathol Pharmacol.29113-127(1980))。已報道白細(xì)胞介素-2的PEG化可增加在體內(nèi)的抗腫瘤能力(Katre等人，Proc.Natl.Acad. Sci.USA.841487-1491(1987))，而源自單克隆抗體A7的F(ab’)2的PEG化可改善其腫瘤定位(Kitamura等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.281387-1394(1990))。
在一個優(yōu)選的實施方案中，通過本發(fā)明的方法用水溶性聚合物衍生化的肽的體內(nèi)半衰期相對于非衍生化的肽的體內(nèi)半衰期增加了。在另一個優(yōu)選的實施方案中，通過本發(fā)明的方法用水溶性聚合物衍生化的肽的曲線下面積相對于非衍生化的肽的曲線下面積增加了。在另一個優(yōu)選的實施方案中，通過本發(fā)明的方法用水溶性聚合物衍生化的肽的保留時間相對于非衍生化的肽的保留時間增加了。確定體內(nèi)半衰期、曲線下面積和保留時間的技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的。這種技術(shù)的描述可參見J.G.Wagner，1993，Pharmacokinetics for thePharmaceutical Scientist，Technomic Publishing Company，Inc.Lancaster PA。
肽體內(nèi)半衰期的增加最好表達為該量的百分比增加范圍。該百分比增加范圍的下限是約40％、約60％、約80％、約100％、約150％或約200％。該范圍的上限是約60％、約80％、約100％、約150％或超過約250％。
在一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了PEG化的促卵泡激素(實施例23和24)。在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了PEG化的運鐵蛋白(實施例42)。
用于本發(fā)明的水溶性聚合物的其他例子包括但不局限于線性或分支的聚環(huán)氧烷、(聚氧乙基化多元醇)、聚(烯醇)、聚(丙烯嗎啉)、葡聚糖、淀粉、聚(氨基酸)等。
b)水不溶性聚合物本發(fā)明的綴合物也可包括一種或多種水不溶性的聚合物。本發(fā)明的實施方案是通過應(yīng)用綴合物作為以有控制的方式送遞治療性肽的載體來闡明的。聚合物藥物送遞系統(tǒng)是本領(lǐng)域中公知的。參見如Dunn等人，Eds.Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems，ACS SymposiumSeries Vol.469，American Chemistry Society，Washington，D.C.1991。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解基本上任何已知的藥物送遞系統(tǒng)均可應(yīng)用于本發(fā)明的綴合物。
代表性的水不溶性聚合物包括但不局限于聚膦嗪、聚乙烯醇、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亞烷類、聚丙烯酰胺、聚(亞烷基)二醇、聚環(huán)氧烷、聚亞烷基對苯二酸酯、聚乙烯醚、聚乙烯酯、聚鹵代乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙醇酸交酯、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚甲基丙烯酸丁酯、聚甲基丙烯酸異丁酯、聚甲基丙烯酸己酯、聚甲基丙烯酸異癸酯、聚甲基丙烯酸月桂酯、聚甲基丙烯酸苯酯、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸異丙酯、聚丙烯酸異丁酯、聚丙烯酸十八酯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙二醇、聚環(huán)氧乙烷、聚對苯二甲酸乙二酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、pluronics和聚乙烯苯酚及其共聚物。
用于本發(fā)明的綴合物中的合成性修飾的天然聚合物包括但不局限于烷基纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯和硝酸纖維素。合成性修飾的天然聚合物大類中特別優(yōu)選的成員包括但不局限于甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸纖維素、丙酸纖維素、乙酸丁酸纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羧甲基纖維素、三乙酸纖維素、硫酸纖維素鈉鹽及丙烯酸和甲基丙烯酸酯和藻酸的聚合物。
在此處討論的這些和其他聚合物可易于從商業(yè)來源購得，如SigmaChemical Co.(St.Louis，MO.)、Polysciences(Warrenton，PA.)、Aldrich(Milwaukee，WI.)、Fluka(Ronkonkoma，NY)和BioRad(Richmond，CA)，或者可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從自這些供應(yīng)商獲得的單體進行合成。
用于本發(fā)明的綴合物中的代表性生物可降解的聚合物包括但不局限于聚交酯、聚乙醇酸交酯及其共聚物、聚對苯二甲酸乙二酯、聚丁酸、聚戊酸、聚(丙交酯-共-己內(nèi)酯)、聚(丙交酯-共-乙內(nèi)酯)、聚酐、聚原酸酯及其混合物和共聚物。具有特別的應(yīng)用的是形成凝膠的組合物，如那些包括膠原、pluronics等的。
用于本發(fā)明的聚合物包括具有水不溶性材料的“雜合”聚合物，該水不溶性材料在其結(jié)構(gòu)的至少一部分中具有可生物再吸收的分子。這種聚合物的一個例子如下其包括具有可生物再吸收區(qū)域的水不溶性共聚物、親水區(qū)域，并且每條聚合物鏈具有多個可交聯(lián)的官能團。
對于本發(fā)明的目的，“水不溶性材料”包括在水中或含有水的環(huán)境中基本不溶解的材料。因而，盡管共聚物的某些區(qū)域或區(qū)段可為親水的或甚至水溶性的，但聚合物分子整體在水中不能在任何基本可測量的程度溶解。
對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“可生物再吸收的材料”包括能夠進行代謝或分解并由身體通過正常的排泄途徑再吸收和/或排除的區(qū)域。這種代謝物或分解產(chǎn)物優(yōu)選地對身體是基本無毒的。
可生物再吸收的區(qū)域可為疏水或親水的，只要使聚合物整體不是水可溶性的。因而，可生物再吸收的區(qū)域是基于聚合物整體保持水不溶性而優(yōu)選選擇的。因此，選擇相關(guān)的性質(zhì)(即可生物再吸收的區(qū)域含有的功能基團的種類和該區(qū)域的相對比例以及親水區(qū)域)以確保有用的可生物再吸收的組合物保持水不溶性。
示例性的可再吸收的聚合物包括如合成生產(chǎn)的可再吸收的多α-羥基-羧酸/聚氧化烯的嵌段共聚物(參見Cohn等人，美國專利No.4,826,945)。這些共聚物不是交聯(lián)的且是水溶性的，從而身體可排泄降解的嵌段共聚物組合物。參見Younes等人，J.Biomed. Mater.Res.211301-1316(1987)；和Cohn等人，J.Biomed.Mater.Res.22993-1009(1988)。
目前優(yōu)選的生物可再吸收的聚合物包括一種或多種選自聚酯、多羥基酸、聚內(nèi)酯、聚酰胺、聚酰胺酯、聚氨基酸、聚酐、聚原酸酯、聚碳酸酯、聚膦嗪、聚磷酸酯、聚硫酯、多糖及其混合物的成分。該可生物再吸收的聚合物更加優(yōu)選地包括多羥基酸成分。多羥基酸，聚乳酸、聚乙醇酸、聚己酸、聚丁酸、聚戊酸及其共聚物和混合物是優(yōu)選的。
除形成在體內(nèi)吸收的(“生物再吸收的”)片段之外，用于本發(fā)明的方法的優(yōu)選的聚合物包被物也可形成可排泄的和/或可代謝的片段。
更高級的共聚物也可用于本發(fā)明中。例如，Casey等人于1984年3月20日發(fā)表的美國專利No.4,438,253公開了從對聚乙醇酸和羥基結(jié)尾的聚(亞烷基)二醇的轉(zhuǎn)酯生產(chǎn)的三-嵌段的共聚物。將這種組合物公開以用作可再吸收的單絲縫線。這種組合物的柔性是通過將芳族原碳酸酯如四-對-甲苯基原碳酸酯整合入共聚物結(jié)構(gòu)中而控制的。
也可應(yīng)用基于乳酸和/或乙醇酸的其他包被物。例如，Spinu于1993年4月13日發(fā)表的美國專利No.5,202,413公開了生物可降解的具有連續(xù)順序的聚交酯和/或聚乙醇酸交酯嵌段的多嵌段共聚物，該嵌段共聚物是通過交酯和/或乙交酯在寡聚二醇或二胺上的開環(huán)聚合及隨后通過用雙功能的化合物進行的鏈延伸而產(chǎn)生的，該雙功能的化合物如二異氰酸酯、二?；然锘蚨裙柰?。
用于本發(fā)明的包被物的可生物再吸收區(qū)域可設(shè)計為可水解和/或酶切割的。為了本發(fā)明的目的，“可水切割”指共聚物尤其是可生物再吸收區(qū)域?qū)υ谒谢蚝沫h(huán)境中水解的易感性。類似地，“可酶切割”在此處用于指共聚物尤其是可生物再吸收區(qū)域?qū)?nèi)源或外源酶切割的易感性。
當(dāng)處于身體中時，親水區(qū)域可加工為可排泄的和/或可代謝的片段。因而，親水區(qū)域可包括如聚醚、聚環(huán)氧烷、多元醇、聚(乙烯吡咯烷)、聚乙烯醇、聚(烷基噁唑啉)、多糖、糖、肽、蛋白質(zhì)及其共聚物和混合物。此外，親水區(qū)域也可為如聚環(huán)氧烷。這種聚環(huán)氧烷可包括如聚環(huán)氧乙烷、聚環(huán)氧丙烷及其混合物和共聚物。
作為水凝膠的成分的聚合物也可用于本發(fā)明中。水凝膠是能夠吸收相對大量的水的聚合物材料。形成水凝膠的化合物的例子包括但不局限于聚丙烯酸、羧甲基纖維素鈉、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷、明膠、角叉藻聚糖和其他多糖、羥亞乙基甲基丙烯酸(HEMA)以及其衍生物等。可生產(chǎn)穩(wěn)定的、生物可降解的和可生物再吸收的水凝膠。此外，水凝膠組合物可包括展示一種或多種該性質(zhì)的亞基。
其完整性可通過交聯(lián)控制的生物相容性水凝膠組合物是公知的且目前優(yōu)選地用于本發(fā)明的方法中。例如，Hubbell等人于1995年4月25日發(fā)表的美國專利No.5,410,016和于1996年6月25日發(fā)表的5,529,914公開了水溶性系統(tǒng)，該系統(tǒng)是具有水溶性中心嵌段區(qū)段的交聯(lián)嵌段共聚物，該水溶性中心嵌段區(qū)段在兩個水解不穩(wěn)定的延伸物中夾入。這種共聚物進一步用可光聚合的丙烯酸酯官能團進行末端加帽。當(dāng)交聯(lián)后，這些系統(tǒng)變?yōu)樗z。這種共聚物的水溶性中央嵌段物可包括聚乙二醇；然而水解不穩(wěn)定的延伸物可為多α-羥基酸，如聚乙醇酸或聚乳酸。參見Sawhney等人，Macromolecules 26581-587(1993)。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，凝膠是熱可逆的(thermoreversible)凝膠。如下熱可逆的凝膠是目前優(yōu)選的，即該熱可逆的凝膠包括如pluronics、膠原、明膠、透明質(zhì)酸、多糖、聚氨基甲酸酯水凝膠、聚氨基甲酸酯-尿素水凝膠及其組合。
在另一個示例性實施方案中，本發(fā)明的綴合物包括脂質(zhì)體成分。脂質(zhì)體可根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的方法制備，如描述于Eppstein等人于1985年6月11日發(fā)表的美國專利No.4,522,811中的。例如，脂質(zhì)體可通過將適當(dāng)?shù)闹|(zhì)(如硬酰脂基磷脂酰乙醇胺、硬脂?；字Ｄ憠A、花生?；?arachadoyl)磷脂酰膽堿和膽固醇)溶解于無機溶劑中然后蒸發(fā)而制備，從而在容器表面剩余一薄層干燥的脂質(zhì)。然后將活性化合物或其藥物可接受的鹽的水溶液引入到容器中。然后用手使容器旋轉(zhuǎn)以使脂質(zhì)材料從容器的側(cè)面釋放并分散脂質(zhì)團聚體，從而形成脂質(zhì)體懸浮液。
上述的微顆粒和制備該微顆粒的方法是通過例示的方法提供的，且它們不是想要限制用于本發(fā)明的微顆粒的范圍。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是由不同方法制造的一系列微顆粒都可用于本發(fā)明中。
c)生物分子在另一個優(yōu)選的實施方案中，修飾的糖具有生物分子。在另外進一步優(yōu)選的實施方案中，該生物分子是功能蛋白質(zhì)、酶、抗原、抗體、肽、核酸(如單核苷酸或核苷、寡核苷酸、多核苷酸和單鏈和多于一條鏈的核酸)、凝集素、受體或其組合。
一些優(yōu)選的生物分子是基本無熒光的，或僅放射最小量的熒光，從而它們不適合于用作測定中的熒光標(biāo)記。其他生物分子可為熒光的。應(yīng)用其他通過共價附著另一個實體(如PEG、生物分子、治療部分、診斷部分等)而修飾的天然存在的糖是適當(dāng)?shù)?。在一個示例性的實施方案中，使作為生物分子的糖部分與連接體臂綴合，且隨后將糖-連接體臂盒與肽通過本發(fā)明的方法進行綴合。
用于本發(fā)明的實踐中的生物分子可源自任何來源。該生物分子可從天然來源分離或可由合成方法生產(chǎn)。肽可為天然的肽或突變的肽。突變可由化學(xué)誘變、定點誘變或其他本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的誘導(dǎo)突變的方法來實現(xiàn)。用于實踐本發(fā)明的肽包括如酶、抗原、抗體和受體。抗體可為多克隆或單克隆的；完整的或片段的。肽可選擇地是定向進化程序的產(chǎn)物。
源自天然的和合成的肽和核酸兩者一起均可用于本發(fā)明中；這些分子可通過任何可用的反應(yīng)基團而附著到糖基殘基成分或交聯(lián)劑上。例如，肽可通過反應(yīng)性的胺、羧基、巰基或羥基基團而附著。該反應(yīng)性基團可位于肽的末端或位于肽鏈的內(nèi)部位點。核酸可通過堿基上的反應(yīng)性基團(如環(huán)外胺)或糖部分上可用的羥基(如3’-或5’-羥基)來附著。肽和核酸鏈可進一步在一個或多個位點進行衍生化以使得能夠?qū)⑦m當(dāng)?shù)姆磻?yīng)性基團附著到鏈上。參見Chrisey等人，Nucleic AcidsRes.243031-3039(1996)。
在進一步優(yōu)選的實施方案中，選擇生物分子以將用本發(fā)明的方法修飾的肽導(dǎo)向到特定的組織中，從而相對于送遞到該組織中的未衍生化的肽的量增強肽向該組織的送遞。在另外進一步的優(yōu)選實施方案中，在選擇的時間段內(nèi)送遞到特定組織中的衍生化肽的量通過衍生化增強了至少約20％、更優(yōu)選地為至少約40％，且更加優(yōu)選地為至少約100％。目前，用于導(dǎo)向應(yīng)用的優(yōu)選的生物分子包括抗體、激素和細(xì)胞表面受體的配體。示例性的導(dǎo)向生物分子包括，但不局限于對用于將分子送遞到腦的運鐵蛋白受體特異性的抗體(Penichet等人，1999，J.Immunol.1634421-4426；Pardridge，2002，Adv.Exp.Med.Biol.513397-430)、識別前列腺的維管結(jié)構(gòu)的肽(Arap等人，2002，PNAS991527-1531)和對肺細(xì)胞膜穴樣內(nèi)陷特異性的抗體(McIntosh等人，2002，PNAS 991996-2001)。
在目前優(yōu)選的實施方案中，修飾基團是蛋白質(zhì)。在一個示例性的實施方案中，該蛋白質(zhì)是干擾素。該干擾素是抗病毒的糖蛋白，該糖蛋白在人中是由人的初級成纖維細(xì)胞在用病毒或雙鏈RNA誘導(dǎo)后分泌的。干擾素可用作治療劑，如抗病毒和對多發(fā)性硬化的治療。對于討論干擾素-β的參考文獻，參見如Yu等人，J.Neuroimmunol.，64(1)91-100(1996)；Schmidt，J.Neurosci.Res.，65(1)59-67(2001)；Wender等人，F(xiàn)olia Neuropathol.，39(2)91-93(2001)；Martin等人，Springer Semin.Immunopathol.，18(1)1-24(1996)；Takane等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.，294(2)746-752(2000)；Sburlati等人，Biotechnol.Prog.，14189-192(1998)；Dodd等人，Biochimicaet Biophysica Acta，787183-187(1984)；Edelbaum等人，J.Interferon Res.，12449-453(1992)；Conradt等人，J.Biol.Chem.，262(30)14600-14605(1987)；Civas等人，Eur.J.Biochem.，173311-316(1988)；Demolder等人，J.Biotechnol.，32179-189(1994)；Sedmak等人，J.Interferon Res.，9(Suppl1)S61-S65(1989)；Kagawa等人，J.Biol.Chem.，263(33)17508-17515(1988)；Hershenson等人，美國專利No.4,894,330；Jayaram等人，J.Interferon Res.，3(2)177-180(1983)；Menge等人，Develop.Biol.Standard.，66391-401(1987)；Vonk等人，J.Interferon Res.，3(2)169-175(1983)；和Adolf等人，J.Interferon Res.，10255-267(1990)。關(guān)于干擾素-α的參考文獻，參見Asano等人，Eur.J.Cancer，27(Suppl 4)S21-S25(1991)；Nagy等人，AnticancerResearch，8(3)467-470(1988)；Dron等人，J.Biol.Regul.Homeost.Agents，3(1)13-19(1989)；Habib等人，Am.Surg.，67(3)257-260(3/2001)；和Sugyiama等人，Eur.J.Biochem.，217921-927(1993)。
在示例性的干擾素綴合物中，干擾素β是通過連接體臂與第二個肽綴合的。該連接體臂包括完整糖基連接基團，該連接體臂是通過該完整糖基連接基團而用本發(fā)明的方法附著到第二個肽上的。該連接體臂也可選擇地包括第二個完整糖基連接基團，通過該完整糖基連接基團可附著到干擾素上。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了促卵泡激素(FSH)的綴合物。FSH是糖蛋白激素。參見如Saneyoshi等人，Biol.Reprod.，651686-1690(2001)；Hakola等人，J.Endocrinol.，158441-448(1998)；Stanton等人，Mol.Cell.Endocrinol.，125133-141(1996)；Walton等人，J.Clin.Endocrinol.Metab.，86(8)3675-3685(08/2001)；Ulloa-Aguirre等人，Endocrine，11(3)205-215(12/1999)；Castro-Fernández等人，I.J.Clin.Endocrinol.Metab.，85(12)4603-4610(2000)；Prevost，Rebecca R.，Pharmacotherapy，18(5)1001-1010(1998)；Linskens等人，The FASEBJournal，13639-645(04/1999)；Butnev等人，Biol.Reprod.，58458-469(1998)；Muyan等人，Mol.Endo.，12(5)766-772(1998)；Min等人，Endo.J.，43(5)585-593(1996)；Boime等人，RecentProgress in Hormone Research，34271-289(1999)；和Rafferty等人，J.Endo.，145527-533(1995)。FSH綴合物可以以與對干擾素描述的相似的方式形成。
在另外一個示例性實施方案中，綴合物包括促紅細(xì)胞生成素(EPO)。EPO已知介導(dǎo)低氧的反應(yīng)和刺激紅血細(xì)胞的產(chǎn)生。對于有關(guān)的參考文獻，參見Cerami等人，Seminars in Oncology，28(2)(Suppl8)66-70(04/2001)。示例性的EPO綴合物的形成方法與干擾素的綴合物類似。
在進一步示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的綴合物。G-CSF是刺激促神經(jīng)生成性(neutropoietic)祖先細(xì)胞繁殖、分化和活化以形成功能上成熟的嗜中性細(xì)胞的糖蛋白。已知注射的G-CSF將很快從身體中清除。參見如Nohynek等人，CancerCfemother.Pharmacol.，39259-266(1997)；Lord等人，ClinicalCancer Research，7(7)2085-2090(07/2001)；Rotondaro等人，Molecular Biotechnology，11(2)117-128(1999)和B_nig等人，Bone Marrow Transplatation，28259-264(2001)。示例性的G-CSF綴合物是如上文對干擾素的綴合物的描述那樣制備的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解許多其他的蛋白質(zhì)可用本發(fā)明的方法和組合物與干擾素綴合，這包括但不局限于列于表7和8(在別處提供)和圖28和圖29-57中的肽，其中提供了單獨的修飾方案。
在另外進一步的示例性實施方案中，提供了與生物素的綴合物。因而，例如選擇性生物素化的肽可通過附著具有一個或多個修飾基團的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白而制作。
在進一步優(yōu)選的實施方案中，選擇生物分子以將用本發(fā)明的方法修飾的肽導(dǎo)向到特定的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中，從而相對于送遞到該組織中的未衍生化的肽的量增強肽向該細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中的送遞。在另外進一步的優(yōu)選實施方案中，在選擇的時間段內(nèi)送遞到特定細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中的衍生化的肽的量通過衍生化增強了至少約20％、更優(yōu)選地為至少約40％，且更加優(yōu)選地為至少約100％。在另一個特別優(yōu)選的實施方案中，使生物分子通過可切割的連接體與肽進行連接，該連接體一旦內(nèi)化后即可水解。目前，用于細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)向應(yīng)用的優(yōu)選的生物分子包括運鐵蛋白、乳運鐵蛋白(乳鐵蛋白)、黑素瘤運鐵蛋白(melanotranferrin)(p97)、血漿銅藍(lán)蛋白和二價陽離子轉(zhuǎn)運蛋白，以及抗特定的血管靶標(biāo)的抗體。預(yù)期的連接包括但不局限于蛋白質(zhì)-糖-連接體-糖-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-糖-連接體-蛋白質(zhì)及其多價形式，和蛋白質(zhì)-糖-連接體-藥物，其中藥物包括小分子、肽、脂質(zhì)等。
治療劑的位點特異性和目標(biāo)導(dǎo)向的送遞是為了治療各種人類疾病的目的所想要的，該疾病如各種類型的惡性腫瘤和某些神經(jīng)病癥。這種程序是由藥物的較低副作用和較高的功效伴隨的。在設(shè)計這些送遞系統(tǒng)時依賴于各種原則。關(guān)于綜述，參見Garnett，Advanced DrugDelivery Reviews 53171-216(2001)。
在設(shè)計藥物送遞系統(tǒng)中一個重要的考慮是目標(biāo)組織特異性。腫瘤表面抗原的發(fā)現(xiàn)使得可能發(fā)展治療方法，在該治療方法中展示限定的表面抗原的腫瘤細(xì)胞是特異性地導(dǎo)向并被殺死的。主要有3類在人類臨床治療惡性腫瘤的實驗中證明有效的治療性單克隆抗體(抗體)(1)未綴合的MAb，它可直接誘導(dǎo)生長抑制和/或細(xì)胞程序死亡，或者間接地活化宿主的防御機制以介導(dǎo)抗腫瘤細(xì)胞毒性；(2)藥物綴合的MAb，它優(yōu)選地將有力的細(xì)胞毒素送遞到腫瘤細(xì)胞中因而使通常與常規(guī)治療相關(guān)的全身性細(xì)胞毒性最小化；和(3)放射性同位素綴合的MAb，它將無菌劑量的放射物送遞到腫瘤中。參見Reff等人，CancerControl 9152-166(2002)的綜述。
為了使MAb具有殺死惡性細(xì)胞的能力，可使MAb與毒素連接，該毒素可從植物、細(xì)菌或真菌來源獲得，從而形成稱為免疫毒素的嵌合蛋白質(zhì)。常用的植物毒素分為兩類(1)全毒素(或II類核糖體失活蛋白)，如蓖麻毒蛋白、相思豆毒蛋白、槲寄生凝集素和modeccin，和(2)半毒素(I類核糖體失活蛋白)，如美洲商陸抗病毒蛋白(PAP)、皂角素、Bryodin 1、bouganin和gelonin。常用的細(xì)菌毒素包括白喉毒素(DT)和假單胞菌外毒素(PE)。Kreitman，Current PharmaceuticalBiotechnology 2313-325(2001)。其他預(yù)期用于本發(fā)明的毒素包括，但不局限于表2中所示的毒素。
表2.毒素。



























1WO-09739025；US-60254662EP-00626383 30 November 19943JP-101016764WO-09705162；WO-09717364(dolastatin synthesis and analogs)5Kosan licensed patent for Epothilone analogs from Sloan-Kettering；US 001859686WO-097232117WO-097232118JP-080922329WO-0963321110EP-00608111；EP-00632042；EP-00634414；WO-0974827811EP-00425235；JP-5312469212US-05416064；US-05208020；EP-00425235B13EP-004252351 JP-53124692；US-06333410B114JP-110418315EP-0068984516EP-0068984517EP-00136791；EP-0008795718US 50001112；US 514390619WO-00136048
常規(guī)的免疫毒素含有與毒素化學(xué)綴合的MAb，對該毒素進行了突變或化學(xué)修飾以使與正常細(xì)胞的結(jié)合最小化。例子包括導(dǎo)向CD5的抗-B4-阻斷的蓖麻毒蛋白和導(dǎo)向CD22的RFB4-去糖基化的蓖麻毒蛋白A鏈。最近發(fā)展的重組免疫毒素是嵌合蛋白質(zhì)，該嵌合蛋白質(zhì)由用重組DNA技術(shù)融合到蛋白質(zhì)毒素上的抗腫瘤抗原的抗體的可變區(qū)組成。該毒素也經(jīng)常進行基因工程修飾以去除正常組織的結(jié)合位點但保持其細(xì)胞毒性。大量的分化抗原、超量表達的受體或癌癥特異性抗原已鑒定為免疫毒素的靶標(biāo)，如CD19、CD22、CD20、IL-2受體(CD25)、CD33、IL-4受體、EGF受體及其突變體、Erβ2、Lewis糖、mesothelin、運鐵蛋白受體、GM-CSF受體、Ras、Bcr-Abl和c-Kit，以用于治療各種惡性腫瘤，包括造血細(xì)胞癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和乳、結(jié)腸、子宮、膀胱和胃腸癌。參見如Brinkmann等人，Expert Opin.Biol.Ther.1693-702(2001)；Perentesis和Sievers，Hematology/Oncology Clinics ofNorth America 15677-701(2001)。
將與放射性同位素綴合的MAb用作另一種治療人類惡性腫瘤的方法，特別是造血細(xì)胞惡性腫瘤，該方法具有高水平的特異性和效力。用于治療的最常用的同位素是高能量的發(fā)射物，如131I和90Y。最近，213Bi標(biāo)記的抗-CD33人源化MAb也已在I期人臨床實驗中進行了檢驗。Reff等人，見上文。
已將許多MAb用于治療目的。例如，用于治療某些造血細(xì)胞惡性腫瘤的重組嵌合抗-CD20MAb即rituximab(RituxanTM)的應(yīng)用已于1997年獲得FDA的批準(zhǔn)。從那時起已獲準(zhǔn)用于治療人類癌癥的其他MAb包括一種人源化的大鼠抗CD52抗體alemtuzumab(Campath-1HTM)；和一種加利車霉素綴合的人源化小鼠抗CD33的MAb gemtuzumabozogamicin(MylotargTM)。目前FDA也檢查了幾種其他的用于位點特異性送遞細(xì)胞毒性劑或放射物目的的MAb的安全性和功效，如放射性標(biāo)記的ZevalinTM和BexxarTM。Reff等人，見上文。
在設(shè)計藥物送遞系統(tǒng)中第二個重要的考慮是目標(biāo)組織對治療劑的可接近性。這是在治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的疾病中特別要考慮的情況，因為血-腦屏障防止了大分子的擴散。已發(fā)展了幾種方法已繞開血-腦屏障而將治療劑有效地送遞到CNS。
對從血漿到腦的鐵轉(zhuǎn)運機制的理解提供了繞開血-腦屏障(BBB)的有用工具。由運鐵蛋白在血漿中轉(zhuǎn)運的鐵是幾乎所有類型細(xì)胞的基本成分。腦需要鐵以進行代謝過程并通過位于腦毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞上的運鐵蛋白受體經(jīng)受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)胞吞作用和內(nèi)吞作用而接受鐵。Moos和Morgan，Cellular and Molecular Neurobiology 2077-95(2000)。已確立了有效地將肽、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)體送遞到腦中的基于運鐵蛋白-運鐵蛋白受體相互作用的送遞系統(tǒng)。例如，可以使肽與抗運鐵蛋白受體的MAb偶聯(lián)以獲得更大的腦攝取，Moos和Morgan，見上文。類似地，當(dāng)與抗運鐵蛋白受體的MAb偶聯(lián)時，堿性成纖維生長因子(bFGF)跨過血-腦屏障的轉(zhuǎn)運得到了增強。Song等人，The Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics 301605-610(2002)；Wu等人，Journal of Drug Targeting 10239-245(2002)。此外，已報道了有效將化療藥物阿霉素轉(zhuǎn)運到C6神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的脂質(zhì)體送遞系統(tǒng)，其中將運鐵蛋白附著到脂質(zhì)體PEG鏈上的遠(yuǎn)端。Eavarone等人，J.Biomed.Mater.Res.5110-14(2000)。許多美國專利也涉及基于運鐵蛋白-運鐵蛋白受體相互作用的繞開血-腦屏障的送遞方法。參見如美國專利No.5,154,924、5,182,107、5,527,527、5,833,988、6,015,555。
對于繞開血-腦屏障的藥物試劑有其他適當(dāng)?shù)木Y合物配偶體。例如，美國專利No.5,672,683、5,977,307和WO 95/02421涉及將神經(jīng)藥物試劑跨過血-腦屏障送遞的方法，其中該試劑是以與配體的融合蛋白的形式給予的，該配體可以與腦的毛細(xì)管內(nèi)皮細(xì)胞受體反應(yīng)；WO99/00150描述了一種藥物送遞系統(tǒng)，其中藥物跨過血-腦屏障的轉(zhuǎn)運是通過與抗人胰島素受體的MAb綴合而促進的；WO 89/10134描述了嵌合的蛋白質(zhì)，該嵌合蛋白質(zhì)包括能夠以相對高的速率跨過血-腦屏障的肽及不能進行轉(zhuǎn)胞吞作用的親水神經(jīng)肽，從而作為一種將親水神經(jīng)肽引入到腦中的方法；WO 01/60411提供了一種可容易地將藥物活性成分轉(zhuǎn)運入腦中的藥物組合物。該活性成分結(jié)合到用作綴合物的冬眠特異性蛋白質(zhì)上，并與甲狀腺激素或促進甲狀腺激素產(chǎn)生的物質(zhì)一起給予。此外，已探究了用于繞開血-腦屏障的可選擇的藥物送遞途徑。例如，無需綴合的治療劑的鼻內(nèi)給予已顯示是有前途的可選擇的送遞方法(Frey，2002，Drug Delivery Technology，2(5)46-49)。
除促進藥物跨過血-腦屏障的轉(zhuǎn)運之外，運鐵蛋白-運鐵蛋白受體相互作用也可用于某些腫瘤細(xì)胞的特異性導(dǎo)向，這是因為許多腫瘤細(xì)胞在其表明超量表達運鐵蛋白。該策略已用于通過運鐵蛋白綴合物將生物活性大分子送遞入K562細(xì)胞中(Wellhoner等人，The Journal ofBiological Chemistry 2664309-4314(1991))，以及用于通過運鐵蛋白綴合物將胰島素送遞入類腸細(xì)胞(enterocyte-like)Caco-2細(xì)胞中(Shah和Shen，Journal of Pharmaceutical Sciences 851306-1311(1996))。
此外，由于對鐵轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)的功能及其表達模式有了更多的了解，如乳運鐵蛋白受體、黑素瘤運鐵蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白和二價陽離子轉(zhuǎn)運蛋白，已發(fā)現(xiàn)一些參與鐵轉(zhuǎn)運機制的蛋白質(zhì)(如黑素瘤運鐵蛋白)或其片段在輔助治療劑跨過血-腦屏障轉(zhuǎn)運或?qū)蛱囟ǖ慕M織中具有相似的效率(WO 02/13843 A2、WO 02/13873 A2)。對于藥物送遞中參與鐵攝取的運鐵蛋白和相關(guān)蛋白質(zhì)作為綴合物的應(yīng)用的綜述，參見Li和Qian，Medical Research Reviews 22225-250(2002)。
治療劑的組織特異性送遞的概念不只局限于運鐵蛋白和運鐵蛋白受體或其相關(guān)蛋白質(zhì)之間的相互作用。例如，已描述了骨骼特異性的送遞系統(tǒng)，其中蛋白質(zhì)是與親骨的氨基二磷酸綴合以改善蛋白質(zhì)向礦化組織的送遞的。Uludag和Yang，Biotechnol.Prog.18604-611(2002)。關(guān)于該主題的綜述，參見Vyas等人，Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier System 181-76(2001)。
各種連接體可用于生成用于治療劑的特異性送遞目的的生物綴合物的方法中。適當(dāng)?shù)倪B接體包括同雙功能和異雙功能的交聯(lián)試劑，該試劑為可由如酸催化的解離切割的或不可切割的(參見如Srinivasachar和Neville，Biochemistry 282501-2509(1989)；Wellhoner等人，The Journal of Biological Chemistry 2664309-4314(1991))。任何已知的結(jié)合配偶體如生物素和抗生物素蛋白/鏈霉抗生物素蛋白之間的相互作用也可用于將治療劑和綴合物配偶體結(jié)合的方法，從而確保治療劑的特異性且有效的送遞。利用本發(fā)明的方法，蛋白質(zhì)可用于將分子與綴合物送遞到細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中。結(jié)合到特定的細(xì)胞表面受體上的蛋白質(zhì)、肽、激素、細(xì)胞因子、小分子等可用于對綴合的治療性化合物的細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)向，該特定的細(xì)胞表面受體在配體結(jié)合后可內(nèi)化。一般地，受體-配體復(fù)合物將依賴于由受體導(dǎo)向的細(xì)胞內(nèi)位置而內(nèi)化到送遞到特定細(xì)胞區(qū)室中的細(xì)胞內(nèi)小泡中，該細(xì)胞區(qū)室包括但不局限于核、線粒體、高爾基體、ER、溶酶體和內(nèi)體中。通過使受體配體與想要的分子綴合，可將藥物攜帶于受體-配體復(fù)合物中并送遞到該受體正常導(dǎo)向的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中。因此，該藥物可送遞到細(xì)胞的特定細(xì)胞內(nèi)位置，它需要在該位置治療疾病。
許多蛋白質(zhì)可用于將治療劑導(dǎo)向到特定的組織和器官中。導(dǎo)向蛋白質(zhì)包括但不局限于生長因子(EPO、HGH、EGF、神經(jīng)生長因子、FGF等)，細(xì)胞因子(GM-CSF、G-CSF、干擾素家族、白細(xì)胞介素等)、激素(FSH、LH、類固醇家族、雌激素、皮質(zhì)類固醇、胰島素等)、血清蛋白質(zhì)(白蛋白、脂蛋白、胎蛋白、人血清蛋白質(zhì)、抗體和抗體片段等)和維生素(葉酸、維生素C、維生素A等)。對大多數(shù)細(xì)胞類型上受體特異性的導(dǎo)向劑是可購得的。
預(yù)期的連接構(gòu)型包括但不局限于蛋白質(zhì)-糖-連接體-糖-蛋白質(zhì)及其多價形式、蛋白質(zhì)-糖-連接體-蛋白質(zhì)及其多價形式、蛋白質(zhì)-糖-連接體-治療劑，其中該治療劑包括但不局限于小分子、肽和脂質(zhì)。在一些實施方案中，應(yīng)用一旦內(nèi)化后即水解的可水解連接體。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)綴合物內(nèi)化入具有酸性pH的內(nèi)體或溶酶體對，可應(yīng)用酸不穩(wěn)定的連接體以得到優(yōu)勢。一旦內(nèi)化入內(nèi)體或溶酶體中，連接體則被水解且治療劑從導(dǎo)向劑中釋放。
在一個示例性的實施方案中，運鐵蛋白通過連接體綴合到想要導(dǎo)向到患者細(xì)胞中的酶或編碼該酶的核酸載體上，該細(xì)胞展示運鐵蛋白受體。該患者可需要對該特定的酶的酶置換治療。在特別優(yōu)選的實施方案中，該酶是具有溶酶體貯積病的患者中缺乏的(參見表5)。一旦進入循環(huán)后，運鐵蛋白-酶綴合物可與運鐵蛋白受體連接并在早期內(nèi)體中內(nèi)化(Xing等人，1998，Biochem.J.336667；Li等人，2002，Trends in Pharmacol.Sci.23206；Suhaila等人，1998，J.Biol.Chem.27314355)。與運鐵蛋白相關(guān)的其他預(yù)期的導(dǎo)向劑包括但不局限于乳運鐵蛋白(乳鐵蛋白)、黑素瘤運鐵蛋白(p97)、血漿銅藍(lán)蛋白和二價陽離子轉(zhuǎn)運蛋白。
在另一個示例性實施方案中，運鐵蛋白-肌營養(yǎng)不良蛋白綴合物將通過運鐵蛋白途徑進入內(nèi)體中。一旦在內(nèi)體中后，肌營養(yǎng)不良蛋白則由于可水解的連接體而釋放，然后可將它們帶到需要它們的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室中。該實施例可用于通過用與運鐵蛋白連接的有功能的肌營養(yǎng)不良蛋白補充遺傳缺陷的肌營養(yǎng)不良蛋白基因和/或蛋白質(zhì)而治療患有肌營養(yǎng)不良的患者。
E.治療部分在另一個優(yōu)選的實施方案中，修飾的糖包括治療部分。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解在治療部分和生物分子的范疇之間有重疊；許多生物分子具有治療性質(zhì)或潛力。
治療部分可為已接受用作臨床應(yīng)用的試劑，或者它們可為在實驗中的藥物，或其活性或作用機制在研究之中。治療部分在給定的疾病狀態(tài)中具有已證實的作用，或可僅僅假設(shè)在給定的疾病狀態(tài)中顯示想要的作用。在優(yōu)選的實施方案中，治療部分是化合物，該化合物是根據(jù)其與選定的組織相互作用的能力選擇的。用于實踐本發(fā)明的的治療部分包括來自廣泛藥物種類的藥物，該藥物種類具有各種藥物學(xué)活性。在一些實施方案中，優(yōu)選的是應(yīng)用非糖的治療部分。該優(yōu)選性的一個例外是應(yīng)用通過共價附著到另一個實體上的糖，該實體如PEG、生物分子、治療部分、診斷部分等。在一個示例性的實施方案中，將反義核酸部分綴合到附著于導(dǎo)向部分的連接體臂上。在另一個示例性的實施方案中，治療性糖部分是綴合到連接體臂上的，且糖-連接體臂盒隨后通過本發(fā)明的方法與肽綴合。
使治療和診斷試劑與各種其他種類綴合的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。參見如Hermanson，Bioconjugate Techniques，AcademicPress，San Diego，1996；和Dunn等人，Eds.Polymeric Drugs AndDrug Delivery Systems，ACS Symposium Series Vol.469，AmericanChemical Society，Washington，D.C.1991。
在一個示例性的實施方案中，治療部分是通過在選擇的條件下可進行切割的鍵附著到修飾的糖上的。示例性的條件包括但不局限于選擇的pH(如胃、腸、內(nèi)吞噬泡)、活性酶的存在(如酯酶、蛋白酶、還原酶、氧化酶)、光、熱等。許多可切割的基團是本領(lǐng)域中公知的。參見如Jung等人，Biochem.Biophys.Acta，761152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.26514518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.，124913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.，155141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.261205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.，1431859-1867(1989)。
有用的治療部分的種類包括如非類固醇的抗炎癥藥物(NSAIDS)。NSAIDS可選自下面的種類(如丙酸衍生物、乙酸衍生物、fenamicacid衍生物、二苯基羧酸衍生物和oxicams)；類固醇抗炎癥藥物，包括氫化可的松等；佐劑；抗組胺藥物(如氯屈米、曲普利啶)；止咳藥(如右旋甲嗎喃、可待因、卡拉美芬和噴托維林)；抗瘙癢藥物(如甲地嗪和阿利馬嗪)；抗膽堿能藥物(如莨菪胺、阿托品、后馬托品、左旋多巴)；抗催吐和抗惡心藥(如賽克力嗪、美克洛嗪、氯丙嗪、布克力嗪)；厭食藥物(如芐非他明、芬特明、對氯苯丁胺、芬氟拉明)；中央刺激藥物(如苯丙胺、脫氧麻黃堿、右苯丙胺和哌甲酯)；抗節(jié)律紊亂藥物(如普萘洛爾、普魯卡因酰胺、丙吡胺、奎尼定、恩卡尼)；β-腎上腺素能阻斷藥物(如美托洛爾、醋丁洛爾、倍他洛爾、拉貝洛爾和噻嗎洛爾)；強心藥(如米力農(nóng)、氨力農(nóng)和多巴酚丁胺)；抗高血壓藥(如依那普利、cloidine、肼曲嗪、米諾地爾、胍那決爾、胍乙啶)；利尿藥物(如阿米洛利和氫氯噻嗪)；血管舒張藥物(如diltiazem、胺碘酮、異克舒令、布酚寧、妥拉唑林和維拉帕米)；血管收縮藥物(如二氫麥角胺、麥角胺和美西麥角(methylsergide))；抗?jié)兯幬?如雷尼替丁和西咪替丁)；麻醉藥物(如利度卡因、布比卡因、氯普魯卡因、地布卡因)；抗抑郁藥物(如丙咪嗪、地昔帕明、阿米替林(amitryptiline)、去甲替林(nortryptiline))；安定藥和鎮(zhèn)靜藥物(如氯氮_、胃復(fù)康(benacytyzine)、苯喹胺、氟西泮、羥嗪、洛沙平和丙嗪；抗精神病藥物(如氯普噻噸、氟奮乃靜、氟哌啶醇、嗎茚酮、硫利達嗪和三氟拉嗪)；抗微生物藥物(如抗細(xì)菌的、抗真菌的、抗原生動物的和抗病毒的藥物)。
有用的治療部分種類包括佐劑。該佐劑可選自如匙孔血藍(lán)蛋白綴合物、單磷酰脂質(zhì)A、源自支原體的脂肽MALP-2、霍亂毒素B亞基、大腸桿菌熱不穩(wěn)定性毒素、來自破傷風(fēng)類毒素的通用T輔助細(xì)胞抗原決定部位、白細(xì)胞介素-12、CpG寡脫氧核苷酸、二甲基二(十八烷基)溴化銨、環(huán)化糊精、鯊烯、鋁鹽、腦膜炎球菌外膜小泡(OMV)、montanideISA、TiterMaxTM(購自Sigma，St.Louis MO)、硝酸纖維素吸收物、免疫刺激復(fù)合物如Quil A、GerbuTM佐劑(Gerbu Biotechnik，Kirchwald，德國)、蘇氨酰胞壁酰二肽、胸腺素α、布比卡因、GM-CSF、不完全弗氏佐劑、MTP-PE/MF59(Ciba/Geigy，Basel，瑞士)、聚磷腈、源自皂樹Quillaja saponaria的皂苷和Syntex佐劑制劑(Biocine，Emeryville，CA)，以及其它本領(lǐng)域眾所周知的。
優(yōu)選地整合入本發(fā)明的組合物的抗微生物藥物包括如β-內(nèi)酰胺藥物的藥物可接受鹽、喹喏酮藥物、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、四環(huán)素、紅霉素、阿米卡星、三氟生、強力霉素、卷曲霉素、氯己定、金霉素、羥四環(huán)素、氯林肯霉素、乙胺丁醇、己脒定異硫代硫酸鹽(hexamidineisothionate)、甲硝基羥乙唑、噴他脒、艮他霉素、卡那霉素、lineomycin、甲烯土霉素、六胺、二甲胺四環(huán)素、新霉素、奈替米星(netilmycin)、巴龍霉素、鏈霉素、妥布拉霉素、霉抗唑和金剛胺。
其他用于本發(fā)明的實踐中的藥物部分包括抗腫瘤藥物(如，抗雄激素物質(zhì)(如亮丙立德或氟他胺)、殺細(xì)胞的試劑(如andriamycin、阿霉素、紫杉醇、環(huán)磷酰胺、白消安、順式鉑氨、β-2-干擾素)、抗雌激素物質(zhì)(如三苯氧胺)、抗代謝物(如氟尿嘧啶、氨甲蝶呤、巰基嘌呤、硫代鳥嘌呤)。在該類中同樣包括的是用于診斷和治療兩者的基于放射性同位素的試劑及綴合的毒素，如蓖麻毒蛋白、格爾德霉素、mytansin、CC-1065、C-1027、倍癌霉素、刺胞霉素及其相關(guān)結(jié)構(gòu)和類似物，以及列于表2中的毒素。
治療部分也可為激素(如6α-甲基-17α-孕甾酮、雌二醇、亮丙立德、甲地孕酮、生長抑素八肽或促生長素抑制素)；肌肉松弛藥物(如桂麻黃堿、環(huán)苯扎林、黃酮哌酯、奧芬那君、paraverine、美貝維林、異達維林、利托君、地芬諾酯、硝苯呋海因和阿珠莫林(azumolen))；鎮(zhèn)痙藥物；骨骼活化藥物(如二磷酸鹽和膦?；榛戊⑺猁}(phosphonoalkylphosphinate)藥物化合物)；內(nèi)分泌調(diào)節(jié)藥物(如避孕藥(如ethinodiol、乙炔基雌二醇、炔諾酮、美雌醇、去氧孕烯、6α-甲基-17α-孕甾酮)、糖尿病調(diào)節(jié)劑(如格列本脲或氯磺丙脲)、合成代謝物如睪內(nèi)酯或司坦唑醇、雄激素(如甲基睪酮、睪酮或氟甲睪酮)、抗利尿劑(如去氨加壓素)和降鈣素)。
同樣用于本發(fā)明的是雌激素(如乙菧酚)、糖皮質(zhì)激素(如氟羥脫氫皮甾醇、倍他米松等)和孕酮，如炔諾酮、炔諾醇(ethynodiol)、炔諾酮、左炔諾孕酮；甲狀腺試劑(如碘噻羅寧或左甲狀腺素)或抗甲狀腺試劑(如甲巰咪唑)；抗高催乳素血癥藥物(如卡麥角林)；激素抑制劑(如達那唑或戈舍瑞林)、催產(chǎn)素(如甲麥角新堿或催產(chǎn)素)和前列腺素，如mioprostol、前列地爾或地諾前列酮。
其他有用的修飾基團包括免疫調(diào)節(jié)藥物(如抗組胺、肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑如洛度沙胺和/或色甘酸(cromolyn)，類固醇(如氟羥脫氫皮甾醇、倍氯米松(beclomethazone)、可的松、地塞米松、強的松龍、甲基強的松龍、倍氯米松(beclomethasone)或氯倍他松)、組胺H2拮抗劑(如法莫替丁、甲腈咪胍、雷尼替丁)、免疫抑制劑(如硫唑嘌呤、環(huán)孢菌素)等。也可應(yīng)用具有抗炎癥活性的種類，如舒林酸、依托度酸、酮洛芬和酮咯酸。用于本發(fā)明的綴合中的其他藥物對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
有用的治療部分的種類包括如反義藥物，且也包括裸DNA。反義藥物可選自如Affinitak(ISIS，Carlsbad，CA)和GenasenseTM(購自Genta，Berkeley Heights，NJ)。裸DNA例如可以與編碼如治療血友病的凝血因子VIII和IX的DNA一起作為基因治療劑進行送遞。
F.修飾的糖的制備用于形成本發(fā)明的綴合物的修飾的糖在此處討論。為了闡明的清晰，該討論集中在制備用水溶性聚合物修飾的糖上。特別地，該討論集中在包括聚(乙二醇)部分的修飾的糖的制備上。技術(shù)人員將理解在此處提出的方法可廣泛應(yīng)用于修飾的糖的制備上，因此，該討論不應(yīng)認(rèn)為是對本發(fā)明范圍的限制。
通常，糖部分和修飾基團是通過反應(yīng)性基團的應(yīng)用而連接在一起的，該反應(yīng)性基團一般被連接方法轉(zhuǎn)化到新的有機官能基團或非反應(yīng)性種類。該糖反應(yīng)性官能基團位于糖部分上的任何位置。反應(yīng)性基團和用于實踐本發(fā)明的反應(yīng)類型通常是那些生物綴合物化學(xué)領(lǐng)域中眾所周知的。目前占優(yōu)勢的對反應(yīng)性糖部分可用的反應(yīng)類型是那些在相對溫和的條件下進行的。這些包括但不局限于親核取代(如胺和醇與?；u化物、活性酯的反應(yīng))、親電取代(如烯胺反應(yīng))和對碳-碳和碳-雜原子重鍵的加成(如Michael氏反應(yīng)、Diels-Alder加成)。這些和其他有用的反應(yīng)的討論可見于如Smith和March，Advanced OrganicChemistry，5thEd.，John Wiley & Sons，New York，2001；Hermanson，Bioconjugate Techniques，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等人，Modification of Proteins；Advances in ChemistrySeries，Vol.198，American Chemical Society，Washington，D.C.，1982。
在糖核心或修飾基團中伸出(pendent)的有用反應(yīng)性功能基團包括，但不局限于(a)羧基基團及其各種衍生物，包括但不局限于N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基苯并三唑酯、酸性鹵化物、?；溥?、硫酯、對硝基苯酯、烷基、鏈烯基、炔基和芳香基酯；(b)羥基基團，該基團可轉(zhuǎn)變?yōu)槿珲ァ⒚?、醛等?br> (c)鹵烷基基團，其中鹵化物后來可用親核基團替代，如胺、羧酸鹽陰離子、硫醇陰離子、負(fù)碳離子或醇鹽離子，從而導(dǎo)致新的基團在鹵素原子官能基團上的共價附著；(d)親雙烯體基團，該基團能夠參與Diels-Alder反應(yīng)，如馬來酰亞胺基(maleimido)基團；(e)醛或酮基團，從而隨后通過形成羰基衍生物或通過如Grignard加成或烷基鋰加成的機制進行衍生是可能的，該羰基衍生物如亞胺、腙、縮氨基脲或肟；(f)用于隨后與胺反應(yīng)以形成例如氨磺酰的磺酰基鹵化物基團；(g)硫醇基團，該基團可轉(zhuǎn)變?yōu)槿缍蚧锘蚺c烷基和酰基鹵化物反應(yīng)；(h)胺或硫氫基團，該基團可進行如?；?、烷基化或氧化；(i)鏈烯，該鏈烯可進行如環(huán)加成、?；?、Michael加成等；和(j)環(huán)氧化物，該環(huán)氧化物可與如胺和羥基化合物反應(yīng)。
可這樣選擇官能基團，從而使得它們不參與或不干擾組裝反應(yīng)性糖核心或修飾基團所必需的反應(yīng)。可選擇地，可對反應(yīng)性官能基團通過在保護基團存在時進行保護以防止其參與反應(yīng)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解如何保護特定的官能基團，從而使其不干擾選定的一套反應(yīng)條件。對于有用的保護基團的例子，參見如Greene等人，Protective Groupsin Organic Synthesis，John Wiley & Sons，New York，1991。
在下面的討論中，提出了許多修飾的糖的特定的例子，該修飾的糖可用于本發(fā)明的實踐中。在一個示例性的實施方案中，將唾液酸衍生物用作在其上附著修飾基團的糖核心。側(cè)重于對唾液酸衍生物的討論僅僅是為了闡明清晰的目的，且不應(yīng)該解釋為對本發(fā)明范圍的限制。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解各種其他的糖部分可以以與用唾液酸作為例子提出的相似的方式進行活化和衍生化。例如，許多修飾半乳糖、葡萄糖、N-乙酰半乳糖胺和巖藻糖的方法是可用的，這些糖僅是少數(shù)提到的底物，它們可易于用本領(lǐng)域認(rèn)可的方法進行修飾。參見如Elhalabi等人，Curr.Med.Chem.693(1999)；和Schafer等人，J.Org.Chem.6524(2000)。
在一個示例性的實施方案中，通過本發(fā)明的方法修飾的肽是在哺乳動物細(xì)胞(如CHO細(xì)胞)中或在轉(zhuǎn)基因動物中產(chǎn)生的肽，因而含有不完全唾液酸化的N-和/或O-連接的寡糖鏈。該糖肽的缺少唾液酸和含有末端半乳糖殘基的寡糖鏈可以進行PEG化、PPG化或用修飾的唾液酸進行修飾。
在方案4中，用保護的氨基酸(如甘氨酸)衍生物的活性酯處理甘露糖胺糖苷1，從而將糖胺殘基轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的保護的氨基酸酰胺加合物。將該加合物用醛縮酶處理以形成唾液酸2。通過CMP-SA合成酶的作用使化合物2轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的CMP衍生物，隨后通過對CMP衍生物的催化加氫以生成化合物3。將通過形成甘氨酸加合物而引入的胺用作PEG或PPG附著的位置從而使化合物3分別與活化的PEG或PPG衍生物(如PEG-C(O)NHS、PPG-C(O)NHS)反應(yīng)，形成4或5。
方案4 表3提出了用PEG或PPG部分衍生化的糖單磷酸酯的代表性例子。表3中的某些化合物是通過方案1的方法制備的。其他衍生物是通過本領(lǐng)域認(rèn)可的方法制備的。參見如Keppler等人，Glycobiology 1111R(2001)；和Charter等人，Glycobiology 101049(2000))。其他胺反應(yīng)性PEG和PPG類似物是商業(yè)上可購得的，或它們可通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員易于獲得的方法制備。
表3.用PEG或PPG部分衍生化的糖單磷酸酯的例子 用于實踐本發(fā)明的修飾的糖磷酸酯可在其他位置以及在上文提出的位置替代。“i”可為Na或另一種鹽，且“i”可以與Na互換。目前唾液酸優(yōu)選的替代在分子式5中提出。
分子式5
其中，X是優(yōu)選地選自-O-、-N(H)-、-S、CH2-和N(R)2的連接基團，其中每一個R均為獨立選自R1-R5的成員。“i”可為Na或另一種鹽，且Na可以與“i”互換。符號Y、Z、A和B各自代表選自在上文中對X所描述的基團。X、Y、Z、A和B每一個均獨立地進行選擇，因此它們可為相同或不同的。符號R1、R2、R3、R4和R5代表H、聚合物、水溶性聚合物、治療部分、生物分子或其他部分。符號R6代表H、OH或聚合物。可選擇地，這些符號代表連接到聚合物、水溶性聚合物、治療部分、生物分子或其他部分上的連接體。
在另一個示例性的實施方案中，甘露糖胺是通過應(yīng)用如在方案5中提出的氯乙酸酐同時進行親核取代的?；突罨摹Ｔ诒静糠种刑峁┑拿恳粋€方案中，i+或Na+可以互換，其中鹽可為鈉，或者可為任何其他適當(dāng)?shù)柠}。
方案5 使結(jié)果所得的氯衍生化的聚糖與丙酮酸鹽在醛縮酶存在時接觸，從而形成氯衍生化的唾液酸。相應(yīng)的核苷酸糖是通過使唾液酸衍生物與適當(dāng)?shù)暮塑账崛姿岷秃铣擅附佑|而制備的。然后唾液酸部分上的氯基團可用親核的PEG衍生物如硫代-PEG取代。
在進一步的示例性實施方案中，如在方案6中顯示的，甘露糖胺是用雙-HOBT二羧酸鹽進行?；?，從而產(chǎn)生相應(yīng)的酰胺-烷基-羧酸，該酰胺-烷基-羧酸隨后轉(zhuǎn)變?yōu)橥僖核嵫苌?。將該唾液酸衍生物轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑账崽牵Ⅳ人峄罨遗c親核PEG衍生物如氨基-PEG反應(yīng)。
方案6 在另一個示例性的實施方案中，如在方案7中提出的，通過將伯羥基基團轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的對甲苯磺酸酯而使胺-和羧基-保護的神經(jīng)氨酸活化，且將甲基酯切除。使活化的神經(jīng)氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的核苷酸糖，且使活化基團用親核的PEG種類如硫代-PEG置換。
方案7
在另外進一步的示例性實施方案中，如在方案8中提出的，用親核的PEG如氯-PEG使胺-和羧基-保護的神經(jīng)氨酸衍生物的伯羥基部分烷基化。隨后切除甲基酯并將PEG-糖轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑账崽恰?br> 方案8 除唾液酸之外的聚糖可用在此處提出的方法用PEG進行衍生化。衍生化的聚糖本身也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。因而，方案9提供了PEG化的半乳糖核苷酸糖的示例性合成途徑。使半乳糖的伯羥基基團活化為相應(yīng)的對甲苯磺酸酯，隨后再轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑账崽恰?br> 方案9 方案10提出了基于半乳糖-6-胺部分的制備半乳糖-PEG衍生物的示例性途徑。因而，使半乳糖胺轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑账崽牵⑹拱肴樘前返陌凡糠钟没钚訮EG衍生物進行官能化。
方案10 方案11提供了制備半乳糖衍生物的另一個示例性途徑。方案11的起始點是半乳糖-2-胺，該半乳糖-2-胺轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑账崽?。核苷酸糖的胺部分是附著PEG衍生物的位置，如甲氧基-PEG(mPEG)羧酸。
方案11 附著到在此處公開的綴合物上的示例性部分包括但不局限于PEG衍生物(如?；?PEG、?；?烷基-PEG、烷基-酰基-PEG氨甲?；?PEG、芳基-PEG、烷基-PEG)、PPG衍生物(如?；?PPG、酰基-烷基-PPG、烷基-?；?PPG氨甲?；?PPG、芳基-PPG)、聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚賴氨酸、治療部分、診斷部分、甘露糖-6-磷酸、肝素、類肝素、SLex、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、Sialyl Lewis X、FGF、VFGF、蛋白質(zhì)(如運鐵蛋白)、軟骨素、角質(zhì)素、皮膚素、葡聚糖、修飾的葡聚糖、直鏈淀粉、二磷酸鹽、poly-SA、透明質(zhì)酸、keritan、白蛋白、整合蛋白、觸角寡糖、肽等。使各種修飾基團與糖部分綴合的方法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員易于獲得的(Poly(Ethylene Glycol)ChemistryBiotechnicaland Biomedical Applications，J.Milton Harris，Ed.，Plenum Pub.Corp.，1992；Poly(Ethylene Glycol)Chemical and BiologicalApplications，J.Milton Harris，Ed.，ACS Symposium Series No.680，American Chemical Society，1997；Hermanson，BioconjugateTechniques，Academic Press，San Diego，1996；和Dunn等人，Eds.Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems，ACS Symposium SeriesVol.469，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)。
糖、核苷酸糖和衍生物的純化由上述方法產(chǎn)生的核苷酸糖和衍生物可不經(jīng)純化而應(yīng)用。然而，通常優(yōu)選地是回收產(chǎn)物?？蓱?yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的眾所周知的用于回收糖基化的糖的技術(shù)，如薄層或厚層層析、柱層析、離子交換層析或膜過濾。優(yōu)選地是應(yīng)用膜過濾，更優(yōu)選地為將反向滲透膜或一種或多種柱層析技術(shù)用于回收，如在下文和在此處引用的參考文獻中討論的。例如，可用膜過濾來去除分子量小于10,000Da的試劑的蛋白質(zhì)，該膜具有約3000～約10,000的分子量截止點。然后膜過濾或反向滲透可用于去除鹽和/或純化產(chǎn)物糖(參見如WO 98/15581)。Nanofilter膜是一類可以使單價鹽經(jīng)過而保留多價的鹽和大于約100～約2,000道爾頓(依賴于所用的膜)的不帶電荷的溶質(zhì)的反向滲透膜。因而，在一般的應(yīng)用中，由本發(fā)明的方法制備的糖將保留在膜上，而雜質(zhì)鹽將通過膜。
G.交聯(lián)基團用于本發(fā)明的方法中的修飾的糖的制備包括修飾基團向糖殘基上的附著及形成穩(wěn)定的加合物，該加合物是糖基轉(zhuǎn)移酶的底物。因而，經(jīng)常優(yōu)選地是應(yīng)用交聯(lián)劑將修飾基團與糖進行綴合?？捎糜趯⑿揎椈鶊F附著到糖部分上的示例性的雙功能化合物包括，但不局限于雙功能聚(乙二醇)、聚酰胺、聚醚、聚酯等。使糖類與其他分子上的連接的一般方法在文獻中是公知的。參見如Lee等人，Biochemistry 281856(1989)；Bhatia等人，Anal.Biochem.178408(1989)；Janda等人，J.Am.Chem.Soc.1128886(1990)和Bednarski等人，WO92/18135。在隨后的討論中，對新生的修飾的糖的糖部分反應(yīng)性基團進行溫和處理。該討論的側(cè)重點是為了闡明清晰的目的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解該討論也適用于修飾基團上的反應(yīng)性基團。
一個示例性的策略包括將用異雙功能交聯(lián)劑SPDP(正琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸)保護的硫氫基整合入糖中，然后對硫氫基去保護以與修飾基團上的其他硫氫基形成二硫鍵。
如果SPDP有害地影響修飾的糖作為糖基轉(zhuǎn)移酶底物的能力，那么可將某個其他交聯(lián)劑用于形成二硫鍵，如2-亞胺基四氫噻吩或N-琥珀酰亞胺S-乙?；虼宜?SATA)。2-亞胺基四氫噻吩可與伯胺反應(yīng)，并立即將未保護的硫氫基整合入含有胺的分子上。SATA也與伯胺反應(yīng)，但整合保護的硫氫基，該保護的硫氫基隨后用羥胺脫乙?；援a(chǎn)生游離的硫氫基。在每一種情況下，整合的硫氫基可自由地與其他的硫氫基或保護的硫氫基如SPDP進行反應(yīng)以形成所需的二硫鍵。
上述策略對于用于本發(fā)明的連接體是示例性的，而不是限制性的?？捎糜趯⑿揎椈鶊F與肽進行交聯(lián)的不同策略中的其他交聯(lián)劑是可得到的。例如，TPCH(S-(2-硫代吡啶基)-L-半胱氨酸酰肼和TPMPH((S-(2-硫代吡啶基)巰基-丙酰基酰肼)與預(yù)先用過碘酸鹽溫和處理氧化的糖部分反應(yīng)，從而在交聯(lián)劑的酰肼部分和過碘酸鹽生成的醛之間形成腙鍵。TPCH和TPMPH在糖上引入了2-吡啶基硫酮保護的硫氫基基團，該基團可用DTT去保護并隨后用于綴合，如在成分之間形成二硫鍵。
如果發(fā)現(xiàn)二硫鍵對于產(chǎn)生穩(wěn)定的修飾的糖是不適當(dāng)?shù)?，那么可?yīng)用在成分之間整合更穩(wěn)定的鍵的其他交聯(lián)劑。異雙功能交聯(lián)劑GMBS(N-gama-malimidobutyryloxy)succinimide)和SMCC(琥珀酰亞胺基4-(N-馬來酰亞胺-甲基)環(huán)己烷)與伯胺反應(yīng)，從而將馬來酰亞胺基團引入到成分上。該馬來酰亞胺基團隨后可以與其他成分上可通過前文所述的交聯(lián)劑引入的硫氫基反應(yīng)，從而在成分之間形成穩(wěn)定的硫醚鍵。如果成分之間的空間位阻干擾了成分的活性或修飾的糖作為糖基轉(zhuǎn)移酶底物的能力，那么可應(yīng)用能夠在成分之間引入較長間隔臂的交聯(lián)劑，且該交聯(lián)劑包括一些前文所述的交聯(lián)劑(即SPDP)的衍生物。因而，存在大量有用的適當(dāng)交聯(lián)劑；它們的每一個均是依賴于其對最適的肽綴合物和修飾的糖生產(chǎn)的作用選擇的。
許多試劑可用于修飾具有分子內(nèi)化學(xué)交聯(lián)的修飾的糖的成分(對于交聯(lián)劑和交聯(lián)程序的綜述，參見Wold，F(xiàn).，Meth.Enzymol.25623-651，1972；Weetall，H.H.和Cooney，D.A.，Enzymes as Drugs(Holcenberg和Roberts，eds.)pp.395-442，Wiley，New York，1981；Ji.，T.H.，Meth .Enzymol.91580-609，1983；Mattson等人，Mol.Biol.Rep.17167-183，1993，均在此處引入作為參考)。優(yōu)選的交聯(lián)劑可源自各種零長度的、同雙功能的和異雙功能的交聯(lián)劑。零長度的交聯(lián)劑包括兩個內(nèi)部化學(xué)基團的直接綴合，而不引入外部的材料。催化二硫鍵形成的試劑屬于這個類型。另一個例子是誘導(dǎo)羧基和伯氨基團的縮合而形成酰胺鍵的試劑，如碳二亞胺、乙基氯代甲酸、Woodward試劑K(2-ethyl-5-phenylisoxazolium-3’-sulfonate)和羰基二咪唑。除這些化學(xué)試劑之外，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(谷氨酰-肽γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶；EC 2.3.2.13)可用作零長度的交聯(lián)劑。該酶催化蛋白質(zhì)連接的谷氨酰胺殘基的氨甲酰的?；D(zhuǎn)移反應(yīng)，通常以伯氨基團作為底物。優(yōu)選的同-和異-雙功能的試劑分別含有兩個相同或不同的位點，該位點對于氨基、硫氫基、胍基、吲哚或非特定的基團是反應(yīng)性的。
2.交聯(lián)劑上優(yōu)選的特異性位點
a.氨基反應(yīng)性基團在一個優(yōu)選的實施方案中，交聯(lián)劑上的位點是氨基反應(yīng)性基團。氨基反應(yīng)性基團的有用的非限制性例子包括N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)酯、亞氨酯、異氰酸酯、?；u化物、芳基氮化物、對硝基苯酯、醛和磺酰氯。
NHS酯優(yōu)選地與修飾的糖成分的伯(包括芳族的)氨基團反應(yīng)。組氨酸的咪唑基團已知可與伯胺競爭反應(yīng)，但其反應(yīng)產(chǎn)物是不穩(wěn)定且易于水解的。該反應(yīng)包括對NHS酯的酸性羧基上胺的親核攻擊以形成酰胺，從而釋放N-羥基琥珀酰亞胺。因而初始氨基基團的正電荷則丟失了。
亞氨酯是與修飾的糖成分的胺基團反應(yīng)的最特異性的?；噭Ｔ?～10的pH時，亞氨酯僅與伯胺反應(yīng)。伯胺親核地攻擊亞胺酯以產(chǎn)生中間物，該中間物在高pH時分解為脒而在低pH時分解為新的亞胺酸酯。該新的亞胺酸酯可與另一個伯胺反應(yīng)，從而使兩個氨基基團交聯(lián)，這是推定的單功能亞胺酸酯進行雙功能反應(yīng)的情況。與伯胺反應(yīng)的主要產(chǎn)物是脒，該脒是比初始的胺堿性更強的堿。因此初始氨基基團上的正電荷則保留了。
異氰酸酯(和異硫氰酸酯)與修飾的糖成分的伯胺反應(yīng)以形成穩(wěn)定的鍵。它們與硫氫基、咪唑和酪氨?；鶊F的反應(yīng)產(chǎn)生相對不穩(wěn)定的產(chǎn)物。
酰基氮化物也用作氨基特異性的試劑，其中親和成分的親核胺在微堿性如pH8.5的條件下攻擊酸性羧基基團。
芳基鹵化物如1，5-二氟-2，4-二硝基苯優(yōu)選地與修飾的糖成分的氨基基團和酪氨酸的酚基團反應(yīng)，但也與硫氫基和咪唑基團反應(yīng)。
單-和二羧酸的對硝基苯酯也是有用的氨基反應(yīng)性基團。盡管該試劑的特異性不是特別高，但α-和ε-氨基基團的反應(yīng)是最快的。
醛如戊二醛與修飾的糖的伯胺反應(yīng)。盡管在氨基基團與醛的反應(yīng)中形成了不穩(wěn)定的希夫堿，但戊二醛能夠用穩(wěn)定的交聯(lián)修飾修飾的糖。在典型的交聯(lián)pH條件pH6-8時，環(huán)形聚合物進行脫水以形成α-β不飽和的醛聚合物。然而希夫堿當(dāng)與另一個雙鍵綴合時是穩(wěn)定的。兩個雙鍵的共振相互作用阻止了希夫鍵的水解。此外，高局部濃度的胺可以攻擊乙烯雙鍵以形成穩(wěn)定的Michael加成產(chǎn)物。
芳族磺酰氯與修飾的糖成分的多個位點反應(yīng)，但與氨基基團的反應(yīng)是最重要的，結(jié)果形成穩(wěn)定的氨磺酰鍵。
b.硫氫基反應(yīng)性基團在另一個優(yōu)選的實施方案中，該位點是硫氫基反應(yīng)性基團。有用的非限制性的硫氫基反應(yīng)性基團包括馬來酰亞胺、烷基鹵化物、吡啶基二硫化物和硫代鄰苯二甲酰亞胺。
馬來酰亞胺與修飾的糖成分的硫氫基基團反應(yīng)以形成穩(wěn)定的硫醚鍵。它們也以非常低的速率與伯氨基團和組氨酸的咪唑基團反應(yīng)。然而，在pH7時可認(rèn)為馬來酰亞胺是硫氫基特異性的基團，這是因為在pH7時簡單硫醇的反應(yīng)速率比相應(yīng)胺的反應(yīng)速率高1000倍。
烷基鹵化物與硫氫基、硫化物、咪唑和氨基基團反應(yīng)。然而，在中性到微堿性的pH時，烷基鹵化物主要與硫氫基反應(yīng)以形成穩(wěn)定的硫醚鍵。在更高的pH時，與氨基基團的反應(yīng)是占優(yōu)勢的。
吡啶基二硫化物與游離硫氫基通過二硫化物交換進行反應(yīng)以形成混合的二硫化物。結(jié)果吡啶基二硫化物是最特異性的硫氫基反應(yīng)性基團。
硫代鄰苯二甲酰亞胺與游離硫氫基基團反應(yīng)以形成二硫化物。
c.羧基反應(yīng)性殘基在另一個實施方案中，將在水和有機溶劑中可溶的碳二亞胺用作羧基反應(yīng)性試劑。這些化合物與游離羧基基團反應(yīng)以形成假脲，然后該假脲可以與可用的胺偶聯(lián)以形成酰胺鍵。用碳二亞胺修飾羧基基團的程序是本領(lǐng)域中眾所周知的(參見Yamada等人，Biochemistry 204836-4842，1981)。
3.交聯(lián)劑中優(yōu)選的非特異性位點除應(yīng)用位點特異性反應(yīng)性部分之外，本發(fā)明也涉及應(yīng)用非特異性的反應(yīng)性基團以使糖與修飾基團連接。
示例性的非特異性交聯(lián)劑包括在黑暗中完全惰性的光活化型基團，該基團在吸收適當(dāng)能量的光子之后可轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻?yīng)性的種類。在一個優(yōu)選的實施方案中，光活化型基團選自通過加熱或光解氮化物而生成的氮賓前體。電子缺陷型氮賓是極度反應(yīng)性的，且可與各種化學(xué)鍵反應(yīng)，包括N-H、O-H、C-H和C＝C。盡管可應(yīng)用3類氮化物(芳基、烷基和酰基衍生物)，但芳基氮化物是目前優(yōu)選的。芳基氮化物在光解后與N-H和O-H的反應(yīng)性比與C-H的好。電子缺陷型芳基氮賓快速地進行環(huán)擴張以形成脫氫氮雜，該脫氫氮雜傾向于與親核物反應(yīng)，而不是形成C-H插入產(chǎn)物。芳基氮化物的反應(yīng)性可通過在環(huán)中存在吸電子取代基如硝基或羥基基團而增強。這種取代基將芳基氮化物的最大吸收推到更大的波長。未取代的芳基氮化物在260-280nm的范圍內(nèi)具有最大吸收，而羥基和硝基芳基氮化物顯著吸收超過305nm的光。因此，羥基和硝基芳基氮化物是最優(yōu)選的，這是因為它們使得能夠比未取代的芳基氮化物應(yīng)用對親和成分害處更低的光解條件。
在另一個優(yōu)選的實施方案中，光活化型基團選自氟化的芳基氮化物。氟化的芳基氮化物的光解產(chǎn)物是芳基氮賓，它們均與該基團進行高效的特征性反應(yīng)，包括C-H鍵插入(Keana等人，J.Org.Chem.553640-3647，1990)。
在另一個實施方案中，光活化型基團選自benzophenone殘基。benzophenone試劑通常比芳基氮化物試劑給出更高的交聯(lián)結(jié)果。
在另一個實施方案中，光活化型基團選自重氮化合物，該重氮化合物在光解后形成電子缺陷型卡賓。這些卡賓可進行各種反應(yīng)，包括向C-H鍵的插入、向雙鍵(包括芳族系統(tǒng))的加成、氫吸引和向親核中心的配位以給出碳離子。
在另外一個實施方案中，光活化型基團選自重氮丙酮酸鹽。例如，對硝基苯重氮丙酮酸鹽的對硝基苯酯與脂族胺反應(yīng)形成重氮丙酮酸酰胺，該重氮丙酮酸酰胺進行紫外線光解形成醛。光解的重氮丙酮酸鹽修飾的親和成分將類似于甲醛或戊二醛進行反應(yīng)以形成交聯(lián)。
4.同雙功能試劑a.與伯胺反應(yīng)的同雙功能試劑胺反應(yīng)性交聯(lián)劑的合成、性質(zhì)和應(yīng)用商業(yè)性地描述于文獻中(對于交聯(lián)程序和試劑的綜述，見上文)。許多試劑是可購得的(如PierceChemical Company，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
同雙功能NHS酯的優(yōu)選的非限制性例子包括二琥珀酰亞胺基戊二酸酯(DSG)、二琥珀酰亞胺基辛二酸酯(DSS)、雙(磺基琥珀酰亞胺基)辛二酸酯(BS)、二琥珀酰亞胺基酒石酸酯(DST)、二磺基琥珀酰亞胺基酒石酸酯(磺基-DST)、雙-2-(琥珀酰亞胺基氧基羰基氧基)乙基砜(BSOCOES)、雙-2-(磺基琥珀酰亞胺基氧基羰基氧基)乙基砜(磺基-BSOCOES)、乙二醇二(琥珀酰亞胺基琥珀酸酯)(EGS)、乙二醇二(磺基琥珀酰亞胺基琥珀酸酯)(磺基-EGS)、二硫代雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)(DSP)、和二硫代雙(磺基琥珀酰亞胺基丙酸酯)(磺基-DSP)。同雙功能亞氨酸酯的優(yōu)選的非限制性例子包括二甲基丙二酰亞胺酸酯(DMM)、二甲基琥珀酰亞胺酸酯(DMSC)、二甲基己二酰亞胺酸酯(DMA)、二甲基庚二酰亞胺酸酯(DMP)、二甲基辛二酰亞胺酸酯(DMS)、二甲基-3，3’-氧基二丙酰亞胺酸酯(DODP)、二甲基-3，3’-(亞甲基二氧)二丙酰亞胺酸酯(DMDP)、二甲基-3’-(二亞甲基二氧)二丙酰亞胺酸酯(DDDP)、二甲基-3，3’-(四亞甲基二氧)二丙酰亞胺酸酯(DTDP)和二甲基-3，3’-二硫代雙丙酰亞胺酸酯(DTBP)。
同雙功能異硫氰酸酯的優(yōu)選的非限制性例子包括對苯二異硫氰酸酯(DITC)和4，4’-二異硫氰酸-2，2’-二磺酸stilbene(DIDS)。
同雙功能異氰酸酯的優(yōu)選的非限制性例子包括二甲苯-二異氰酸酯、甲苯-2，4-二異氰酸酯、甲苯-2-異氰酸酯-4-異硫氰酸酯、3-甲氧基二苯基甲烷-4，4’-二異氰酸酯、2，2’-二羧基-4，4’-偶氮苯基二異氰酸酯和六亞甲基二異氰酸酯。
同雙功能芳基鹵化物的優(yōu)選的非限制性例子包括1，5-二氟-2，4-二硝基苯(DFDNB)和4，4’-二氟-3，3’-二硝基苯基砜。
同雙功能脂族醛試劑的優(yōu)選的非限制性例子包括乙二醛、丙二醛(malondialdehyde)和戊二醛。
同雙功能酰化試劑的優(yōu)選的非限制性例子包括二羧酸的硝基苯酯。
同雙功能芳族磺酰氯的優(yōu)選的非限制性例子包括苯酚-2，4-二磺?；然锖挺?萘酚-2，4-二磺?；然?。
額外的氨基反應(yīng)性同雙功能試劑的優(yōu)選的非限制性例子包括與胺反應(yīng)生成二氨基甲酸酯(biscarbamate)的赤蘚醇二羧酸(erythriolbiscarbonate)。
b.與游離硫氫基基團反應(yīng)的同雙功能交聯(lián)劑這種試劑的合成、性質(zhì)和應(yīng)用描述于文獻中(對于交聯(lián)程序和試劑的綜述，見上文)。許多試劑是商業(yè)上可購得的(如Pierce ChemicalCompany，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
同雙功能馬來酰亞胺的優(yōu)選的非限制性例子包括雙馬來酰亞胺己烷(BMH)、N，N’-(1，3-亞苯基)雙馬來酰亞胺、N，N’-(1，2-亞苯基)雙馬來酰亞胺、偶氮苯基雙馬來酰亞胺和雙(N-馬來酰亞胺甲基)醚。
同雙功能吡啶基二硫化物的優(yōu)選的非限制性例子包括1，4-二-3’-(2’-吡啶基二硫代)丙酰胺基丁烷(DPDPB)。
同雙功能烷基鹵化物的優(yōu)選的非限制性例子包括2，2’-二羧基-4，4’-二碘乙酰胺基偶氮苯、α，α’-二碘-對二甲苯磺酸、α，α’-二溴-對二甲苯磺酸、N，N’-雙(b-溴乙基)芐胺、N，N’-二(溴乙?；?苯基肼和1，2-二(溴乙?；?氨基-3-苯基丙烷。
c.同雙功能光活化型交聯(lián)劑這種試劑的合成、性質(zhì)和應(yīng)用描述于文獻中(對于交聯(lián)程序和試劑的綜述，見上文)。許多試劑是商業(yè)上可購得的(如Pierce ChemicalCompany，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
同雙功能光活化型交聯(lián)劑的優(yōu)選的非限制性例子包括雙-β-(4-疊氮基水楊基酰胺基)乙基二硫化物(BASED)、二-N-(2-硝基-4-疊氮基苯基)-胱胺-S，S’-二氧化物(DNCO)和4，4’-二硫代雙苯基氮化物。
5.異雙功能試劑a.具有吡啶基二硫化物部分的氨基反應(yīng)性異雙功能試劑這種試劑的合成、性質(zhì)和應(yīng)用描述于文獻中(對于交聯(lián)程序和試劑的綜述，見上文)。許多試劑是可購得的(如Pierce ChemicalCompany，Rockford，Ill.；Sigma Chemical Company，St.Louis，Mo.；Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。
具有吡啶基二硫化物部分和氨基反應(yīng)性NHS酯的異雙功能試劑的優(yōu)選的非限制性例子包括N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸(SPDP)、琥珀酰亞胺基6-3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺己酸(LC-SPDP)、磺基琥珀酰亞胺基6-3-(2-吡啶基二硫代)丙酰胺己酸(磺基-LCSPDP)、4-琥珀酰亞胺基氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯(SMPT)和磺基琥珀酰亞胺基6-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)甲苯甲酰胺己酸(磺基-LC-SMPT)。
b.具有馬來酰亞胺部分的氨基反應(yīng)性異雙功能試劑這種試劑的合成、性質(zhì)和應(yīng)用描述于文獻中。具有馬來酰亞胺部分和氨基反應(yīng)性NHS酯的異雙功能試劑的優(yōu)選的非限制性例子包括琥珀酰亞胺馬來酰亞胺乙酰酯(AMAS)、琥珀酰亞胺3-馬來酰亞胺丙酸酯(BMPS)、N-γ-馬來酰亞胺丁酰氧琥珀酰亞胺酯(GMBS)、N-γ-馬來酰亞胺丁酰氧磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-GMBS)、琥珀酰亞胺6-馬來酰亞胺己酸酯(EMCS)、琥珀酰亞胺3-馬來酰亞胺苯甲酸酯(SMB)、間馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(MBS)、間馬來酰亞胺苯甲酰-N-羥基磺基琥珀酰亞胺酯(磺基-MBS)、琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯(SMCC)、磺基琥珀酰亞胺4-(N-馬來酰亞胺甲基)-環(huán)己烷-1-羧酸酯(磺基-SMCC)、琥珀酰亞胺4-(對馬來酰亞胺苯基)丁酸酯(SMPB)和磺基琥珀酰亞胺4-(對馬來酰亞胺苯基)丁酸酯(磺基-SMPB)。
c.具有烷基鹵化物部分的氨基反應(yīng)性異雙功能試劑這種試劑的合成、性質(zhì)和應(yīng)用描述于文獻中。具有烷基鹵化物部分和氨基反應(yīng)性NHS酯的異雙功能試劑的優(yōu)選的非限制性例子包括N-琥珀酰亞胺-(4-碘代乙酰基)氨基苯甲酸酯(SIAB)、磺基琥珀酰亞胺-(4-碘代乙?；?氨基苯甲酸酯(磺基-SIAB)、琥珀酰亞胺-6-(碘代乙酰基)氨基己酸酯(SIAX)、琥珀酰亞胺-6-(6-((碘代乙?；?-氨基)己酰氨基)己酸酯(SIAXX)、琥珀酰亞胺-6-(((4-碘代乙?；?-氨基)-甲基)-環(huán)己烷-1-羰基)氨基己酸酯(SIACX)和琥珀酰亞胺-4((碘代乙酰)-氨基)甲基環(huán)己烷-1-羧酸酯(SIAC)。
具有氨基反應(yīng)性NHS酯和烷基二鹵化物部分的異雙功能試劑的優(yōu)選的例子是N-羥基琥珀酰亞胺2，3-二溴丙酸酯(SDBP)。SDBP通過綴合其氨基基團而向親和成分引入分子內(nèi)交聯(lián)。二溴丙?；糠峙c伯胺的反應(yīng)性可通過反應(yīng)溫度控制(McKenzie等人，Protein Chem.7581-592(1988))。
具有烷基鹵化物部分和氨基反應(yīng)性對硝基苯酯的異雙功能試劑的優(yōu)選的非限制性例子包括對硝基苯基碘乙酸酯。
其他交聯(lián)劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。參見如Pomato等人，美國專利No.5,965,106。對特定的應(yīng)用選擇適當(dāng)?shù)慕宦?lián)劑是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)的。
d.可切割的連接體基團在另外進一步的實施方案中，連接體基團具有可進行切割以將修飾基團從糖殘基上釋放的基團。許多可切割的基團是本領(lǐng)域中公知的。參見如Jung等人，Biochem.Biophys.Acta 761152-162(1983)；Joshi等人，J.Biol.Chem.26514518-14525(1990)；Zarling等人，J.Immunol.124913-920(1980)；Bouizar等人，Eur.J.Biochem.155141-147(1986)；Park等人，J.Biol.Chem.261205-210(1986)；Browning等人，J.Immunol.1431859-1867(1989)。此外，廣泛的可切割的雙功能連接體基團(同或異雙功能的)是商業(yè)上可從如Pierce的供應(yīng)商購得的。
示例性的可切割的部分可用光、熱或試劑切割，該試劑如硫醇、羥胺、堿、過碘酸鹽等。此外，某些優(yōu)選的基團是在體內(nèi)響應(yīng)于內(nèi)吞而切割的(如順式烏頭基(cis-aconityl)；參見Shen等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1021048(1991))。優(yōu)選的可切割的基團包含選自二硫化物、酯、二酰亞胺、碳酸鹽、硝基芐基、苯乙酮基和安息香基團的成員的可切割部分。
e.修飾的糖與肽的綴合修飾的糖是通過介導(dǎo)綴合的適當(dāng)?shù)拿概c糖基化或非糖基化的肽進行綴合的。優(yōu)選地，選擇修飾的供體糖、酶和受體肽的濃度，從而糖基化可以進行到受體被用完時。盡管是關(guān)于唾酸轉(zhuǎn)移酶提出的，但在下面討論的因素通常可應(yīng)用于其他的糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)中。
許多用糖基轉(zhuǎn)移酶合成想要的寡糖結(jié)構(gòu)的方法是公知的，且通常應(yīng)用于本發(fā)明中。一些文獻描述了示例性的方法，如WO 96/32491、Ito等人，Pure Appl.Chem.65753(1993)和U.S.Pat.No.5,352,670、5,374,541和5,545,553。
本發(fā)明是用單一糖基轉(zhuǎn)移酶或糖基轉(zhuǎn)移酶的組合實踐的。例如，人們可以應(yīng)用唾酸轉(zhuǎn)移酶和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的組合。在應(yīng)用超過一種酶的實施方案中，酶和底物優(yōu)選地是在初始反應(yīng)化合物中組合的，或者第二個酶促反應(yīng)的酶和試劑是在第一個酶促反應(yīng)完成或接近完成時添加到反應(yīng)介質(zhì)中的。通過在單個容器中依次進行兩個酶促反應(yīng)，總產(chǎn)量相對于要分離中間物種類的程序改善了。此外，減少了對額外的溶劑和副產(chǎn)品的清除和處理。
在一個優(yōu)選的實施方案中，第一種和第二種酶均是糖基轉(zhuǎn)移酶。在另一個優(yōu)選的實施方案中，一種酶是內(nèi)切糖苷酶。在另一個優(yōu)選的實施方案中，一種酶是外切糖苷酶。在額外優(yōu)選的實施方案中，將超過兩種酶用于組裝本發(fā)明的修飾糖蛋白。該酶用于在將修飾的糖添加到肽上之前或之后在任何位點改變肽上的糖結(jié)構(gòu)。
在另一個實施方案中，至少兩種酶是糖基轉(zhuǎn)移酶，且添加到肽上糖結(jié)構(gòu)中的最后的糖是非修飾的糖?；蛘?，修飾的糖位于聚糖結(jié)構(gòu)的內(nèi)部，因此不必是聚糖上的最后的糖。在一個示例性的實施方案中，半乳糖基轉(zhuǎn)移酶可催化Gal-PEG從UDP-Gal-PEG向聚糖上的轉(zhuǎn)移，隨后在ST3Gal3和CMP-SA存在時進行溫育，這將向聚糖添加未修飾的“加帽”唾液酸(圖23A)。
在另一個實施方案中，至少兩種所用的酶是糖基轉(zhuǎn)移酶，且將至少兩個修飾的糖添加到肽的聚糖結(jié)構(gòu)上。以這種方式，兩個或多個不同的肽綴合物可添加到肽上一個或多個聚糖上。該過程產(chǎn)生了具有兩個或多個功能不同的修飾的糖的聚糖結(jié)構(gòu)。在一個示例性的實施方案中，肽與GnT-I、II和UDP-GlcNAc-PEG的溫育可將GlcNAc-PEG分子添加到聚糖上；然后與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和UDP-Gal的溫育可在其上添加Gal殘基；且與ST3Gal3和CMP-SA-Man-6-磷酸的溫育可將SA-甘露糖-6-磷酸分子添加到聚糖上。該系列反應(yīng)結(jié)果產(chǎn)生具有PEG化聚糖的功能特征以及甘露糖-6-磷酸導(dǎo)向活性的聚糖鏈(圖23B)。
在另一個實施方案中，至少兩種用于反應(yīng)中的酶是糖基轉(zhuǎn)移酶，且將不同的修飾的糖添加到肽上N-連接的和O-連接的聚糖上。當(dāng)將兩個不同的修飾的糖添加到肽的聚糖上，且當(dāng)重要的是在空間上對肽上所述修飾的糖進行相互分隔時，該實施方案是有用的。例如，如果修飾的糖包含體積大的分子，則該方法是優(yōu)選的，該體積大的分子包括但不局限于PEG和其他分子如連接體分子。修飾的糖可同時添加到肽的聚糖上，或者它們可依次加入。在一個示例性的實施方案中，與ST3Gal3和CMP-SA-PEG的溫育可將唾液酸-PEG添加到N-連接的聚糖上，而與ST3Gal1和CMP-SA-二磷酸酯的溫育可將唾液酸二磷酸酯添加到O-連接的聚糖上(圖23C)。
在另一個實施方案中，該方法應(yīng)用一種或多種外切或內(nèi)切糖苷酶。該糖苷酶一般是突變體，該突變體是經(jīng)過加工的以形成糖基鍵而不是破壞該鍵。有時稱為糖合成酶的突變聚糖酶一般包括氨基酸殘基對活性位點酸性氨基酸殘基的取代。例如，當(dāng)內(nèi)切聚糖酶是endo-H時，取代的活性位點一般是位置130的Asp、位置132的Glu或其組合。該氨基酸通常是用絲氨酸、丙氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺取代的。外切糖苷酶如轉(zhuǎn)唾液酸酶(transialylidase)也是有用的。
突變的酶通常以合成步驟催化反應(yīng)，這是與內(nèi)切聚糖酶的水解步驟的反向反應(yīng)類似的。在這些實施方案中，糖基供體分子(如想要的寡-或單-糖結(jié)構(gòu))含有離去基團，且反應(yīng)隨著向蛋白質(zhì)上的GlcNAc殘基上添加供體分子而進行。例如，離去基團可為鹵素，如氟化物。在其他實施方案中，離去基團是Asn或Asn-肽部分。在另外進一步的實施方案中，糖基供體分子上的GlcNAc殘基得到了修飾。例如，GlcNAc殘基可包含1，2_唑啉部分。
在一個優(yōu)選的實施方案中，用于產(chǎn)生本發(fā)明的綴合物的每一種酶均是以催化量存在的。特定酶的催化量根據(jù)該酶底物的濃度以及反應(yīng)條件而變化，該反應(yīng)條件如溫度、時間和pH值。確定給定的酶在預(yù)先選擇的底物濃度和反應(yīng)條件下的催化量的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。
實施上述方法的溫度范圍為冰凍點到最敏感的酶變性的溫度。優(yōu)選的溫度范圍為約0℃～約55℃，且更優(yōu)選地為約20℃～約37℃。在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明方法中的一種或多種成分是用嗜熱的酶在升高的溫度下進行的。
使反應(yīng)混合物維持足夠的時間以使得受體可進行糖基化，從而形成想要的綴合物。一些綴合物常在少數(shù)幾個小時即可探測到，而可回收的量通常在24小時內(nèi)或更短時間內(nèi)獲得。本領(lǐng)域的技術(shù)人員理解反應(yīng)速率依賴于許多可變的因素(如酶濃度、供體濃度、受體濃度、溫度、溶劑體積)，根據(jù)選擇的系統(tǒng)使這些因素最適化。
本發(fā)明也提供了對修飾肽的工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)。如在此處所用的，工業(yè)規(guī)模通常生產(chǎn)至少一克最終純化的綴合物。
在隨后的討論中，本發(fā)明是通過修飾的唾液酸部分與糖基化的肽的綴合進行示例的。該示例性的修飾唾液酸是用PEG標(biāo)記的。下面對PEG-修飾的唾液酸和糖基化的肽的應(yīng)用的討論是為了闡明清晰的目的，而不是意味著本發(fā)明局限于這兩個配偶體的綴合。技術(shù)人員可以理解該討論通?？捎糜谔砑映僖核嶂獾男揎椞腔糠?。此外，該討論同樣用于用除PEG之外的試劑對糖基單位的修飾，該試劑包括其他的水溶性聚合物、治療部分和生物分子。
一種酶促方法可用于選擇性地將PEG化的或PPG化的糖引入到肽或糖肽中。該方法利用含有PEG、PPG或掩蓋的反應(yīng)性官能基團的修飾的糖，且與適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶或糖合成酶組合。通過選擇可形成想要的糖連接和利用修飾糖作為供體底物的糖基轉(zhuǎn)移酶，可將PEG或PPG直接引入到肽主鏈上、引入到糖肽上已存在的糖殘基上或引入到已添加到肽上的糖殘基上。
唾酸轉(zhuǎn)移酶的受體存在于由本發(fā)明的方法修飾的肽上，它或者作為天然存在的結(jié)構(gòu)，或者是重組地、酶促地或化學(xué)地置于其上的。適當(dāng)?shù)氖荏w包括如半乳糖基受體如Galβ1，4GlcNAc、Galβ1，4GalNAc、Galβ1，3GalNAc、lacto-N-tetraose、Galβ1，3GlcNAc、Galβ1，3Ara、Galβ1，6GlcNAc、Galβ1，4Glc(乳糖)和其他本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的受體(參見如Paulson等人，J.Biol.Chem.2535617-5624(1978))。
在一個實施方案中，唾酸轉(zhuǎn)移酶的受體是在待修飾的肽體內(nèi)合成后即存在于其上的。這種肽可不預(yù)先對肽的糖基化模式進行修飾而用本發(fā)明的方法進行唾液酸化。可選擇地，本發(fā)明的方法可用于對不包括適當(dāng)?shù)氖荏w的肽進行唾液酸化；人們首先通過本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的方法對肽進行修飾以使其包括受體。在一個示例性的實施方案中，GalNAc殘基是通過GalNAc轉(zhuǎn)移酶的作用而添加的。
在一個示例性的實施方案中，半乳糖基受體是通過將半乳糖殘基添加到與肽連接的適當(dāng)受體如GlcNAc上而組裝的。該方法包括使要進行修飾的肽與反應(yīng)混合物進行溫育，該反應(yīng)混合物含有適當(dāng)量的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(如galβ1，3或galβ1，4)和適當(dāng)?shù)陌肴樘腔w(如UDP-半乳糖)。使該反應(yīng)基本進行完全，或可選擇地使該反應(yīng)在已添加了預(yù)先選擇的量的半乳糖殘基時終止。其他組裝選擇的糖受體的方法對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
在另外一個實施方案中，首先完全或部分地對肽連接的寡糖進行“修剪”以暴露唾酸轉(zhuǎn)移酶的受體或一種部分，其中一種或多種適當(dāng)?shù)臍埢商砑拥皆摬糠稚弦垣@得適當(dāng)?shù)氖荏w。例如糖基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)切糖苷酶(參見如美國專利No.5,716,812)對于附著和修剪反應(yīng)是有用的?！靶藜簟焙椭貥?gòu)N-連接的和O-連接的聚糖的詳細(xì)討論在別處提供。
在隨后的討論中，本發(fā)明的方法是通過應(yīng)用在其上附著有水溶性聚合物的修飾的糖而示例的。討論的側(cè)重點是為了闡明清晰的目的。技術(shù)人員將理解該討論同樣適用于其中修飾的糖攜帶有治療部分、生物分子等的實施方案。
本發(fā)明的一個示例性的實施方案在
圖14中提出，其中糖殘基在添加修飾的糖之前進行了“修剪”，該實施方案提出了將高甘露糖修剪至第一代雙觸角結(jié)構(gòu)的方案。攜帶有水溶性聚合物的修飾的糖則與由“修剪”所暴露的一個或多個糖殘基綴合。在一個例子中，水溶性聚合物是通過GlcNAc部分進行添加的，該GlcNAc部分與水溶性聚合物綴合。修飾的GlcNAc是附著到雙觸角結(jié)構(gòu)的一個或兩個末端甘露糖殘基上的?？蛇x擇地，未修飾的GlcNAc可添加到分支種類的一個或兩個末端上。
在另一個示例性的實施方案中，水溶性聚合物是通過具有半乳糖殘基的修飾的糖而添加到雙觸角結(jié)構(gòu)的一個或兩個末端甘露糖殘基上的，該修飾的糖是與添加到末端甘露糖殘基上的GlcNAc殘基綴合的?？蛇x擇地，未修飾的Gal可添加到一個或兩個末端GlcNAc殘基上。
在另外進一步的例子中，水溶性聚合物是用修飾的唾液酸添加到Gal殘基上的。
另一個示例性的實施方案在
圖15中提出，該圖展示了與
圖14所示的類似的方案，其中將高甘露糖結(jié)構(gòu)“修剪”至甘露糖(雙觸角結(jié)構(gòu)從該甘露糖分支)。在一個例子中，水溶性聚合物是通過用聚合物修飾的GlcNAc進行添加的?？蛇x擇地，未修飾的GlcNAc是添加到甘露糖上的，隨后再添加具有附著的水溶性聚合物的Gal。在另外一個實施方案中，未修飾的GlcNAc和Gal殘基是依次添加到甘露糖上的，隨后再添加用水溶性聚合物修飾的唾液酸部分。
圖16提出了利用與
圖14中所示的類似的方案的進一步的示例性實施方案，其中將高甘露糖“修剪”至第一個甘露糖所附著的GlcNAc。該GlcNAc是與攜帶有水溶性聚合物的Gal殘基綴合的。可選擇地，將未修飾的Gal添加到GlcNAc上，隨后添加用水溶性糖修飾的唾液酸。在另外進一步的例子中，使末端GlcNAc與Gal綴合，并隨后將GlcNAc用攜帶有水溶性聚合物的修飾巖藻糖進行巖藻糖基化。
圖17是與
圖14中所示的相似的方案，其中將高甘露糖修剪至附著到肽的Asn上的第一個GlcNAc。在一個例子中，GlcNAc-(Fuc)a殘基的GlcNAc是與攜帶有水溶性聚合物的GlcNAc綴合的。在另一個例子中，GlcNAc-(Fuc)a殘基的GlcNAc是用攜帶有水溶性聚合物的Gal修飾的。在另外進一步的實施方案中，GlcNAc是用Gal修飾的，隨后與用水溶性聚合物修飾的唾液酸的Gal綴合。
其他示例性的實施方案在
圖18-22中提出。在每一個前述的圖中提供了本發(fā)明所實踐的一系列反應(yīng)類型的說明。
在上面給出的例子提供了對在此處提出的方法的力量的闡明。利用本發(fā)明的方法，可能的是“修剪”并構(gòu)造具有幾乎任何想要的結(jié)構(gòu)的糖殘基。修飾的糖可添加到如在上面提出的糖部分末端上，或者它可介于肽核心和糖末端之間。
在一個示例性的實施方案中，將存在的唾液酸用唾液酸酶從糖肽上去除，從而暴露下面所有或大多數(shù)的半乳糖基殘基?？蛇x擇地，肽或糖肽是用半乳糖殘基或者以半乳糖單位結(jié)束的寡糖殘基進行標(biāo)記的。在暴露或添加了半乳糖殘基之后，將適當(dāng)?shù)耐偎徂D(zhuǎn)移酶用于添加修飾的唾液酸。該方法總結(jié)于方案12中。
方案12 在更進一步的總結(jié)于方案13的方法中，在唾液酸上存在掩蓋的反應(yīng)性官能團。該掩蓋的反應(yīng)性基團優(yōu)選地不受用于將修飾的唾液酸附著到肽上的條件影響。在修飾的唾液酸與肽的共價附著之后，該掩蓋被去除，且該肽與如PEG、PPG、治療部分、生物分子或其他試劑進行綴合。該試劑是以特定的方式通過其與修飾的糖殘基上的暴露的反應(yīng)性基團的反應(yīng)與肽綴合的。
方案13
依賴于糖肽的寡糖側(cè)鏈的末端糖，可應(yīng)用任何修飾的糖與其適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶(表4)。如上所述，引入PEG化或PPG化結(jié)構(gòu)所必需的糖肽的末端糖可在其表達過程中天然引入，或者它可在表達后用適當(dāng)?shù)奶擒彰?、糖基轉(zhuǎn)移酶或糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的混合物產(chǎn)生。
表4.修飾的糖
在進一步的示例性實施方案中，UDP-半乳糖-PEG是與牛奶β1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的，從而將修飾的半乳糖轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)哪┒薔-乙酰葡糖胺結(jié)構(gòu)上。糖肽上的末端GlcNAc殘基可在表達過程中產(chǎn)生，如在哺乳動物、昆蟲、植物或真菌的表達系統(tǒng)中出現(xiàn)的，但也可通過用所需的唾液酸酶和/或糖苷酶和/或糖基轉(zhuǎn)移酶對糖肽進行處理以產(chǎn)生。
在另一個示例性的實施方案中，將GlcNAc轉(zhuǎn)移酶如GnT-I-IV用于將PEG化的GlcNAc轉(zhuǎn)移到糖肽的甘露糖殘基上。在更進一步的示例性實施方案中，將N-和/或O-連接的聚糖結(jié)構(gòu)酶促地從糖肽上去除以暴露隨后可與修飾的糖綴合的氨基酸或末端糖基殘基。例如，將內(nèi)切聚糖酶用于去除糖肽的N-連接的結(jié)構(gòu)以暴露末端GlcNAc，使其顯示為糖肽上GlcNAc連接的Asn。UDP-Gal-PEG和適當(dāng)?shù)陌肴樘腔D(zhuǎn)移酶可用于將PEG-或PPG-半乳糖官能團引入到暴露的GlcNAc上。
在一個可選擇的實施方案中，修飾的糖是用糖基轉(zhuǎn)移酶直接添加到肽主鏈上的，其中該酶已知可將糖殘基轉(zhuǎn)移到肽主鏈上。該示例性的實施方案在方案14中提出。用于實踐本發(fā)明的示例性糖基轉(zhuǎn)移酶包括但不局限于GalNAc轉(zhuǎn)移酶(GalNAc T1-14)、GlcNAc轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖基轉(zhuǎn)移酶、木糖基轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶等。應(yīng)用本方法使得能夠直接將修飾的糖添加到缺乏任何糖的肽上或添加到現(xiàn)有的糖肽上。在這兩種情況下，修飾的糖的添加發(fā)生于由糖基轉(zhuǎn)移酶的底物特異性所限定的肽主鏈上的特定位置，而不是如用化學(xué)方法修飾蛋白質(zhì)的肽主鏈過程中發(fā)生的隨機方式。通過將適當(dāng)?shù)陌被嵝蛄屑庸と腚逆溨?，可將一系列試劑引入到原本缺乏糖基轉(zhuǎn)移酶的底物肽序列的蛋白質(zhì)或糖肽中。
方案14 在上文提出的每一個示例性的實施方案中，在修飾的糖與肽綴合之后可應(yīng)用一個或多個額外的化學(xué)或酶促修飾步驟。在一個示例性的實施方案中，可將酶(如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)用于在附著于肽上的末端修飾的糖上附加糖基單位(如巖藻糖)。在另一個例子中，可將酶促反應(yīng)用于對修飾的糖不能綴合的位點進行“加帽”?？蛇x擇地，將化學(xué)反應(yīng)用于改變綴合的修飾的糖的結(jié)構(gòu)。例如，使綴合的修飾的糖與試劑進行反應(yīng)，該試劑可使其與修飾的糖所附著的肽成分的連接穩(wěn)定化或去穩(wěn)定化。在另一個例子中，在與肽綴合之后，修飾的糖的成分是去保護的。技術(shù)人員將理解有一系列的酶促和化學(xué)程序可在修飾的糖與肽綴合之后的階段用于本發(fā)明的方法中。對修飾的糖-肽綴合物的進一步的修飾是在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的。
用甘露糖-6-磷酸導(dǎo)向的肽在一個示例性的實施方案中，肽是用至少一種甘露糖-6-磷酸部分衍生化的。該甘露糖-6-磷酸部分可將肽導(dǎo)向到細(xì)胞的溶酶體中，且可用于如將治療性蛋白質(zhì)導(dǎo)向到溶酶體中以治療溶酶體貯積病。
溶酶體貯積病是超過40種病癥的群體，它們是編碼分解細(xì)胞溶酶體中糖脂或多糖廢物的酶的基因缺陷的結(jié)果。該酶的產(chǎn)物如糖和脂質(zhì)可再循環(huán)為新的產(chǎn)物。這些病癥的每一個均源自遺傳的常染色體或X-連鎖的隱性性狀，該性狀影響溶酶體中酶的水平。通常，染病的個體的細(xì)胞和組織中受影響的酶沒有生物學(xué)或功能活性。表5提供了代表性貯積病和與疾病相關(guān)的酶缺陷的列表。在這種疾病中，酶功能的缺陷造成身體細(xì)胞溶酶體中脂質(zhì)或糖類底物的逐步地全身性沉積，最終導(dǎo)致器官功能的喪失和死亡。溶酶體貯積病的遺傳病因?qū)W、臨床表現(xiàn)、分子生物學(xué)和發(fā)病率詳細(xì)描述于Scriver等人，eds.，The Metabolicand Molecular Basis of Inherited Disease，7.sup.th Ed.，Vol.II，McGraw Hill，(1995)。
表5.溶酶體貯積病及相關(guān)的酶缺陷
*MPS＝粘多糖De Duve首先提出用外源生物學(xué)活性的酶替代缺失的溶酶體酶可能是治療溶酶體貯積病的可行的方法(De Duve，F(xiàn)ed.Proc.231045(1964))。從那時開始，各種研究已提出酶替代治療對于治療各種溶酶體貯積病均是有益的。在具有I型高歇病的個體中已顯示了最大的成功，該個體已用從胎盤中制備的外源酶(β-葡糖腦苷脂酶)(CeredaseTM)或最近重組生產(chǎn)的酶(CerezymeTM)進行治療。也已提出酶替代對于治療法布萊氏病以及其他的溶酶體貯積病均是有益的。參見如Dawson等人，Ped.Res.7(8)684-690(1973)(在體外)和Mapes等人，Science 169987(1970)(在體內(nèi))。酶替代治療的臨床實驗已在用正常血漿(Mapes等人，Science 169987-989(1970))、從胎盤中純化的α-半乳糖苷酶A(Brady等人，N.Eng.J.Med.2791163(1973))或從脾或血漿中純化的α-半乳糖苷酶A(Desnick等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 765326-5330(1979))灌輸?shù)姆ú既R氏病患者中報道，并已證明對法布萊氏病直接進行酶替代的生物醫(yī)學(xué)效力。這些研究顯示通過重復(fù)的酶替代消除或顯著減少病理學(xué)的糖脂貯積的潛力。例如，在一個研究中(Desnick等人，見上文)，純化的酶的靜脈注射導(dǎo)致貯積的脂質(zhì)底物globotriasylceramide的血漿水平暫時的降低。
因此，本領(lǐng)域中需要向缺陷細(xì)胞提供足夠量的生物學(xué)活性的溶酶體酶如人類α-半乳糖苷酶A的方法。最近，已嘗試用重組方法來滿足這些需要，參見如U.S.Pat.No.5,658,567、5,580,757；Bishop等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，834859-4863(1986)；Medin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA937917-7922(1996)；Novo，F(xiàn).J.，Gene Therapy 4488-492(1997)；Ohshima等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 942540-2544(1997)；和Sugimoto等人，Human Gene Therapy6905-915(1995)。通過甘露糖-6-磷酸介導(dǎo)的治療性肽向溶酶體中的導(dǎo)向，本發(fā)明提供了用于將足夠量的生物學(xué)活性溶酶體肽送遞到缺陷細(xì)胞中的組合物和方法。
因而，在一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用甘露糖-6-磷酸衍生化的表7中的肽(圖24和圖25)。該肽可為重組或化學(xué)制備的。此外，該肽可為完整的天然序列，或者可通過如截斷、延伸而修飾，或者它可包括替代或缺失。用本發(fā)明的方法重構(gòu)的示例性蛋白質(zhì)包括葡糖腦苷脂酶、β-葡糖苷酶、α-半乳糖苷酶A、酸性-α-葡糖苷酶(酸性麥芽糖酶)。用于臨床應(yīng)用的代表性修飾的肽包括但不局限于CeredaseTM、CerezymeTM和FabryzymeTM。在修飾的和臨床上相當(dāng)?shù)碾纳系奶腔鶊F也可用本發(fā)明的方法進行改變。甘露糖-6-磷酸是通過糖基連接基團附著到肽上的。在一個示例性的實施方案中，糖基連接基團源自唾液酸。示例性的源自唾液酸的糖基連接基團在表3中提出，其中一個或多個“R”部分是甘露糖-6-磷酸或在其上附著有一個或多個甘露糖-6-磷酸部分的間隔基團。該修飾的唾液酸部分優(yōu)選地是連接到肽表面上的寡糖的末端殘基(圖26)。
除甘露糖-6-磷酸之外，本發(fā)明的肽可進一步用諸如水溶性聚合物、治療部分或額外的導(dǎo)向部分的部分進行衍生化。用于附著這些和其他的基團的方法在此處提出。在一個示例性的實施方案中，除甘露糖-6-磷酸之外的基團是通過根據(jù)表3的衍生化的唾液酸衍生物附著到肽上的，其中一個或多個“R”部分是除甘露糖-6-磷酸之外的基團。
在一個示例性的實施方案中，制備了用Cbz-保護的基于甘氨酸的連接體臂修飾的唾液酸部分。制備了相應(yīng)的核苷酸糖，并通過催化加氫將Cbz基團去除。結(jié)果所得的核苷酸糖具有與活化的甘露糖-6-磷酸衍生物接觸的可用的反應(yīng)性胺，從而提供了可用于實踐本發(fā)明的甘露糖-6-磷酸衍生化的核苷酸糖。
如在下面方案(方案15)中所示的，示例性活化的甘露糖-6-磷酸衍生物的形成方式如下將2-溴-芐基-保護的磷酸三酯在原位轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的三氟甲基磺酸酯，并使該三氟甲基磺酸酯與具有反應(yīng)性含氧部分的連接體反應(yīng)，從而在糖和連接體之間形成醚鍵。芐基保護基團是通過催化加氫去除的，且將連接體的甲酯水解，從而提供相應(yīng)的羧酸。該羧酸可通過本領(lǐng)域公知的任何方法活化。一個示例性的活化程序依賴于羧酸向N-羥基琥珀酰亞胺酯的轉(zhuǎn)變。
方案15 在另一個示例性的實施方案中，如在下面方案(方案16)中所示的，N-乙?；耐僖核崾峭ㄟ^對pyruvyl部分的處理而轉(zhuǎn)變?yōu)榘返摹Ｒ蚨?，將伯羥基轉(zhuǎn)變?yōu)榛撬狨ゲ⑹蛊渑c疊氮化鈉反應(yīng)。將疊氮化物催化還原為相應(yīng)的胺。隨后將糖轉(zhuǎn)變?yōu)槠浜塑账犷愃莆?，并使其通過胺基團與如上所述制備的連接體臂衍生的甘露糖-6-磷酸偶聯(lián)。
方案16 用于治療溶酶體貯積病的肽可用其他導(dǎo)向部分進行衍生化，該導(dǎo)向部分包括但不局限于運鐵蛋白(將肽跨過血-腦屏障送遞和送到內(nèi)體)、肉堿(將肽送遞入肌肉細(xì)胞)和磷酸鹽，如二磷酸鹽(將肽導(dǎo)向到骨骼和其他鈣化的組織中)。導(dǎo)向部分和治療性肽是通過任何在此處討論的方法或另外本領(lǐng)域中公知的方法綴合的。
在一個示例性的實施方案中，導(dǎo)向劑和治療性肽是通過連接體部分偶聯(lián)的。在該實施方案中，至少一個治療性肽或?qū)騽┦歉鶕?jù)本發(fā)明的方法通過完整糖基連接基團與連接體部分偶聯(lián)的。在一個示例性的實施方案中，連接體部分包括聚(醚)如聚(乙二醇)。在另一個示例性的實施方案中，連接體部分包括至少一個在體內(nèi)降解的鍵，從而在將綴合物送遞到身體的目標(biāo)組織或區(qū)域中后從導(dǎo)向劑中釋放治療性肽。
在另外一個示例性的實施方案中，治療部分的體內(nèi)分配是通過改變治療部分上的糖形式而改變的，而無需將治療性肽與導(dǎo)向部分綴合。例如，通過用唾液酸(或其衍生物)對糖基基團的末端半乳糖部分進行加帽可使治療性肽避開網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的攝取(圖24和27)。覆蓋末端Gal的唾液酸化避免了肝脫唾液酸糖蛋白(ASGP)受體對肽的攝取，且可延伸該肽相對于無唾液酸化而僅具有復(fù)雜的聚糖鏈的肽的半衰期。
II.本發(fā)明的肽/糖肽在一個實施方案中，本發(fā)明提供了包含多拷貝的單個肽的組合物，該肽以基本的三甘露糖核心作為在其上附著的主要聚糖結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選的實施方案中，該肽可為治療性分子。該肽的天然形式可包含復(fù)雜的N-連接的聚糖或可為高甘露糖聚糖。該肽可為哺乳動物的肽，且優(yōu)選地為人類的肽。在一些實施方案中，該肽選自免疫球蛋白、促紅細(xì)胞生成素、組織型活化因子肽等(見圖28)。
其聚糖可用本發(fā)明的方法進行重構(gòu)的示例性肽在圖28中提出。
表6.用于進行聚糖重構(gòu)的優(yōu)選的肽
表7.用于進行聚糖重構(gòu)的最優(yōu)選的肽
用于本發(fā)明的肽及其來源的更詳細(xì)的列表在圖28中提出。
用本發(fā)明的方法修飾的其他示例性肽包括免疫球蛋白家族的成員(如抗體、MHC分子、T細(xì)胞受體等)、細(xì)胞間受體(如整合蛋白、激素或生長因子受體等)、凝集素和細(xì)胞因子(如白細(xì)胞介素)。額外的例子包括組織型血纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)、腎素、凝血因子如凝血因子VIII和凝血因子IX、鈴蟾肽、凝血酶、造血生長因子、集落刺激因子、病毒抗原、補體肽、α1-抗胰蛋白酶、促紅細(xì)胞生成素、P-選擇蛋白糖肽配體-1(PSGL-1)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、抗凝血酶III、白細(xì)胞介素、干擾素、肽A和C、血纖蛋白原、herceptinTM、leptin、糖苷酶等。該肽列表是示例性的，且并不應(yīng)該認(rèn)為是排它性的。相反，如從在此處提供的公開內(nèi)容中顯而易見的，本發(fā)明方法可應(yīng)用于任何肽中，在該肽中可形成任何想要的聚糖結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的方法也用于修飾嵌合的肽，該嵌合的肽包括但不局限于包括源自免疫球蛋白如IgG的部分的嵌合肽。
用本發(fā)明的方法修飾的肽可為合成的或野生型的肽，或者它們可為用本領(lǐng)域公知的方法產(chǎn)生的突變肽，如定點誘變。肽的糖基化一般是N-連接的或O-連接的。一個示例性的N-連接是修飾的糖向天冬酰胺殘基側(cè)鏈的附著。三肽結(jié)構(gòu)天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸是糖部分向天冬酰胺側(cè)鏈上酶促附著的識別序列，其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸。因而，肽中任何一個這些三肽序列的存在均產(chǎn)生了潛在的糖基化位點。如在別處所描述的，O-連接的糖基化指一個糖(如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、甘露糖、GlcNAc、葡萄糖、巖藻糖或木糖)向羥基氨基酸的羥基側(cè)鏈的附著，優(yōu)選地為絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可應(yīng)用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。
本發(fā)明的幾個示例性的實施方案在下面進行討論。盡管這些實施方案的幾個應(yīng)用具有商標(biāo)名稱的肽和其他特定的肽作為示例性的肽，但這些例子不局限于任何特定的肽。下面的示例性實施方案包括所有肽等價物和任何肽的變體。這種變體包括但不局限于添加和刪除N-連接的和O-連接的糖基化位點及具有添加的糖基化位點的融合蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解下面的實施方案和在此處公開的基本方法可同樣成功地應(yīng)用于許多肽。
在一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的方法。圖29A～29G提出了一些如何用在此處公開的方法實現(xiàn)該修飾的例子。在圖29B中，將在哺乳動物細(xì)胞中表達的G-CSF肽用唾液酸酶進行修剪。這樣暴露的殘基可通過用其適當(dāng)供體和ST3Gal1添加唾液酸-聚(乙二醇)部分(PEG部分)而修飾。圖29C提出了用于修飾在昆蟲細(xì)胞上表達的G-CSF肽的示例性方案。該肽是通過用其適當(dāng)?shù)墓w和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶添加半乳糖部分而修飾的。半乳糖殘基是通過ST3Gal1的作用和唾液酸-PEG衍生物用PEG進行官能化的。在圖29D中，使細(xì)菌表達的G-CSF與N-乙酰半乳糖胺供體和N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶接觸。該肽是通過PEG化的唾液酸供體和唾酸轉(zhuǎn)移酶用PEG官能化的。在圖29E中，使哺乳動物細(xì)胞表達的G-CSF與唾液酸供體接觸，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽上聚糖的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖29F中，細(xì)菌表達的G-CSF是通過使肽與內(nèi)切-GalNAc酶在其發(fā)揮合成功能而不是水解功能的條件下接觸而重構(gòu)的，從而從其活化的衍生物中添加PEG-Gal-GalNAc分子。圖29G提供了重構(gòu)細(xì)菌表達的G-CSF的另一個途徑。多肽是通過使該多肽與N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)腜EG化的N-乙酰半乳糖胺供體接觸而用PEG化的N-乙酰半乳糖胺殘基衍生化的。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾干擾素α-14C(IFNα14C)的方法，如圖30A～30N所示。IFNα的各種形式在別處公開。在圖30B中，將在哺乳動物細(xì)胞中表達的IFNα14C首先用唾液酸酶處理以修剪其上的唾液酸單位，然后用ST3Gal3和PEG化的唾液酸供體對該分子進行PEG化。在圖30C中，使N-乙酰葡糖胺首先添加到在昆蟲或真菌細(xì)胞中表達的IFNα14C上，該反應(yīng)是通過利用N-乙酰葡糖胺供體的GnT-I和/或II的作用進行的。然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG-半乳糖供體對該多肽進行PEG化。在圖30D中，使在酵母中表達的IFNα14C首先用Endo-H處理以修剪其上的糖基單位。用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和半乳糖供體對該分子進行半乳糖基化，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖30F中，用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對由哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的IFNα14C進行修飾以使其具有(inched)PEG部分。在圖30G中，首先用一種或多種GnT-I、II、IV和V和N-乙酰葡糖胺供體將N-乙酰葡糖胺添加到在昆蟲或真菌細(xì)胞中表達的IFNα14C中。隨后用適當(dāng)?shù)墓w和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對該蛋白質(zhì)進行半乳糖基化。然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對IFNα14C進行PEG化。在圖30H中，首先用甘露糖苷酶處理酵母產(chǎn)生的IFNα14C以修剪甘露糖基基團。然后用N-乙酰葡糖胺供體和一種或多種GnT-I、II、IV和V添加N-乙酰葡糖胺。進一步用適當(dāng)?shù)墓w和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對IFNα14C進行半乳糖基化。然后，用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對該多肽進行PEG化。在圖30I中，通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾NSO細(xì)胞表達的IFNα14C，其中該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖30J中，用PEG-唾液酸供體和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶對由哺乳動物細(xì)胞表達的IFNα14C進行PEG化。在圖30K中，首先用唾液酸酶處理由哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的IFNα14C以修剪末端唾液酸殘基，然后用反式唾液酸酶和PEG化的唾液酸-乳糖復(fù)合物對該分子進行PEG化。在圖30L中，用唾液酸供體和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶對由哺乳動物系統(tǒng)表達的IFNα14C進行唾液酸化。在圖30M中，首先用適當(dāng)?shù)墓w和GnT-I和/或II將N-乙酰葡糖胺添加到在昆蟲或真菌細(xì)胞中表達的IFNα14C中。然后使該分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和半乳糖供體接觸，該半乳糖供體是通過連接體用反應(yīng)性唾液酸衍生化的，從而該多肽可通過連接體和半乳糖殘基附著到反應(yīng)性唾液酸上。然后使該多肽與ST3Gal1和運鐵蛋白接觸，從而使其通過唾液酸殘基與運鐵蛋白連接。在圖30N中，首先用內(nèi)切聚糖酶處理昆蟲或真菌細(xì)胞中表達的IFNα14C以修剪糖基基團，然后使其與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和半乳糖供體接觸，該半乳糖供體是通過連接體用反應(yīng)性唾液酸衍生化的，從而該多肽可通過連接體和半乳糖殘基附著到反應(yīng)性唾液酸上。然后使該分子與ST3Gal3和運鐵蛋白接觸，從而使其通過唾液酸殘基與運鐵蛋白連接。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾干擾素α-2a或2b(IFNα)的方法，如圖30O～30EE所示。在圖30P中，將在哺乳動物細(xì)胞中表達的IFNα首先用唾液酸酶處理以修剪糖基單位，然后用ST3Gal3和PEG化的唾液酸供體對其進行PEG化。在圖30Q中，首先用適當(dāng)?shù)墓w和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對在昆蟲細(xì)胞中表達的IFNα進行半乳糖基化，然后用ST3Gal1和PEG化的唾液酸供體對其進行PEG化。圖30R提供了在細(xì)菌中重構(gòu)IFNα的另一種方法用適當(dāng)?shù)墓w和N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶將PEG化的N-乙酰半乳糖胺添加到蛋白質(zhì)中。在圖30S中，通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾在哺乳動物細(xì)胞中表達的IFNα，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖30T中，用以合成而不是水解方式發(fā)揮功能的修飾的酶內(nèi)切-N-乙酰半乳糖胺酶和用PEG部分衍生化的N-乙酰半乳糖胺供體對細(xì)菌表達的IFNα進行PEG化。在圖30U中，首先用適當(dāng)?shù)墓w和N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶將N-乙酰半乳糖胺添加到IFNα中，然后用唾酸轉(zhuǎn)移酶和PEG化的唾液酸供體對其進行PEG化。在圖30V中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物系統(tǒng)中表達的IFNα以修剪唾液酸殘基，然后用適當(dāng)?shù)墓w和ST3Gal1和/或ST3Gal3對其進行PEG化。在圖30W中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物系統(tǒng)中表達的IFNα以修剪唾液酸殘基。然后使該多肽與ST3Gal1和兩個通過連接體連接的反應(yīng)性唾液酸殘基接觸，從而將該多肽通過連接體和第二個唾液酸殘基附著到一個反應(yīng)性唾液酸上。隨后使該多肽與ST3Gal3和運鐵蛋白接觸，從而使其通過唾液酸殘基與運鐵蛋白連接。在圖30Y中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物系統(tǒng)中表達的IFNα以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal1和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖30Z中，用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG化的半乳糖供體對由昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生的IFNα進行PEG化。在圖30AA中，首先用適當(dāng)?shù)墓w和N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶將N-乙酰半乳糖胺添加到細(xì)菌表達的IFNα中。然后用唾酸轉(zhuǎn)移酶和PEG-唾液酸供體對該蛋白質(zhì)進行PEG化。在圖30CC中，細(xì)菌中表達的IFNα是以另一個程序修飾的即用PEG化的N-乙酰半乳糖胺供體通過N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶將PEG化的N-乙酰半乳糖胺添加到蛋白質(zhì)中。在圖30DD中，在細(xì)菌中表達的IFNα是以另一種方案重構(gòu)的。首先使該多肽與N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶和用反應(yīng)性唾液酸通過連接體衍生化的N-乙酰半乳糖胺供體接觸，從IFNα通過連接體和N-乙酰半乳糖胺附著到反應(yīng)性唾液酸上。然后使IFNα與ST3Gal3和脫唾液酸運鐵蛋白接觸，從而使其通過唾液酸殘基與運鐵蛋白連接。然后用ST3Gal3和唾液酸供體對IFNα進行唾液酸殘基加帽。修飾細(xì)菌表達的IFNα的額外方法在圖30EE中公開，其中首先使IFNα暴露于NHS-CO-連接體-SA-CMP中，然后使其通過連接體與反應(yīng)性唾液酸連接。隨后用ST3Gal3和運鐵蛋白使其與運鐵蛋白綴合。
對IFNω進行重構(gòu)的方法基本與此處對IFNα提供的方法相同，只是聚糖與IFNω肽的附著發(fā)生于SEQ ID NO75的氨基酸殘基101。IFNω的核苷酸和氨基酸序列在此處提供為SEQ ID NO74和75。制備和應(yīng)用IFNω的方法見美國專利No.4,917,887和5,317,089，以及歐洲專利No.0170204-A。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾干擾素β(IFNβ)的方法，如圖31A～31S所示。在圖31B中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物系統(tǒng)中表達的IFNβ以修剪末端唾液酸殘基。然后用ST3Gal3和PEG化的唾液酸供體對該蛋白質(zhì)進行PEG化。圖31C是修飾由昆蟲細(xì)胞產(chǎn)生的IFNβ的方案。首先用適當(dāng)?shù)墓w和GnT-I和/或-II將N-乙酰葡糖胺添加到IFNβ中。然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對該蛋白質(zhì)進行半乳糖基化。最后，用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對IFNβ進行PEG化。在圖31D中，首先用Endo-H處理在酵母中表達的IFNβ以修剪其糖基鏈，然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化，然后用ST3Gal3和PEG化的唾液酸供體對其進行PEG化。在圖31E中，由哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的IFNβ是用ST3Gal3和已用PEG部分衍生化的唾液酸供體進行PEG化修飾的。在圖31F中，首先用N-乙酰葡糖胺供體通過一種或多種GnT-I、II、IV和V將N-乙酰葡糖胺添加到在昆蟲細(xì)胞中表達的IFNβ中，然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖31G中，首先用甘露糖苷酶處理在酵母中表達的IFNβ以修剪甘露糖單位，然后用N-乙酰葡糖胺供體通過一種或多種GnT-I、II、IV和V添加N-乙酰葡糖胺。將該蛋白質(zhì)進一步用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶進行半乳糖基化，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖31H中，通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾哺乳動物細(xì)胞表達的IFNβ，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖31I中，用PEG-唾液酸供體和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶對哺乳動物系統(tǒng)中表達的IFNβ進行PEG化。在圖31J中，首先用唾液酸酶處理由哺乳動物細(xì)胞表達的IFNβ以修剪末端唾液酸殘基，然后用反式唾液酸酶和PEG化的唾液酸供體對其進行PEG化。在圖31K中，首先用唾液酸酶處理哺乳動物細(xì)胞中表達的IFNβ以修剪末端唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化，且然后用ST3Gal3和唾液酸供體對其進行唾液酸化。在圖31L中，首先用唾液酸酶和半乳糖苷酶處理哺乳動物細(xì)胞中表達的IFNβ以修剪糖基鏈，然后用半乳糖供體和α-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化，且然后用ST3Gal3或唾酸轉(zhuǎn)移酶和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖31M中，首先用唾液酸酶處理哺乳動物細(xì)胞中表達的IFNβ以修剪糖基單位。然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化，且然后用ST3Gal3和唾液酸供體對其進行唾液酸化。在圖31N中，通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾哺乳動物細(xì)胞表達的IFNβ，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖310中，用唾液酸供體和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶對哺乳動物細(xì)胞中表達的IFNβ進行唾液酸化。在圖31Q中，首先用N-乙酰葡糖胺供體通過一種或多種GnT-I、II、IV和V將N-乙酰葡糖胺添加到在昆蟲細(xì)胞中表達的IFNβ中，并進一步用PEG-半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行PEG化。在圖31R中，首先用內(nèi)切聚糖酶處理酵母中表達的IFNβ以修剪糖基基團，然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化，且然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖31S中，首先使在哺乳動物系統(tǒng)中表達的IFNβ與ST3Gal3和兩個通過連接體連接的反應(yīng)性唾液酸接觸，從而將該多肽通過連接體和第二個唾液酸殘基附著到一個反應(yīng)性唾液酸上。然后使該多肽與ST3Gal3和脫唾液酸化的運鐵蛋白接觸，從而使其通過唾液酸殘基與運鐵蛋白連接。然后，進一步用唾液酸供體和ST3Gal3對IFNβ進行唾液酸化。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾凝血因子VII或VIIa的方法，如圖32A～32D所示。在圖32B中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物系統(tǒng)中產(chǎn)生的凝血因子VII或VIIa以修剪末端唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG化的唾液酸供體對其進行PEG化。在圖32C中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的凝血因子VII或VIIa以修剪末端唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG化的唾液酸供體對其進行PEG化。進一步地，用ST3Gal3和唾液酸供體對該多肽進行唾液酸化。圖32D提供了對由哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的凝血因子VII或VIIa的另一種修飾方案即首先用唾液酸酶和半乳糖苷酶處理該多肽以修剪其唾液酸和半乳糖殘基，然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和半乳糖供體對其進行半乳糖基化，且然后用ST3Gal3和PEG化的唾液酸供體對其進行PEG化。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾凝血因子IX的方法，其一些例子包括于圖33A～33G中。在圖33B中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生的凝血因子IX以修剪末端唾液酸殘基，然后以PEG-唾液酸為供體用ST3Gal3對其進行PEG化。在圖33C中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的凝血因子IX以修剪末端唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化，并進一步用ST3Gal1和唾液酸供體對該多肽進行唾液酸化。在圖33D中可發(fā)現(xiàn)對哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的凝血因子IX進行重構(gòu)的另一種方案。首先用唾液酸酶處理該多肽以修剪末端唾液酸殘基，然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化，進一步用唾液酸供體和ST3Gal3對其進行唾液酸化，且然后用PEG化的唾液酸供體和ST3Gal1對其進行PEG化。在圖33E中，在哺乳動物系統(tǒng)中表達的凝血因子IX是通過用PEG-唾液酸供體以ST3Gal3催化的唾液酸化過程而PEG化的。在圖33F中，通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾哺乳動物細(xì)胞表達的凝血因子IX，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。圖33G提供了修飾凝血因子IX的額外的方法。由哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的該多肽是用PEG-唾液酸供體和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶進行PEG化的。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾促卵泡激素(FSH)的方法。圖34A～34J提供了一些例子。在圖34B中，F(xiàn)SH是在哺乳動物系統(tǒng)中表達的并通過唾液酸酶處理來修飾以修剪末端唾液酸殘基，隨后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖34C中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的FSH以修剪末端唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化，且然后用ST3Gal3和唾液酸供體對其進行唾液酸化。圖34D提供了修飾哺乳動物系統(tǒng)中表達的FSH的方案。用唾液酸酶和半乳糖苷酶處理該多肽以修剪其唾液酸和半乳糖殘基，然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化，且然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖34E中，在哺乳動物細(xì)胞中表達的FSH是用下面的程序修飾的即首先用唾液酸酶處理FSH以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化，且然后用ST3Gal3和唾液酸供體對其進行唾液酸化。圖34F提供了修飾由哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的FSH的另一個例子即通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾該多肽，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖34G中，表達于哺乳動物系統(tǒng)中的FSH是用另一種程序修飾的即通過用唾液酸供體和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶添加唾液酸而對該多肽進行重構(gòu)。在圖34H中，F(xiàn)SH是表達于昆蟲細(xì)胞中的且用下面的程序進行修飾即用適當(dāng)?shù)腘-乙酰葡糖胺供體通過一種或多種GnT-I、II、IV和V將N-乙酰葡糖胺添加到FSH中；然后用PEG-半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對FSH進行PEG化。圖34I描述了修飾由酵母產(chǎn)生的FSH的方案。根據(jù)該方案，首先用內(nèi)切聚糖酶處理FSH以修剪糖基基團，然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化，且然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖34J中，首先使在哺乳動物細(xì)胞中表達的FSH與ST3Gal3和兩個通過連接體連接的反應(yīng)性唾液酸殘基接觸，從而將該多肽通過連接體和第二個唾液酸殘基附著到反應(yīng)性唾液酸上。然后使該多肽與ST3Gal1和在CHO中產(chǎn)生的脫唾液酸化的絨毛膜促性腺激素(CG)接觸，從而使其通過唾液酸殘基與CG連接。然后，用唾液酸供體和ST3Gal3和/或ST3Gal1對FSH進行唾液酸化。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾促紅細(xì)胞生成素(EPO)的方法。圖35A～35從提出了一些與重構(gòu)野生型或突變的EPO肽相關(guān)的例子。在圖35B中，EPO是在各種哺乳動物系統(tǒng)中表達的并通過使表達的蛋白質(zhì)與唾液酸酶接觸以除去末端唾液酸殘基而進行重構(gòu)。使結(jié)果所得的肽與唾酸轉(zhuǎn)移酶和用PEG部分衍生化的CMP-唾液酸接觸。在圖35C中，在昆蟲細(xì)胞中表達的EPO是用GnT-I和/或-II以N-乙酰葡糖胺進行重構(gòu)的。然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶把半乳糖加到該肽上。PEG基團是通過使肽與唾酸轉(zhuǎn)移酶和用PEG部分衍生化的CMP-唾液酸接觸而添加到重構(gòu)的肽上的。在圖35D中，在哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中表達的EPO是通過唾酸轉(zhuǎn)移酶的作用去除末端唾液酸殘基而進行重構(gòu)的。N-連接的糖基基團的末端半乳糖殘基是用ST3Gal3和唾液酸供體以唾液酸“加帽的”。用適當(dāng)?shù)耐僖核峁w和ST3Gal1以攜帶有PEG部分的唾液酸對O-連接聚糖的末端半乳糖殘基進行官能化。在圖35E中，表達于哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中的EPO是通過用PEG-衍生化的唾液酸部分對N-連接的糖基殘基的官能化而重構(gòu)的。使該肽與ST3Gal3和適當(dāng)修飾的唾液酸供體接觸。在圖35F中，表達于昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)、酵母或真菌中的EPO是通過添加至少一個N-乙酰葡糖胺殘基而重構(gòu)的，這些N-乙酰葡糖胺殘基是通過使肽與N-乙酰葡糖胺供體和一種或多種GnT-I、GnT-II和GnT-V接觸而添加的。然后通過使該肽與PEG化的半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶接觸而對其進行PEG化。在圖35G中，表達于昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)、酵母或真菌中的EPO是通過用適當(dāng)?shù)腘-乙酰葡糖胺供體和一種或多種GnT-I、GnT-II和GnT-V添加至少一種N-乙酰葡糖胺殘基而進行重構(gòu)的。將改變?yōu)橐院铣啥皇撬夥绞桨l(fā)揮功能的半乳糖苷酶用于將活化的PEG化半乳糖供體添加到N-乙酰葡糖胺殘基上。在圖35H中，將表達于昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)、酵母或真菌中的EPO通過添加至少一個末端N-乙酰葡糖胺-PEG殘基進行重構(gòu)。使肽與GnT-I和用PEG部分衍生化的適當(dāng)N-乙酰葡糖胺供體進行接觸。在圖35I中，將表達于昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)、酵母或真菌中的EPO通過添加一個或多個末端半乳糖-PEG殘基進行重構(gòu)。使肽與GnT-I和用PEG部分衍生化的適當(dāng)N-乙酰葡糖胺供體進行接觸。然后使肽與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和用PEG部分修飾的適當(dāng)半乳糖供體進行接觸。在圖35J中，將表達于昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)、酵母或真菌中的EPO通過再添加一個末端唾液酸-PEG殘基進行重構(gòu)。使肽與適當(dāng)N-乙酰葡糖胺供體和GnT-I進行接觸。進一步使肽與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)半乳糖供體進行接觸。然后使肽與ST3Gal3和用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體進行接觸。在圖35K中，將表達于昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)、酵母或真菌中的EPO通過添加末端唾液酸-PEG殘基進行重構(gòu)。使肽與適當(dāng)N-乙酰葡糖胺供體和一個或多個GnT-I、GnT-II和GnT-V進行接觸。然后使肽與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)半乳糖供體進行接觸。進一步使肽與ST3Gal3和用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體進行接觸。在圖35L中，將表達于昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)、酵母或真菌中的EPO通過添加一個或多個末端α2，6-唾液酸-PEG殘基進行重構(gòu)。使肽與適當(dāng)N-乙酰葡糖胺供體和一個或多個GnT-I、GnT-II和GnT-V進行接觸。進一步使肽與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)半乳糖供體進行接觸。然后使肽與α2，6-唾酸轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)修飾的唾液酸供體進行接觸。在圖35M中，將表達于哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中的EPO通過添加一個或多個末端唾液酸-PEG殘基進行重構(gòu)。使肽與唾液酸酶進行接觸以除去末端唾液酸殘基。進一步使肽與唾酸轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)耐僖核峁w進行接觸。進一步使肽與唾酸轉(zhuǎn)移酶和用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體進行接觸。在圖35N中，將表達于哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中的EPO通過添加一個或多個末端唾液酸-PEG殘基進行重構(gòu)。使肽與唾酸轉(zhuǎn)移酶和用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體進行接觸。在圖350中，將表達于哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中的EPO通過向主要O-連接的聚糖添加一個或多個末端α2，8-唾液酸-PEG殘基進行重構(gòu)。使肽與α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶和用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體進行接觸。在圖35P中，將表達于哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中的EPO通過向O-連接的和N-連接的聚糖添加一個或多個末端α2，8-唾液酸-PEG殘基進行重構(gòu)。使肽與α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶和用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體進行接觸。在圖35Q中，將表達于酵母或真菌中的EPO通過添加一個或多個末端唾液酸-PEG殘基進行重構(gòu)。使肽與甘露糖苷酶進行接觸以除去末端甘露糖殘基。下一步，使肽與GnT-I和適當(dāng)?shù)腘-乙酰葡糖胺供體進行接觸。進一步使肽與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)陌肴樘枪w進行接觸。然后使肽與唾酸轉(zhuǎn)移酶和用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體進行接觸。在圖35R中，將表達于酵母或真菌中的EPO通過添加至少一個末端N-乙酰葡糖胺-PEG殘基進行重構(gòu)。使肽與甘露糖苷酶進行接觸以除去末端甘露糖殘基。然后使肽與GnT-I和用PEG部分衍生化的適當(dāng)N-乙酰葡糖胺供體進行接觸。在圖35S中，將表達于酵母或真菌中的EPO通過添加一個或多個末端唾液酸-PEG殘基進行重構(gòu)。使肽與甘露糖苷酶-I進行接觸以除去α2甘露糖殘基。進一步使肽與GnT-I和適當(dāng)?shù)腘-乙酰葡糖胺供體進行接觸。然后使肽與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)陌肴樘枪w進行接觸。然后使肽與唾酸轉(zhuǎn)移酶和用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體進行接觸。在圖35U中，將表達于酵母或真菌中的EPO通過添加一個或多個半乳糖-PEG殘基進行重構(gòu)。使肽與endo-H進行接觸以修剪至糖基基團。然后使肽與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和用PEG部分衍生化的適當(dāng)半乳糖供體進行接觸。在圖35V中，將表達于酵母或真菌中的EPO通過添加一個或多個末端唾液酸-PEG殘基進行重構(gòu)。使肽與endo-H進行接觸以修剪至糖基基團。進一步使肽與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)陌肴樘枪w進行接觸。然后使肽與唾酸轉(zhuǎn)移酶和用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體進行接觸。在圖35W中，將表達于昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中的EPO通過添加末端半乳糖-PEG殘基進行重構(gòu)。使肽與甘露糖苷酶進行接觸以除去末端甘露糖殘基。然后使肽與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和用PEG部分衍生化的適當(dāng)半乳糖供體進行接觸。在圖35Y中，將表達于NSO鼠骨髓瘤細(xì)胞中的稱為“新型紅細(xì)胞發(fā)生刺激蛋白質(zhì)”或NESP的突變的EPO通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而重構(gòu)，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖35Z中，將表達于哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中的突變EPO即NESP通過添加一個或多個末端唾液酸-PEG殘基進行重構(gòu)。應(yīng)用PEG修飾的唾液酸和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶將PEG添加到聚糖上的糖基殘基上。在圖35從中，將表達于哺乳動物細(xì)胞系統(tǒng)中的NESP通過添加末端唾液酸殘基進行重構(gòu)。唾液酸是用唾液酸供體和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶添加到糖基殘基上的。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了重構(gòu)粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的方法，如圖36A～36K所示。在圖36B中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的GM-CSF以修剪唾液酸殘基，隨后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖36C中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的GM-CSF以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化，且然后進一步用唾液酸供體和ST3Gal3和/或ST3Gal1對其進行唾液酸化。在圖36D中，首先用唾液酸酶和α-半乳糖苷酶處理在NSO細(xì)胞中表達的GM-CSF以修剪糖基基團，然后用唾液酸供體和ST3Gal3對其進行唾液酸化，且然后用ST3Gal1和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖36E中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的GM-CSF以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化，且然后用ST3Gal3和唾液酸供體對其進行唾液酸化。在圖36F中，通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾在哺乳動物細(xì)胞中表達的GM-CSF，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖36G中，表達于哺乳動物細(xì)胞中的GM-CSF是用唾液酸供體和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶進行唾液酸化的。在圖36I中，表達于昆蟲細(xì)胞中的GM-CSF的修飾是通過用適當(dāng)?shù)墓w和一種或多種GnT-I、II、IV和V添加N-乙酰葡糖胺，及隨后用適當(dāng)?shù)墓w和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶添加PEG化的半乳糖而進行的。在圖36J中，首先用內(nèi)切聚糖酶和/或甘露糖苷酶處理酵母表達的GM-CSF以修剪糖基單位，隨后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG-半乳糖供體對其進行PEG化。在圖36K中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的GM-CSF以修剪唾液酸殘基，且隨后用ST3Gal1和唾液酸供體對其進行唾液酸化。然后使該多肽與ST3Gal1和兩個通過連接體連接的反應(yīng)性唾液酸殘基接觸，從而將該多肽通過連接體和第二個唾液酸殘基附著到一個反應(yīng)性唾液酸上。進一步使該多肽與ST3Gal3和運鐵蛋白接觸，從而使其與運鐵蛋白連接。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾干擾素γ(IFNγ)的方法。圖37A～37N含有一些例子。在圖37B中，首先用唾液酸酶處理在各種哺乳動物細(xì)胞中表達的IFNγ以修剪末端唾液酸殘基，隨后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖37C中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物系統(tǒng)中表達的IFNγ以修剪末端唾液酸殘基。然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對該多肽進行PEG化，并進一步用ST3Gal3和唾液酸供體對其進行唾液酸化。在圖37D中，首先用唾液酸酶和α-半乳糖苷酶處理哺乳動物細(xì)胞表達的IFNγ以修剪唾液酸和半乳糖殘基。然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對該多肽進行半乳糖基化。然后用PEG-唾液酸供體和ST3Gal3對IFNγ進行PEG化。在圖37E中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物系統(tǒng)中表達的IFNγ以修剪末端唾液酸殘基。然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對該多肽進行PEG化，并進一步用ST3Gal3和唾液酸供體對其進行唾液酸化。圖37F描述了修飾在哺乳動物系統(tǒng)中表達的IFNγ的另一種方法。通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾該蛋白質(zhì)，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖37G中，表達于哺乳動物細(xì)胞中的IFNγ是通過用唾液酸供體和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶添加唾液酸而進行重構(gòu)的。在圖37I中，表達于昆蟲或真菌細(xì)胞中的IFNγ是通過用適當(dāng)?shù)墓w和一種或多種GnT-I、II、IV和V添加N-乙酰葡糖胺而修飾的。該蛋白質(zhì)進一步通過用PEG化的半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶添加PEG部分而進行修飾。圖37J提供了修飾在酵母中表達的IFNγ的方法。首先用內(nèi)切聚糖酶處理該多肽以修剪糖鏈，隨后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化。然后用PEG化的唾液酸供體和ST3Gal3對IFNγ進行PEG化。在圖37K中，哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的IFNγ是如下進行修飾的首先使該多肽與ST3Gal3和唾液酸供體接觸，該唾液酸供體是通過連接體用反應(yīng)性半乳糖衍生化的，從而該多肽可通過連接體和唾液酸殘基附著到反應(yīng)性半乳糖上。然后使該多肽與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和用內(nèi)切聚糖酶預(yù)先處理的運鐵蛋白接觸，從而使其通過半乳糖殘基與運鐵蛋白連接。在由圖37L描述的方案中，表達于哺乳動物系統(tǒng)中的IFNγ是通過ST3Gal3的作用而修飾的即使PEG化的唾液酸從適當(dāng)?shù)墓w轉(zhuǎn)移到IFNγ上。圖37M是修飾表達于昆蟲或真菌細(xì)胞中的IFNγ的例子，其中多肽的PEG化是通過用GnT-I和/或II將PEG化的N-乙酰葡糖胺從供體轉(zhuǎn)移到IFNγ上而實現(xiàn)的。在圖37N中，表達于哺乳動物系統(tǒng)中的IFNγ是通過用適當(dāng)?shù)墓w和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶添加PEG化的唾液酸而重構(gòu)的。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾α1抗胰蛋白酶(α1-蛋白酶抑制劑)的方法。一些這種例子可發(fā)現(xiàn)于圖38A～380中。在圖38B中，首先用唾液酸酶處理在各種哺乳動物細(xì)胞中表達的α1抗胰蛋白酶以修剪唾液酸殘基。然后用適當(dāng)?shù)墓w如CMP-SA-PEG和唾酸轉(zhuǎn)移酶如ST3Gal3添加PEG化的唾液酸殘基。圖38C中示范了α1抗胰蛋白酶修飾的另一種方案。首先用唾液酸酶處理在哺乳動物系統(tǒng)中表達的α1抗胰蛋白酶以修剪唾液酸殘基。然后用適當(dāng)?shù)墓w和唾酸轉(zhuǎn)移酶如ST3Gal3添加用PEG衍生化的唾液酸殘基。隨后，進一步通過用唾液酸供體和ST3Gal3添加唾液酸殘基而修飾該分子。任選地，首先用唾液酸酶和α-半乳糖苷酶處理哺乳動物細(xì)胞表達的α1抗胰蛋白酶以修剪唾液酸和α-連接的半乳糖殘基。然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)陌肴樘枪w對該多肽進行半乳糖基化。進一步地，通過利用PEG化的唾液酸供體的ST3Gal3作用添加用PEG衍生化的唾液酸。在圖38D中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物系統(tǒng)中表達的α1抗胰蛋白酶，從而修剪末端唾液酸殘基。然后通過ST3Gal3的作用將PEG添加到N-連接的糖基殘基上，該ST3Gal3介導(dǎo)PEG化的唾液酸從供體如CMP-SA-PEG向α1抗胰蛋白酶的轉(zhuǎn)移。隨后用唾液酸供體和ST3Gal3附著了更多的唾液酸殘基。圖38E描述了重構(gòu)α1抗胰蛋白酶的另一種方法。通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾表達于哺乳動物細(xì)胞中的α1抗胰蛋白酶，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖38F中，公開了α1抗胰蛋白酶修飾的另外一個方法。從哺乳動物表達系統(tǒng)中獲得的α1抗胰蛋白酶是通過用唾液酸供體和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶添加唾液酸而進行重構(gòu)的。在圖38H中，α1抗胰蛋白酶是表達于昆蟲或酵母細(xì)胞中的，且是通過使該多肽與UDP-N-乙酰葡糖胺和一種或多種GnT-I、II、IV或V接觸以添加末端N-乙酰葡糖胺殘基而進行重構(gòu)的。然后，利用PEG化的半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶以PEG部分對該多肽進行修飾。在圖38I中，首先用內(nèi)切聚糖酶處理在酵母細(xì)胞中表達的α1抗胰蛋白酶以修剪糖鏈。然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和半乳糖供體對其進行半乳糖基化。然后，用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對該多肽進行PEG化。在圖38J中，α1抗胰蛋白酶是在哺乳動物系統(tǒng)中表達的。首先使該多肽與ST3Gal3和唾液酸供體接觸，該唾液酸供體是通過連接體用反應(yīng)性半乳糖衍生化的，從而該多肽可通過連接體和唾液酸殘基附著到反應(yīng)性半乳糖上。然后使該多肽與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和用內(nèi)切聚糖酶預(yù)先處理的運鐵蛋白接觸，從而使其通過半乳糖殘基與運鐵蛋白連接。在圖38L中，首先用內(nèi)切聚糖酶處理在酵母中表達的α1抗胰蛋白酶以修剪其糖基基團。然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和具有PEG部分的半乳糖基供體對該蛋白質(zhì)進行PEG化。在圖38M中，用氨基己糖苷酶、甘露糖苷酶和木糖苷酶處理在植物細(xì)胞中表達的α1抗胰蛋白酶以修剪其糖基鏈，并隨后用N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)墓w以用PEG部分衍生化的N-乙酰葡糖胺進行修飾。在圖38N中，表達于哺乳動物細(xì)胞中的α1抗胰蛋白酶是通過用ST3Gal3和用PEG衍生化的唾液酸供體添加PEG化的唾液酸殘基而修飾的。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾葡糖腦苷脂酶(β-葡糖苷酶、CerezymeTM或CeredaseTM)的方法，如圖39A～39K所示。在圖39B中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物系統(tǒng)中表達的CerezymeTM以修剪末端唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖39C中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的CerezymeTM以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和用甘露糖-6-磷酸衍生化的反應(yīng)性唾液酸來附著甘露糖-6-磷酸，且然后用ST3Gal3和唾液酸供體對其進行唾液酸化。任選地，首先用唾液酸酶和半乳糖苷酶處理NSO細(xì)胞表達的CerezymeTM以修剪糖基基團，然后用半乳糖供體和α-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化。然后，甘露糖-6-磷酸部分可用ST3Gal3和用甘露糖-6-磷酸衍生化的反應(yīng)性唾液酸添加到該分子上。在圖39D中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的CerezymeTM以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化，且然后用ST3Gal3和唾液酸對其進行唾液酸化。在圖39E中，通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾表達于哺乳動物細(xì)胞中的CerezymeTM，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如例如一種或多種甘露糖-6-磷酸基團的部分進行衍生化。在圖39F中，表達于哺乳動物細(xì)胞中的CerezymeTM是用唾液酸供體和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶進行唾液酸化的。在圖39H中，用適當(dāng)?shù)墓w和一種或多種GnT-I、II、IV和V向表達于昆蟲細(xì)胞中的CerezymeTM中添加N-乙酰葡糖胺，然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG-半乳糖供體對其進行PEG化。在圖39I中，首先用內(nèi)切聚糖酶處理在酵母細(xì)胞中表達的CerezymeTM以修剪糖基基團，然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化，且然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對該多肽進行PEG化。在圖39JK中，首先使表達于哺乳動物細(xì)胞中的CerezymeTM與ST3Gal3和兩個通過連接體連接的反應(yīng)性唾液酸殘基接觸，從而將該多肽通過連接體和第二個唾液酸殘基附著到一個反應(yīng)性唾液酸上。然后使該多肽與ST3Gal3和脫唾液酸化的運鐵蛋白接觸，從而使其與運鐵蛋白連接。然后用唾液酸供體和ST3Gal3對該多肽進行唾液酸化。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于組織型血纖維蛋白溶酶原活化因子(TPA)及其突變體的修飾方法。在圖40A～40W中給出了幾個特定的修飾方案。圖40B闡明了一種修飾程序在TPA在哺乳動物細(xì)胞中表達之后，用一種或多種甘露糖苷酶和唾液酸酶對其進行處理以修剪甘露糖基和/或唾液酸殘基。然后通過使多肽與適當(dāng)?shù)腘-乙酰葡糖胺供體和一種或多種GnT-I、II、IV和V接觸而添加末端N-乙酰葡糖胺。進一步用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對TPA進行半乳糖基化。然后通過由ST3Gal3催化和用PEG部分衍生化的唾液酸供體的唾液酸化將PEG附著到該分子上。在圖40C中，TPA是在昆蟲或真菌細(xì)胞中表達的。該修飾包括以下步驟，即用適當(dāng)?shù)腘-乙酰葡糖胺供體和GnT-I和/或II添加N-乙酰葡糖胺；用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶進行半乳糖基化；和通過用ST3Gal3和PEG部分衍生化的唾液酸供體的唾液酸化附著PEG。在圖40D中，TPA是在酵母中表達的，并隨后用內(nèi)切聚糖酶對其進行處理以修剪糖鏈。該多肽進一步通過半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的作用而PEG化，該半乳糖基轉(zhuǎn)移酶催化PEG-半乳糖從供體向TPA的轉(zhuǎn)移。在圖40E中，TPA是在昆蟲或酵母細(xì)胞中表達的。然后用α-和β-甘露糖苷酶處理該多肽以修剪末端甘露糖殘基。進一步地，PEG部分是通過PEG-半乳糖從適當(dāng)?shù)墓w向TPA的轉(zhuǎn)移而附著到該分子上的，該轉(zhuǎn)移是由半乳糖基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的。圖40F提供了對從昆蟲或酵母系統(tǒng)中獲得的TPA進行修飾的不同方法對該多肽的重構(gòu)為用N-乙酰葡糖胺供體和GnT-I和/或II添加N-乙酰葡糖胺，隨后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG化的半乳糖供體對其進行PEG化。圖40G提供了對表達于昆蟲或酵母細(xì)胞中的TPA進行重構(gòu)的另一種方案。末端N-乙酰葡糖胺是用N-乙酰葡糖胺供體和GnT-I和/或II添加的。將修飾為以合成而不是水解方式發(fā)揮功能的半乳糖苷酶用于將PEG化的半乳糖從適當(dāng)?shù)墓w添加到N-乙酰葡糖胺殘基上。在圖40I中，首先用唾液酸酶和半乳糖苷酶處理表達于哺乳動物系統(tǒng)中的TPA以修唾液酸和半乳糖殘基。通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而進一步修飾該多肽，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖40J中，表達于哺乳動物系統(tǒng)中的TPA是根據(jù)下面的方案重構(gòu)的首先，用α-和β-甘露糖苷酶處理該多肽以修剪末端甘露糖殘基；然后用唾液酸供體和ST3Gal3將唾液酸殘基附著到末端半乳糖殘基上；進一步地，TPA通過由半乳糖基轉(zhuǎn)移酶催化的PEG化半乳糖從供體向N-乙酰葡糖胺殘基轉(zhuǎn)移而PEG化。在圖40K中，TPA是在植物系統(tǒng)中表達的。在該例子中的修飾程序如下首先用氨基己糖苷酶、甘露糖苷酶和木糖苷酶處理TPA以修剪其糖基基團；然后用適當(dāng)?shù)墓w和N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶將PEG化的N-乙酰葡糖胺添加到TPA中。在圖40M中，對表達于哺乳動物細(xì)胞中的TPA突變體(TNK TPA)進行了重構(gòu)。首先用唾液酸酶修剪末端唾液酸殘基；然后將ST3Gal3用于將PEG化的唾液酸從供體向TNK TPA轉(zhuǎn)移，從而使該多肽PEG化。在圖40N中，首先用唾液酸酶處理表達于哺乳動物系統(tǒng)中的TNK TPA以修剪末端唾液酸殘基。然后用CMP-SA-PEG作為供體和ST3Gal3將該蛋白質(zhì)PEG化，并進一步用唾液酸供體和ST3Gal3對其進行唾液酸化。在圖400中，首先用唾液酸酶和α-半乳糖苷酶處理NSO細(xì)胞表達的TNK TPA以修剪末端唾液酸和半乳糖殘基。然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對TNK TPA進行半乳糖基化。該重構(gòu)方案中的最后步驟是用唾酸轉(zhuǎn)移酶如ST3Gal3將PEG部分衍生化的唾液酸從供體轉(zhuǎn)移到TNK TPA中。在圖40Q中，TNK TPA是在哺乳動物系統(tǒng)中表達的，且首先用唾液酸酶對其進行處理以修剪末端唾液酸殘基。然后用ST3Gal3和PEG化的唾液酸供體對該蛋白質(zhì)進行PEG化。然后用唾液酸供體和ST3Gal3對該蛋白質(zhì)進行唾液酸化。在圖40R中，通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾表達于哺乳動物系統(tǒng)中的TNK TPA，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖40S中，表達于哺乳動物細(xì)胞中的TNK TPA是通過不同的方法修飾的該多肽是通過用唾液酸供體和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶添加唾液酸而進行重構(gòu)的。在圖40U中，表達于昆蟲細(xì)胞中的TNK TPA是通過用適當(dāng)?shù)墓w和一種或多種GnT-I、II、IV和V添加N-乙酰葡糖胺而進行重構(gòu)的。該蛋白質(zhì)進一步通過用PEG化的半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶添加PEG部分而進行修飾。在圖40V中，TNK TPA是在酵母中表達的。首先用內(nèi)切聚糖酶處理該多肽以修剪其糖基鏈，然后用PEG衍生化的半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行PEG化。在圖40W中，TNK TPA是在哺乳動物系統(tǒng)中產(chǎn)生的。首先使該多肽與ST3Gal3和唾液酸供體接觸，該唾液酸供體是通過連接體用反應(yīng)性半乳糖衍生化的，從而該多肽可通過連接體和唾液酸殘基附著到反應(yīng)性半乳糖上。然后使該多肽與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和CHO中產(chǎn)生的抗-TNF IG嵌合體接觸，從而使其通過半乳糖殘基與嵌合體連接。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾白細(xì)胞介素-2(IL-2)的方法。圖41A～41G提供了一些例子。圖41B提供了兩步驟的修飾方案首先用唾液酸酶處理由哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的IL-2以修剪末端唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG化的唾液酸供體對其進行PEG化。在圖41C中，昆蟲細(xì)胞表達的IL-2是首先用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的半乳糖基化進行修飾的。隨后用ST3Gal3和PEG化的唾液酸供體對IL-2進行PEG化。在圖41D中，在細(xì)菌中表達的IL-2是用適當(dāng)?shù)墓w和N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶以N-乙酰葡糖胺修飾的，隨后為用PEG-唾液酸供體和唾酸轉(zhuǎn)移酶的PEG化步驟。圖41E提供了修飾由哺乳動物系統(tǒng)產(chǎn)生的IL-2的另一種方案。通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾該多肽，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。圖41F闡明了對由大腸桿菌表達的IL-2進行重構(gòu)的例子。該多肽是用PEG基團衍生化的反應(yīng)性N-乙酰葡糖胺復(fù)合物和一種酶進行PEG化的，其中對該酶進行了修飾從而它的功能為合成酶而不是水解酶。在圖41G中，由細(xì)菌表達的IL-2是通過用適當(dāng)?shù)墓w和N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶添加PEG化的N-乙酰半乳糖胺而修飾的。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾凝血因子VIII的方法，如圖42A～42N所示。在圖42B中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的凝血因子VIII以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖42C中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的凝血因子VIII以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和適當(dāng)?shù)墓w對其進行PEG化，并進一步用ST3Gal1和唾液酸供體對其進行唾液酸化。
在圖42E中，哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的凝血因子VIII是通過用ST3Gal3和PEG化的唾液酸供體進行的一步PEG化修飾的。圖42F提供了修飾表達于哺乳動物細(xì)胞中的凝血因子VIII的另一個例子。該蛋白質(zhì)是用ST3Gal1和PEG化的唾液酸供體PEG化的。在圖42G中，哺乳動物細(xì)胞表達的凝血因子VIII是根據(jù)下面的方案重構(gòu)的即用α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖42I中，通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾由哺乳動物細(xì)胞表達的凝血因子VIII，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖42J中，首先將哺乳動物細(xì)胞表達的凝血因子VIII用Endo-H處理，以修剪至糖基基團。然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG-半乳糖供體進行PEG化。在圖42K中，首先用ST3Gal3和唾液酸供體對表達于哺乳動物系統(tǒng)中的凝血因子VIII進行唾液酸化，然后用Endo-H處理以修剪糖基基團，然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG-半乳糖供體進行PEG化。在圖42L中，首先用甘露糖苷酶處理表達于哺乳動物系統(tǒng)中的凝血因子VIII以修剪末端甘露糖殘基，然后用適當(dāng)?shù)墓w和GnT-I和/或II添加N-乙酰葡糖胺基團，然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG-半乳糖供體進行PEG化。在圖42M中，首先用甘露糖苷酶處理表達于哺乳動物細(xì)胞中的凝血因子VIII以修剪甘露糖單位，然后用N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)墓w添加N-乙酰葡糖胺基團。進一步用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和半乳糖供體進行半乳糖基化，然后用ST3Gal3和唾液酸供體進行唾液酸化。在圖42N中，由哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生凝血因子VIII并進行如下修飾首先用甘露糖苷酶處理以修剪末端甘露糖殘基。然后用GnT-I和適當(dāng)?shù)腜EG化N-乙酰葡糖胺供體添加PEG化的N-乙酰葡糖胺基團。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾尿激酶的方法，如圖43A～43M所示。在圖43B中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的尿激酶以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG化的唾液酸供體對其進行PEG化。在圖43C中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的尿激酶以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG化的唾液酸供體對其進行PEG化，且然后用ST3Gal3和唾液酸供體對其進行唾液酸化。任選地，首先用唾液酸酶和半乳糖苷酶處理哺乳動物系統(tǒng)中表達的尿激酶以修剪糖基鏈，然后用半乳糖供體和α-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化，且然后用ST3Gal3或唾酸轉(zhuǎn)移酶和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖43D中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的尿激酶以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化，且進一步用ST3Gal3和唾液酸供體對其進行唾液酸化。在圖43E中，通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾表達于哺乳動物細(xì)胞中的尿激酶，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖43F中，表達于哺乳動物細(xì)胞中的尿激酶是用唾液酸供體和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶進行唾液酸化的。在圖43H中，表達于昆蟲細(xì)胞中的尿激酶是用下面的步驟修飾的首先，用適當(dāng)?shù)腘-乙酰葡糖胺供體和一種或多種GnT-I、II、IV和V向該多肽中添加N-乙酰葡糖胺；然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG-半乳糖供體添加PEG化的半乳糖。在圖43I中，首先用內(nèi)切聚糖酶處理表達于酵母中的尿激酶以修剪糖基基團，然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶進行半乳糖基化，且然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體進行PEG化。在圖41J中，首先使表達于哺乳動物細(xì)胞中的尿激酶與ST3Gal3和兩個通過連接體連接的反應(yīng)性唾液酸殘基接觸，從而將該多肽通過連接體和第二個唾液酸殘基附著到一個反應(yīng)性唾液酸上。然后使該多肽與ST3Gal1和哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生的脫唾液酸化尿激酶接觸，從而使其與第二個尿激酶分子連接。然后進一步用唾液酸供體和ST3Gal1和/或ST3Gal3對整個分子進行唾液酸化。在圖43K中，首先用磺基水解酶(sulfohydrolase)處理分離的尿激酶以去除硫酸基團，然后用唾酸轉(zhuǎn)移酶和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖43LM中，首先用磺基水解酶和氨基己糖苷酶處理分離的尿激酶以去除硫酸基團和己糖胺基團，然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG-半乳糖供體對其進行PEG化。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾DNaseI的方法，如圖44A～44J所示。在圖44B中，DNaseI是在哺乳動物系統(tǒng)中表達的并用下面的步驟進行修飾首先，用唾液酸酶處理該蛋白質(zhì)以修剪唾液酸殘基；然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖44C中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的DNaseI以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化，且然后用ST3Gal3和唾液酸供體對其進行唾液酸化。任選地，首先使哺乳動物系統(tǒng)中表達的DNaseI暴露于唾液酸酶和半乳糖苷酶中以修剪糖基基團，然后用半乳糖供體和α-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化，且然后用ST3Gal3或唾酸轉(zhuǎn)移酶和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖44D中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的DNaseI以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化，且然后用ST3Gal3和唾液酸供體對其進行唾液酸化。在圖44E中，通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾表達于哺乳動物細(xì)胞中的DNaseI，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖44F中，表達于哺乳動物細(xì)胞中的DNaseI是用唾液酸供體和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶進行唾液酸化的。在圖44H中，首先用適當(dāng)?shù)墓w和一種或多種GnT-I、II、IV和V向表達于昆蟲細(xì)胞中的DNaseI添加N-乙酰葡糖胺。然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG-半乳糖供體對該蛋白質(zhì)進行PEG化。在圖44I中，首先用內(nèi)切聚糖酶處理在酵母中表達的DNaseI以修剪糖基單位，然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化，且然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖44JK中，首先使表達于哺乳動物細(xì)胞中的DNaseI與ST3Gal3和兩個通過連接體連接的反應(yīng)性唾液酸殘基接觸，從而將該多肽通過連接體和第二個唾液酸殘基附著到一個反應(yīng)性唾液酸上。然后使該多肽與ST3Gal1和脫唾液酸化的α-1-蛋白酶抑制劑接觸，從而使其通過唾液酸殘基與該抑制劑連接。然后，進一步用適當(dāng)?shù)墓w和ST3Gal1和/或ST3Gal3對該多肽進行唾液酸化。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾突變后含有N-糖基化位點的胰島素的方法，如圖45A～45L所示。在圖45B中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物系統(tǒng)中表達的胰島素以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖45C中，表達于昆蟲細(xì)胞中的胰島素是通過用適當(dāng)?shù)墓w和GnT-I和/或II添加PEG化的N-乙酰葡糖胺而修飾的。在圖45D中，首先用Endo-H處理在酵母中表達的胰島素以修剪糖基基團，然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG-半乳糖供體對其進行PEG化。在圖45F中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的胰島素以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal1和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖45G中，表達于昆蟲細(xì)胞中的胰島素是通過用適當(dāng)?shù)墓w和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶添加PEG化的半乳糖而修飾的。在圖45H中，首先用適當(dāng)?shù)墓w和N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶向表達于細(xì)菌中的胰島素添加N-乙酰半乳糖胺。然后用唾酸轉(zhuǎn)移酶和PEG-唾液酸供體對該多肽進行PEG化。在圖45J中，表達于細(xì)菌中的胰島素是通過不同的方法修飾的即用適當(dāng)?shù)墓w和N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶向蛋白質(zhì)添加PEG化的N-乙酰半乳糖胺。在圖45K中，表達于細(xì)菌中的胰島素是根據(jù)另一個方案修飾的首先使該多肽與N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶和反應(yīng)性N-乙酰半乳糖胺接觸，該N-乙酰半乳糖胺是通過連接體用反應(yīng)性唾液酸衍生化的，從而該多肽可通過連接體和N-乙酰半乳糖胺附著在反應(yīng)性唾液酸上。然后使該多肽與ST3Gal3和脫唾液酸化運鐵蛋白接觸，因此可與運鐵蛋白連接，然后用ST3Gal3和唾液酸供體使該多肽唾液酸化。在圖45L中，表達于細(xì)菌中的胰島素是用另外一個方法修飾的首先使該多肽暴露于NHS-CO-連接體-SA-CMP中并通過連接體與反應(yīng)性唾液酸殘基連接。然后用ST3Gal3和脫唾液酸化運鐵蛋白使該多肽與運鐵蛋白綴合。然后進一步用ST3Gal3和唾液酸供體使該多肽唾液酸化。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾乙型肝炎B抗原(M抗原-preS和S)的方法，如圖46A～46K所示。在圖46B中，M-抗原是表達于哺乳動物系統(tǒng)中的并通過最初用唾液酸酶處理以修剪末端唾液酸殘基和隨后用ST3Gal3和通過連接體與脂質(zhì)A連接的反應(yīng)性唾液酸使其與脂質(zhì)A綴合而修飾。在圖46C中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的M-抗原以修剪末端唾液酸殘基，然后用ST3Gal1和通過連接體與毒素連接的反應(yīng)性唾液酸殘基使其與破傷風(fēng)毒素進行綴合，且然后用ST3Gal3和唾液酸供體對其進行唾液酸化。在圖46D中，首先用半乳糖苷酶處理哺乳動物系統(tǒng)中表達的M-抗原以修剪半乳糖基殘基，然后用ST3Gal3和唾液酸供體對其進行唾液酸化。然后用ST3Gal1和適當(dāng)?shù)墓w向該多肽添加用KLH衍生化的唾液酸。在圖46E中，首先用甘露糖苷酶處理酵母表達的M-抗原以修剪甘露糖基殘基，然后用GnT-I和與白喉毒素連接的N-乙酰葡糖胺供體使其與白喉毒素綴合。在圖46F中，通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾哺乳動物細(xì)胞表達的M-抗原，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到肽的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖46G中，從哺乳動物系統(tǒng)中獲得的M-抗原是通過用唾液酸供體和聚α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶進行唾液酸化而重構(gòu)的。在圖46I中，表達于昆蟲細(xì)胞中的M-抗原是用GnT-II和適當(dāng)?shù)呐c奈瑟球菌屬(Neisseria)蛋白質(zhì)連接的N-乙酰葡糖胺供體而與奈瑟球菌屬蛋白質(zhì)綴合的。在圖46J中，首先用內(nèi)切聚糖酶處理在酵母中表達的M-抗原以修剪糖基鏈，然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)呐c奈瑟球菌屬蛋白質(zhì)連接的半乳糖供體使其與奈瑟球菌屬蛋白質(zhì)綴合。圖46K是修飾在酵母中表達的M-抗原的另一個例子。首先用甘露糖苷酶處理該多肽以修剪末端甘露糖基殘基，然后用GnT-I和/或II向其添加N-乙酰葡糖胺。隨后，用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶使該多肽半乳糖基化，然后用唾酸轉(zhuǎn)移酶和唾液酸供體對其用唾液酸殘基進行加帽。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾人生長激素(N，V及其變體)的方法，如圖47A～47K所示。在圖47B中，首先用唾液酸酶處理由哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的人生長激素以修剪末端唾液酸殘基并隨后用ST3Gal3和PEG化的唾液酸供體對其進行PEG化，該人生長激素是突變后含有N-連接位點的或是具有N-連接位點的天然存在的同工型(即胎盤酶)。在圖47C中，表達于昆蟲細(xì)胞中的人生長激素是通過用GnT-I和/或II和適當(dāng)?shù)腜EG化的N-乙酰葡糖胺供體添加PEG化的N-乙酰葡糖胺而修飾的。在圖47D中，人生長激素在酵母中表達，用Endo-H進行處理以修剪糖基基團，并進一步用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG化的半乳糖供體進行PEG化。在圖47F中，表達于哺乳動物系統(tǒng)中的人生長激素-粘蛋白融合蛋白質(zhì)通過最初用唾液酸酶處理以修剪唾液酸殘基和隨后用PEG-唾液酸供體和ST3Gal1對其進行PEG化而修飾。在圖47G中，表達于昆蟲細(xì)胞中的人生長激素-粘蛋白融合蛋白質(zhì)是通過用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG化的半乳糖供體進行PEG化而重構(gòu)的。在圖47H中，人生長激素-粘蛋白融合蛋白質(zhì)是在細(xì)菌中產(chǎn)生的。首先用N-乙酰半乳糖胺供體通過N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶的作用將N-乙酰半乳糖胺添加到融合蛋白質(zhì)中，隨后用PEG-唾液酸供體和唾酸轉(zhuǎn)移酶對該融合蛋白質(zhì)進行PEG化。圖47I描述了修飾細(xì)菌表達的人生長激素-粘蛋白融合蛋白質(zhì)的另一個方案用PEG化的N-乙酰半乳糖胺供體通過N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶的作用對該融合蛋白質(zhì)進行PEG化。圖47J提供了對人生長激素-粘蛋白融合蛋白質(zhì)進一步的重構(gòu)方案。首先使該融合蛋白質(zhì)與N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶和N-乙酰半乳糖胺供體接觸，該N-乙酰半乳糖胺供體是通過連接體用反應(yīng)性唾液酸衍生化的，從而該融合蛋白質(zhì)可通過連接體和N-乙酰半乳糖胺附著在反應(yīng)性唾液酸上。然后使該融合蛋白質(zhì)與唾酸轉(zhuǎn)移酶和脫唾液酸化運鐵蛋白接觸，因此使其通過唾液酸殘基與運鐵蛋白連接。然后，用ST3Gal3和唾液酸供體對融合蛋白質(zhì)用唾液酸殘基進行加帽。在圖47K中，提供了修飾細(xì)菌中產(chǎn)生的人生長激素(N)的另一種方案。首先使該多肽與NHS-CO-連接體-SA-CMP接觸并通過連接體與反應(yīng)性唾液酸偶聯(lián)。然后使該多肽與ST3Gal3和脫唾液酸化運鐵蛋白接觸并使該多肽通過唾液酸殘基與運鐵蛋白綴合。然后用ST3Gal3和唾液酸供體使該多肽唾液酸化。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾TNF受體IgG融合蛋白質(zhì)(TNFR-IgG或EnbrelTM)的方法，如圖48A～48G所示。圖48B闡明了一種修飾程序，其中首先用唾液酸供體和唾酸轉(zhuǎn)移酶ST3Gal1使在哺乳動物系統(tǒng)中表達的TNFR-IgG唾液酸化；然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對融合蛋白質(zhì)進行半乳糖基化；然后通過ST3Gal3和用PEG衍生化的唾液酸供體對融合蛋白質(zhì)進行PEG化。在圖48C中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的TNFR-IgG以修剪唾液酸殘基。隨后通過在由ST3Gal1催化的反應(yīng)中將PEG化的唾液酸從供體轉(zhuǎn)移到融合蛋白質(zhì)中而使PEG部分附著到TNFR-IgG上。在圖48D中，TNFR-IgG是表達于哺乳動物系統(tǒng)中的并通過半乳糖基化程序添加PEG而修飾，該半乳糖基化程序是由半乳糖基轉(zhuǎn)移酶用PEG-半乳糖供體介導(dǎo)的。在圖48E中，TNFR-IgG是在哺乳動物系統(tǒng)中表達的。重構(gòu)融合蛋白質(zhì)的第一個步驟是用唾液酸供體和唾酸轉(zhuǎn)移酶ST3Gal1添加O-連接的唾液酸殘基。隨后，用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)木哂蠵EG部分的半乳糖供體向融合蛋白質(zhì)中添加PEG化的半乳糖。在圖48F中，通過用唾液酸供體對適當(dāng)?shù)哪┒藲埢M行加帽而修飾表達于哺乳動物細(xì)胞中的TNFR-IgG，該唾液酸供體是用乙酰丙酸修飾的，從而在唾液酸供體上添加了反應(yīng)性的酮。在添加到融合蛋白質(zhì)的糖基殘基上之后，該酮用如肼-或胺-PEG的部分進行衍生化。在圖48G中，表達于哺乳動物細(xì)胞中的TNFR-IgG是用α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶進行重構(gòu)的，該酶催化將PEG化的唾液酸從具有PEG部分的唾液酸供體轉(zhuǎn)移到融合蛋白質(zhì)的反應(yīng)。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于生成HerceptinTM綴合物的方法，如圖49A～49D所示。在圖49B中，HerceptinTM是表達于哺乳動物系統(tǒng)中的，并首先用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶進行半乳糖基化。然后通過利用反應(yīng)性唾液酸-毒素復(fù)合物的ST3Gal3的作用使HerceptinTM通過唾液酸與毒素綴合。在圖49C中，使哺乳動物細(xì)胞或真菌中產(chǎn)生的HerceptinTM通過半乳糖基化過程與毒素綴合，該半乳糖基化過程應(yīng)用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和反應(yīng)性半乳糖-毒素復(fù)合物。圖49D含有制備HerceptinTM綴合物的另一種方案首先用Endo-H處理在真菌中產(chǎn)生的HerceptinTM以修剪糖基基團，然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化，且然后通過唾液酸化使其與放射性同位素綴合，該唾液酸化應(yīng)用ST3Gal3和反應(yīng)性唾液酸-放射性同位素復(fù)合物。可選擇地，反應(yīng)性唾液酸部分可以只附著螯合部分，然后可以在隨后的階段加載放射性同位素。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于制備SynagisTM綴合物的方法，如圖50A～50D所示。在圖50B中，首先用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對表達于哺乳動物細(xì)胞中的SynagisTM進行半乳糖基化，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖50C中，哺乳動物細(xì)胞或真菌中表達的SynagisTM是用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG-半乳糖供體進行PEG化的。在圖50D中，首先用Endo-H處理在表達的SynagisTM以修剪糖基基團，然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化，且然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于生成RemicadeTM綴合物的方法，如圖51A～51D所示。在圖51B中，首先用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對表達于哺乳動物細(xì)胞中的RemicadeTM進行半乳糖基化，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖51C中，在哺乳動物系統(tǒng)中表達的RemicadeTM是通過用適當(dāng)?shù)墓w和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶添加PEG化的半乳糖而修飾的。在圖51D中，首先用Endo-H處理在真菌中表達的RemicadeTM以修剪糖基基團，然后用半乳糖供體和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對其進行半乳糖基化，且然后用ST3Gal3和用放射性同位素衍生化的反應(yīng)性唾液酸使其與放射性同位素綴合。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾突變后含有N糖基化位點的Reopro的方法。圖52A～52L含有這種例子。在圖52B中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物系統(tǒng)中表達的Reopro以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal3和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖52C中，表達于昆蟲細(xì)胞中的Reopro是通過用適當(dāng)?shù)墓w和GnT-I和/或II添加PEG化的N-乙酰葡糖胺而修飾的。在圖52D中，首先用Endo-H處理在酵母中表達的Reopro以修剪糖基基團。隨后，用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG-半乳糖供體對該蛋白質(zhì)進行PEG化。在圖52F中，首先用唾液酸酶處理在哺乳動物細(xì)胞中表達的Reopro以修剪唾液酸殘基，然后用ST3Gal1和PEG-唾液酸供體對其進行PEG化。在圖52G中，表達于昆蟲細(xì)胞中的Reopro是通過用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和PEG-半乳糖供體進行的PEG化而修飾的。在圖52H中，首先用N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)墓w向表達于細(xì)菌中的Reopro添加N-乙酰半乳糖胺。然后用唾酸轉(zhuǎn)移酶和PEG-唾液酸供體對該蛋白質(zhì)進行PEG化。在圖52J中，表達于細(xì)菌中的Reopro是通過不同的方案修飾的即用PEG化的N-乙酰半乳糖胺供體通過N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶的作用對其進行PEG化。在圖52K中，細(xì)菌表達的Reopro是用另外一個方法修飾的首先，使該多肽與N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶和N-乙酰半乳糖胺供體接觸，該N-乙酰半乳糖胺供體是通過連接體用反應(yīng)性唾液酸衍生化的，從而該多肽可通過連接體和N-乙酰半乳糖胺附著在反應(yīng)性唾液酸上。然后使該多肽與ST3Gal3和脫唾液酸化運鐵蛋白接觸，從而使其通過唾液酸殘基與運鐵蛋白連接。然后用適當(dāng)?shù)墓w和ST3Gal3對該多肽用唾液酸殘基進行加帽。圖52L提供了修飾細(xì)菌表達的Reopro的額外的方案。首先使該多肽暴露于NHS-CO-連接體-SA-CMP中并使其通過連接體與反應(yīng)性唾液酸連接。然后使該多肽與ST3Gal3和脫唾液酸化運鐵蛋白接觸，從而使其通過唾液酸殘基與運鐵蛋白綴合。然后用適當(dāng)?shù)墓w和ST3Gal3對該多肽用唾液酸殘基加帽。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于生成RituxanTM綴合物的方法。圖53A～53G提供了一些例子。在圖53B中，首先用適當(dāng)?shù)陌肴樘枪w和半乳糖基轉(zhuǎn)移酶對表達于各種哺乳動物系統(tǒng)中的RituxanTM進行半乳糖基化。然后用唾液酸供體和ST3Gal3以用毒素部分衍生化的唾液酸對該肽進行官能化。在圖53C中，表達于哺乳動物細(xì)胞或真菌細(xì)胞中的RituxanTM是用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和半乳糖供體進行半乳糖基化的，這給肽提供了含有藥物部分的半乳糖。圖53D提供了重構(gòu)在真菌系統(tǒng)中表達的RituxanTM的另一個例子。首先用Endo-H修剪該多肽的糖基基團。然后用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和半乳糖供體添加半乳糖。隨后，通過放射性同位素復(fù)合的唾液酸供體和唾酸轉(zhuǎn)移酶ST3Gal3使放射性同位素和該分子綴合。在圖53F中，RituxanTM是表達于哺乳動物系統(tǒng)中的，并首先用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)陌肴樘枪w對其進行半乳糖基化；然后用ST3Gal3和PEG化的唾液酸供體使具有PEG部分的唾液酸附著。如在圖53G中所示的，表達于真菌、酵母或哺乳動物細(xì)胞中的RituxanTM也可用下面的方法修飾首先，用α-和β-甘露糖苷酶處理該多肽以除去末端甘露糖殘基；然后用GnT-I和II和GlcNAc供體將GlcNAc附著于該分子上，然后通過半乳糖基化將放射性同位素附著在其上，該半乳糖基化應(yīng)用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和與能夠結(jié)合放射性同位素的螯合部分偶聯(lián)的半乳糖供體。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾抗凝血酶III(ATIII)的方法。圖54A～540提供了一些例子。在圖54B中，將表達于各種哺乳動物系統(tǒng)中的抗凝血酶III通過添加一個或多個末端唾液酸-PEG部分進行重構(gòu)。首先使ATIII分子與唾液酸酶接觸以除去末端唾液酸部分。然后，使分子與唾酸轉(zhuǎn)移酶和已用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。在圖54C中，將表達于各種哺乳動物系統(tǒng)中的ATIII通過添加唾液酸-PEG部分進行重構(gòu)。使ATIII分子與唾液酸酶接觸以除去末端唾液酸部分。然后使分子與ST3Gal3和已用1.2mol當(dāng)量的PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。然后使分子與ST3Gal3和適當(dāng)?shù)耐僖核峁w接觸以對剩余的末端半乳糖部分進行加帽。在圖54D中，將表達于NSO鼠骨髓瘤細(xì)胞中的ATIII重構(gòu)為具有復(fù)雜聚糖分子，該聚糖分子具有末端唾液酸-PEG部分。使ATIII分子與唾液酸酶和α-半乳糖苷酶接觸以除去末端唾液酸和半乳糖部分。然后使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)陌肴樘枪w接觸。然后使分子與ST3Gal3和已用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。在圖54E中，將表達于各種哺乳動物系統(tǒng)中的ATIII重構(gòu)為具有基本完全的末端唾液酸-PEG部分。使ATIII分子與唾液酸酶接觸以除去末端唾液酸部分。然后使分子與ST3Gal3和已用16mol當(dāng)量的PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。然后使分子與ST3Gal3和適當(dāng)?shù)耐僖核峁w接觸以對剩余的末端半乳糖部分進行加帽。在圖54F中，將表達于各種哺乳動物系統(tǒng)中的ATIII通過添加一個或多個末端唾液酸-PEG部分進行重構(gòu)。使ATIII分子與ST3Gal3和已用乙酰丙酸部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。然后使分子與肼-PEG接觸。在圖54G中，將表達于各種哺乳動物系統(tǒng)中的ATIII通過添加一個或多個末端聚α2，8-連接的唾液酸部分進行重構(gòu)。使ATIII分子與聚α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)耐僖核峁w接觸。在圖54I中，將表達于昆蟲、酵母或真菌細(xì)胞中的ATIII通過添加分支的N-N-乙酰葡糖胺-PEG部分進行重構(gòu)。使ATIII分子與GnT-I和已用PEG衍生化的適當(dāng)N-乙酰葡糖胺供體接觸。在圖54J中，將表達于酵母中的ATIII通過除去高甘露糖聚糖結(jié)構(gòu)和添加末端唾液酸-PEG部分進行重構(gòu)。使ATIII分子與內(nèi)切聚糖酶接觸以修剪糖基基團。然后使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)陌肴樘枪w接觸。然后使分子與ST3Gal3和已用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。在圖54K中，將表達于各種哺乳動物系統(tǒng)中的ATIII通過添加糖綴合的運鐵蛋白進行重構(gòu)。使ATIII分子與ST3Gal3和已用連接體-半乳糖供體部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。然后使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)切聚糖酶處理的運鐵蛋白接觸。在圖54M中，將表達于酵母中的ATIII通過除去高甘露糖聚糖結(jié)構(gòu)和添加末端半乳糖-PEG部分進行重構(gòu)。使分子與內(nèi)切聚糖酶接觸以修剪糖基基團。進一步使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和已用PEG部分衍生化的適當(dāng)半乳糖供體接觸。在圖54N中，將表達于植物細(xì)胞中的ATIII通過將聚糖結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)椴溉閯游镄蛷?fù)雜聚糖且然后添加一個或多個末端半乳糖-PEG部分進行重構(gòu)。使ATIII分子與木糖苷酶(xylosidase)接觸以除去木糖殘基。然后使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和已用PEG部分衍生化的適當(dāng)半乳糖供體接觸。在圖540中，將表達于各種哺乳動物系統(tǒng)中的ATIII通過向末端半乳糖部分添加一個或多個末端唾液酸-PEG部分進行重構(gòu)。使ATIII分子與ST3Gal3和已用PEG衍生化的適當(dāng)唾液酸PEG供體接觸。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾人絨毛膜促性腺激素(hCG)的α和β亞基的方法。圖55A～55J提供了一些例子。在圖55B中，將表達于各種哺乳動物和昆蟲系統(tǒng)中的hCG通過添加末端唾液酸-PEG部分進行重構(gòu)。使hCG分子與唾液酸酶接觸以除去末端唾液酸部分。然后，使分子與ST3Gal3和已用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。在圖55C中，將表達于昆蟲細(xì)胞、酵母或真菌系統(tǒng)中的hCG通過構(gòu)建N-連接的聚糖和添加末端唾液酸-PEG部分進行重構(gòu)。使hCG分子與GnT-I和GnT-II和適當(dāng)?shù)腘-乙酰葡糖胺供體接觸。然后使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)陌肴樘枪w接觸。進一步使分子與ST3Gal3和已用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。在圖55D中，將表達于各種哺乳動物和昆蟲系統(tǒng)中的hCG通過在O-連接的聚糖結(jié)構(gòu)上添加一個或多個末端唾液酸-PEG部分進行重構(gòu)。使hCG分子與唾液酸酶接觸以除去末端唾液酸。然后使分子與ST3Gal3和適當(dāng)?shù)耐僖核峁w接觸，以用唾液酸部分對聚糖結(jié)構(gòu)進行加帽。然后使分子與ST3Gal1和已用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。在圖55E中，將表達于各種哺乳動物和昆蟲系統(tǒng)中的hCG通過向N-連接的聚糖結(jié)構(gòu)添加唾液酸-PEG部分進行重構(gòu)。使hCG分子與ST3Gal3和已用PEG衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。在圖55F中，將表達于昆蟲細(xì)胞、酵母或真菌中的hCG通過添加末端N-乙酰葡糖胺-PEG分子進行重構(gòu)。使hCG分子與GnT-I和GnT-II和已用PEG衍生化的適當(dāng)N-乙酰葡糖胺供體接觸。在圖55G中，將表達于昆蟲細(xì)胞、酵母或真菌中的hCG通過每個N-連接的聚糖結(jié)構(gòu)添加不超過一個N-乙酰葡糖胺-PEG部分而進行重構(gòu)。使hCG分子與GnT-I和已用PEG部分衍生化的適當(dāng)N-乙酰葡糖胺供體接觸。在圖55H中，將表達于各種哺乳動物系統(tǒng)中的hCG通過向O-連接的聚糖結(jié)構(gòu)添加一個或多個末端唾液酸-PEG部分進行重構(gòu)。使hCG分子與ST3Gal3和已用PEG衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。在圖55I中，將表達于各種哺乳動物系統(tǒng)中的hCG通過添加末端唾液酸-PEG部分進行重構(gòu)。使hCG分子與α2，8-SA和已用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。在圖55J中，將表達于各種哺乳動物系統(tǒng)中的hCG通過添加末端唾液酸部分進行重構(gòu)。使hCG分子與聚α2，8-ST和已用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾α-半乳糖苷酶A(FabrazymeTM)的方法。圖56A～56J提供了一些例子。在圖56B中，將表達于并分泌自各種哺乳動物和昆蟲系統(tǒng)中的α-半乳糖苷酶A通過添加一個或多個末端半乳糖-PEG-運鐵蛋白部分進行重構(gòu)。使α-半乳糖苷酶A分子與Endo-H接觸以修剪糖基基團。然后，使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和已用PEG和運鐵蛋白衍生化的適當(dāng)半乳糖供體接觸。在圖56C中，將表達于并分泌自各種哺乳動物和昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中的α-半乳糖苷酶A通過添加一個或多個末端唾液酸-連接體-甘露糖-6-磷酸部分進行重構(gòu)。使α-半乳糖苷酶A分子與唾液酸酶接觸以除去末端唾液酸部分。進一步使分子與ST3Gal3和已通過連接體綴合于甘露糖-6-磷酸的適當(dāng)唾液酸供體接觸。在圖56D中，將表達于NSO鼠骨髓瘤細(xì)胞中的α-半乳糖苷酶A通過添加末端唾液酸-連接體-甘露糖-6-磷酸部分進行重構(gòu)。使α-半乳糖苷酶A分子與唾液酸酶和α-半乳糖苷酶接觸以除去末端唾液酸和半乳糖部分。然后使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)陌肴樘枪w接觸。然后使分子與唾酸轉(zhuǎn)移酶和已通過連接體綴合于甘露糖-6-磷酸的適當(dāng)唾液酸供體接觸。在圖56E中，將表達于并分泌自各種哺乳動物和昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中的α-半乳糖苷酶A通過添加一個或多個末端唾液酸-PEG部分進行重構(gòu)。使α-半乳糖苷酶A分子與唾液酸酶接觸以除去末端唾液酸部分。然后使分子與唾酸轉(zhuǎn)移酶和已用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。在圖56F中，將表達于哺乳動物、昆蟲、酵母或真菌系統(tǒng)中的α-半乳糖苷酶A通過添加一個或多個末端甘露糖-連接體-ApoE部分進行重構(gòu)。使α-半乳糖苷酶A分子與甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和已通過連接體綴合于ApoE的適當(dāng)甘露糖供體接觸。在圖56G中，將表達于哺乳動物、昆蟲、酵母或真菌系統(tǒng)中的α-半乳糖苷酶A通過添加半乳糖-連接體-α2-巨球蛋白部分進行重構(gòu)。使α-半乳糖苷酶A分子與Endo-H接觸以修剪糖基基團。然后使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和已通過連接體綴合于α2-巨球蛋白的適當(dāng)半乳糖供體接觸。在圖56H中，將表達于昆蟲、酵母和真菌系統(tǒng)中的α-半乳糖苷酶A通過添加一個或多個N-乙酰葡糖胺-PEG-甘露糖-6-磷酸部分進行重構(gòu)。使α-半乳糖苷酶A分子與GnT-I和已用PEG和甘露糖-6-磷酸衍生化的適當(dāng)N-乙酰葡糖胺供體接觸。在圖56I中，將表達于昆蟲、酵母或真菌系統(tǒng)中的α-半乳糖苷酶A通過添加一個或多個末端半乳糖-PEG-運鐵蛋白部分進行重構(gòu)。使α-半乳糖苷酶A分子與GnT-I和適當(dāng)?shù)腘-乙酰葡糖胺供體接觸。然后使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和已用PEG和運鐵蛋白衍生化的適當(dāng)半乳糖供體接觸。在圖56J中，將表達于昆蟲、酵母或真菌系統(tǒng)中的α-半乳糖苷酶A通過添加一個或多個末端唾液酸-PEG-黑運鐵蛋白(melanotransferrin)部分進行重構(gòu)。使α-半乳糖苷酶A分子與GnT-I和GnT-II和適當(dāng)?shù)腘-乙酰葡糖胺供體接觸。然后使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)陌肴樘枪w接觸。然后使分子與唾酸轉(zhuǎn)移酶和已用PEG和黑運鐵蛋白衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。
在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明提供了用于修飾α-艾杜糖苷酶(AldurazymeTM)的方法。圖57A～57J提供了一些例子。在圖57B中，將表達于并分泌自各種哺乳動物和昆蟲系統(tǒng)中的α-艾杜糖苷酶通過添加一個或多個末端半乳糖-PEG-運鐵蛋白部分進行重構(gòu)。使α-艾杜糖苷酶分子與Endo-H接觸以修剪糖基基團。然后，使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和已用PEG和運鐵蛋白衍生化的適當(dāng)半乳糖供體接觸。在圖57C中，將表達于并分泌自各種哺乳動物和昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中的α-艾杜糖苷酶通過添加末端唾液酸-連接體-甘露糖-6-磷酸部分進行重構(gòu)。使α-艾杜糖苷酶分子與唾液酸酶接觸以除去末端唾液酸部分。進一步使分子與ST3Gal3和已通過連接體綴合于甘露糖-6-磷酸的適當(dāng)唾液酸供體接觸。在圖57D中，將表達于NSO鼠骨髓瘤細(xì)胞中的α-艾杜糖苷酶通過添加一個或多個末端唾液酸-連接體-甘露糖-6-磷酸部分進行重構(gòu)。使α-艾杜糖苷酶分子與唾液酸酶和α-半乳糖苷酶接觸以除去末端唾液酸和半乳糖部分。然后使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)陌肴樘枪w接觸。然后使分子與唾酸轉(zhuǎn)移酶和已通過連接體綴合于甘露糖-6-磷酸的適當(dāng)唾液酸供體接觸。在圖57E中，將表達于并分泌自各種哺乳動物和昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)中的α-艾杜糖苷酶通過添加一個或多個末端唾液酸-PEG部分進行重構(gòu)。使α-艾杜糖苷酶分子與唾液酸酶接觸以除去末端唾液酸部分。進一步使分子與唾酸轉(zhuǎn)移酶和已用PEG部分衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。在圖57F中，將表達于哺乳動物、昆蟲、酵母或真菌系統(tǒng)中的α-艾杜糖苷酶通過添加一個或多個末端甘露糖-連接體-ApoE部分進行重構(gòu)。使α-艾杜糖苷酶分子與甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和已通過連接體綴合于ApoE的適當(dāng)甘露糖供體接觸。在圖57G中，將表達于哺乳動物、昆蟲、酵母或真菌系統(tǒng)中的α-艾杜糖苷酶通過添加一個或多個半乳糖-連接體-α2-巨球蛋白部分進行重構(gòu)。使α-艾杜糖苷酶分子與Endo-H接觸以修剪糖基基團。然后使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和已通過連接體綴合于α2-巨球蛋白的適當(dāng)半乳糖供體接觸。在圖57H中，將表達于昆蟲、酵母和真菌系統(tǒng)中的α-艾杜糖苷酶通過添加一個或多個N-乙酰葡糖胺-PEG-甘露糖-6-磷酸部分進行重構(gòu)。使α-艾杜糖苷酶分子與GnT-I和已用PEG和甘露糖-6-磷酸衍生化的適當(dāng)N-乙酰葡糖胺供體接觸。在圖57I中，將表達于昆蟲、酵母或真菌系統(tǒng)中的α-艾杜糖苷酶通過添加一個或多個末端半乳糖-PEG-運鐵蛋白部分進行重構(gòu)。使α-艾杜糖苷酶分子與GnT-I和適當(dāng)?shù)腘-乙酰葡糖胺供體接觸。然后使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和已用PEG和運鐵蛋白衍生化的適當(dāng)半乳糖供體接觸。在圖57J中，將表達于昆蟲、酵母或真菌系統(tǒng)中的α-艾杜糖苷酶通過添加一個或多個末端唾液酸-PEG-黑運鐵蛋白部分進行重構(gòu)。使α-艾杜糖苷酶分子與GnT-I和GnT-II和適當(dāng)?shù)腘-乙酰葡糖胺供體接觸。然后使分子與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)陌肴樘枪w接觸。進一步使分子與唾酸轉(zhuǎn)移酶和已用PEG和黑運鐵蛋白衍生化的適當(dāng)唾液酸供體接觸。
A.生成或消除N-連接的糖基化位點本發(fā)明涉及應(yīng)用以下肽，其中該肽上的聚糖鏈位點已相對于天然肽的進行了改變。一般地，N-連接的聚糖鏈?zhǔn)窃谔於０窔埢B接到一級肽結(jié)構(gòu)上的，其中該天冬酰胺殘基位于可由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)上的膜結(jié)合糖基轉(zhuǎn)移酶識別的氨基酸序列中。一般地，一級肽結(jié)構(gòu)上的識別位點是序列天冬酰胺-X-絲氨酸/蘇氨酸，其中X可為除脯氨酸和天冬氨酸之外的任何氨基酸。盡管該識別位點是典型的，但本發(fā)明進一步包含在其他識別位點具有N-連接聚糖的肽，其中該N-連接的鏈?zhǔn)怯锰烊坏幕蛑亟M的糖基轉(zhuǎn)移酶添加的。
由于N-連接的糖基化的識別位點是已知的，所以生成突變的一級肽序列是在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)的，其中在所述突變的序列中去除了天然的N-連接糖基化識別位點，或者可選擇地另外又生成了一個或多個額外的N-糖基化識別位點。最簡單地，可將天冬酰胺殘基從肽的一級序列中去除，從而去除聚糖的附著位點，因而可從成熟肽中去除一種聚糖。例如，可用基因工程方法將具有天冬酰胺-絲氨酸-絲氨酸序列的識別天然位點加工為具有亮氨酸-絲氨酸-絲氨酸序列，從而在該位置消除了N-連接的糖基化位點。
進一步地，N-連接的糖基化位點可通過改變識別位點中的殘基而去除，從而即使存在天冬酰胺殘基，一個或多個另外的識別殘基卻不存在。例如，可使天然序列天冬酰胺-絲氨酸-絲氨酸突變?yōu)樘於０?絲氨酸-賴氨酸，從而在該位置消除N-糖基化位點。在N-連接的糖基化位點包含除上述典型的識別位點之外的殘基的情況下，技術(shù)人員可確定適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶識別所必需的序列和殘基，然后突變至少一個殘基，從而適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶不再識別該位點。換句話說，對肽的一級序列進行處理以生成或去除或同時生成和去除糖基化位點是在技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)的，從而可生成具有改變的糖基化模式的肽。因此，不應(yīng)將本發(fā)明解釋為局限于將在此處提供的任何一級肽序列作為進行聚糖重構(gòu)的唯一序列，而應(yīng)解釋為包括任何或全部適合于進行聚糖重構(gòu)的肽序列。
為了生成突變的肽，對編碼肽一級序列的核酸序列進行了改變，從而使編碼天然氨基酸殘基的天然密碼子突變以生成編碼其他氨基酸殘基的密碼子。改變核酸序列的技術(shù)是本領(lǐng)域中普遍的，且描述于例如任何眾所周知的分子生物學(xué)手冊中。
此外，可用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在體外合成編碼一級肽結(jié)構(gòu)的核酸。例如，可用如亞磷酰胺方法的規(guī)程在“基因機”中合成核酸分子。如果在如合成核酸或其片段的應(yīng)用中需要化學(xué)合成的雙鏈DNA，那么每一個互補鏈可單獨合成。短的核酸(60～80個堿基對)的生產(chǎn)在技術(shù)上是簡單的，且可通過合成互補鏈然后使其退火而實現(xiàn)。對于較長的核酸(＞300個堿基對)的生產(chǎn)，需要特定的技術(shù)，這是因為在化學(xué)DNA合成的每一個循環(huán)中的偶聯(lián)效率很少是100％的。為了解決該問題，合成的基因(雙鏈的)是以模塊的模式從長度為20～100個核苷酸的單鏈片段組裝而來的。對于多核苷酸合成的綜述，參見如Glick和Paternak(Molecular Biotechnology，Principles and Applications ofRecombinant DNA，1994，ASM Press)，Itakura等人(1984，Annu.Rev.Biochem.53323)和Climie等人(1990，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 87633)。
此外，編碼肽的核酸序列中的改變可通過定點誘變來形成。如所理解的，該技術(shù)一般應(yīng)用同時以單鏈和雙鏈形式存在的噬菌體載體。用于定點誘變的一般載體包括如M13噬菌體的載體。這些噬菌體是易于獲得的，且其應(yīng)用通常是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的。在定點誘變中也常規(guī)地應(yīng)用雙鏈質(zhì)粒，這消除了將目標(biāo)核酸從質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到噬菌體中的步驟。
通常，定點誘變是通過首先獲得單鏈載體或熔解雙鏈載體的兩條鏈而進行的，其中該雙鏈載體在其序列中包括編碼想要的肽的DNA序列。具有想要的突變序列的寡核苷酸引物通常是合成制備的。然后使該引物與單鏈載體退火，然后用DNA聚合酶如大腸桿菌聚合酶I的Klenow片段處理以完成具有突變的鏈的合成。因而，形成了異雙鏈體，其中一條鏈編碼最初的無突變的序列，而另一條鏈具有想要的突變。然后將該異雙鏈體用于轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)募?xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞，并選擇包括具有突變的序列的重組載體的克隆。Kunkel等人(1987，Kunkel等人，Methods Enzymol.154367-382)設(shè)計了一種遺傳選擇方案以富集整合了誘變的寡核苷酸的克隆?？蛇x擇地，可將商業(yè)上可購得的熱穩(wěn)定性酶如Taq聚合酶和PCRTM用于將誘變的寡核苷酸引物整合入擴增的DNA片段中，然后可將該片段克隆入適當(dāng)?shù)目寺』虮磉_載體中。Tomic等人(1990，Nucl.Acids Res.，121656)和Upender等人(1995，Biotechniques，1829-31)的PCRTM-介導(dǎo)的誘變方法提供了這種規(guī)程的兩個例子。除熱穩(wěn)定性聚合酶之外還應(yīng)用熱穩(wěn)定性連接酶的PCRTM也可用于將磷酸化的誘變寡核苷酸整合入擴增的DNA片段中，然后可將該片段克隆入適當(dāng)?shù)目寺』虮磉_載體中。由Michael(1994，Biotechniques 16410-412)描述的誘變方法提供了這種規(guī)程的一個例子。
不是所有的Asn-X-Ser/Thr序列均是N-糖基化的，這提示該基元所處的前后環(huán)境是重要的。在另一個方法中，生成了具有新的N-連接一致位點的突變肽的文庫以鑒定新的N-連接位點，該新的N-連接位點在體內(nèi)進行糖基化，且對肽的活性、穩(wěn)定性或其他特征是有益的。
如前文所指出的，在糖蛋白中添加N-連接的聚糖鏈的一致序列是Asn-X-Ser/Thr，其中X可為任何氨基酸。編碼距Asn的羧基末端一側(cè)兩個位置的氨基酸的核苷酸序列可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)方法進行突變以編碼Ser和/或Thr。如上文所陳述的，不是所有的Asn-X-Ser/Thr位點均通過添加聚糖來修飾。因此，必須使每一個重組突變的糖蛋白在真菌、酵母或動物或哺乳動物表達系統(tǒng)中表達并分析N-連接的聚糖鏈的添加。表征糖基化位點的技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的。進一步地，突變的重組糖蛋白的生物學(xué)功能可用對于檢查的特定蛋白質(zhì)是標(biāo)準(zhǔn)的測定法來確定。因而，對肽的一級序列進行處理和鑒定在其中含有的新糖基化位點，并且進一步確定該新位點對肽的生物學(xué)活性的作用則變?yōu)楹唵蔚氖虑椤?br> 在一個可選擇的實施方案中，編碼距Ser和/或Thr的氨基末端一側(cè)為兩個位置的氨基酸的核苷酸序列可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)程序進行突變以編碼Asn。確定是否生成了新的糖基化位點及該位點對肽的生物學(xué)活性的作用的方法如上文所述。
B.生成或消除O-連接的糖基化位點向肽中添加O-連接的糖基化位點可方便地通過改變肽的一級氨基酸序列而實現(xiàn)，從而使其與開始的肽一級氨基酸序列相比含有一個或多個額外的O-連接的糖基化位點。向肽中添加O-連接的糖基化位點也可通過將一個或多個氨基酸種類整合入在其肽序列中包含-OH基團(優(yōu)選地為絲氨酸或蘇氨酸殘基)的肽中而實現(xiàn)，從而OH基團是可接近的且能夠用于O-連接的糖基化。與肽中N-連接的糖基化位點的改變相似，肽的一級氨基酸序列優(yōu)選地是在核苷酸水平上改變的?？蓪幋a肽的DNA序列中特定的核苷酸進行改變，從而使該序列編碼想要的氨基酸。DNA中的突變優(yōu)選地是用本領(lǐng)域中公知的方法實現(xiàn)的，如上述的亞磷酰胺DNA合成方法和定點誘變的技術(shù)。
可選擇地，編碼用于添加O-連接的聚糖的推定位點的核苷酸序列可以以一個或幾個拷貝在DNA分子的5’或3’末端添加到該分子中。然后可使改變的DNA序列在真菌、酵母或動物或哺乳動物表達系統(tǒng)中表達并分析向肽中添加的序列及該序列是否是有功能的O-連接的糖基化位點。簡言之，合成的肽受體序列是在核苷酸分子的5’或3’末端引入的。原則上，當(dāng)在適當(dāng)?shù)谋磉_系統(tǒng)中表達時該類序列的添加對結(jié)果所得的糖蛋白的破壞性是較小的。然后使改變的DNA在CHO細(xì)胞或其他適當(dāng)?shù)谋磉_系統(tǒng)中表達，并檢查在其中表達的蛋白質(zhì)以確定是否存在O-連接的糖基化位點。此外，可確定聚糖鏈的存在與否。
在另外一個方法中，通過生成含有各種新O-連接位點的肽的文庫可在肽中發(fā)現(xiàn)新的O-連接位點的有利位點。例如，通過N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶添加N-乙酰半乳糖胺的一致氨基酸序列依賴于所用的特定轉(zhuǎn)移酶。可對肽的氨基酸序列進行掃描以鑒定連續(xù)的氨基酸組，該氨基酸組可進行突變以生成添加O-連接的聚糖鏈的潛在位點。這些突變可用如前文所述的本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)程序生成。為了確定是否任何發(fā)現(xiàn)的糖基化位點實際上是糖基化的，使每一個重組突變的肽在適當(dāng)?shù)谋磉_系統(tǒng)中表達并隨后分析位點的添加和/或O-連接的聚糖鏈的存在與否。
C.肽的化學(xué)合成盡管用于本發(fā)明中的肽的一級結(jié)構(gòu)可最有效地在基于細(xì)胞的表達系統(tǒng)中生成，但在本發(fā)明的范圍之內(nèi)的是肽可以合成地生成。肽的化學(xué)合成是本領(lǐng)域中眾所周知的，且不限制地包括逐步的固相合成及在溶液或固相中的片段縮合。典型的逐步固相合成包括使相應(yīng)于想要的肽鏈的羧基末端氨基酸的氨基酸共價地與固體支持體連接，然后通過逐步結(jié)合具有活化的羧基基團的活化氨基酸衍生物而向氨基末端延伸肽鏈。在完全保護的固相結(jié)合肽鏈組裝完成之后，通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)切割肽-固相的共價附著，并去除保護基團以得到產(chǎn)物肽。參見R.Merrifield，Solid Phase Peptide SynthesisThe Synthesis of aTetrapeptide，J.Am.Chem.Soc.，852149-2154(1963)。肽鏈越長，獲得高純度的確定產(chǎn)物越是具有挑戰(zhàn)性。由于復(fù)雜的混合物的產(chǎn)生，逐步固相合成方法具有大小的限制。通常，具有100個連續(xù)的或更多氨基酸殘基的確定肽不能通過逐步固相合成常規(guī)地制備。
區(qū)段縮合方法包括通過固相逐步方法制備幾個肽區(qū)段，隨后從固相上切割并純化這些最大限度保護的區(qū)段。使保護的區(qū)段一個接一個與結(jié)合到固相上的第一個區(qū)段縮合。
用于本發(fā)明的肽可通過完全固相合成、部分固相方法、片段縮合或經(jīng)典的溶液合成來合成。這些合成方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參見如Merrifield，J.Am.Chem.Soc.，852149(1963)，Stewart等人，“Solid Phase Peptide Synthesis”(第二版)，(PierceChemical Co.1984)，Bayer和Rapp，Chem.Pept.Prot.33(1986)，Atherton等人，Solid Phase Peptide SynthesisA PracticalApproach(IRL Press 1989)，F(xiàn)ields和Colowick，“Solid-PhasePeptide Synthesis”，Methodsin Enzymology 289卷(Academic Press1997)和Lloyd-Williams等人，Chemical Approaches to theSynthesis of Peptides and Peptides(CRCPress，Inc.1997))?？偟幕瘜W(xué)合成策略的改變方法如“天然化學(xué)連接”和“表達的肽連接”也是標(biāo)準(zhǔn)的(參見如Dawson等人，Science 266776(1994)，Hackeng等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 947845(1997)，Dawson，Methods Enzymol.28734(1997)，Muir等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 956705(1998)和Severinov和Muir，J.Biol.Chem.27316205(1998))。同樣有用的是由Gryphon Sciences，SouthSanFrancisco，CA開發(fā)的固相肽合成方法。參見美國專利No.6,326,468、6,217,873、6,174,530和6,001,364，在此處將它們?nèi)空w引入作為參考。
D.翻譯后修飾本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解肽除在其上添加N-連接的和/或O-連接的聚糖之外還可進行翻譯后修飾。預(yù)期具有糖基化以外的翻譯后修飾的肽可用作本發(fā)明的肽，只要維持或改善了該肽的想要的生物學(xué)活性或功能。這種翻譯后修飾可為通常在體內(nèi)進行的天然修飾，或者為在體外進行的對肽的加工修飾。預(yù)期的已知修飾包括但不局限于乙?；Ⅴ；DP-核糖基化、酰胺化、黃素的共價附著、血紅素部分的共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物的共價附著、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物的共價附著、磷脂酰肌醇的共價附著、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基作用、共價交聯(lián)的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲?；?、γ羧化、糖基化、GPI錨定物形成、羥化、碘化、甲基化、豆蔻?；?、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、異戊二?；?、外消旋化、硒化(selenoylation)、硫酸鹽化、轉(zhuǎn)運RNA介導(dǎo)的氨基酸向肽的添加如精氨酰化(和遍在蛋白化。可用于進行許多這些修飾的酶是本領(lǐng)域中眾所周知的，且可從如Boehringer Mannheim(Indianapolis，IN)和Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)的公司購得。
這種修飾是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，且已詳細(xì)描述于科學(xué)文獻中。幾個特別普通的修飾如糖基化、脂質(zhì)附著、硫酸鹽化、谷氨酸殘基的γ羧化、羥化和ADP-核糖基化描述于最基本的課本中，如Peptides-Structure and Molecular Properties，2ndEd.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)。對于該主題上有許多詳細(xì)的綜述，如Wold，F(xiàn).，Post-translationalCovalent Modification of Peptides，B.C.Johnson，Ed.，AcademicPress，New York 1-12(1983)；Seifter等人(Meth.Enzymol.182626-646(1990))和Rattan等人(Ann.N.Y.Acad.Sci.66348-62(1992))。
肽的共價修飾也可在體外通過使肽的反應(yīng)性目標(biāo)氨基酸殘基與有機衍生化試劑進行反應(yīng)而引入到分子中，該有機衍生化試劑能夠與選擇的側(cè)鏈或末端氨基酸殘基反應(yīng)。最常用的衍生化的殘基為半胱氨酰、組氨酰、賴氨酰、精氨酰、酪氨酰、谷氨酰胺酰、天冬酰胺酰和氨基末端殘基。脯氨酸和賴氨酸的羥化，絲氨酰和蘇氨酰殘基的羥基基團的磷酸化，賴氨酸、組氨酸和組氨酸側(cè)鏈的α-氨基基團的甲基化，N-末端胺的乙?；虲-末端羧基的酰胺化。這種衍生化的部分可改善溶解性、吸收、生物學(xué)半衰期等。該部分也可消除或減少肽的任何不想要的副作用等。
此外，用雙功能試劑的衍生化可用于使肽與水不溶性支持體基質(zhì)或其他的大分子載體交聯(lián)。常用的交聯(lián)劑包括戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯、同雙功能亞氨酸酯、1，1-雙(-二唑乙酰基)-2-苯基乙烷和雙功能馬來酰亞胺。衍生化試劑如甲基-3-[9-對疊氮基苯基)]二硫代丙酰亞胺酸酯產(chǎn)生了能夠在光存在時交聯(lián)的光活化型中間物。可選擇地，可將描述于U.S.Pat.No.3,969,287和3,691,016中的反應(yīng)性水不溶性基質(zhì)如溴化氰活化的糖和反應(yīng)性底物用于肽固定。
E.融合肽/肽用于本發(fā)明的肽可包含融合肽。當(dāng)需要將兩個肽的生物學(xué)和/或功能特征組合在一個肽分子中時，融合肽是特別有利的。這種融合肽可展示生物學(xué)活性和功能的天然不存在的組合以生成治療和工業(yè)應(yīng)用中新的有用分子。目標(biāo)生物學(xué)活性包括但不局限于酶活性、受體和/或配體活性、免疫原性基元和結(jié)構(gòu)性結(jié)構(gòu)域。
這種融合肽是本領(lǐng)域中眾所周知的，且其生成方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，已經(jīng)制備了人α-干擾素-人白蛋白融合肽，其中結(jié)果所得的肽具有與白蛋白長的循環(huán)壽命組合的α-干擾素的治療益處，從而生成了使得能夠減少服藥頻率和對患者的潛在副作用的治療組合物。參見來自Human Genome Sciences，Inc.和美國專利No.5,766,883的AlbuferonTM。其他融合肽包括在別處描述的抗體分子。
F.較小的“生物學(xué)活性”分子的生成用于本發(fā)明的肽可為天然肽的變體，其中用天然肽的片段替代全長的天然肽。此外，預(yù)期應(yīng)用前原肽(pre-pro-peptide)和前肽(pre-peptide)。變體肽在大小上可比天然肽小，且可包含較大的肽的一個或多個結(jié)構(gòu)域。當(dāng)肽中某些結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性是想要的但肽中其他結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)活性不是想要的時，對特定肽結(jié)構(gòu)域的選擇是有利的。同樣包括的是可增強肽的想要的治療作用的肽的截斷和內(nèi)部缺失。倘若可保持肽的想要的生物學(xué)活性，那么任何這種形式的肽均可用于本發(fā)明中。
肽的較短形式可能具有天然肽中未發(fā)現(xiàn)的獨特優(yōu)點。在人白蛋白的情況下，已發(fā)現(xiàn)包含少至63％的天然白蛋白肽的截短形式作為血漿體積的膨脹劑是有利的。人們認(rèn)為截短的白蛋白肽在此治療目的上優(yōu)于天然的肽，這是因為相對于天然人血清白蛋白劑量或重組人血清白蛋劑量，所述肽只要1/2到2/3的劑量即可達到等價的膠體滲透作用。參見美國專利No.5,380,712，在此處將其整體引入作為參考。
也發(fā)現(xiàn)較小的“生物學(xué)活性”肽與天然肽相比具有增強的治療活性。IL-2的治療潛力受以血管滲漏綜合癥為主的副作用的限制。人們發(fā)現(xiàn)由相應(yīng)于整個α-螺旋的殘基1-30組成的肽的較小的化學(xué)合成形式可正確折疊并含有天然的IL-2生物學(xué)活性，而不具有主要的副作用。
G.新肽的生成本發(fā)明的肽可源自天然肽的一級序列，或者可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的許多方法進行加工。這種加工的肽可根據(jù)其與天然的肽相比增強的或新的性質(zhì)而設(shè)計和/或選擇。例如，可對肽進行加工以使其具有增加的酶反應(yīng)速率、增加的或降低的對底物或配體的親和力、增加的或降低的對受體的結(jié)合親和力、改變的對底物、配體、受體或其他結(jié)合配偶體的特異性、增加的或降低的體內(nèi)和/或體外穩(wěn)定性或增加的或降低的在動物中的免疫原性。
H.突變1.推理的設(shè)計突變用于本發(fā)明方法中的肽可進行突變以增強想要的生物學(xué)活性或功能、減少肽的不想要的性質(zhì)和/或向肽添加新的活性或功能?！昂侠淼碾脑O(shè)計”可用于生成這種改變的肽。一旦肽的氨基酸序列和結(jié)構(gòu)是已知的且計劃了想要的突變，那么可最方便地在相應(yīng)的核酸密碼子進行突變，該核酸密碼子編碼想要進行突變的氨基酸殘基。本領(lǐng)域的技術(shù)人員基于通用遺傳密碼和所選擇的表達系統(tǒng)的密碼子偏愛性的知識易于確定應(yīng)該如何對核酸序列進行改變?？稍诿艽a子中進行突變以改變在翻譯過程中將聚合入肽中的氨基酸殘基。可選擇地，可對密碼子進行突變，從而相應(yīng)編碼的氨基酸殘基不變，但密碼子的選擇更適合于想要的肽表達系統(tǒng)。例如，可用其他的氨基酸替代cys-殘基以去除天然肽中的二硫鍵，可對催化性結(jié)構(gòu)域進行突變以改變生物學(xué)活性，且通常可對肽的同種型進行加工。這種突變可為點突變、缺失、插入和截短等。
使肽中特定的氨基酸突變的技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的。上述定點誘變技術(shù)非常適用于密碼子的定向突變。寡核苷酸介導(dǎo)的誘變方法也在Sambrook等人(2001，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York，從15.51頁開始)中詳細(xì)討論。可以用接頭插入誘變、核酸酶Bal31消化和接頭分區(qū)誘變以及其他本領(lǐng)域中眾所周知的方法進行系統(tǒng)性的缺失、插入和截短(Sambrook等人，2001，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)。
推理(rational)的肽設(shè)計已成功地用于增加酶對熱失活和氧化的穩(wěn)定性。例如，酶的穩(wěn)定性可通過去除α-淀粉酶中的天冬酰胺殘基(Declerck等人，2000，J.Mol.Biol.3011041-1057)、向α-淀粉酶(Igarashi等人，1999，Biosci.Biotechnol.Biochem.631535-1540)和D-木糖異構(gòu)酶(Zhu等人，1999，Peptide Eng.12635-638)中引入更剛性的結(jié)構(gòu)元件如脯氨酸而改善。進一步地，額外的疏水接觸的引入可穩(wěn)定3-異丙基蘋果酸脫氫酶(Akanuma等人，1999，Eur.J.Biochem.260499-504)和從假單胞菌屬物種(Pseudonomas sp.)中獲得的甲酸脫氫酶(Rojkova等人，1999，F(xiàn)EBSLett.445183-188)。這些突變的穩(wěn)定作用的機制通?？蓱?yīng)用于許多肽。預(yù)期這些和類似的突變對于本發(fā)明的方法中重構(gòu)的肽是有用的。
2.隨機誘變技術(shù)用于本發(fā)明的方法中的新肽可用在核酸的編碼序列中引入隨機突變的技術(shù)生成。然后使核酸在想要的表達系統(tǒng)中表達，并對結(jié)果所得的肽評估目的性質(zhì)。將隨機突變引入DNA序列的技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的，且包括PCR誘變、飽和誘變和簡并寡核苷酸方法。參見Sambrook和Russell(2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NY)和Ausubel等人(2002，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，NY)。
在PCR誘變中，將降低的Taq聚合酶的保真性用于向克隆的DNA片段中引入隨機突變(Leung等人，1989，Technique111-15)。這是將隨機突變引入到DNA序列中的非常有力和相對快速的方法。要進行誘變的DNA區(qū)域是用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)在降低Taq DNA聚合酶合成DNA的保真性的條件下擴增的，如應(yīng)用改變的dGTP/dATP比例和通過向PCR反應(yīng)中添加Mn2+。將擴增的DNA片段的集合插入到適當(dāng)?shù)目寺≥d體中以提供隨機的突變文庫。
飽和誘變使得能夠快速向克隆的DNA片段中引入大量的單堿基替代(Mayers等人，1985，Science 229242)。該技術(shù)包括例如用在體外對單鏈DNA的化學(xué)處理或輻射生成突變和合成互補的DNA鏈。突變頻率可通過調(diào)節(jié)處理的激烈程度來調(diào)節(jié)，且基本可獲得所有可能的堿基替代。因為該程序不涉及突變片段的遺傳選擇，所以可獲得中性替代以及那些改變功能的替代。點突變的分布不偏向于保守的序列元件。
核酸同源物的文庫也可從一套簡并寡核苷酸序列中生成。簡并寡核苷酸序列的化學(xué)合成可在自動DNA合成儀上進行，且然后可將合成的基因連接到適當(dāng)?shù)谋磉_載體上。簡并寡核苷酸的合成是本領(lǐng)域中公知的(參見如Narang，SA(1983)Tetrahedron 393；Itakura等人(1981)Recombinant DNA，Proc 3rdCleveland Sympos.Macromolecules，ed.AG Walton，AmsterdamElsevierpp.273-289；Itakur a等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53323；Itakura等人(1984)Science 1981056；Ike等人(1983)Nucleic Acid Res.11477)。這種技術(shù)已應(yīng)用于其他肽的定向進化中(參見如Scott等人(1990)Science 249386-390；Roberts等人(1992)PNAS 892429-2433；Devlin等人(1990)Science 249404-406；Cwirla等人(1990)PNAS 876378-6382以及U.S.Pat.No.5,223,409、5,198,346和5,096,815)。
a.定向進化用于本發(fā)明方法中的肽也可用“定向進化”技術(shù)生成。與定點誘變技術(shù)(其中肽結(jié)構(gòu)的知識是必需的)相反，目前存在無需知道肽結(jié)構(gòu)特征而生成突變文庫的策略，從該文庫中可獲得具有改善的性質(zhì)的肽。這些策略通常稱為“定向進化”技術(shù)且與傳統(tǒng)的隨機誘變程序差別在于它們對編碼目標(biāo)肽的核酸序列進行多輪重復(fù)的突變、篩選和擴增。
在一些“定向進化”技術(shù)中，獲得的核酸中的多樣性是通過在核酸序列中隨機生成點突變的突變方法生成的。點突變技術(shù)包括但不局限于“易錯的PCRTM”(Caldwell和Joyce，1994；PCR Methods Appl.228-33；和Ke和Madison，1997，Nucleic Acids Res.253371-3372)、重復(fù)的寡核苷酸指導(dǎo)的誘變(Reidhaar-Olson等人，1991，MethodsEnzymol.208564-586)和任何前述的隨機誘變方法。
另一種生成多樣性的方法是應(yīng)用增變(mutator)基因，定向進化可在該多樣性上進行作用。將目標(biāo)核酸培養(yǎng)于增變細(xì)胞株中，該細(xì)胞株的基因組一般編碼缺陷的DNA修復(fù)基因(美國專利No.6,365,410；Selifonova等人，2001，Appl.Environ.Microbiol.673645-3649；Long-McGie等人，2000，Biotach.Bioeng.68121-125，參見GenencorInternational Inc，Palo Alto CA)。
用定向進化技術(shù)獲得多樣性也可用簡并引物和飽和誘變實現(xiàn)(Gene Site Saturation MutagenesisTM，Diversa Corp.，San Diego，CA)。在該類飽和誘變中，將設(shè)計為覆蓋要進行多樣化的核酸序列全長的簡并引物用于引發(fā)PCR反應(yīng)中的聚合酶。在該方式中可將氨基酸編碼序列的每一個密碼子進行突變以使其編碼剩余的19個普通氨基酸的每一個。該技術(shù)也可用于向核酸編碼序列的特定區(qū)域引入突變、缺失和插入，而使核酸分子的剩余部分保持不變。基因飽和技術(shù)的程序是本領(lǐng)域中眾所周知的，且可發(fā)現(xiàn)于美國專利6,171,820。
b.DNA重排(shuffling)用于本發(fā)明方法中的新肽也可用基因重排、基元重排、外顯子重排和/或密碼子重排(統(tǒng)稱為“DNA重排”)技術(shù)生成。DNA重排技術(shù)可應(yīng)用于調(diào)節(jié)用于本發(fā)明的肽的活性或可用于生成具有改變的活性的肽。通常參見U.S.Pat.Nos.5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252和5,837,458和Stemmer等人(1994，Nature 370(6488)389-391)；Crameri等人(1998，Nature 391(6664)288-291)；Zhang等人(1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(9)4504-4509)；Stemmer等人(1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(22)10747-10751)，Patten等人(1997，Curr.Opinion Biotechnol.8724-33)；Harayama(1998，Trends Biotechnol.16(2)76-82)；Hansson等人(1999，J.Mol.Biol.287265-76)和Lorenzo和Blasco(1998，Biotechniques 24(2)308-13)(這些專利的每一個均在此處整體引入作為參考)，DNA重排包括通過同源或位點專一性重組組裝兩個或多個DNA片段以生成多核苷酸序列中的變異。已將DNA重排用于生成1型人免疫缺陷病毒蛋白質(zhì)(Pekrun等人，2002，J.Virol.76(6)2924-35)、三嗪水解酶(Raillard等人，2001，Chem Biol 8(9)891-898)、鼠白血病病毒(MLV)蛋白質(zhì)(Powell等人2000，Nat Biotechnol 18(12)1279-1282)和吲哚甘油磷酸合成酶(Merz等人2000，Biochemistry 39(5)880-889)。
DNA重排技術(shù)也發(fā)展為可通過在體外進行DNA的同源重組而模擬天然的重組以生成分子多樣性(Stemmler，1994，Nature 370389-391；和Stemmler，1994，PNAS 9110747-10751)。通常，在該方法中將相關(guān)基因的群體進行片段化并進行多次變性、再次雜交并伴隨著Taq聚合酶對5’突出端的延伸。在每一個循環(huán)中，片段的長度增加，且當(dāng)源自不同基因的片段相互雜交時可發(fā)生重組。最初的DNA片段化可通過核酸酶消化來實現(xiàn)，一般應(yīng)用DNase(參見Stemmler的參考文獻，見上文)，但也可通過間斷的PCR合成來實現(xiàn)(美國專利5,965,408，在此處整體引入作為參考；參見Diversa Corp.，San Diego，CA)。DNA重排方法相對于隨機點突變方法的優(yōu)勢在于可實現(xiàn)對由每一輪重排生成的有利突變的直接重組，因此對于改善的肽表型有自主的選擇。
DNA重排技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的。對該技術(shù)的詳細(xì)解釋可發(fā)現(xiàn)于Stemmler，1994，Nature 370389-391和Stemmler，1994，PNAS9110747-10751中。DNA重排技術(shù)也描述于美國專利6,180,406、6,165,793、6,132,970、6,117,679、6,096,548、5,837,458、5,834,252、5,830,721、5,811,238和5,605,793中(在此處將其全部整體引入作為參考)。
本領(lǐng)域也提供了對DNA重排的基本技術(shù)的最近修飾。在一個例子中，利用嵌合的寡核苷酸擴增了外顯子重排、外顯子或編碼肽的特定結(jié)構(gòu)域的外顯子的組合。然后通過自身引導(dǎo)的PCR組裝對擴增的分子進行了重組(Kolkman和Stemmler，2001，Nat.Biotech.19423-428)。在另一個例子中，利用瞬時模板文庫構(gòu)建體中隨機嵌合體生成(RACHITT)的技術(shù)，使單鏈的親代DNA片段與全長的單鏈模板進行退火(Coco等人，2001，Nat Biotechnol.19354-359)。在另一個例子中(交錯的延伸過程(StEP))將具有大大縮減的退火/延伸循環(huán)的熱循環(huán)用于重復(fù)中斷DNA從側(cè)面引物的聚合(Zhao等人，1998，NatBiotechnol.16258-261)。在已知為CLERY的技術(shù)中，將體外的系列重排與酵母中的體內(nèi)同源重組進行組合(Abecassis等人，2000，Nucleic Acids Res.28E88)。為了使基因間重組最大化，將來自每一個核酸的互補鏈的單鏈DNA用DNase消化并進行退火(Kikuch i等人，2000，Gene 243133-137)。然后使由可切割的序列連接的可變長度的兩個截短核酸的平端進行連接以生成基因融合物，而無需進行同源重組(Sieber等人，2001，Nat Biotechnol.19456-460；Lutz等人，2001，Nucleic Acids Res.29E16；Ostermeier等人，1999，Nat Biotechnol.171205-1209；Lutz和Benkovic，2000，Curr.Opin.Biotechnol.11319-324)。也可用外切核酸酶介導(dǎo)的對DNA片段的平端化和將片段連接在一起以使其進行重組來增強具有很小的共有序列同源性的核酸之間的重組(美國專利No.6,361,974，在此處整體引入作為參考)。本發(fā)明預(yù)期應(yīng)用上述的每一個和全部變體方法作為增強用于本發(fā)明方法中的任何肽和/或酶的生物學(xué)性質(zhì)的方法。
除發(fā)表的詳細(xì)描述定向進化和基因重排技術(shù)的規(guī)程之外，目前對選擇的肽進行基因重排和選擇程序的商業(yè)服務(wù)也是可用的。Maxygen(Redwood City，CA)提供了生成定制的DNA重排文庫的商業(yè)服務(wù)。此外，該公司將進行定制的進化程序，該程序包括對選擇的肽種類的基因重排和選擇。
Optigenix，Inc.(Newark，DE)提供了質(zhì)粒重排的相關(guān)服務(wù)。Optigenix利用基因家族以獲得其中具有新性質(zhì)的突變。將該目標(biāo)核酸克隆入曲霉屬(Aspergillus)表達系統(tǒng)的質(zhì)粒中。然后將相關(guān)家族的DNA引入表達系統(tǒng)中，且在宿主中可發(fā)生家族中保守區(qū)域中的重組。然后使結(jié)果所得的突變DNA表達，并從其中產(chǎn)生的肽中篩選存在想要的性質(zhì)和不存在不想要的性質(zhì)的肽。
c.篩選程序在每一個“進化”循環(huán)之后，對由突變基因表達的想要的肽進行目標(biāo)特征的篩選。然后使“候選”基因進行擴增并匯集以進行下一輪的DNA重排。所用的篩選程序高度依賴于進行“進化”的肽和目標(biāo)特征。利用本領(lǐng)域中眾所周知的程序可選擇如肽穩(wěn)定性、生物學(xué)活性、抗原性等的特征。對于用于本發(fā)明方法中的優(yōu)選的肽的生物學(xué)活性的單個測定法在別處描述。
d.技術(shù)的組合技術(shù)人員將理解上述突變和選擇技術(shù)可相互組合并與額外的程序進行組合以生成用于本發(fā)明方法中的最可能的肽分子。因而，本發(fā)明不局限于生成肽的任何一個方法，而應(yīng)解釋為包含在此處描述的任何或全部方法。例如，開始可進行向核酸序列中引入點突變的程序，隨后進行DNA重排、選擇和擴增的循環(huán)。開始的點突變的引入可用于將多樣性引入到缺乏該多樣性的基因群體中，且隨后的DNA重排和篩選的循環(huán)將選擇并重組有利的點突變。
III.糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶A.糖苷酶糖苷酶是用水作為受體分子的糖基轉(zhuǎn)移酶，且一般同樣地是糖苷水解酶。通過控制反應(yīng)混合物的熱力學(xué)和動力學(xué)可將糖苷酶用于在體外形成糖苷鍵。但即使在修飾的反應(yīng)條件下，糖苷酶反應(yīng)仍然是難以操作的，且作為可逆的轉(zhuǎn)糖基酶反應(yīng)和競爭性的水解反應(yīng)的結(jié)果，糖苷酶傾向于給出低的合成結(jié)果。
糖苷酶可通過對在水解過程中斷裂的鍵位置保持其立體化學(xué)或通過對在水解過程中斷裂的鍵位置顛倒其立體化學(xué)而發(fā)揮功能，從而分別將糖苷酶分為“保持型”糖苷酶或“顛倒型”糖苷酶。保持型糖苷酶具有存在于活性位點的兩個關(guān)鍵羧酸部分，其一個羧酸充當(dāng)酸/堿催化劑而另一個充當(dāng)親核試劑，而對于顛倒型糖苷酶，一個羧酸發(fā)揮酸的功能，而另一個發(fā)揮堿的功能。
確定任何糖苷酶的活性和連接特異性的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，包括簡化的HPLC規(guī)程(Jacob和Scudder，1994，Methodsin Enzymol.230280-300)。對于糖苷酶和糖苷酶處理的一般討論可發(fā)現(xiàn)于Glycobiology，APractical Approach，(1993，F(xiàn)ukuda和Kobataeds.，Oxford University Press Inc.，New York)。
用于本發(fā)明中的糖苷酶包括但不局限于唾液酸酶、半乳糖苷酶、內(nèi)切聚糖酶、甘露糖苷酶(即α和βManI、ManII和ManIII)、木糖苷酶、巖藻糖苷酶、土壤桿菌屬物種(Agrobacteriumsp.)β-葡糖苷酶、糞肥纖維單胞菌(Cellulomonasfimi)甘露糖苷酶2A、Humicolainsolens糖苷酶、硫磺礦硫化葉菌(Sulfolobus solfataricus)糖苷酶和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)糖苷酶。
用于本發(fā)明中的巖藻糖苷酶的選擇依賴于巖藻糖與其他分子的連接。許多用于本發(fā)明方法中的α-巖藻糖苷酶的特異性是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，且許多巖藻糖苷酶的變體也是商業(yè)上可購得的(Glyko，Novato，CA；PROzyme，San Leandro，CA；Calbiochem-NovabiochemCorp.，San Diego，CA等)。目標(biāo)α-巖藻糖苷酶包括但不局限于來自Turbo cornutus、Charonia lampas、迅雷鼓脹菌(Bacillusfulminans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、產(chǎn)氣莢膜羧菌(Clostridium perfringens)、牛腎(Glyko)、雞肝(Tyagarajan等人，1996，Glycobiology 683-93)的α-巖藻糖葡酶和來自木薯假單胞菌(Xanthomonas manihotis)(Glyko，PROzyme)的α-巖藻糖苷酶I I。雞肝巖藻糖苷酶對于從N-連接的聚糖中去除核心巖藻糖是特別有用的。
B.糖基轉(zhuǎn)移酶糖基轉(zhuǎn)移酶以逐步的方式催化活化的糖(供體NDP-糖)向蛋白質(zhì)、糖肽、脂質(zhì)或糖脂或生長的寡糖的非還原末端的添加。N-連接的糖肽是通過轉(zhuǎn)移酶和脂質(zhì)連接的寡糖供體Dol-PP-NAG2Glc3Man9進行總體(enblock)轉(zhuǎn)移并隨后對核心進行修剪而合成的。在該情況下，“核心”糖的特性與隨后的附著物有些不同。大量的糖基轉(zhuǎn)移酶是本領(lǐng)域中公知的。
用于本發(fā)明中的糖基轉(zhuǎn)移酶可為任何只要能夠利用修飾糖作為糖供體的糖基轉(zhuǎn)移酶。這種酶的例子包括Leloir氏途徑的糖基轉(zhuǎn)移酶，如半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、唾酸轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、木糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶等。
對于涉及糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的酶促糖合成，可克隆或從任何來源分離糖基轉(zhuǎn)移酶。許多克隆的糖基轉(zhuǎn)移酶及其多核苷酸序列是已知的。參見如Taniguchi等人，2002，Handbook of glycosyltransferases andrelated genes，Springer，Tokyo。
糖基轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列和編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列也發(fā)現(xiàn)于各種公用的數(shù)據(jù)庫中，包括GenBank、Swiss-Prot、EMBL等，其中從該核苷酸序列中可推斷氨基酸序列。
可用于本發(fā)明方法中的糖基轉(zhuǎn)移酶包括但不局限于半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖基轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶、葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶、唾酸轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、葡糖醛酸轉(zhuǎn)移酶、半乳糖醛酸轉(zhuǎn)移酶和寡糖基轉(zhuǎn)移酶。適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶包括那些從真核生物以及原核生物中獲得的。
編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA可通過化學(xué)合成、通過篩選來自適當(dāng)?shù)募?xì)胞或細(xì)胞系培養(yǎng)物的mRNA的反轉(zhuǎn)錄物、通過篩選來自適當(dāng)?shù)募?xì)胞的基因組文庫或通過組合這些程序而獲得。對mRNA或基因組DNA的篩選可用源自糖基轉(zhuǎn)移酶核酸序列的寡核苷酸探針來進行。探針根據(jù)已知的程序可用可探測的標(biāo)記進行標(biāo)記并用于常規(guī)的雜交測定中，該標(biāo)記如但不局限于熒光基團、放射性原子或化學(xué)發(fā)光基團?？蛇x擇地，糖基轉(zhuǎn)移酶核酸序列可通過應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)程序獲得，其中PCR的寡核苷酸引物是從糖基轉(zhuǎn)移酶核酸序列中產(chǎn)生的。參見Mullis等人的U.S.Pat.No.4,683,195和Mullis的U.S.Pat.No.4,683,202。
糖基轉(zhuǎn)移酶可在用含有編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA的載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞中合成。載體是可復(fù)制的DNA構(gòu)建體。載體可用于擴增編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA和/或表達編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA。表達載體是可復(fù)制的DNA構(gòu)建體，其中編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA序列是可操作地連接到適當(dāng)?shù)目刂菩蛄猩系?，該控制序列能夠?qū)崿F(xiàn)糖基轉(zhuǎn)移酶在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中的表達。對這種控制序列的需要將依賴于選擇的宿主和選擇的轉(zhuǎn)化方法而有變化。通常，控制序列包括轉(zhuǎn)錄啟動子、控制轉(zhuǎn)錄的可選擇的操縱基因序列、編碼適當(dāng)?shù)膍RNA核糖體結(jié)合位點的序列和控制轉(zhuǎn)錄和翻譯終止的序列。擴增載體不需要表達控制結(jié)構(gòu)域。所需的只是通常由復(fù)制起點所賦予的在宿主中復(fù)制的能力和促進轉(zhuǎn)化體識別的選擇基因。
1.巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在一些實施方案中，用于本發(fā)明方法中的糖基轉(zhuǎn)移酶是巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。示例性的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括將L-巖藻糖從GDP-巖藻糖向受體糖的羥基位置轉(zhuǎn)移的酶。將非核苷酸的糖轉(zhuǎn)移到受體中的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶也可用于本發(fā)明中。
在一些實施方案中，受體糖例如是寡糖糖苷中Galβ(1→3，4)GlcNAcβ-基團中的GlcNAc。該反應(yīng)的適當(dāng)?shù)膸r藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括首先從人乳中表征的Galβ(1→3，4)GlcNAcβ1-α(1→3，4)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FTIII E.C.No.2.4.1.65)(參見Palcic等人，Carbohydrate Res.1901-11(1989)；Prieels等人，J.Biol.Chem.25610456-10463(1981)；和Nunez等人，Can.J.Chem.592086-2095(1981))和發(fā)現(xiàn)于人血清中的Galβ(1→4)GlcNAcβ-α巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(FTIV、FTV、FTVI)。也表征了唾液酸基α(2→3)Galβ(1→3)GlcNAcβ巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FTVII(E.C.No.2.4.1.65)。Galβ(1→3，4)GlcNAc β1-α(1→3，4)巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的重組形式也進行了表征(參見Dumas等人，Bioorg.Med.Letters 1425-428(1991)和Kukowska-Latallo等人，Genes and Development 41288-1303(1990))。其他示例性的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括如α1，2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.No.2.4.1.69)。酶促巖藻糖基化可通過描述于Mollicone等人，Eur.J.Biochem.191169-176(1990)或美國專利No.5,374,655中的方法進行。
2.半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在另一組實施方案中，糖基轉(zhuǎn)移酶是半乳糖基轉(zhuǎn)移酶。示例性的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶包括α(1，3)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.No.2.4.1.151，參見如Dabkowski等人，Transplant Proc.252921(1993)和Yamamoto等人，Nature 345229-233(1990)，牛的(GenBank j04989，Joziasse等人，J.Biol.Chem.26414290-14297(1989))，鼠的(GenBankm26925；Larsen等人，Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 868227-8231(1989))，豬的(GenBank L36152；Strahan等人，Immunogenetics 41101-105(1995))。另一種適當(dāng)?shù)摩?，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶是參與血液B組抗原形成的(E.C.2.4.1.37，Yamamoto等人，J.Biol.Chem.2651146-1151(1990)(人的))。
同樣適用于本發(fā)明方法中的是β(1，4)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶包括如E.C.2.4.1.90(LacNAc合成酶)和E.C.2.4.1.22(乳糖合成酶)(牛的(D’Agostaro等人，Eur.J.Biochem.183211-217(1989))，人的(Masri等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.157657-663(1988))，鼠的(Nakazawa等人，J.Biochem.104165-168(1988))，以及E.C.2.4.1.38和神經(jīng)酰胺半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.1.45，Stahl等人，J.Neurosci.Res.38234-242(1994)。其他適當(dāng)?shù)陌肴樘腔D(zhuǎn)移酶包括如α1，2半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(來自如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，Chapell等人，Mol.Biol.Cell5519-528(1994))。對于進一步的適當(dāng)?shù)陌肴樘腔D(zhuǎn)移酶，參見Taniguchi等人(2002，Handbook of Glycosyltransferases andRelated Genes，Springer，Tokyo)，Guo等人(2001，Glycobiology，11(10)813-820)和Breton等人(1998，J Biochem.1231000-1009)。
通過基因工程從克隆的基因中生產(chǎn)如酶GalNAc TI-XIV的蛋白質(zhì)是眾所周知的。參見如U.S.Pat.No.4,761,371。一個方法包括集中足夠的樣品，然后通過N-末端測序確定酶的氨基酸序列。然后將該信息用于分離編碼全長(膜結(jié)合的)轉(zhuǎn)移酶的cDNA克隆，該cDNA克隆在昆蟲細(xì)胞系Sf 9中表達后導(dǎo)致完全活性的酶的合成。然后通過對16個不同蛋白質(zhì)中已知的糖基化位點周圍氨基酸的半定量分析并伴隨著對合成肽的體外糖基化研究以確定酶的受體特異性。該研究已證明某些氨基酸殘基在糖基化的肽區(qū)段中是高頻率存在的(overrepresent)，且在圍繞糖基化的絲氨酸和蘇氨酸殘基的特定位置的殘基對于受體功效具有比其他氨基酸部分更顯著的影響。
3.唾酸轉(zhuǎn)移酶唾酸轉(zhuǎn)移酶是用于本發(fā)明的重組細(xì)胞和反應(yīng)混合物中的另一類糖基轉(zhuǎn)移酶。適用于本發(fā)明的唾酸轉(zhuǎn)移酶的例子包括ST3GalIII(如大鼠或人的ST3GalIII)、ST3GalIV、ST3GalI、ST6GalI、ST3GalV、ST6GalII、ST6GalNAcI、ST6GalNAcII和ST6GalNAcIII(用于此處的唾酸轉(zhuǎn)移酶的命名法描述于Tsuji等人，Glycobiology 6-(1996)中)。稱為α(2，3)唾酸轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.99.6)的示例性α(2，3)唾酸轉(zhuǎn)移酶可將唾液酸轉(zhuǎn)移到Galβ1→3Glc二糖或糖苷的非還原末端Gal上。參見Vanden Eijnden等人，J.Biol.Chem.2563159(1981)，Weinstein等人，J.Biol.Chem.25713845(1982)和Wen等人，J.Biol.Chem.26721011(1992)。另一個示例性的α2，3-唾酸轉(zhuǎn)移酶(E.C.2.4.99.4)可將唾液酸轉(zhuǎn)移到二糖或糖苷的非還原末端Gal上。參見Rearick等人，J.Biol.Chem.2544444(1979)和Gillespie等人，J.Biol.Chem.26721004(1992)。進一步示例性的酶包括Gal-β-1，4-GlcNAcα-2，6唾酸轉(zhuǎn)移酶(參見Kurosawa等人，Eur.J.Biochem.219375-381(1994))。
優(yōu)選地，對于糖肽的糖的糖基化，唾酸轉(zhuǎn)移酶能夠?qū)⑼僖核徂D(zhuǎn)移到序列Galβ1，4GlcNAc-、Galβ1，3GlcNAc-或Galβ1，3GalNAc-上，即完全唾液酸化的糖結(jié)構(gòu)上末端唾液酸的最常見的倒數(shù)第二個序列(參見表8)。能夠?qū)⑼僖核徂D(zhuǎn)移到α2，3Galβ1，4GlcNAc的α2，8-唾<p>表4.cH36對恒河猴中E.coli誘導(dǎo)的膿毒性休克的保護作用
實施例4 狒狒中的急性肺損傷模型A.急性肺損傷是膿毒病發(fā)病和致死的重要因素。感染有革蘭氏陰性膿毒病的患者具有急性呼吸窘迫綜合征和多種器官衰竭的高發(fā)生率。已經(jīng)顯示，用活性位點失活的因子VIIa去阻止組織因子的功能，能限制狒狒中膿毒病誘導(dǎo)的急性肺損傷和其它器官損害(見Welty-Wolf，K.et al.，Am.J.Respir.Crit.Care Med.1641988(2001))。急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)的一個重要的病理生理學(xué)特征是對外源性凝血的局部激活和對纖維蛋白溶解的抑制。隨著損傷的發(fā)展，這些干擾導(dǎo)致纖維蛋白在肺的肺泡空間和微血管、組織間隙沉著，導(dǎo)致毛細(xì)管閉塞和透明膜形成。外源性凝血途徑的組分(例如，TF、凝血酶和纖維蛋白)為炎癥細(xì)胞交通(traffic)的改變和血管滲透性的增加提供信號。前凝血劑(procoagulant)和纖維蛋白還能促進損傷中的其它關(guān)鍵事件，包括補體激活、前炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生、對纖維蛋白溶解的抑制和受損的肺的重構(gòu)。已經(jīng)確定膿毒病誘導(dǎo)的TF表達激活了肺中的外源性凝血級聯(lián)，導(dǎo)致了前凝血環(huán)境，其導(dǎo)致纖維蛋白沉著并且增強了炎癥。通過阻止外源性凝血的起始事件，實驗性ARDS期間，它們對于肺中前炎性事件和紊亂的纖維蛋白轉(zhuǎn)換的效果可被更正，嚴(yán)重的結(jié)構(gòu)和功能損傷的發(fā)展可被防止。近來的研究表明，用活性位點被抑制的因子VIIa(FVIIai)或TF途徑抑制劑(TFPI)來預(yù)防TF-因子TIIa復(fù)合體上凝血的起始，可以削弱膿毒病中的炎癥以及纖維蛋白的沉著，由此限制了狒狒中的急性肺損傷(ALI)和其它的器官損害。
用于膿毒病誘導(dǎo)的ALI模型的模型已在狒狒中建立。見Welty-6,096,529和6,210,933以及WO99/49051，以及公布的美國專利申請2002/2,042,369)。該酶催化唾液酸向Galβ1，4Glc或Galβ1，3GalNAc的轉(zhuǎn)移。用于本發(fā)明的其他示例性的唾酸轉(zhuǎn)移酶包括那些從空腸彎曲桿菌空腸亞種(Campylobacter jejuni)中分離的，包括α(2，3)唾酸轉(zhuǎn)移酶。參見如WO99/49051。
其他唾酸轉(zhuǎn)移酶(包括那些列于表8中的)也用于經(jīng)濟和有效的大規(guī)模過程中以對商業(yè)上重要的糖肽進行唾液酸化。作為發(fā)現(xiàn)這些其他的酶的效用的簡單檢驗，使各種量的每一種酶(1-100mU/mg蛋白質(zhì))與脫唾液酸化-α1AGP(1-10mg/ml)進行反應(yīng)，以比較目標(biāo)唾酸轉(zhuǎn)移酶相對于牛的ST6GalI、ST3GalIII的每一個或兩者對糖肽進行唾液酸化的能力?？蛇x擇地，可將從肽主鏈中酶促釋放的其他糖肽或糖肽或N-連接的寡糖代替脫唾液酸化-α1AGP用于進行該估計。將具有比ST6GalI更有效地對糖肽的N-連接的寡糖進行唾液酸化能力的唾酸轉(zhuǎn)移酶用于肽唾液酸化的大規(guī)模實踐過程中(如在本公開內(nèi)容中對ST3GalIII所闡明的)。
4.其他糖基轉(zhuǎn)移酶本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解可將其他的糖基轉(zhuǎn)移酶替代入類似的轉(zhuǎn)移酶循環(huán)中，如對唾酸轉(zhuǎn)移酶詳細(xì)描述的。特別地，糖基轉(zhuǎn)移酶也可為如葡糖基轉(zhuǎn)移酶，如Alg8(Stagljov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 915977(1994))或Alg5(Heesen等人，Eur.J.Biochem.22471(1994))。
N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶也可用于本發(fā)明的實踐中。適當(dāng)?shù)腘-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶包括但不局限于α(1，3)N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶、β(1，4)N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶(Nagata等人，J.Biol.Chem.26712082-12089(1992)和Smith等人，J.Biol.Chem.26915162(1994))和肽N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶(Homa等人，J.Biol.Chem.26812609(1993))。適當(dāng)?shù)腘-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶包括GnT-I(2.4.1.101，Hull等人，BBRC 176608(1991))、GnT-II、GnT-III(Ihara等人，J.Biochem.113692(1993))、GnT-IV、GnT-V(Shoreibah等人，J.Biol.Chem.26815381(1993))和GnT-VI、O-連接的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(Bierhuizen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 899326(1992))、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶(Rajput等人，Biochem J.285985(1992))和透明質(zhì)酸合成酶(hyaluronan synthase)。
甘露糖基轉(zhuǎn)移酶可用于轉(zhuǎn)移修飾的甘露糖部分。適當(dāng)?shù)母事短腔D(zhuǎn)移酶包括α(1，2)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、α(1，3)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、α(1，6)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、β(1，4)甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、Dol-P-Man合成酶、Och1和Pmt1(參見Kornfeld等人，Annu.Rev.Biochem.54631-664(1985))。
木糖基轉(zhuǎn)移酶也可用于本發(fā)明中。參見如Rodgers等人，Biochem.J.，288817-822(1992)；和Elbain等人，美國專利No.，6,168,937。
其他適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶循環(huán)描述于Ichikawa等人，JACS 1149283(1992)、Wong等人，J.Org.Chem.574343(1992)和Ichikawa等人Carbohydrates and Carbohydrate Polymers，Yaltami，ed.(ATLPress，1993)。
原核生物的糖基轉(zhuǎn)移酶也可用于本發(fā)明的實踐中。這種糖基轉(zhuǎn)移酶包括參與脂寡糖(LOS)合成的酶，該LOS可由許多革蘭氏陰性細(xì)菌產(chǎn)生。LOS一般具有模擬在人上皮細(xì)胞表面或在宿主分泌物中發(fā)現(xiàn)的糖綴合物的末端聚糖序列(Preston等人，Critical Reviews in Microbiology 23(3)139-180(1996))。這種酶包括但不局限于如大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)物種的rfa操縱子的蛋白質(zhì)，這包括β1，6半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和β1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(參見如EMBL Accession Nos.M80599和M86935(大腸桿菌)；EMBL Accession No.S56361(鼠傷寒沙門氏菌))、葡糖基轉(zhuǎn)移酶(Swiss-Prot Accession No.P25740(大腸桿菌)、β1，2-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(rfaJ)(Swiss-Prot Accession No.P27129(大腸桿菌)和Swiss-Prot Accession No.P19817(鼠傷寒沙門氏菌))和β1，2-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶(rfaK)(EMBL Accession No.U00039(大腸桿菌))。其他氨基酸序列已知的糖基轉(zhuǎn)移酶包括那些由操縱子如rfaB編碼的，這已在下面生物中進行了表征，如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、腸沙門氏菌(Salmonella enterica)、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica)、Mycobacterium leprosum和銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的rh1操縱子。
同樣適用于本發(fā)明的是參與產(chǎn)生含有乳-N-新四糖(lacto-N-neotetraose)D-半乳糖基-β-1，4-N-乙?；?D-葡糖胺基-β-1，3-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖和Pk血液基團三糖序列D-半乳糖基-α-1，4-D-半乳糖基-β-1，4-D-葡萄糖的結(jié)構(gòu)的糖基轉(zhuǎn)移酶，該結(jié)構(gòu)已在粘膜病原體淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonnorhoeae)和腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)的LOS中進行了鑒定(Scholten等人，J.Med.Microbiol.41236-243(1994))。來自腦膜炎奈瑟氏球菌和淋病奈瑟氏球菌的編碼參與這些結(jié)構(gòu)生物合成的糖基轉(zhuǎn)移酶的基因已從腦膜炎奈瑟氏球菌免疫型L3和L1(Jennings等人，Mol.Microbiol.18729-740(1995))和淋病奈瑟氏球菌突變體F62(Gotshlich，J.Exp.Med.1802181-2190(1994))中進行了鑒定。在腦膜炎奈瑟氏球菌中，由3個基因lgtA、lgtB和lgE組成的座位編碼在乳-N-新四糖中添加最后3個糖所必需的糖基轉(zhuǎn)移酶(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.27119166-73(1996))。最近證明了lgtB和lgtA基因產(chǎn)物的酶活性，從而提供了對于它們的糖基轉(zhuǎn)移酶功能的第一個直接證據(jù)(Wakarchuk等人，J.Biol.Chem.271(45)28271-276(1996))。在淋病奈瑟氏球菌中，有2個額外的基因，即將β-D-GalNAc添加到乳-N-新四糖結(jié)構(gòu)的末端半乳糖的3位置中的lgtD和將末端α-D-Gal添加到截短的LOS的乳糖元件中的lgtC從而生成了Pk血液基團抗原結(jié)構(gòu)(Gotshlich(1994)，見上文)。在腦膜炎奈瑟氏球菌中，單獨免疫型L1也表達Pk血液基團抗原且已顯示具有l(wèi)gtC基因(Jennings等人(1995)，見上文)。奈瑟氏球菌糖基轉(zhuǎn)移酶和相關(guān)基因也描述于USPN5,545,553中(Gotshlich)。也已表征了來自幽門螺桿菌(Helicobacterpylori)的α1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和α1，3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(Martin等人，J.Biol.Chem.27221349-21356(1997))。同樣用于本發(fā)明中的是空腸彎曲桿菌空腸亞種的糖基轉(zhuǎn)移酶(參見Taniguchi等人，2002，Handbookof glycosyltransferases and related genes，Springer，Tokyo)。
B.磺基轉(zhuǎn)移酶本發(fā)明也提供了生成包括硫酸化分子的肽的方法，該硫酸化的分子包括如硫酸化的多糖如肝素、類肝素硫酸鹽、角叉藻聚糖和相關(guān)化合物。適當(dāng)?shù)幕腔D(zhuǎn)移酶包括如軟骨素-6-磺基轉(zhuǎn)移酶(由Fukuta等人，J.Biol.Chem.27018575-18580(1995)描述的雞cDNA；GenBankAccession No.D49915)、糖胺聚糖N-乙酰葡糖胺N-脫乙?；?N-磺基轉(zhuǎn)移酶1(Dixon等人，Genomics 26239-241(1995)；UL18918)和糖胺聚糖N-乙酰葡糖胺N-脫乙酰基酶/N-磺基轉(zhuǎn)移酶2(在Orellana等人，J.Biol.Chem.2692270-2276(1994)和Eriksson等人，J.Biol.Chem.26910438-10443(1994)中描述的鼠cDNA；描述于GenBank Accession No.U2304中描述的人cDNA)。
C.細(xì)胞結(jié)合的糖基轉(zhuǎn)移酶在另一個實施方案中，用于本發(fā)明方法中的酶是細(xì)胞結(jié)合的糖基轉(zhuǎn)移酶。盡管許多可溶性的糖基轉(zhuǎn)移酶是已知的(參見如U.S.Pat.No.5,032,519)，但當(dāng)與細(xì)胞結(jié)合時糖基轉(zhuǎn)移酶通常是膜結(jié)合形式的。迄今研究的許多膜結(jié)合酶可認(rèn)為是內(nèi)在蛋白質(zhì)；即它們不可通過超聲處理而從膜中釋放且需要去污劑以使其溶解。已在脊椎動物和無脊椎動物細(xì)胞的表面鑒定了表面糖基轉(zhuǎn)移酶，并已認(rèn)識到這些表面轉(zhuǎn)移酶在生理學(xué)條件下可保持催化活性。然而，細(xì)胞表面糖基轉(zhuǎn)移酶更認(rèn)可的功能是細(xì)胞間識別(Roth，1990，Molecular Approaches toSupracellular Phenomena)。
已發(fā)展了改變由細(xì)胞表達的糖基轉(zhuǎn)移酶的方法。例如，Larsen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 868227-8231(1989)報道了分離克隆的cDNA序列的遺傳方法，該克隆的cDNA序列決定細(xì)胞表面寡糖結(jié)構(gòu)及其同源的糖基轉(zhuǎn)移酶的表達。將從mRNA生成的cDNA文庫轉(zhuǎn)染入COS-1細(xì)胞中，該mRNA是從已知表達UDP-半乳糖.β.-D-半乳糖基-1，4-N-乙酰基-D-氨基葡糖苷α-1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的鼠細(xì)胞系分離的。然后培養(yǎng)該轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并測定α1-3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
Francisco等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892713-2717(1992)公開了將β-內(nèi)酰胺酶錨定于大腸桿菌外表面的方法。產(chǎn)生了三重的融合物，結(jié)果導(dǎo)致了表面結(jié)合的活性β-內(nèi)酰胺酶分子，該三重的融合物由(i)外膜蛋白質(zhì)的信號序列，(ii)外膜蛋白質(zhì)的跨膜部分和(iii)完整的成熟β-內(nèi)酰胺酶序列組成。然而，F(xiàn)rancisco方法僅限于原核細(xì)胞系統(tǒng)，且如作者所承認(rèn)的，需要完整的三重結(jié)構(gòu)以發(fā)揮正確的功能。
D.融合酶在另一個示例性的實施方案中，本發(fā)明的方法利用融合肽，該融合肽具有超過一種參與想要的糖肽綴合物合成的酶活性。該融合蛋白質(zhì)可包含如與輔助酶的催化活性結(jié)構(gòu)域結(jié)合的糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性結(jié)構(gòu)域。該輔助酶的催化結(jié)構(gòu)域可催化如核苷酸糖形成中的一個步驟，該核苷酸糖是糖基轉(zhuǎn)移酶的供體，或者催化參與糖基轉(zhuǎn)移酶循環(huán)的反應(yīng)。例如，可以使編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的多核苷酸按閱讀框(in-frame)與編碼參與核苷酸糖合成的酶的多核苷酸結(jié)合。然后結(jié)果所得的融合肽不僅可催化核苷酸糖的合成，而且可將糖部分轉(zhuǎn)移到受體分子上。融合肽可為連接至一個可表達的核苷酸序列的兩個或多個循環(huán)酶。在其他的實施方案中，融合肽包括兩個或多個糖基轉(zhuǎn)移酶的催化活性結(jié)構(gòu)域。參見如美國專利No.5,641,668。本發(fā)明修飾的糖肽可易于用各種適當(dāng)?shù)娜诤想倪M行設(shè)計和生產(chǎn)(參見如于1999年6月24日作為WO 99/31224發(fā)表的PCT專利申請PCT/CA98/01180)。
E.固定的酶除細(xì)胞結(jié)合的酶之外，本發(fā)明也提供了固定于固體和/或可溶性支持體上的酶的應(yīng)用。在一個示例性的實施方案中，提供了根據(jù)本發(fā)明的方法通過完整糖基連接體與PEG綴合的糖基轉(zhuǎn)移酶。該PEG-連接體-酶綴合物可選擇地是附著于固體支持體上的。在本發(fā)明方法中固體支持的酶的應(yīng)用簡化了反應(yīng)混合物的操作和反應(yīng)產(chǎn)物的純化，且也使得該酶易于回收。該糖基轉(zhuǎn)移酶綴合物應(yīng)用于本發(fā)明的方法中。酶和支持體的其他組合對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的。
F.糖基轉(zhuǎn)移酶的誘變用于本發(fā)明的方法中的糖基轉(zhuǎn)移酶、唾酸轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶和任何其他酶的新形式可用前文所述的任何方法以及本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的其他方法生成。特別感興趣的是具有改變的受體特異性和/或供體特異性的轉(zhuǎn)移酶。同樣感興趣的是具有較高轉(zhuǎn)化率和較高穩(wěn)定性等的酶。
當(dāng)肽的序列已知時可應(yīng)用推理的設(shè)計誘變技術(shù)。由于用于本發(fā)明的轉(zhuǎn)移酶和葡糖苷酶的序列以及許多三級結(jié)構(gòu)是已知的，所以這些酶可理想地用于推理的突變設(shè)計。例如，可以使酶的催化位點進行突變以改變酶的供體和/或受體特異性。
糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶水解酶的詳盡的三級結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)也使得這些酶可理想地用于包括結(jié)構(gòu)域交換的突變。糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶水解酶是模塊化的酶(參見Bourne和Henrissat，2001，Current Opinion inStructural Biology 11593-600)。糖基轉(zhuǎn)移酶可基于其結(jié)構(gòu)分為兩類GT-A和GT-B。GT-A類的糖基轉(zhuǎn)移酶包含2個不同的結(jié)構(gòu)域，一個參與核苷酸結(jié)合而另一個參與受體結(jié)合。因而，人們可方便地將來自一個基因的編碼結(jié)構(gòu)域的DNA序列與來自第二個基因的結(jié)構(gòu)域按讀碼框融合以生成新的基因，該新的基因編碼具有新的受體/供體特異性的蛋白質(zhì)。這種結(jié)構(gòu)域交換額外地可包括糖模塊和其他輔助結(jié)構(gòu)域。
如上所述的隨機突變和/或定向進化技術(shù)也可用于生成用于本發(fā)明的新形式的糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶。
IV.體外和體內(nèi)表達系統(tǒng)A.生產(chǎn)糖肽的細(xì)胞糖基轉(zhuǎn)移酶的作用是肽的糖基化的關(guān)鍵，因而，任何給定的細(xì)胞類型中一套糖基轉(zhuǎn)移酶的表達中的差異可影響在該細(xì)胞中產(chǎn)生的任何給定肽的糖基化模式。對于宿主細(xì)胞依賴性肽糖基化的綜述，參見Kabata和Takasaki，“Structure and Biosynthesis of Cell SurfaceCarbohydrates”，Cell Surface Carbohydrates and CellDevelopment，1991，pp.1-24，Eds.Minoru Fukuda，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)L。
根據(jù)本發(fā)明的公開內(nèi)容，產(chǎn)生肽的細(xì)胞類型僅與生成具有想要的糖基化的肽所必需的重構(gòu)程度相關(guān)。例如，在體外生成具有想要的糖基化的肽所必需的酶促消化反應(yīng)的數(shù)目和順序及酶促合成反應(yīng)的數(shù)目和順序?qū)⒁蕾囉谟商囟?xì)胞類型產(chǎn)生的肽上聚糖的結(jié)構(gòu)而變化。盡管本發(fā)明決不應(yīng)該解釋為局限于從任何特定的細(xì)胞類型(包括在此處公開的細(xì)胞類型)產(chǎn)生肽，但現(xiàn)在提供了對幾個細(xì)胞系統(tǒng)的討論，該討論確定了本發(fā)明的效力及生成肽的細(xì)胞類型的獨立性。
通常，為了從編碼肽的核酸中表達該肽，必須將該核酸整合入表達盒中，該表達盒包含啟動子元件、終止子元件和在兩者之間可操作地連接的肽編碼序列。然后使該表達盒可操作地與載體連接。為此目的，可將連接物或連接體用于連接核苷酸片段，或可包括其他操作以提供便利的限制酶切位點、去除多余的核苷酸、去除限制酶切位點等。為此目的，可包括體外誘變、引物修復(fù)、限制性切割、退火、再次替代如轉(zhuǎn)換和顛換。穿梭載體具有在細(xì)胞中復(fù)制所必需的遺傳元件。一些載體僅可在原核生物中復(fù)制，或者可同時在原核生物和真核生物中復(fù)制。這種質(zhì)粒表達載體將在一個或多個復(fù)制系統(tǒng)中維持，優(yōu)選地為兩個復(fù)制系統(tǒng)，這使得能夠為了表達的目的在酵母宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地維持且為了克隆的目的在原核宿主中穩(wěn)定維持。許多具有不同特征的載體是商業(yè)上可購得的。載體通常是質(zhì)?；蚴删w，但也可為粘粒或微型染色體。方便地是，許多商業(yè)上可購得的載體將具有已存在的表達盒的啟動子和終止子及可用于插入目標(biāo)肽的編碼序列的多連接體位點。然后使含有表達盒的穿梭載體在大腸桿菌中轉(zhuǎn)化，在其中該載體在細(xì)胞分裂過程中復(fù)制以生成載體制劑，該載體制劑足以轉(zhuǎn)化具有選擇的表達系統(tǒng)的宿主細(xì)胞。上述方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，且實施的規(guī)程可發(fā)現(xiàn)于Sambrook等人(2001，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)。
該載體一旦從使其擴增的細(xì)胞中純化后，則轉(zhuǎn)化入表達系統(tǒng)的細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化規(guī)程依賴于細(xì)胞類型和載體的特性。使轉(zhuǎn)化體生長于適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)培養(yǎng)基上，且在適當(dāng)時在選擇性壓力下維持以確保內(nèi)源DNA的保持。當(dāng)表達是誘導(dǎo)型的時，可使得酵母宿主生長以得到高密度的細(xì)胞，然后誘導(dǎo)表達。分泌的成熟的異源肽可通過任何常規(guī)方法來收獲，且可通過層析、電泳、透析、溶劑-溶劑提取等來純化。
分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的。進一步地，分子克隆程序的技術(shù)可發(fā)現(xiàn)于Sambrook等人(2001，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.)；Glover等人(1985，DNA CloningA PracticalApproach，I和II卷)；Gait等人(1985，OligonucleotideSynthesis)；Hames和Higgins(1985，Nucleic Acid Hybridization)；Hames和Higgins(1984，Trans cription And Translation)；Freshney等人(1986，Animal Cell Culture)；Perbal(1986，Immobilized CellsAnd Enzymes，IRL Press)；Perbal(1984，A Practical Guide ToMolecular Cloning)；Au subel等人(2002，Current ProtocolsinMolecular Biology，John Wiley &amp; Sons，Inc.)。
B.真菌和酵母在酵母中產(chǎn)生的肽是糖基化的，且在其上存在的聚糖結(jié)構(gòu)主要是高甘露糖結(jié)構(gòu)。在N-聚糖的情況下，在酵母中產(chǎn)生的聚糖結(jié)構(gòu)可含有多達9個或更多的甘露糖殘基，該結(jié)構(gòu)可含有或不含有額外的糖。由酵母細(xì)胞產(chǎn)生的肽上聚糖的類型的例子在圖4左側(cè)顯示。不管甘露糖殘基的數(shù)目和在其上添加的額外糖的類型和復(fù)雜性，作為酵母細(xì)胞中產(chǎn)生的肽的成分的N-聚糖包含如圖4所示的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)。當(dāng)由酵母細(xì)胞產(chǎn)生的肽上的聚糖結(jié)構(gòu)是高甘露糖結(jié)構(gòu)時，在體外用適當(dāng)?shù)母事短擒彰笍姆肿又?除包含聚糖的三甘露糖核心的分子之外)去除所有甘露糖對于技術(shù)人員而言是簡單的事情，從而生成了在其上附著有基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)的肽。目前，利用本領(lǐng)域中可用的技術(shù)并利用本發(fā)明的公開內(nèi)容，在體外向基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)酶促地添加額外的糖部分以生成具有在其上附著有想要的聚糖結(jié)構(gòu)的肽是簡單的事情。類似地，當(dāng)由酵母細(xì)胞產(chǎn)生的肽除在其上附著的其他復(fù)雜糖之外還包含高甘露糖結(jié)構(gòu)時，酶促地去除所有額外的糖(包括額外的甘露糖殘基)以得到基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)是簡單的事情。一旦產(chǎn)生了基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)，則可能根據(jù)在此處提供的說明生成具有想要的糖基化的肽。
“酵母”意思指產(chǎn)子囊酵母(Endomycetales)、擔(dān)子孢子囊酵母和屬于Fungi Imperfecti(Blastomycetes)的酵母。產(chǎn)子囊酵母可分為兩個科，即蝕精霉科和糖酵母科。后一個科包含4個亞科，即裂殖糖酵母亞科(如裂殖糖酵母屬)、拿遜氏亞科、油脂酵母亞科和糖酵母亞科(如畢赤氏酵母屬、克魯維氏酵母屬和糖酵母屬)。擔(dān)子孢子囊酵母包括Leucosporidium、紅冬飽屬、鎖擲酵母屬、Filobasidium和線黑粉菌屬。屬于Fungi Imperfecti的酵母可分為兩個科，即擲孢酵母科(如擲孢酵母屬、布氏彈孢酵母屬)和隱球酵母科(如假絲酵母屬)。本發(fā)明特別感興趣的是糖酵母屬、畢赤氏酵母屬、曲霉屬、木霉屬、克魯維氏酵母屬的物種，尤其是乳克魯維氏酵母(K.lactis)和果蠅克魯維氏酵母(K.drosophilum)、假絲酵母屬、漢遜氏酵母屬、裂殖糖酵母屬、Yarrowia和｀金孢子菌屬(Chrysoporium)。由于酵母的分類將來可能變化，所以為了本發(fā)明的目的，酵母定義應(yīng)如Skinner等人，eds.(1980)Biology and Activities of Yeast(Soc.App.Bacteriol.Symp.Series No.9)描述的。
除前文所述的之外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可能熟悉酵母的生物學(xué)和酵母遺傳學(xué)的操作。參見如Bacila等人，eds.(1978，Biochemistryand Genetics of Yeast，Academic Press，New York)；和Rose和Harrison(1987，The Yeast(2nded.)Academic Press，London)。將外源DNA引入到酵母宿主中的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。有眾多方法可用于轉(zhuǎn)化酵母。原生質(zhì)球轉(zhuǎn)化是由Hinnen等人(1978，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 751919-1933)、Beggs(1978，Nature 275(5676)104-109)和Stinchcomb等人(EPO Publication No.45，573；在此處引入作為參考)介紹的。電穿孔是由Becker和Gaurante(1991，Methods Enzymol.194182-187)介紹的，乙酸鋰是由Gietz等人(2002，Methods Enzymol.35087-96)和Mount等人(1996，MethodsMol Biol.53139-145)介紹的。對于非-糖酵母的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的綜述，參見Wang等人(Crit Rev Biotechnol.2001；21(3)177-218)。對于酵母基因工程的一般程序，參見Barr等人(1989，Yeastgeneticengineering，Butterworths，Boston)。
除野生型酵母和真菌細(xì)胞之外，也有已進行突變和/或選擇的酵母和真菌菌株，以增強外源基因的表達水平，結(jié)果所得的肽的純度、翻譯后加工，以及成熟肽的回收和純度。外源肽的表達也可指向細(xì)胞分泌途徑，如由胰島素的表達所闡明的(參見Kjeldsen，2000，Appl.Microbiol.Biotechnol.54277-286及在其中引用的參考文獻)。通常，為了導(dǎo)致外源肽從酵母細(xì)胞中分泌，可應(yīng)用源自酵母基因的分泌信號，如那些殺傷毒素(Stark和Boyd，1986，EMBO J.51995-2002)或α信息素(Kurjan和Herskowita，1982，Cell 30933；Brake等人，1988，Yeast 4S436)的基因的分泌信號。
關(guān)于通常的絲狀真菌，遺傳操作的方法可發(fā)現(xiàn)于Kinghorn和Turner(1992，Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi，Blackie Academic and Professional，New York)。適當(dāng)載體的指南可發(fā)現(xiàn)于Martinelli和Kinghorn(1994，Aspergilus50years，Elsevier，Amsterdam)。
1.糖酵母在糖酵母中，用于產(chǎn)生肽的適當(dāng)?shù)慕湍篙d體包括YRp7(Struhl等人，Proc.Natl.Acad.Sci.UsA 761035-1039，1978)、YEp13(Broach等人，Gene 8121-133，1979)、POT載體(Kawasaki等人，U.S.Pat.No.4,931,373，在此處引入作為參考)、pJDB249和pJDB219(Beggs，Nature 275104-108，1978)及其衍生物。用于酵母中的優(yōu)選的啟動子包括酵母糖酵解基因表達(Hitzeman等人，J.Biol.Chem.25512073-12080，1980；Alber和Kawasaki，J.Mol.Appl.Genet.1419-434，1982；Kawasaki，U.S.Pat.No.4,599,311)或醇脫氫酶基因(Young等人，Genetic Engineering of Microorganisms forChemicals，Hollaender等人，(eds.)，p.355，Plenum，New York，1982；Ammerer，Meth.Enzymol.101192-201，1983)的啟動子和ADH2-4c啟動子(Russell等人，Nature 304652-654，1983；Irani和Kilgore，美國專利申請Ser.No.07/784,653，CA1,304,020和EP 284044，在此處引入作為參考)。表達單位也可包括轉(zhuǎn)錄終止子。優(yōu)選的轉(zhuǎn)錄終止子是TPI1終止子(Alber和Kawasaki，如上)。
這種酵母-細(xì)菌穿梭載體的例子包括Yep24(Botstein等人(1979)Gene 817-24)、pC1(Brake等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 814642-4646)和Yrp17(Stnichomb等人(1982)J.Mol.Biol.158157)。此外，質(zhì)粒表達載體可為高或低拷貝數(shù)目的質(zhì)粒，該拷貝數(shù)目范圍一般為約1個～約200個。在高拷貝數(shù)目酵母載體的情況下，在單個宿主中通常將有至少10個、優(yōu)選地為至少20個且通常不超過約150個載體拷貝。依賴于選擇的異源肽，高或低拷貝數(shù)目的載體依賴于載體和重組肽對宿主的作用均可為想要的。參見如Brake等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 814642-4646。本發(fā)明的DNA構(gòu)建體也可通過整合型載體整合入酵母基因組中。這種載體的例子是本領(lǐng)域中公知的。參見如Botstein等人(1979)Gene 817-24。
選擇適當(dāng)?shù)慕湍负推渌⑸锼拗饕詫嵺`本發(fā)明是在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍之內(nèi)的。特別感興趣的是糖酵母物種啤酒糖酵母(S.cerevisae)、卡爾斯伯糖酵母(S.carlsbergensis)、糖化糖酵母(S.diastaticus)、S.douglasii、S.kluyveri、S.norbensis和卵形糖酵母(S.oviformis)。當(dāng)選擇酵母宿主細(xì)胞以表達想要的肽時，適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞可包括那些具有好的分泌能力、低的蛋白水解活性和總體活力等的。酵母和其他微生物通?？蓮母鞣N來源獲得，包括YeastGenetic Stock Center，Department of Biophysics and MedicalPhysics，University of California，Berkeley，Calif.；和美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection)，ManassasVA。至于綜述，參見Strathern等人，eds.(1981，The MolecularBiology of the Yeast Saccharomyces，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)。
將外源DNA引入到酵母宿主中的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。
2.畢赤氏酵母用Pichia methanolica作為宿主細(xì)胞對重組肽的生產(chǎn)公開于PCT申請WO 97/17450、WO 97/17451、WO 98/02536和WO 98/02565中。用于轉(zhuǎn)化P.methanolica的DNA分子通常是作為雙鏈的環(huán)狀質(zhì)粒制備的，該質(zhì)粒在進行轉(zhuǎn)化之前優(yōu)選地進行線性化。對于P.methanolica中的肽生產(chǎn)，優(yōu)選地是質(zhì)粒的啟動子和終止子是P.methanolica基因的，如P.methanolica醇利用基因(AUG1或AUG2)的。其他有用的啟動子包括那些二羥丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脫氫酶(FMD)和過氧化氫酶(CAT)基因的以及那些公開于美國專利No.5,252,726中的。為了促進DNA向宿主染色體中的整合，優(yōu)選地是使質(zhì)粒的整個表達區(qū)段在兩端與宿主DNA序列相接。用于Pichiame thanolica中的優(yōu)選的選擇標(biāo)記是P.methanolica ADE2基因，該基因編碼磷酸核糖-5-氨基咪唑羧化酶(phosphoribosyl-5-aminoimidazole carboxylase)(AIRC；EC 4.1.1.21)，這使得ade2宿主細(xì)胞可在不存在腺嘌呤時生長。對于想要使甲醇的應(yīng)用最小化的大規(guī)模工業(yè)過程，兩個甲醇利用基因(AUG1和AUG2)均缺失的宿主細(xì)胞是優(yōu)選的。對于分泌的肽的生產(chǎn)，液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)缺失的宿主細(xì)胞是優(yōu)選的。電穿孔可用于促進含有編碼目標(biāo)肽的DNA的質(zhì)粒向P.methanolica細(xì)胞中的引入。優(yōu)選的是用電穿孔轉(zhuǎn)化P.methanolica細(xì)胞，該電穿孔應(yīng)用指數(shù)衰變的電場強度為2.5～4.5kV/cm的脈沖電場，優(yōu)選地為約3.75kV/cm，和1～40毫秒的時間常數(shù)(t)，最優(yōu)選地為約20毫秒。對于應(yīng)用巴斯德畢赤氏酵母(Pichiapastoris)以進行大規(guī)?？贵w片段生產(chǎn)的綜述，參見Fischer等人(1999，Biotechnol Appl Biochem.30(Pt2)117-120)。
3.曲霉屬在曲霉屬物種中表達肽的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，包括但不局限于那些描述于Carrez等人，1990，Gene 94147-154；Contreras，1991，Bio/Technology 9378-381；Yelton等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 811470-1474；Tilburn等人，1983，Gene 26205-221；Kelly和Hynes，1985，EMBO J.4475-479；Ballance等人，1983，Biochem.Biophys.Res.Comm.112284-289；Buxton等人，1985，Gene 37207-214和U.S.Pat.No.4,935,349中的，在此處整體引入作為參考。用于曲霉屬中的啟動子的例子可發(fā)現(xiàn)于美國專利No.5,252,726。用于肽表達的曲霉屬的菌株可發(fā)現(xiàn)于美國專利No.4,935,349。黑曲霉和米曲霉(Aspergillus oryzae)外源肽的商業(yè)產(chǎn)物可從Novoenzymes購得。
4.木霉對于表達想要的肽，木霉具有優(yōu)于其他重組宿主細(xì)胞物種的優(yōu)點。該生物易于大量生長，且具有進行糖基化和有效地將高產(chǎn)量的重組哺乳動物肽分泌到培養(yǎng)基中的能力，從而使得對肽的分離相對容易。此外，表達的肽上的糖基化模式比在許多其他系統(tǒng)中表達的肽更與人的肽上的相似。然而，在這些細(xì)胞中表達的肽上的聚糖結(jié)構(gòu)中仍然有差異。例如，末端唾液酸殘基對于哺乳動物系統(tǒng)中肽的治療功能是重要的，這是因為這些部分在聚糖結(jié)構(gòu)末端的存在阻止了肽從哺乳動物血液中的清除。人們認(rèn)為唾液酸化的分子增加的生物學(xué)半衰期的機制在于凝集素對它們的識別降低(Drickamer，1988，J.Biol.Chem.2639557-9560)。然而，通常真菌細(xì)胞不將額外的末端唾液酸殘基添加到肽上的聚糖上，且因此在真菌細(xì)胞中合成的肽是脫唾液酸化的。根據(jù)本發(fā)明，該缺陷可用在別處詳細(xì)描述的本發(fā)明的體外聚糖重構(gòu)方法進行彌補。
用作宿主以生產(chǎn)要進行重構(gòu)的肽的木霉屬物種包括T.reesei，如QM6a、ALK02442或CBS 383.78(Centraalbureau voorSchimmelcultures，Oosterstraat1，PO Box 273，3740 AG Baarn，荷蘭)或ATCC13631(美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas VA，10852，美國，模式))；綠色木霉(T.viride)(如CBS 189.79(det.W.Gams))；T.longibrachiatum，如CBS 816.68(模式)；T.pseudokoningii(如MUCL19358；Myco theque de l’Universite Catholique de Louvain)；T.saturnisporum CBS330.70(模式)；T.harzianum CBS316.31(det.W.Gams)；T.virgatum(T.pseudokoningii)ATCC24961。最優(yōu)選地，宿主為T.reesei，且更優(yōu)選地為T.reesei菌株QM9414(ATCC26921)、RUT-C-30(ATCC56765)和源自QM9414的高生產(chǎn)性的突變體如VTT-D-79125(Nevalainen，Technical Research Centre of FinlandPublications 26，(1985)，Espoo，芬蘭)。
用DNA對木霉的轉(zhuǎn)化是用本領(lǐng)域中公知的任何技術(shù)進行的，包括在歐洲專利No.EP0244234、Harkki(1989，Bio/Technology 7596-601)和Uusitalo(1991，J.Biotech.1735-50)中介紹的。木霉的培養(yǎng)是由前述工業(yè)規(guī)模發(fā)酵技術(shù)的大量經(jīng)驗所支持；例如參見Finkelstein，1992，Biotechnology of Filamentous FungiTechnology and Products，But terworth-Heinemann，publishers，Stoneham，Mass。
5.克魯維氏酵母屬于克魯維氏酵母屬的酵母已用作宿主生物以生產(chǎn)重組的肽。由該屬酵母產(chǎn)生的肽特別地為凝乳酶(歐洲專利96 430)、奇異果甜蛋白(歐洲專利96910)、白蛋白、白細(xì)胞介素-1β、TPA、TIMP(歐洲專利361991)和具有治療功能的白蛋白衍生物(歐洲專利413622)?？唆斁S氏酵母屬中特別感興趣的物種包括乳克魯維氏酵母。
在克魯維氏酵母屬物種中表達重組肽的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。在克魯維氏酵母屬中表達和分泌人重組肽的載體是本領(lǐng)域中公知的(Yeh，J.Cell.Biochem.Suppl.14C68，Abst.H402；Fleer，1990，Yeast6(特別期號)S449)，重組肽轉(zhuǎn)化和表達的程序也是公知的(Ito等人，1983，J.Bacteriol.153163-168；vanden Berg，1990，Bio/Technology 8135-139；美國專利No.5,633,146、WO8304050A1、EP 0096910、EP 0241435、EP0301670、EP0361991，在此處全部整體引入作為參考)。對于通過基因?qū)蚝唾|(zhì)粒穿梭對乳克魯維氏酵母線性DNA質(zhì)粒的遺傳操作的綜述，參見Schaffrath等人(1999，F(xiàn)EMS Microbiol Lett.178(2)201-210)。
6.金孢子菌最近已將真菌金孢子菌屬用于表達外源重組肽。本領(lǐng)域的技術(shù)人員利用金孢子菌以表達外源肽的程序的描述可發(fā)現(xiàn)于WO 00/20555中(在此處整體引入作為參考)。特別適用于表達系統(tǒng)的物種包括，但不局限于C.botryoides、C.carmichaelili、C.crassitunicatum、C.europae、C.evolceannui、F.fastidium、C.filiforme、C.gerogiae、C.globiferum、C.globiferum var.articulatum、C.globiferum var.niveum、C.hirundo、C.hi spanicum、C.holmii、C.indicum、C.inops、嗜角質(zhì)金孢子菌(C.keratinophilum)、C.kreiselii、C.kuzurovianum、C.lignorum、C.lobatum、C.lucknowense、C.lucknowense Garg 27K、C.medium、C.medium var.spissescens、C.mephiticum、C.merdarium、C.merdarium var.roseum、C.minor、C.pannicola、短小金孢子菌(C.parvum)、C.paryum var.crescens、C.pilosum、C.peodomer derium、C.pyriformis、C.queenslandicum、C.sigleri、C.sulfureum、C.synchronum、C.tropicum、C.undulatum、C.vallenarense、C.vespertilium和C.zonatum。
7.其他用于轉(zhuǎn)化許旺氏酵母屬(Schwanniomyces)的方法公開于歐洲專利394538中。用于轉(zhuǎn)化Acremonium chrysogenum的方法由U.S.Pat.No.5,162,228公開。用于轉(zhuǎn)化鏈孢霉屬的方法由U.S.Pat.No.4,486,533公開。同樣已知的是對粟酒裂殖糖酵母特異性的表達系統(tǒng)(歐洲專利385391)。在裂殖酵母粟酒裂殖糖酵母中表達肽的常規(guī)方法可發(fā)現(xiàn)于Giga-Hama和Kumagai(1977，F(xiàn)oreign geneexpression in fission yeastSchizosaccharomyces pombe，Springer，Berlin)。
C.哺乳動物系統(tǒng)如上所述，哺乳動物細(xì)胞一般產(chǎn)生N-聚糖結(jié)構(gòu)的異源混色物，該N-聚糖在附著到三甘露糖核心上的額外的糖的數(shù)目和排列方面有變化。一般地，哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生具有復(fù)雜的聚糖結(jié)構(gòu)的肽，如在圖3右側(cè)顯示的。利用本發(fā)明的方法，可對在哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生的肽進行重構(gòu)以生成具有想要的糖基化的肽，該重構(gòu)通過首先鑒定一級聚糖結(jié)構(gòu)，然后再確定為了重構(gòu)聚糖結(jié)構(gòu)必須去除哪些糖而實現(xiàn)。如在此處所討論的，要去除的糖將決定將使用何種切割酶，且因而重構(gòu)過程的精確步驟將依賴于用作初始底物的一級聚糖結(jié)構(gòu)而變化。用于對通常在哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生的聚糖結(jié)構(gòu)進行重構(gòu)的示例性方案在圖2中顯示。哺乳動物細(xì)胞中的N-聚糖生物合成途徑已進行了充分的表征(綜述見Moremen，1994，Glycobiology 4113-125)。已鑒定了許多聚糖合成所必需的酶，且已分離了在該酶途徑中有缺陷的突變細(xì)胞系，包括中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞系Lec 23(α-葡糖苷酶I缺陷)和Lec18(新的GlcNAc-TVIII)。由這些突變細(xì)胞產(chǎn)生的肽的糖基化模式相對于正常CHO細(xì)胞是改變的。如在此處所討論的，可將這些和其他突變細(xì)胞中的糖基化缺陷應(yīng)用于產(chǎn)生缺乏復(fù)雜聚糖結(jié)構(gòu)的肽的目的。例如，由Lec23細(xì)胞產(chǎn)生的肽缺乏唾液酸殘基，因而為了將聚糖結(jié)構(gòu)減少到基本的三甘露糖核心或Man3GlcNAc4需要較少的酶操作。因而，由這些細(xì)胞產(chǎn)生的肽可充當(dāng)聚糖重構(gòu)的優(yōu)選底物。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可基于公知的方法分離或鑒定其他的糖基化-缺陷的細(xì)胞系，如描述于Stanley等人，1990，Somatic Cell Mol.Genet.，16211-223中的方法。為了生成用于在此處描述的重構(gòu)過程的優(yōu)選肽底物的目的，可將那些鑒定的和尚未鑒定的糖基化缺陷細(xì)胞系的應(yīng)用包括于本發(fā)明中。
用于在哺乳動物細(xì)胞中表達外源肽的表達載體是眾多的，且是本領(lǐng)域中眾所周知的。許多哺乳動物表達載體目前是商業(yè)上可從公司購得的，包括Novagen，Inc(Madison，WI)、Gene Therapy Systems(SanDiego，CA)、Promega(Madison，WI)、ClonTech Inc.(Palo Alto，CA)和Stratagene(La Jolla，CA)等。
有幾種特別擅長表達外源肽的哺乳動物細(xì)胞系。一般哺乳動物細(xì)胞系源自從哺乳動物中提取的已永生化的腫瘤細(xì)胞，即它們可在培養(yǎng)基中基本無限地復(fù)制。這些細(xì)胞系包括，但不局限于CHO(中國倉鼠卵巢，如CHO-K1；ATCC No.CCL 61)及其變體、NS0(小鼠骨髓瘤)、BNK、BHK 570(ATCC No.CRL 10314)、BHK(ATCC No.CRL 1632)、Per.C6TM(永生化的人細(xì)胞，Crucell N.V.，Leiden，荷蘭)、COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7(ATCC No.CRL 1651)、HEK 293、小鼠L細(xì)胞、T淋巴樣細(xì)胞系、BW5147細(xì)胞和MDCK(Madin-Darby犬腎的)、HeLa(人的)、A549(人肺癌)、293(ATCC No.CRL 1573；Graham等人，1977，Gen.Virol.3659-72)、BGMK(水牛綠猴腎(BuffaloGreen Monkey kidney)、Hep-2(人表皮樣喉癌)、LLC-MK2(非洲綠猴腎、McCoy、NCI-H292(人肺粘液表皮樣瘤管)、RD(橫紋肌肉瘤)、Vero(非洲綠猴腎)、HEL(人胚胎肺)、人胎兒肺-Chang、MRC5(胚胎肺)、MRHF(人包皮)和WI-38(人胚胎肺)。在一些情況下，表達治療性肽的細(xì)胞可為源自要治療的患者的細(xì)胞，或者可源自另一種相關(guān)或無關(guān)的哺乳動物。例如，成纖維細(xì)胞可從哺乳動物皮膚組織中分離并在體外培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化。該技術(shù)商業(yè)上可從Transkaryotic Therapies，Inc.(Cambridge，MA)獲得。幾乎所有目前所用的細(xì)胞系均可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)和BioWhittaker(Walkersville，Maryland)獲得。
哺乳動物細(xì)胞可以用本領(lǐng)域眾所周知的幾種技術(shù)的任何一種用DNA進行轉(zhuǎn)化。這種技術(shù)包括但不局限于磷酸鈣轉(zhuǎn)化(Chen和Okayama，1988；Gr aham和vander Eb，1973；Corsaro和Pearson，1981，SomaticCell Genetics 7603)、二乙氨乙基(DEAE)-葡聚糖轉(zhuǎn)染(Fujita等人，1986；Lopata等人，1984；Selden等人，1986)、電穿孔(Neumann等人，1982；Potter，1988；Potter等人，1984；Wong和Neuman，1982)、陽離子脂質(zhì)試劑轉(zhuǎn)染(Elroy-Stein和Moss，1990；Feigner等人，1987；Rose等人，1991；Whitt等人，1990；Hawley-Nelson等人，1993，F(xiàn)ocus 1573；Ciccarone等人，1993，F(xiàn)ocus 1580)、反轉(zhuǎn)錄病毒(Cepko等人，1984；Miller和Baltimore，1986；Pear等人，1993；Austin和Cepko，1990；Bodine等人，1991；Fekete和Cepko，1993；Lemischka等人，1986；Turner等人，1990；Williams等人，1984；Miller和Rosman，1989，BioTechniques 7980-90；Wang和Finer，1996，Nature Med.2714-6)、1，5-二甲基-1，5-二氮十一亞甲基聚甲溴化物(polybrene)(Chaney等人，1986；Kawai和Nishizawa，1984)、微注射(Capecchi，1980)和原生質(zhì)體融合(Rassoulzadegan等人，1982；Sandri-Goldin等人，1981；Schaffer，1980)等。通常，轉(zhuǎn)化技術(shù)參見Sambrook等人(2001，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)和Ausubel等人(2002，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley &amp; Sons，New York)。
最近已使昆蟲細(xì)胞轉(zhuǎn)化所常用的桿狀病毒系統(tǒng)適合于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞(參見綜述Koat和Condreay，2002，Trends Biotechnol.20173-180及在其中引用的參考文獻)。重組肽在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中的生產(chǎn)公開于如U.S.Pat.No.4,713,339、4,784,950、4,579,821和4,656,134中。幾個公司提供了轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的服務(wù)，包括Cell Trends，Inc.(Middletown，MD)。培養(yǎng)哺乳動物細(xì)胞的技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的，且進一步可發(fā)現(xiàn)于Hauser等人(1997，Mammalian Cell Biotechnology，Walterde Gruyer，Inc.，Hawthorne，NY)和Sambrook等人(2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor)及在其中引用的參考文獻中。
D.昆蟲昆蟲細(xì)胞特別是培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞可表達具有N-連接的聚糖結(jié)構(gòu)的肽，該N-連接的聚糖結(jié)構(gòu)是很少唾液酸化的，且通常包含在其上具有或不具有附著的額外的巖藻糖的甘露糖殘基。存在于培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的肽上的這類聚糖結(jié)構(gòu)及其甘露糖聚糖的例子在圖6中顯示。在該情形中，可以存在或不存在核心巖藻糖，如果存在的話，該核心巖藻糖可通過幾個不同的鍵連接到聚糖。
昆蟲細(xì)胞中桿狀病毒介導(dǎo)的表達對重組肽的生產(chǎn)已變?yōu)樘貏e適合的(Altmann等人，1999，Glycoconjugate J.16109-123)。在肽折疊和翻譯后加工方面，昆蟲細(xì)胞僅次于哺乳動物細(xì)胞。然而，如上文所注意到的，昆蟲細(xì)胞中肽的N-糖基化與哺乳動物細(xì)胞中的N-糖基化在許多方面有差異，特別是昆蟲細(xì)胞經(jīng)常生成截短的聚糖結(jié)構(gòu)，該聚糖結(jié)構(gòu)包含僅含有3個或有時僅僅2個甘露糖殘基的寡糖。這些結(jié)構(gòu)可額外地由巖藻糖殘基替代。
根據(jù)本發(fā)明，可首先通過用適當(dāng)?shù)膸r藻糖苷酶可選擇地去除任何替代的巖藻糖殘基而在體外對昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的肽進行重構(gòu)以生成具有想要的糖基化的肽。在去除巖藻糖殘基后肽包含基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)的情況下，那么所有需要的是在體外向三甘露糖核心結(jié)構(gòu)添加適當(dāng)?shù)奶且陨删哂邢胍奶腔碾?。在去除任何巖藻糖殘基后肽在聚糖結(jié)構(gòu)中可能僅含有2個甘露糖殘基的情況下，可用甘露糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)墓w分子如GDP-甘露糖添加第三個甘露糖殘基，從而添加適當(dāng)?shù)臍埢陨删哂邢胍奶腔碾?。任選地，也可從這些種類中生成單觸角聚糖。
用桿狀病毒轉(zhuǎn)化昆蟲細(xì)胞的規(guī)程是本領(lǐng)域中眾所周知的。已出版了幾本提供利用桿狀病毒系統(tǒng)在昆蟲細(xì)胞中表達肽的程序的書。這些書包括但不局限于Richardson(Baculovirus Expression Protocols，1998，Methodsin Molecular Biology，39卷，Humana Pr)、O’Reilly等人(1994，Baculovirus Expression VectorsA Laboratory Manual，Oxford Univ Press)和King和Possee(1992，The BaculovirusExpression SystemA Laboratory Guide，Chapman &amp; Hall)。此外，也有如Lucklow(1993，Curr.Opin.Biotechnol.4564-572)和Miller(1993，Curr.Opin.Genet.Dev.397-101)的出版物。
也已授予了許多與外源蛋白質(zhì)的桿狀病毒表達系統(tǒng)相關(guān)的專利。這些專利包括但不局限于美國專利No.6,210,966(缺乏谷氨酰胺但含有銨鹽的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基)、美國專利No.6,090,584(BVAC(桿狀病毒人工染色體)生產(chǎn)重組肽的應(yīng)用)、美國專利No.5,871,986(桿狀病毒在哺乳動物細(xì)胞中表達重組核酸的應(yīng)用)、美國專利No.5,759,809(在昆蟲細(xì)胞中表達肽的方法和殺死昆蟲的方法)、美國專利No.5,753,220(半胱氨酸蛋白酶基因缺陷型桿狀病毒、其生產(chǎn)過程及用其生產(chǎn)經(jīng)濟的肽的過程)、美國專利No.5,750,383(桿狀病毒克隆系統(tǒng))、美國專利No.5,731,182(在哺乳動物細(xì)胞中表達重組核酸的非哺乳動物DNA病毒)、美國專利No.5,728,580(在昆蟲細(xì)胞系中誘導(dǎo)單細(xì)胞懸浮的方法和培養(yǎng)基)、美國專利No.5,583,023(修飾的桿狀病毒、其制備過程及其作為基因表達載體的應(yīng)用)、美國專利No.5,571,709(修飾的桿狀病毒及桿狀病毒表達載體)、美國專利No.5,521,299(探測桿狀病毒感染的寡核苷酸)、美國專利No.5,516,657(用于表達分泌型和膜結(jié)合型肽的桿狀病毒載體)、美國專利No.5,475,090(編碼增強對宿主昆蟲的病毒感染的肽的基因)、美國專利No.5,472,858(昆蟲幼蟲中重組肽的生產(chǎn))、美國專利No.5,348,886(在細(xì)菌中產(chǎn)生重組真核生物病毒的方法)、美國專利No.5,322,774(重組桿狀病毒表達系統(tǒng)中的原核生物前導(dǎo)序列)、美國專利No.5,278,050(改善昆蟲系統(tǒng)中重組基因的加工和分泌效率的方法)、美國專利No.5,244,805(桿狀病毒表達載體)、美國專利No.5,229,293(重組桿狀病毒)、美國專利No.5,194,376(能夠以高水平產(chǎn)生重組肽的桿狀病毒表達系統(tǒng))、美國專利No.5,179,007(純化重組肽的方法和載體)、美國專利No.5,169,784(桿狀病毒雙啟動子表達載體)、美國專利No.5,162,222(桿狀病毒早期啟動子在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞或重組桿狀病毒中表達重組核酸的應(yīng)用)、美國專利No.5,155,037(用于改善昆蟲系統(tǒng)中重組核酸加工和分泌效率的昆蟲信號序列)、美國專利No.5,147,788(桿狀病毒載體及應(yīng)用方法)、美國專利No.5,110,729(用桿狀病毒載體在培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生肽的方法)、美國專利No.5,077,214(桿狀病毒早期啟動子在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞中表達重組基因的應(yīng)用)、美國專利No.5,023,328(鱗翅目(Lepidopteran)AKH信號序列)和美國專利No.4,879,236和4,745,051(產(chǎn)生重組桿狀病毒表達載體的方法)。上述的專利全部在此處整體引入作為參考。
目前幾個不同物種來源的昆蟲細(xì)胞系應(yīng)用于肽的表達中，且這些細(xì)胞系是本領(lǐng)域中眾所周知的。目標(biāo)昆蟲細(xì)胞系包括但不局限于通常的雙翅目和鱗翅目昆蟲細(xì)胞、Sf9及其變體(秋季粘蟲(fallarmyworm)草地夜蛾(Spodopterafrugiperda))、Estigmene acrea、Trichoplusiani、家蠶(Bombyxmori)、Malacosoma disstri、果蠅品系Kc1和SL2等及蚊子。
E.植物作為肽生產(chǎn)者的植物細(xì)胞提供了不同的情況。盡管植物中產(chǎn)生的N-連接聚糖包含三甘露糖核心結(jié)構(gòu)，但該五糖主鏈可包含如圖5所示的幾個不同的額外的糖。例如，在一種情況下，該三甘露糖核心結(jié)構(gòu)是由β1，2連接的木糖殘基和α1，3連接的巖藻糖殘基取代的。此外，植物細(xì)胞也可產(chǎn)生Man5GlcNAc2結(jié)構(gòu)。植物細(xì)胞中產(chǎn)生的肽由于在聚糖結(jié)構(gòu)上存在核心α1，3木糖和巖藻糖而經(jīng)常是高抗原性的，且當(dāng)引入到哺乳動物中后由于不存在末端唾液酸殘基而將快速地從血流中清除。因此，除非用在此處提供的方法對這些肽進行重構(gòu)，否則通常認(rèn)為它們不適合于用作哺乳動物中的治療劑。盡管發(fā)現(xiàn)植物中表達的一些單克隆抗體在小鼠中是無免疫原性的，但可能的是該聚糖鏈由于埋藏在這些抗體的Fc區(qū)域而無免疫原性(Chargelegue等人，2000，Transgenic Res.9(3)187-194)。
根據(jù)在此處提供的說明，目前可能的是生成在植物細(xì)胞中產(chǎn)生的肽，其中在其上存在的增加數(shù)目的聚糖結(jié)構(gòu)包含基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)。這是通過用適當(dāng)?shù)奶擒彰傅慕M合在體外切除額外的糖直到達到基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)而實現(xiàn)的，該糖苷酶包括巖藻糖苷酶。這些切割反應(yīng)也應(yīng)該包括從結(jié)構(gòu)中去除任何巖藻糖或木糖殘基以消除最終的肽當(dāng)引入哺乳動物中時的抗原性。具有抑制巖藻糖和木糖殘基向三甘露糖核心結(jié)構(gòu)添加的突變的植物細(xì)胞是本領(lǐng)域中公知的(von Schaewen等人，1993，PlantPhysiology 1021109-1118)。本發(fā)明預(yù)期了這些細(xì)胞在生產(chǎn)具有缺乏巖藻糖和木糖的聚糖的肽中的應(yīng)用。在產(chǎn)生了基本的三甘露糖核心或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)之后，然后可將額外的糖添加到其上以得到具有想要的糖基化的肽，該肽因此適合于哺乳動物中的治療應(yīng)用。
許多人認(rèn)為轉(zhuǎn)基因植物是藥物肽精選的表達系統(tǒng)。潛在地，植物可提供便宜的重組肽來源。已估計植物中重組肽的生產(chǎn)成本可比在大腸桿菌中生產(chǎn)相同的肽的成本低10～50倍。盡管與動物相比植物中密碼子使用有微小的差異，但這可通過調(diào)節(jié)重組DNA序列而得以補償(參見Kusnadi等人，1997，Biotechnol.Bioeng.56473-484；Khoudi等人，1999，Biotechnol.Bioeng.135-143；Hood等人，1999，Adv.Exp.Med.Biol.464127-147)。此外，肽合成、分泌和翻譯后修飾在植物和動物中是非常相似的，僅在植物糖基化中有細(xì)小的差異(參見Fischer等人，2000，J.Biol.Regul.Homest.Agents 1483-92)。然后，來自轉(zhuǎn)基因植物的產(chǎn)物也不大可能被動物病原體、微生物毒素和致癌序列污染。
植物細(xì)胞中重組肽的表達是本領(lǐng)域中眾所周知的。除轉(zhuǎn)基因植物之外，肽也可在轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞培養(yǎng)物(Lee等人，1997，Mol.Cell.7783-787)和用重組植物病毒接種的非轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生。已出版了幾本描述植物細(xì)胞的遺傳轉(zhuǎn)化過程的書Potrykus(1995，Genetransfertoplants，Springer，New York)、Nickoloff(1995，Plantcellelectroporation and electrofusionprotocols，Humana Press，Totowa，New York)和Draper(1988，Plantgenetic transformation，Oxford Press，Boston)。
目前已將幾種方法用于用重組遺傳材料穩(wěn)定轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。這些方法包括但不局限于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化(Bechtold和Pelletier，1998；Escudero和Hohn，1997；Hansen和Chilton，1999；Touraev等人，1997)、生物彈法(微彈轟擊法)(Finer等人，1999；Hansen和Chilton，1999；Shilito，1999)、原生質(zhì)體電穿孔(Fromm等人，1985；Ou-Lee等人，1986；Rhodes等人，1988；Saunders等人，1989；Trick等人，1997)、聚乙二醇處理(Shilito，1999；Trick等人，1997)、in planta微注射(Leduc等人，1996；Zhou等人，1983)、種子吸漲(Trick等人，1997)、激光束(1996)和silicon carbide whiskers(Thompson等人，1995；U.S.Patent Appln.No.20020100077，在此處整體引入作為參考)。
許多種類的植物可進行外源肽的轉(zhuǎn)化和表達。表達用于本發(fā)明的重構(gòu)方法中的肽的特別感興趣的植物包括，但不局限于擬南芥(Arabidopsis thalliana)、油菜籽(Brassica spp.；Ruiz和Blumwald，2002，Planta 214965-969))、大豆(Glycine max)、向日葵(Helian thus unnuus)、油棕櫚樹(Elaeis guineeis)、落花生(花生，Ara chis hypogaea；Deng等人，2001，Cell.Res.11156-160)、椰子(Cocus nucifera)、蓖麻(Ricinus communis)、紅花(Carthamustinctorius)、芥菜(Brassica spp.和Sinapisalba)、胡荽(Coriandrum sativum)、南瓜(Cucurbita maxima；Spencer和Snow，2001，Heredity 86(Pt6)694-702)、亞麻子/亞麻(Linumusitatissimum；Lamblin等人，2001，Physiol Plant 112223-232)、巴西堅果(Bertholletia excelsa)、楊柳料(Simmondsia chinensis)、玉米(Zea mays；Hood等人，1999，Adv.Exp.Med.Biol.464127-147；Hood等人，1997，Mol.Breed.3291-306；Petolino等人，2000，Transgenic Research 91-9)、紫花苜蓿(Khoudi等人，1999，Biotechnol.Bioeng.64135-143)、煙草(Nicotiana tabacum；Wright等人，Transgenic Res.10177-181；Frigerio等人，2000，PlantPhysiol.1231483-1493；Cramer等人，1996，Ann.New York Acad.Sci.79262-8-71；Cabanes-Macheteau等人，1999，Glycobiology9365-372；Ruggiero等人，2000，F(xiàn)EBS Lett.469132-136)、canola(Bai等人，2001，Biotechnol.Prog.17168-174；Zhang等人，2000，J.Anim.Sci.782868-2878))、馬鈴薯(Tacket等人，1998，J.Infect.Dis.182302-305；Richter等人，2000，Nat.Biotechnol.181167-1171；Chong等人，2000，Transgenic Res.971-78)、紫花苜蓿(Wigdorovitz等人，1999，Virology 255347-353)、豌豆(Pisumsativum；Perrin等人，2000，Mol.Breed.6345-352)、水稻(Oryza sativa；Stoger等人，2001；Plant Mol.Biol.42583-590)、棉花(Gossypium hirsutum；Kornyeyev等人，2001，PhysiolPlant 113323-331)、大麥(Hordeum vulgare；Petersen等人，2002，Plant Mol Biol 4945-58)；小麥(Triticum spp.；Pellegrineschi等人，2002，Genome 45421-430)和豆(Vicia spp.，Saalbach等人，1994，Mol Gen Genet 242226-236)。
如果想要在完整植物而不是培養(yǎng)的細(xì)胞中表達重組核酸，那么可首先用編碼肽的DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，隨后使植物再生。這包括一般對于每一種植物物種最適化的組織培養(yǎng)程序。對于許多物種，植物再生程序在本領(lǐng)域中是公知的。此外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可利用常規(guī)的實驗發(fā)展對其他物種的規(guī)程。許多描述植物再生程序的實驗室手冊是可用的，包括但不局限于Smith(2000，Plant tissue culturetechniques and experiments，Academic Press，San Diego)、Bhojwani和Razdan(1996，Plant tissue culturetheory and practice，Elsevier Science Pub.，Amsterdam)、Islam(1996，Plant tissueculture，Oxford &amp; IBH Pub.Co.，New Delhi，印度)、Dodds和Roberts(1995，Experimentsinplant tissue culture，New YorkCambridgeUniversity Press，Cambridge英國)、Bhojwani(Plant tissue cultureapplications and limitations，Elsevier，Amsterdam，1990)、Trigiano和Gray(2000，Plant tissue culture concepts andlaboratory exercises，CRC Press，Boca Raton，F(xiàn)la)和Lindsey(1991，Plant tissue culture manualfundamentals andapplications，Kluwer Academic，Boston)。
盡管從植物中純化重組的肽可能是昂貴的，但已發(fā)展了幾個系統(tǒng)以使該成本最小化。一種方法將合成的肽導(dǎo)向種子的胚乳，該肽在此胚乳中易于提取(Wright等人，2001，Transgenic Res.10177-181，Guda等人，2000，Plant Cell Res.19257-262和美國專利No.5,767,379，在此處整體引入作為參考)。一種可選擇的方法是使重組肽與常規(guī)的植物產(chǎn)物如淀粉、粗粉或油共提取。在油料種子油菜中，油質(zhì)蛋白-hurudin融合肽當(dāng)在植物中表達時附著于種子的油體上，且可與油一起從植物種子中提取(Parmenter，1995，Plant Mol.Biol.291167-1180；美國專利No.5,650,554、5,792,922、5,948,682和6,288,304及美國申請2002/0037303，在此處將它們?nèi)空w引入作為參考)。在該方法的一個變體中，使油質(zhì)蛋白與對外源共表達的目標(biāo)肽具有親和力的肽融合(美國專利No.5,856,452，在此處整體引入作為參考)。
重組肽在植物質(zhì)體如葉綠體中的表達生成了在其上不具有聚糖結(jié)構(gòu)的肽，這與原核生物中的情形類似。然而，當(dāng)在這種植物細(xì)胞器中表達時這種肽的產(chǎn)量是極其大的，因而這類表達系統(tǒng)可具有優(yōu)于其他系統(tǒng)的優(yōu)點。對于外源肽在高等植物質(zhì)體中表達技術(shù)的一般綜述，參見Hager和Beck(2000，Appl.Microbiol.Biotechnol.54302-310及在其中引用的參考文獻)。質(zhì)體表達在煙草中是特別成功的(參見如Staub等人，2000，Nat.Biotechnol.18333-338)。
F.轉(zhuǎn)基因動物將重組DNA引入到動物(如哺乳動物)的受精卵中可用轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)中的任何數(shù)目的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來實現(xiàn)。參見如Hogan等人，Manipulating the Mouse EmbryoA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986；和U.S.Pat.No.5,811,634，在此處整體引入作為參考。更一般地，重組DNA可通過前核微注射而引入到胚胎中(Gordon等人，1980，PNAS777380-7384；Gordon和Ruddle，1981，Science 2141244-1246；Brinster等人，1981，Cell 27223-231；Costantini和Lacy，1981，Nature 29492-94)。微注射具有可應(yīng)用于大量物種中的優(yōu)點。植入前胚胎也可用反轉(zhuǎn)錄病毒進行轉(zhuǎn)化(Jaenisch和Mintz，1974，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.711250-1254；Jaenisch等人，1976，Hamatol Bluttransfus.19341-356；Stuhlmann等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.817151-7155)。反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化具有可將單拷貝的重組核酸添加到細(xì)胞中的優(yōu)點，但它產(chǎn)生了高水平的鑲嵌現(xiàn)象。最近，已應(yīng)用了胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)的技術(shù)(Gossler等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.839065-9069)、完整染色體片段的轉(zhuǎn)移(Lavitrano等人，1989，Cell 57717-723)，且也已應(yīng)用了與體外受精結(jié)合的配子轉(zhuǎn)染(Lavitrano等人，1989，Cell 57717-723)。已出版了幾本公開這些技術(shù)的實驗室程序的書Cid-Arregui和García-Carrancá(1998，Microinjection andTrans genesisStrategies and Protocols，Springer，Berlin)、Clarke(2002，Transgenesis TechniquesPrinciples and Protocols，Humana Press，Totowa，NJ)和P inkert(1994，Transgenic AnimalTechnologyA Laboratory Handbook，Academic Press，San Diego)。
一旦將重組DNA引入到卵中，則將卵溫育短的時間段，然后轉(zhuǎn)移到獲得該卵的相同物種的假孕動物中(Hogan等人，見上文)。在哺乳動物的情況下，一般每次實驗注射125個卵，其中大約三分之二將在程序中存活。將20個有生活力的卵轉(zhuǎn)移到假孕的哺乳動物中，其中4～10個將發(fā)育為活的后代。一般地，后代的10-30％(在小鼠的情況下)攜帶有重組DNA。
盡管可將整個動物用作本發(fā)明肽的表達系統(tǒng)，但在一個優(yōu)選的實施方案中，外源肽在動物的產(chǎn)物中積聚，該外源肽可以從該產(chǎn)物中收獲而無需傷害該動物。在優(yōu)選的實施方案中，外源肽積聚在乳、卵、毛發(fā)、血液和尿中。
如果重組肽積聚在動物的乳中，那么適當(dāng)?shù)牟溉閯游餅榉雌c動物、有蹄類動物、馴化的哺乳動物和產(chǎn)乳動物。特別優(yōu)選的動物為山羊、綿羊、駱駝、母牛、豬、馬、公牛和美洲駝(llamas)。生成在其乳中積聚重組肽的轉(zhuǎn)基因母牛的技術(shù)是眾所周知的參見Newton(1999，J.Immunol.Methods 231159-167)、Ebert等人(1991，Biotechnology9835-838)和美國專利No.6,210,736、5,849,992、5,843,705、5,827,690、6,222,094，在此處將它們?nèi)空w引入作為參考?？僧a(chǎn)生想要的重組肽的轉(zhuǎn)基因動物的生成是商業(yè)上從GTCBiotherapeutics，F(xiàn)ramingham，MA可獲得的。
如果重組肽想要積聚在卵中，適當(dāng)?shù)镍B包括但不局限于雞、鵝和火雞。其他目標(biāo)動物包括但不局限于鳥類其他物種、魚、爬行動物和兩棲動物。通過反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化向雞中引入重組DNA是本領(lǐng)域中眾所周知的Thoraval等人(1995，Transgenic Research 4369-376)、Bosselman等人，(1989，Science 243533-535)、Petropoulos等人(1992，J.Virol.663391-3397)、美國專利No.5,162,215，在此處整體引入作為參考。用重組DNA對雞的成功轉(zhuǎn)化也通過將DNA引入胚盤細(xì)胞并將這樣轉(zhuǎn)染的胚盤細(xì)胞引入胚胎而實現(xiàn)Brazolot等人(1991，Mol.Reprod.Dev.30304-312)、Fraster等人(1993，Int.J.Dev.Biol.37381-385)和Petitte等人(1990，Development108185-189)。已發(fā)展了高通量的技術(shù)來估計轉(zhuǎn)基因雞是否表達想要的肽(Harvey等人，2002，Poult.Sci.81202-212，美國專利No.6,423,488，在此處整體引入作為參考)。利用重組DNA對雞的反轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)化，外源β-內(nèi)酰胺酶積聚在雞的蛋清中(Harvey等人，2002，Nat.Biotechnol.20(4)396-399)。在卵中產(chǎn)生外源肽的雞的生產(chǎn)商業(yè)上可從AviGenics，Inc.，Athens GA購得。
G.細(xì)菌在細(xì)菌中產(chǎn)生的重組表達的肽通常不是糖基化的。然而，能夠使肽糖基化的細(xì)菌系統(tǒng)已變?yōu)轱@而易見的，因此將來可能在細(xì)菌中產(chǎn)生糖基化的重組肽。
許多細(xì)菌表達系統(tǒng)是本領(lǐng)域中公知的。優(yōu)選的細(xì)菌物種包括但不局限于大腸桿菌和芽孢桿菌屬(Bacillus)物種。
重組肽在大腸桿菌中的表達是本領(lǐng)域中眾所周知的?；诖竽c桿菌的表達系統(tǒng)的規(guī)程可發(fā)現(xiàn)于U.S.Appln No.20020064835、美國專利No.6,245,539、5,606,031、5,420,027、5,151,511和RE 33,653等。轉(zhuǎn)化細(xì)菌的方法包括但不局限于氯化鈣(Cohen等人，1972，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.692110-2114；Hanahan，1983，J.Mol.Biol.166557-580；Mandel和Higa，1970，J.Mol.Biol.53159-162)和電穿孔(Shigekawa和Dower，1988，Biotechniques 6742-751)，以及那些描述于Sambrook等人，2001(見上文)中的。對于微生物轉(zhuǎn)化和表達系統(tǒng)的實驗室規(guī)程的綜述，參見Saunders和Saunders(1987，Microbial Genetics Applied to BiotechnologyPrinciples andTechniques of Gene Transfer and Manipulation，Croom Helm，London)、Pühler(1993，Genetic Engineering of Microorganisms，Weinheim，New York)、Lee等人(1999，Metabolic Engineering，Marcel Dekker，New York)、Adolph(1996，Microbial Genome Methods，CRC Press，Boca Raton)和Birren和Lai(1996，Nonmammalian GenomicAnalysisAPractical Guide，Academic Press，San Diego)。
對于大腸桿菌中肽表達的文獻的一般綜述，參見Balbas(2001，Mol.Biotechnol.19251-267)。幾個公司目前提供選擇用于表達哺乳動物肽的細(xì)菌菌株，如大腸桿菌的RosettaTM菌株(Novagen，inc.，Madison，WI；具有通常不用于細(xì)菌細(xì)胞中的真核生物密碼子的增強表達和增強的二硫鍵形成)。
H.細(xì)胞工程從本發(fā)明的公開內(nèi)容看顯而易見的是，由細(xì)胞產(chǎn)生的起始材料越均一，在體外生成大量具有想要的糖基化的肽則越有效。因而，在此處公開的對宿主細(xì)胞進行基因工程操作以產(chǎn)生均一糖基化的肽作為體外酶促反應(yīng)的起始材料提供了優(yōu)于用具有在其上附著的異質(zhì)聚糖結(jié)構(gòu)的肽起始材料的顯著優(yōu)勢。一種用于本發(fā)明的優(yōu)選的肽起始材料是主要具有唯一由基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)組成的聚糖分子的肽。另一種優(yōu)選的起始材料是Man3GlcNAc4。在重構(gòu)過程后，該優(yōu)選的肽將產(chǎn)生最大量的具有想要的糖基化的肽，因而改善了臨床功效。然而，其他聚糖起始材料也適用于在此處描述的方法，例如在體外高甘露糖可易于用一系列甘露糖苷酶裁剪為基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)。如在別處描述的，也可應(yīng)用其他聚糖起始材料，只要能切除所有無關(guān)的糖部分從而生成基本的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)或Man3GlcNAc4。因而，應(yīng)用基因工程加工的細(xì)胞以生產(chǎn)本發(fā)明的肽的目的是為了生成具有盡量均一的在其上附著的聚糖結(jié)構(gòu)的肽，其中聚糖結(jié)構(gòu)可在體外進行重構(gòu)以生成具有想要的糖基化的肽。這將導(dǎo)致這些肽生產(chǎn)成本的急劇降低。由于由該方法產(chǎn)生的糖肽主要具有相同的N-連接聚糖結(jié)構(gòu)，所以可使生產(chǎn)后修飾規(guī)程標(biāo)準(zhǔn)化和最適化以產(chǎn)生更大的終產(chǎn)物批次間一致性。結(jié)果，最終完成的鏈產(chǎn)物的異質(zhì)性可比那些目前可用的更低。該產(chǎn)物與現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域的產(chǎn)物相比將具有改善的生物學(xué)半衰期和生物活性?？蛇x擇地，如果需要，本發(fā)明可用于引入有限且特定的異質(zhì)性，如通過選擇導(dǎo)致糖部分的差異添加的反應(yīng)條件。
優(yōu)選地(不是嚴(yán)格的必要條件)，基因工程加工的細(xì)胞是可產(chǎn)生具有主要由基本三甘露糖核心結(jié)構(gòu)或Man3GlcNAc4組成的聚糖結(jié)構(gòu)的肽的細(xì)胞。最低限度的要求是由基因工程加工的細(xì)胞產(chǎn)生的這些優(yōu)選的結(jié)構(gòu)的比例必須足以在重構(gòu)規(guī)程后產(chǎn)生具有想要的糖基化的肽。
通常，可對任何真核細(xì)胞進行修飾以使其變?yōu)楸景l(fā)明的宿主細(xì)胞。首先，確定內(nèi)源的和由生物產(chǎn)生的重組糖肽的糖基化模式以鑒定酶活性的添加/刪除，其中該酶活性可導(dǎo)致產(chǎn)生基本的三甘露糖核心糖肽或Man3GlcNAc4糖肽。這一般需要刪除用三甘露糖糖肽作為底物的糖基轉(zhuǎn)移酶的活性和增加降解更復(fù)雜的N-連接聚糖以產(chǎn)生較短鏈的酶活性。此外，基因工程加工的細(xì)胞可產(chǎn)生高甘露糖聚糖，該聚糖可用甘露糖苷酶切割以產(chǎn)生想要的起始聚糖結(jié)構(gòu)。該甘露糖苷酶可為在細(xì)胞體內(nèi)有活性的(即對該細(xì)胞進行基因工程加工以產(chǎn)生該酶)，或者它們可用于體外生產(chǎn)后的反應(yīng)中。
對宿主細(xì)胞進行遺傳修飾以改變表達的肽的糖基化性質(zhì)的技術(shù)是眾所周知的。參見如Altmann等人(1999，Glycoconjugate J.16109-123)、Ailor等人(2000，Glycobiology 10(8)837-847)、Jarvis等人(In vitrogen Conference，March，1999，摘要)、Hollister和Jarvis(2001，Glycobiology 11(1)1-9)和Palacpac等人(1999，PNAS USA 964697)、Jarvis等人(1998，Curr.Opin.Biotechnol.9528-533)、Gerngross(U.S.Patent Publication No.20020137134)，它們均公開了通過用糖基轉(zhuǎn)移酶基因轉(zhuǎn)染昆蟲或植物細(xì)胞而使昆蟲或植物細(xì)胞表達系統(tǒng)“哺乳動物化(mammalianize)”的技術(shù)。
遺傳地改變大腸桿菌中表達的肽的糖基化性質(zhì)的技術(shù)也是存在的。大腸桿菌已用來自細(xì)菌腦膜炎奈瑟氏球菌和固氮根瘤菌屬的各種糖基轉(zhuǎn)移酶進行了加工以在體內(nèi)產(chǎn)生寡糖(Bettler等人，1999，Glycoconj.J.16205-212)。進行了基因工程加工以超表達腦膜炎奈瑟氏球菌的β1，3N乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶lgtA基因的大腸桿菌將有效地使外源乳糖糖基化(Priem等人，2002，Glycobiology 12235-240)。
也已對真菌細(xì)胞進行了遺傳修飾以使其產(chǎn)生外源的糖基轉(zhuǎn)移酶(Yoshida等人，1999，Glycobiology 9(1)53-58；Kalsner等人，1995，Glycoconj.J.12360-370；Schwientek和Ernst，1994，Gene145(2)299-303；Chiba等人，1995，Biochem J.308405-409)。
因而，在一方面，本發(fā)明提供了使糖肽群體糖基化的細(xì)胞，從而產(chǎn)生的一部分糖肽具有基本的三甘露糖核心或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)。優(yōu)選地，細(xì)胞產(chǎn)生具有唯一由基本三甘露糖核心組成的聚糖結(jié)構(gòu)的肽。最低限度的要求是具有基本的三甘露糖核心或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)的肽的比例必須足以在重構(gòu)過程后產(chǎn)生具有想要的糖基化的肽。在該細(xì)胞中引入了一種或多種異源核酸表達單位，這些表達單位的每一個可包含一種或多種編碼一種或多種目標(biāo)肽的核酸序列。目標(biāo)糖肽的天然形式可包含一種或多種復(fù)雜的N-連接聚糖或可簡單地為高甘露糖聚糖。
該細(xì)胞可為任何類型的細(xì)胞，且優(yōu)選地為真核細(xì)胞。該細(xì)胞可為哺乳動物細(xì)胞，如人的、小鼠的、大鼠的、兔的、倉鼠的或其他類型的哺乳動物細(xì)胞。當(dāng)該細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞時，該哺乳動物細(xì)胞可源自或包含于非人類的轉(zhuǎn)基因哺乳動物中，其中哺乳動物中的細(xì)胞編碼想要的糖肽和生產(chǎn)想要的糖肽分子所必需的各種糖基化和糖苷酶酶類。此外，該細(xì)胞可為真菌細(xì)胞，優(yōu)選地為酵母細(xì)胞，或者該細(xì)胞可為昆蟲或植物細(xì)胞。類似地，當(dāng)該細(xì)胞是植物細(xì)胞時，該植物細(xì)胞可源自或包含于轉(zhuǎn)基因植物中，其中該植物編碼想要的糖肽和生產(chǎn)想要的糖肽分子所必需的各種糖基化和糖苷酶酶類。
在一些實施方案中，宿主細(xì)胞可為表達一種或多種異源糖基轉(zhuǎn)移酶和/或一種或多種異源糖苷酶的真核細(xì)胞，其中重組糖肽在宿主細(xì)胞中的表達導(dǎo)致具有基本三甘露糖核心作為在其上附著的主要聚糖結(jié)構(gòu)的重組糖肽的產(chǎn)生。
在一些實施方案中，用于細(xì)胞中的異源糖基轉(zhuǎn)移酶可選自任何已知的糖基轉(zhuǎn)移酶，該糖基轉(zhuǎn)移酶包括在例如Taniguchi等人(2002，Handbook of Glycosyltransferases and Related Genes，Springer，New York)的糖基轉(zhuǎn)移酶家族列表中。
在其他的實施方案中，異源的糖基化酶可選自甘露糖苷酶1、甘露糖苷酶2、甘露糖苷酶3和其他甘露糖苷酶，包括但不局限于微生物甘露糖苷酶。關(guān)于用于本發(fā)明中的酶的額外的公開內(nèi)容在別處提供。
在另外其他的實施方案中，宿主細(xì)胞可為真核細(xì)胞，其中已使一種或多種內(nèi)源糖基轉(zhuǎn)移酶和/或一種或多種內(nèi)源糖苷酶失活，從而宿主細(xì)胞中重組糖肽的表達導(dǎo)致具有基本三甘露糖核心作為在其上附著的主要聚糖結(jié)構(gòu)的重組糖肽的產(chǎn)生。
在額外的實施方案中，宿主細(xì)胞可表達異源糖基轉(zhuǎn)移酶和/或糖苷酶，而同時一種或多種內(nèi)源糖基轉(zhuǎn)移酶和/或糖苷酶是失活的。內(nèi)源糖基轉(zhuǎn)移酶和/或糖苷酶可用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任何技術(shù)進行失活，該技術(shù)包括但不局限于反義技術(shù)和涉及將核酸向宿主細(xì)胞基因組中插入的技術(shù)。在一些實施方案中，內(nèi)源酶可選自GnT-I、甘露糖苷酶、木糖基轉(zhuǎn)移酶、核心α1，3巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、絲氨酸/蘇氨酸O-甘露糖基轉(zhuǎn)移酶等。
可選擇地，可應(yīng)用使肽天然地糖基化的表達系統(tǒng)，從而N-連接的聚糖主要是三甘露糖核心類型的或Man3GlcNAc4類型的。產(chǎn)生三甘露糖核心的細(xì)胞類型的一個例子是Sf9細(xì)胞。其他這種系統(tǒng)可通過分析天然地或重組地在細(xì)胞中表達的糖肽并選擇那些展示想要的糖基化特征的系統(tǒng)而鑒定。本發(fā)明應(yīng)該解釋為包括任何或所有這些用于產(chǎn)生本發(fā)明的肽的細(xì)胞。
V.聚糖重構(gòu)的和/或糖綴合的肽的純化如果修飾的糖蛋白質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的或分泌的，那么第一步可通過如離心或超濾去除微粒殘渣或者宿主細(xì)胞裂解的片段；可選擇地，蛋白質(zhì)可用商業(yè)上可購得的蛋白質(zhì)濃縮濾器進行濃縮，隨后通過一個或多個步驟從其他雜質(zhì)中分離肽變體，該步驟選自免疫親和層析，離子交換柱分級分離(如二乙氨乙基(DEAE)或含有羧甲基或磺丙基的基質(zhì))，在Blue-瓊脂糖、CM Blue-瓊脂糖、MONO-Q、MONO-S、晶狀體凝集素-瓊脂糖、WGA-瓊脂糖、Con A-瓊脂糖、醚Toyopearl、丁基Toyopearl、苯基Toyopearl或蛋白質(zhì)A瓊脂糖上的層析，SDS-PAGE層析，硅層析，層析聚焦，反相HPLC(RP-HPLC)，利用如交聯(lián)葡聚糖分子篩或大小排阻層析的凝膠過濾，在選擇性結(jié)合肽的柱子上的層析，和乙醇、pH或硫酸銨沉淀，膜過濾和各種技術(shù)。
在培養(yǎng)物中產(chǎn)生的修飾的肽通常是通過從細(xì)胞、酶等的初始提取和隨后通過一種或多種濃縮、鹽析、水相離子交換或大小排阻層析步驟而分離的。此外，修飾的糖蛋白可通過親和層析來純化。然后可應(yīng)用HPLC進行最后的純化步驟。
可將蛋白酶抑制劑如苯甲基磺酰氟(PMSF)包括于前述的任何步驟中以抑制蛋白水解，且可包括抗生素以防止外來污染物的生長。
在另一個實施方案中，首先用商業(yè)上可購得的蛋白質(zhì)濃縮濾器濃縮來自產(chǎn)生本發(fā)明修飾肽的系統(tǒng)的上清液，該濃縮濾器如Amicon或Millipore Pellicon超濾單位。在濃縮步驟之后，可將濃縮物應(yīng)用于適當(dāng)?shù)募兓|(zhì)中。例如，適當(dāng)?shù)挠H和基質(zhì)可包含肽的配體、與適當(dāng)?shù)闹С煮w結(jié)合的凝集素或抗體分子?？蛇x擇地，可應(yīng)用陰離子交換樹脂，如具有伸出的DEAE基團的基質(zhì)或底物。適當(dāng)?shù)幕|(zhì)包括丙烯酰胺、瓊脂糖、葡聚糖、纖維素或蛋白質(zhì)純化中常用的其他類型?？蛇x擇地，可應(yīng)用陽離子交換步驟。適當(dāng)?shù)年栯x子交換劑包括各種不溶性的基質(zhì)，該基質(zhì)包含磺丙基或羧甲基基團。磺丙基基團是特別優(yōu)選的。
然后，可應(yīng)用一種或多種RP-HPLC步驟以進一步純化肽變體組合物，該RP-HPLC步驟應(yīng)用疏水RP-HPLC介質(zhì)如具有伸出的甲基或其他脂肪族基團的硅膠。前述純化步驟的一些或全部的各種組合也可用于提供同質(zhì)的修飾的糖蛋白。
從大規(guī)模發(fā)酵中得到的本發(fā)明修飾的肽可通過與由Urdal等人，J.Chromatog.296171(1984)公開的類似的方法進行純化。該參考文獻描述了在制備型HPLC柱上純化重組人IL-2的兩個連續(xù)的RP-HPLC步驟?？蛇x擇地，可應(yīng)用如親和層析的技術(shù)以純化修飾的糖蛋白。
VI.優(yōu)選的肽和編碼優(yōu)選的肽的核酸本發(fā)明包括編碼各種肽和蛋白質(zhì)的分離的核酸及其相似分子或片段。本發(fā)明不應(yīng)被理解為以任何方式僅局限于這些肽在本發(fā)明方法中的應(yīng)用，而應(yīng)被理解為包括任何和所有對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言目前可用的肽或?qū)⒆優(yōu)榭捎玫碾?。此外，本發(fā)明不應(yīng)被理解為僅包括此處所列的肽的一個特定的核酸或氨基酸序列，而應(yīng)被理解為包括每一個肽的任何和所有變體、同系物、突變體等。應(yīng)該注意，當(dāng)肽被鑒定為具有該肽序列中的突變或其他改變時，除非此處另有說明，如下確定改變或突變的氨基酸的編號方式，即這樣成熟肽序列中的第一個氨基酸是第1位氨基酸。
優(yōu)選的肽包括但不局限于人粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、人干擾素α(IFN-α)、人干擾素β(IFN-β)、人凝血因子VII(FactorVII)、人凝血因子IX(FactorIX)、人促卵泡激素(FSH)、人促紅細(xì)胞生成素(EPO)、人粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、人干擾素γ(IFN-γ)、人α-1-蛋白酶抑制劑(也已知為α-1-抗胰蛋白酶或α-1-胰蛋白酶抑制劑；A-1-PI)、葡糖腦苷脂酶、人組織型活化因子(TPA)、人白細(xì)胞介素-2(IL-2)、人凝血因子VIII(FactorVIII)、與人IgG免疫球蛋白Fc部分融合的75kDa的腫瘤壞死因子受體，商業(yè)上已知為ENBRELTM或ETANERCEPTTM(嵌合的TNFR)、人尿激酶(尿激酶)、特異性結(jié)合糖蛋白IIb/IIIa和玻連蛋白αvβ3受體的人/鼠嵌合的單克隆抗體的Fab片段，商業(yè)上已知為REOPROTM或ABCIXIMAB(嵌合的抗糖蛋白IIb/IIIa)、特異性結(jié)合人HER2的人/鼠嵌合的單克隆抗體，商業(yè)上已知為HERCEPTITM(嵌合的抗-HER2)、特異性結(jié)合呼吸道合胞病毒F蛋白質(zhì)或A抗原性位點的人/鼠嵌合的抗體，商業(yè)上已知為SYNAGISTM或PALIVIZUMAB(嵌合的抗-RSV)、特異性結(jié)合人B-細(xì)胞上的CD20的嵌合人/鼠單克隆抗體，商業(yè)上已知為RITUXANTM或RITUXAMAB(嵌合的抗-CD20)、人重組DNa se(DNase)、特異性結(jié)合人腫瘤壞死因子的嵌合人/鼠單克隆抗體，商業(yè)上已知為REMICADETM或INFLIXIMAB(嵌合的抗-TNF)、人胰島素、乙型肝炎病毒的表面抗原(adw亞型；HBsAg)和人生長激素(HGH)、α-半乳糖苷酶A(FabryzymeTM)、α-艾杜糖苷酶(AldurazymeTM)、抗凝血酶(抗凝血酶III，AT-III)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、干擾素ω等。
本發(fā)明分離的核酸應(yīng)該解釋為包括編碼任何上述的本發(fā)明肽的RNA或DNA序列及其修飾形式，該修飾形式包括對DNA或RNA的化學(xué)修飾以使得當(dāng)無細(xì)胞時或與細(xì)胞結(jié)合時該核苷酸序列更穩(wěn)定。作為非限制性的例子，含有至少一種硫代磷酸修飾的寡核苷酸已知可賦予該寡核苷酸對核酸酶增強的抗性。修飾的寡核苷酸的特定的例子包括那些含有硫代磷酸、磷酸三酯、甲基磷酸酯、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間連接或短鏈雜原子或雜環(huán)糖間(“主鏈”)連接。此外，也可應(yīng)用具有嗎啉主鏈結(jié)構(gòu)(美國專利No5,034,506)或聚酰胺主鏈結(jié)構(gòu)(Nielsen等人，1991，Science 2541497)的寡核苷酸。
對核苷酸的化學(xué)修飾可用于增強細(xì)胞攝取核苷酸序列的效率和該核苷酸序列在細(xì)胞中表達的效率。本發(fā)明涉及對核苷酸序列進行修飾的任何和所有組合。
本發(fā)明不應(yīng)解釋為僅局限于在此處公開的核酸和氨基酸序列。如在別處更詳細(xì)描述的，一旦閱讀了本發(fā)明，則對本領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的是編碼本發(fā)明肽的其他核酸可通過在此處描述的程序(即定點誘變、移碼突變等)和本領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)來獲得。
同樣包括的是分離的編碼肽片段的核酸，其中該肽片段保持了肽想要的生物學(xué)活性。此外，盡管在此處用特定的SEQ ID NOS公開了編碼肽的示例性核酸，但本發(fā)明決不應(yīng)解釋為局限于在此處公開的任何特定的核酸。相反，本發(fā)明應(yīng)該解釋為包括與在此處公開的序列具有足夠的百分比一致性的任何或所有核酸分子，從而這些核酸也編碼具有在此處公開的想要的生物學(xué)活性的肽。同樣涉及的是比全長核酸短的分離的核酸，其保持了其編碼的肽的生物學(xué)活性。確定一個核酸和另一個之間的百分比一致性的方法與確定任何特定的優(yōu)選肽的生物學(xué)活性的測定一樣在文中其它地方公開。
同樣如在文中其它地方公開的，任何其他程序可用于用本領(lǐng)域中眾所周知的重組DNA方法生成本發(fā)明的肽的衍生物、突變體或變體形式，該重組DNA方法如描述于Sambrook等人(1989，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，New York)和Ausubel等人(1997，Current Protocols inMolecular Biology，Green &amp; Wiley，New York)。通過改變編碼肽的DNA序列而引入肽或多肽中氨基酸改變的程序是本領(lǐng)域中眾所周知的且同樣描述于Sambrook等人(1989，見上文)；Ausubel等人(1997，見上文)中。
本發(fā)明包括編碼G-CSF、IFN-α、IFN-β、凝血因子VII、凝血因子IX、FSH、EPO、GM-CSF、IFN-γ、A-1-PI、葡糖腦苷脂酶、TPA、IL-2、凝血因子VIII、嵌合的TNFR、尿激酶、嵌合的抗-糖蛋白IIb/IIIa、嵌合的抗-HER2、嵌合的抗-RSV、嵌合的抗-CD20、DNase、嵌合的抗-TNF、人胰島素、HBsAg和HGH、的核酸，其中在其上共價連接了編碼標(biāo)記肽的核酸。即本發(fā)明包含嵌合的核酸，其中編碼標(biāo)記肽的核酸序列共價地與編碼本發(fā)明的肽的核酸連接。這種標(biāo)記肽是本領(lǐng)域中眾所周知的，且包括如綠色熒光蛋白(GFP)、myc、myc-丙酮酸激酶(myc-PK)、His6、麥芽糖結(jié)合蛋白質(zhì)(MBP)、流感病毒血凝素標(biāo)記多肽、旗型(flag)標(biāo)記多肽(FLAG)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)記多肽。然而，本發(fā)明決不應(yīng)解釋為局限于編碼上面所列的標(biāo)記肽的核酸。相反，編碼可以與這些標(biāo)記肽以基本相似的方式發(fā)揮功能的肽的任何核酸序列均應(yīng)解釋為包括于本發(fā)明中。
包含編碼標(biāo)記肽的核酸的核酸可用于將本發(fā)明的肽定位于細(xì)胞、組織和/或整個生物(如哺乳動物胚胎)中，探測從細(xì)胞分泌的本發(fā)明的肽和研究該肽在細(xì)胞中的作用。進一步地，標(biāo)記肽的添加促進了“標(biāo)記的”肽的分離和純化，從而本發(fā)明的肽可易于生產(chǎn)和純化。
本發(fā)明包括下面優(yōu)選的分離肽G-CSF、IFN-α、IFN-β、凝血因子VII、凝血因子IX、FSH、EPO、GM-CSF、IFN-γ、A-1-PI、葡糖腦苷脂酶、TPA、IL-2、凝血因子VIII、嵌合的TNFR、尿激酶、嵌合的抗-糖蛋白IIb/IIIa、嵌合的抗-HER2、嵌合的抗-RSV、嵌合的抗-CD20、DNase、嵌合的抗-TNF、人胰島素、HBsAg、HGH、α-半乳糖苷酶A、α-艾杜糖苷酶、抗凝血酶III、hCG和干擾素ω等。
本發(fā)明也應(yīng)解釋為包含本發(fā)明的肽(或編碼該肽的DNA)的“衍生物”、“突變體”和“變體”，該衍生物、突變體和變體是在一個或多個氨基酸進行了改變的(或者當(dāng)指編碼該肽的核苷酸序列時，是在一個或多個堿基對進行了改變的)，從而結(jié)果所得的肽(或DNA)與在此處列舉的序列不同，但具有與在此處公開的肽相同的生物學(xué)性質(zhì)，即該肽具有G-CSF、IFN-α、IFN-β、凝血因子VII、凝血因子IX、FSH、EPO、GM-CSF、IFN-γ、A-1-PI、葡糖腦苷脂酶、TPA、IL-2、凝血因子VIII、嵌合的TNFR、尿激酶、嵌合的抗-糖蛋白IIb/IIIa、嵌合的抗-HER2、嵌合的抗-RSV、嵌合的抗-CD20、DNase、嵌合的抗-TNF、人胰島素、HBsAg和HGH的生物學(xué)/生物化學(xué)性質(zhì)。
進一步包括的是保持了肽的想要的生物學(xué)活性的肽片段，而不管其長度。完全在技術(shù)人員技術(shù)范圍之內(nèi)的是分離比用于本發(fā)明中的任何肽的全長形式短的肽，及用在此處提供的測定確定哪些分離的片段保持了想要的生物學(xué)活性并因而是可用于本發(fā)明的肽。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)的生物學(xué)性質(zhì)應(yīng)該解釋為包括但不局限于該肽在生物學(xué)測定和在此處描述的環(huán)境中發(fā)揮功能的能力，該功能如減少炎癥、消除免疫反應(yīng)、血液凝集、增加的造血產(chǎn)出、蛋白酶抑制、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、結(jié)合抗原、生長、減輕或治療疾病、DNA切割等。
A.G-CSF本發(fā)明包含修飾G-CSF上聚糖結(jié)構(gòu)的方法。G-CSF是本領(lǐng)域中眾所周知的由活化的T-細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。G-CSF主要在骨髓發(fā)揮作用以增加炎癥白細(xì)胞的產(chǎn)生，并進一步發(fā)揮內(nèi)分泌激素的功能以起始對在炎癥功能過程中消耗的嗜中性粒細(xì)胞的補充。G-CSF在化學(xué)療法后的骨髓替代中也具有臨床應(yīng)用。
重構(gòu)的G-CSF肽可施用于如下患者，該患者選自接受骨髓抑制化學(xué)療法的非骨髓癌患者、接受誘導(dǎo)或強化化學(xué)療法的急性髓性白血病(AML)患者、接受骨髓移植的非骨髓癌患者、進行外周血祖先細(xì)胞收集的患者、患有嚴(yán)重慢性中性白細(xì)胞減少癥的患者和患有持久性中性白細(xì)胞減少癥且也患有晚期HIV感染的患者。優(yōu)選地，患者是人患者。
盡管G-CSF對于哺乳動物特別是人的治療性應(yīng)用是重要的和有用的，但從重組細(xì)胞中生產(chǎn)G-CSF的現(xiàn)有方法導(dǎo)致如下產(chǎn)物，該產(chǎn)物具有相對短的生物學(xué)壽命、可潛在地導(dǎo)致免疫原性的不正確的糖基化模式、功能的喪失和對更大量和更頻繁服藥的需要以達到相同的效果等。
已分離和克隆了G-CSF，且其核酸和氨基酸序列分別如SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示(分別為圖58A和58B)。本發(fā)明包含修飾G-CSF的方法，特別當(dāng)其涉及G-CSF充當(dāng)有效的和有功能的生物學(xué)分子的能力時。當(dāng)利用本發(fā)明的公開內(nèi)容和在此處的介紹時，技術(shù)人員易于理解本發(fā)明提供了修飾G-CSF的組合物和方法。
本發(fā)明進一步包含G-CSF變體，如在本領(lǐng)域中眾所周知的。作為例子，但決不意味著限制本發(fā)明，在美國專利No.6,166,183中已描述了G-CSF變體，其中描述了包含賴氨酸殘基的天然補體(complement)并進一步連接到一個或兩個聚乙二醇分子上的G-CSF。此外，美國專利No.6,004,548、5,580,755、5,582,823和5,676,941描述了G-CSF變體，其中位置17、36、42、64和74上的一個或多個半胱氨酸殘基由丙氨酸或絲氨酸替代。美國專利No.5,416,195描述了G-CSF分子，其中位置17上的半胱氨酸、位置27上的天冬氨酸和位置65和66上的絲氨酸分別由絲氨酸、絲氨酸、脯氨酸和脯氨酸替代。其他變體是本領(lǐng)域中眾所周知的，且描述于如美國專利No.5,399,345中。
本發(fā)明修飾的G-CSF分子的表達和活性可用本領(lǐng)域中眾所周知及描述于如美國專利No.4,810,643中的方法進行測定。作為例子，活性可用放射性標(biāo)記的胸腺嘧啶攝取測定法進行測量。簡言之，使來自健康供體的人骨髓用Ficoll-Hypaque(1.077g/ml，Pharmacia，Piscataway，NJ)進行密度分離(cut)，且低密度的細(xì)胞懸浮于含有10％胎牛血清、谷氨酰胺和抗生素的Iscove氏培養(yǎng)基中(GIBCO，LaJolla，CA)中。使約2×104的人骨髓細(xì)胞與對照培養(yǎng)基或本發(fā)明的G-CSF在96-孔平底平板上在空氣中5％的CO2于約37℃溫育約2天。然后用0.5μCi/孔的3H-胸腺嘧啶(New England Nuclear，Boston，Mass.)對培養(yǎng)物脈沖處理約4小時，并以描述于如Ventua等人(1983，Blood61781)中的方法對攝取進行測量。與用對照化合物處理的骨髓細(xì)胞相比3H-胸腺嘧啶向人骨髓細(xì)胞中整合的增加是活性和有生活力的G-CSF化合物的指示。
B.IFNα、IFNβ和IFNω本發(fā)明進一步包含重構(gòu)和修飾IFNα、IFNβ和IFNω的方法。IFNα是重量為約18kDa的約20個肽的家族的部分。IFNω在結(jié)構(gòu)和功能上非常類似于IFNα。當(dāng)宿主對IFNα的免疫反應(yīng)增長從而使得該治療無效時，IFNω可用于治療丙型肝炎病毒感染?？笽FNα的抗體不能與IFNω交叉反應(yīng)。因而，當(dāng)IFNα療法不再可能時，可以應(yīng)用IFNω繼續(xù)治療丙型肝炎。
共同已知為I型干擾素的IFNα、ω和IFNβ結(jié)合到相同的細(xì)胞受體上并引起相似的反應(yīng)。I型IFN抑制病毒復(fù)制、增加NK細(xì)胞的裂解潛力、調(diào)節(jié)MHC分子的表達并抑制細(xì)胞增殖等。I型IFN已用作對病毒感染特別是肝炎病毒感染以及對多發(fā)性硬化的治療劑。
如上所述I型IFN的現(xiàn)有組合物是對于調(diào)節(jié)異常免疫學(xué)反應(yīng)和用作對各種疾病的治療劑有用的化合物。然而，與包含糖基化的天然補體的天然細(xì)胞因子相比它們受到降低的能力和功能及有限的體內(nèi)半衰期的阻礙。
重構(gòu)的IFNα肽可施用于如下患者，該患者選自患有多毛細(xì)胞白血病的患者、患有惡性黑素瘤的患者、患有濾泡性淋巴瘤的患者、患有尖銳濕疣的患者、患有AIDS-相關(guān)的卡波西肉瘤的患者、患有丙型肝炎的患者、患有乙型肝炎的患者、患有人乳頭瘤病毒感染的患者、患有慢性髓性白血病(CML)的患者、患有慢性相費城染色體(Ph)陽性慢性髓細(xì)胞性白血病的患者、患有非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的患者、患有淋巴瘤的患者、患有膀胱癌的患者和患有腎癌的患者。優(yōu)選地，患者是人患者。
重構(gòu)的IFNβ肽可施用于如下患者，該患者選自患有多發(fā)性硬化(MS)的患者、患有乙型肝炎的患者、患有丙型肝炎的患者、患有人乳頭瘤病毒感染的患者、患有乳腺癌的患者、患有腦癌的患者、患有結(jié)腸直腸癌的患者、患有肺纖維化的患者和患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患者。優(yōu)選地，患者是人患者。
重構(gòu)的IFNω肽可施用于如下患者，該患者選自患有多毛細(xì)胞白血病的患者、患有惡性黑素瘤的患者、患有濾泡性淋巴瘤的患者、患有尖銳濕疣的患者、患有AIDS-相關(guān)的卡波西肉瘤的患者、患有丙型肝炎的患者、患有乙型肝炎的患者、患有人乳頭瘤病毒感染的患者、患有慢性髓性白血病(CML)的患者、患有慢性相費城染色體(Ph)陽性慢性髓細(xì)胞性白血病的患者、患有非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的患者、患有淋巴瘤的患者、患有膀胱癌的患者和患有腎癌的患者。優(yōu)選地，患者是人患者。
IFNα的原型核苷酸和氨基酸序列在此處分別以SEQ ID NO3和SEQ ID NO4提出(分別為圖59A和59B)。IFNω的原型核苷酸和氨基酸序列在此處分別以SEQ ID NO74和SEQ ID NO75提出(分別為圖84A和84B)。IFNβ包含約20kDa的單基因產(chǎn)物，其核酸和氨基酸序列在此處分別以SEQ ID NO5和SEQ ID NO6提出(分別為圖60A和60B)。本發(fā)明不局限于此處的核苷酸和氨基酸序列。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將易于理解天然地或作為加工的衍生物存在許多IFNα的變體。類似地，已對IFNβ進行修飾以實現(xiàn)更有利的治療性質(zhì)。修飾的I型IFN的例子是本領(lǐng)域中眾所周知的(參見表9)，且描述于如美國專利6,323,006中，其中半胱氨酸-60被酪氨酸替代，也描述于如美國專利No.4,737,462、4,588,585、4,545,723和6,127,332中，其中描述了具有多種氨基酸替代的IFNβ。此外，美國專利No.4,966,843、5,376,567、5,795,779描述了IFNα-61和IFN α-76。美國專利No.4,748,233和4,695,543描述了IFNα gx-1，而美國專利No.4,975,276描述了IFNα-54。此外，美國專利No.4,695,623、4,897,471、5,661,009和5,541,293均描述了代表在提交日期已知的所有變體的一致IFNα序列。盡管I型IFN及其變體的該列表決不是無遺漏的，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員易于理解本發(fā)明包含已知的或?qū)戆l(fā)現(xiàn)的IFNβ和IFNα分子、衍生物和變體。
表9.干擾素-α同種型
在重組細(xì)胞中表達IFN的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，且易于用如下技術(shù)實現(xiàn)，該技術(shù)描述于如美國專利No.4,966,843和Sambrook等人(2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York)和Ausubel等人(1997，CurrentProtocols in Molecular Biology，Green &amp; Wiley，New York)。
確定由本發(fā)明修飾的I型IFN的生物學(xué)活性的測定法是本領(lǐng)域的技術(shù)人員眾所周知的。例如，描述于Rubinstein等人(1981，Journalof Virology 37755-758)中的測定法通常用于通過測量細(xì)胞群體中的病毒感染致細(xì)胞病變效應(yīng)而確定I型IFN的作用。該方法僅是本領(lǐng)域中許多已知用于測定I型IFN的生物學(xué)功能的方法之一。
C.凝血因子VIIa本發(fā)明進一步包含重構(gòu)和修飾凝血因子VII的方法。血液凝結(jié)途徑是包含許多事件的復(fù)雜反應(yīng)。該途徑中的一個中間事件是凝血因子VII，其是通過在組織因子和鈣離子存在時將凝血因子X轉(zhuǎn)變?yōu)閄a而參與血液凝結(jié)的外在途徑的酶原(活化后為凝血因子VIIa)。凝血因子Xa然后在凝血因子Va、鈣離子和磷脂存在時將凝血酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槟浮Ｄ蜃覺向凝血因子Xa的活化是內(nèi)在和外在血液凝結(jié)途徑所共有的事件，因此凝血因子VIIa可用于治療具有凝血因子VIII缺陷或抑制的患者。也有證據(jù)表明凝血因子VIIa也可參與內(nèi)在途徑，因此增加了凝血因子VII在血液凝結(jié)中作用的突出性和重要性。
凝血因子VII是分子量約50kDa的單鏈糖蛋白。在該形式時，該因子在血液中以無活性的酶原進行循環(huán)。凝血因子VII向凝血因子VIIa的活化可由幾種不同的血漿蛋白酶催化，如凝血因子XIIa。凝血因子VII的活化導(dǎo)致重鏈和輕鏈通過至少一個二硫鍵結(jié)合在一起。進一步地，描述了不能轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜃覸IIa的修飾的凝血因子VII分子，且該分子可用作抗凝結(jié)藥物，如在血凝塊、血栓等情況下。鑒于凝血因子VII在血液凝結(jié)途徑中的重要性及其可用作對增加和降低的凝結(jié)水平的治療，那么具有以下性質(zhì)的分子將是有利的且可用于對血液凝結(jié)病癥的治療，該分子具有較長的生物學(xué)半衰期、增加的能力，且通常具有與在健康人體中合成和分泌的野生型凝血因子VII更相似的治療性質(zhì)。
重構(gòu)的凝血因子VII肽可施用于如下患者，該患者選自具有流血發(fā)作的血友病患者；患有A型血友病的患者；患有B型血友病的患者；患有A型血友病的患者，其中該患者也具有抗凝血因子VIII的抗體；患有B型血友病的患者，其中該患者也具有抗凝血因子IX的抗體；患有肝硬化的患者；具有同位肝移植的硬化患者；具有上胃腸流血的硬化患者；具有骨髓移植的患者和具有肝切除的患者。優(yōu)選地，患者是人患者。
凝血因子VII已進行了克隆和測序，且其核酸和氨基酸序列在此處以SEQ ID NO7和SEQ ID NO8提供(分別為圖61A和61B)。本發(fā)明決不應(yīng)該解釋為局限于在此處提出的凝血因子VII核酸和氨基酸序列。凝血因子VII的變體描述于如美國專利No.4,784,950和5,580,560中,其中賴氨酸-38、賴氨酸-32、精氨酸-290、精氨酸-341、異亮氨酸-42、酪氨酸-278和酪氨酸-332由各種氨基酸替代。進一步地，美國專利No.5,861,374、6,039,944、5,833,982、5,788,965、6,183,743、5,997,864和5,817,788描述了不能進行切割以形成凝血因子VIIa的凝血因子VII變體。技術(shù)人員可認(rèn)識到血液凝結(jié)途徑及其中凝血因子VII的作用是眾所周知的，因此在本發(fā)明中包括許多如上所述的天然存在的和加工的變體。
表達和確定凝血因子VII的活性的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，并且描述于如美國專利No.4,784,950中。簡言之，凝血因子VII或其變體的表達可在各種原核生物和真核生物系統(tǒng)中實現(xiàn)，包括大腸桿菌、CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、應(yīng)用桿狀病毒表達系統(tǒng)的昆蟲細(xì)胞，它們?nèi)渴潜绢I(lǐng)域中眾所周知的。
對根據(jù)本發(fā)明的方法制備的修飾的凝血因子VII的活性的測定是本領(lǐng)域中眾所周知的。作為非限制性的例子，Quick等人(HemorragicDisease and Thrombosis，2nded.，Leat Febiger，Philadelphia，1966)描述了用于確定根據(jù)本發(fā)明的方法制備的凝血因子VII分子的生物學(xué)活性的一步凝結(jié)測定法(one-stage clotting assay)。
D.凝血因子IX本發(fā)明進一步包含重構(gòu)和/或修飾凝血因子IX的方法。如上所述，凝血因子IX在血液凝結(jié)級聯(lián)中是至關(guān)重要的。身體中凝血因子IX的缺陷是一類血友病(B型)的特征。對該疾病的治療通常局限于輸入凝血因子IX的人血漿蛋白質(zhì)濃縮物。然而，除操作時間和花費的缺點之外，血液濃縮物的輸入涉及向受體傳遞病毒性肝炎、獲得性免疫缺陷綜合癥或血栓栓塞疾病的危險。
盡管已證明凝血因子IX本身對于治療應(yīng)用是重要和有用的化合物，但從重組細(xì)胞產(chǎn)生凝血因子IX的現(xiàn)有方法(美國專利No.4,770,999)導(dǎo)致如下產(chǎn)物，該產(chǎn)物具有相當(dāng)短的生物學(xué)壽命、可潛在導(dǎo)致免疫原性的不正確的糖基化模式、功能的喪失和對更大量和更頻繁服藥的需要以達到相同的效果等。
重構(gòu)的凝血因子IX肽可施用于如下患者，該患者選自具有流血發(fā)作且也患有B型血友病的血友病患者、患有B型血友病的患者、患有B型血友病且也具有抗凝血因子IX的抗體的患者、患有肝硬化的患者、具有同位肝移植的硬化患者、具有上胃腸流血的硬化患者、具有骨髓移植的患者和具有肝切除的患者。也可施用重構(gòu)的凝血因子IX肽以控制和/或預(yù)防患有B型血友病、先天性凝血因子IX不足或克里斯馬斯病的患者中的出血發(fā)作。也可對患者施用重構(gòu)的凝血因子IX肽以控制和/或預(yù)防外科手術(shù)過程中患者中的出血發(fā)作。優(yōu)選地，患者是人患者。
凝血因子IX的核酸和氨基酸序列在此處以SEQ ID NO9和SEQ IDNO10提出(分別為圖62A和62B)。本發(fā)明決不局限于在此處提出的序列。凝血因子IX變體是本領(lǐng)域中眾所周知的，如描述于美國專利No.4,770,999，其中第一個位置的酪氨酸由丙氨酸替代的5,521,070，其中凝血因子XI連接到烯化氧基團上的美國專利No.6,037,452，以及其中編碼凝血因子IX的DNA在至少一個剪接位點進行修飾的美國專利No.6,046,380中的。如在此處證明的，凝血因子IX的變體是本領(lǐng)域中眾所周知的，且本發(fā)明的公開內(nèi)容包含那些已知的或?qū)砜砂l(fā)展或發(fā)現(xiàn)的變體。
確定根據(jù)本發(fā)明的方法制備的修飾的凝血因子IX的方法可用上述的方法實現(xiàn)，或者此外用本領(lǐng)域中眾所周知的方法實施，如一步活化的局部組織促凝血酶原激酶時間測定，如描述于Biggs(1972，HumanBlood Coagulation Haemostasis and Thrombosis(Ed.1)，Oxford，Blackwell，Scientific，pg.614)中的。簡言之，為了測定根據(jù)本發(fā)明的方法發(fā)展的凝血因子IX分子的生物學(xué)活性，可用等體積的活化的局部組織促凝血酶原激酶試劑、用本領(lǐng)域中眾所周知的無菌靜脈切開放血術(shù)技術(shù)從B型血友病患者中分離的凝血因子IX缺陷型血漿和作為標(biāo)準(zhǔn)或樣品的正常收集的血漿進行測定。在該測定中，1單位的活性定義為在1毫升正常收集的血漿中存在的該量。進一步地，可進行基于凝血因子IX減少從凝血因子IX缺陷型患者的血漿凝結(jié)時間至正常時間的能力的測定法，如描述于Proctor和Rapaport(1961，Amer.J.Clin.Path.36212)中的。
E.FSH本發(fā)明進一步包括重構(gòu)和/或修飾FSH的方法。人的生殖功能部分是由異二聚體的人糖蛋白激素家族控制的，該家族具有共同的92個氨基酸的糖蛋白α亞基，但在其激素特異性的β亞基上有差異。該家族包括促卵泡激素(FSH)、黃體生成素(LH)、促甲狀腺素或促甲狀腺激素(TSH)和人絨毛膜促性腺激素(hCG)。人FSH和LH在治療上可用于調(diào)節(jié)人類女性中與生殖相關(guān)的代謝的各個方面。例如，部分從尿中純化的FSH可臨床地用于刺激無卵性綜合癥或黃體期缺陷的無卵性婦女中卵泡的成熟。黃體生成素(LH)和FSH可組合地用于刺激卵泡的發(fā)育以進行體外受精。FSH在生殖循環(huán)中的作用是充分已知的，從而允許其進行治療應(yīng)用，但部分由于來自天然來源的制劑的異質(zhì)性和不純而遇到了困難。該異質(zhì)性歸因于糖基化模式中的變化。
FSH在體外受精和對體內(nèi)受精的刺激中均是有價值的工具，但如上所述，其臨床功效受到蛋白質(zhì)糖基化中的不一致性的阻礙。因此明顯的是重構(gòu)FSH的方法將對于生殖科學(xué)具有巨大的益處。
重構(gòu)的FSH肽可施用于如下患者，該患者選自進行子宮內(nèi)授精(IUI)的患者、進行體外受精(IVF)的患者和不育性患者。也可施用重構(gòu)的FSH肽以誘導(dǎo)或增加患者中的排卵；刺激患者中卵泡的發(fā)育；誘導(dǎo)患者中的配子形成的卵泡生長；刺激、誘導(dǎo)或增加患者中的卵泡發(fā)育和隨后的排卵或治療患者中的不育。優(yōu)選地，患者是人女性患者。也可將重構(gòu)的FSH肽施用于患有垂體缺陷的患者或者青春期中的患者。優(yōu)選地，患者是人男性患者。
FSH已進行了克隆和測序，其核酸和氨基酸序列在此處分別以SEQID NO11、SEQ ID NO12(α亞基)和分別以SEQ ID NO13和SEQID NO14(β亞基)提出(分別為圖63A、63B、63C和63D)。技術(shù)人員將易于理解本發(fā)明不局限于在此處描述的序列，這是因為FSH的變體是本領(lǐng)域中眾所周知的。作為非限制性的例子，美國專利No.5,639,640描述了包含兩個不同氨基酸序列的β亞基，而美國專利No.5,338,835描述了包含額外的氨基酸序列的β亞基，該額外的氨基酸序列源自人絨毛膜促性腺激素β亞基并且長約27個氨基酸。因此，本發(fā)明包含天然的和由人類手工加工的FSH變體，它們均是本領(lǐng)域中眾所周知的。
在原核和真核細(xì)胞兩者中表達FSH的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，且大量描述于文獻中(美國專利No.4,840,896、4,923,805、5,156,957)。進一步地，估計本發(fā)明重構(gòu)的FSH分子的生物學(xué)活性的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，且描述于如美國專利No.4,589,402中，其中描述了非人的靈長類和人被試者中確定FSH對生育力、卵的產(chǎn)生和懷孕率的影響的方法。
F.EPO本發(fā)明進一步包含重構(gòu)和/或修飾EPO的方法。EPO是約34kDa的酸性糖蛋白，且可以以3種天然形式存在α、β和脫唾液酸化的。α和β形式僅在糖成分上有細(xì)微差異，但具有相同的能力、生物學(xué)活性和分子量。脫唾液酸化形式是去除了末端唾液酸的α或β形式。在健康狀態(tài)時EPO以非常低的濃度存在于血漿中，其中組織從現(xiàn)有數(shù)目的紅細(xì)胞中接受足夠的氧化。該正常的濃度足以刺激通過正常衰老損失的紅血細(xì)胞的替代。循環(huán)中促紅細(xì)胞生成素的量在當(dāng)循環(huán)中由血細(xì)胞轉(zhuǎn)運的氧減少時的低氧狀況下是增加的。低氧可由通過出血造成的大量血液喪失、紅血細(xì)胞由于過度暴露于放射中的破壞、由于高海拔或長期的人事不省導(dǎo)致的氧攝入的減少或各種形式的貧血而導(dǎo)致。因此EPO是在放射治療、貧血和其他危害生命的狀況后補充紅血細(xì)胞的有用化合物。
重構(gòu)的EPO肽可施用于如下患者，該患者選自患有貧血的患者、具有慢性腎機能不全的貧血患者、具有末期腎病的貧血患者、進行透析的貧血患者、具有慢性腎衰竭的貧血患者、貧血性疊氮胸苷治療的HIV感染患者、具有非骨髓癌和進行化學(xué)療法的貧血患者以及安排進行非心臟非血管外科手術(shù)的貧血患者。也可將重構(gòu)的EPO肽施用于進行外科手術(shù)的患者以減少同種異體輸血的需要。也可將重構(gòu)的EPO肽施用于預(yù)期有顯著的血液喪失而具有增加的手術(shù)期間輸血風(fēng)險的患者。優(yōu)選地，患者是人患者。
根據(jù)EPO在輔助從各種疾病和病癥恢復(fù)中的重要性，本發(fā)明可用于產(chǎn)生具有天然的且因此更有效的糖成分的EPO。目前所合成的EPO缺乏完全的糖基化，因此由于其在體內(nèi)的短壽命而必須更頻繁地且以更高的劑量給予。本發(fā)明也提供了PEG化EPO分子的生產(chǎn)，該EPO分子與可通過使所需的糖形式最大化所得的EPO分子相比具有大大改進的半衰期。
EPO已進行了克隆和測序，且其核苷酸和氨基酸序列在此處分別以SEQ ID NO15和SEQ ID NO16提出(分別為圖64A和64B)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員易于理解在此處提出的序列僅是編碼和包含EPO的序列的例子。作為例子，美國專利No.6,187,564描述了包含兩個或多個EPO肽的氨基酸序列的融合蛋白質(zhì)，美國專利No.6,048,971和5,614,184描述了在位置101、103、104和108具有氨基酸替代的突變EPO分子。美國專利No.5,106,954描述了截短的EPO分子，且美國專利No.5,888,772描述了在位置33、139和166具有替代的EPO類似物。因此，技術(shù)人員將認(rèn)識到本發(fā)明包含EPO和EPO衍生物和變體，這些是在文獻和本領(lǐng)域中整體充分證明的。
此外，在細(xì)胞中表達EPO的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。如在美國專利No.4,703,008、5,688,679和6,376,218等中示例的，EPO可在原核生物和真核生物表達系統(tǒng)中表達。測定EPO的生物學(xué)活性的方法同樣是本領(lǐng)域中眾所周知的。作為例子，Krystal測定(Krystal，1983，Exp.Hematol.11649-660)可用于確定根據(jù)本發(fā)明的方法制備的EPO的活性。簡言之，該測定測量促紅細(xì)胞生成素對完整小鼠脾細(xì)胞的作用。用苯肼處理小鼠以刺激促紅細(xì)胞生成素反應(yīng)性紅血細(xì)胞祖先細(xì)胞的產(chǎn)生。在處理后，獲取脾，將完整的脾細(xì)胞分離并使其與各種量的野生型促紅細(xì)胞生成素或在此處描述的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)進行溫育。在過夜溫育后，添加3H-胸腺嘧啶并測量其向細(xì)胞DNA中的整合。3H-胸腺嘧啶整合的量指示了通過促紅細(xì)胞生成素與其細(xì)胞受體的相互作用導(dǎo)致的促紅細(xì)胞生成素刺激的紅血細(xì)胞的生產(chǎn)。本發(fā)明的促紅細(xì)胞生成素蛋白質(zhì)的濃度以及野生型促紅細(xì)胞生成素的濃度通過本領(lǐng)域中眾所周知的競爭性放射免疫測定方法進行了定量。特定的活性以在Krystal測定中測量的國際單位除以由放射免疫測定測量的免疫沉淀性蛋白質(zhì)的微克數(shù)而計算。
已報道了幾個具有不同糖基化模式的不同的突變EPO。許多具有改進的網(wǎng)狀細(xì)胞增多活性的刺激，而不影響該肽在動物血流中的半衰期。預(yù)期突變的EPO肽可以替代天然的EPO肽用于此處所述的任何聚糖重構(gòu)、糖PEG化和/或糖綴合實施方案中。優(yōu)選的EPO突變列于下表中，但不局限于列于下表中的那些(參見如Chern等人，1991，Eur.J.Biochem.202225-229；Grodberg等人，1993，Eur.J.Biochem.218597-601；Burns等人，2002，Blood 994400-4405；美國專利No.5,614,184；GenBank Accession No.AAN76993；O’Connell等人，1992，J.Biol.Chem.26725010-25018；Elliott等人，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.812708-2712；Biossel等人，1993，J.Biol.Chem.26815983-15993)。最優(yōu)選的EPO突變是Arg139到Ala139，Arg143到Ala143和Lys154到Ala154。制備這些突變的優(yōu)選天然EPO形式是165aa的形式，其描述于圖65中；然而也可應(yīng)用其他EPO的天然形式。最后，描述于表10中的突變可以相互或與其他突變組合，以制備用于本發(fā)明中的EPO肽。
表10.EPO突變
G.GM-CSF本發(fā)明包含修飾GM-CSF的方法。GM-CSF是本領(lǐng)域中眾所周知的由活化的T-細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和基質(zhì)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子。GM-CSF主要在骨髓發(fā)揮作用以增加炎癥白細(xì)胞的產(chǎn)生，并進一步發(fā)揮內(nèi)分泌激素的功能以起始對在炎癥功能過程中消耗的嗜中性粒細(xì)胞的補充。GM-CSF進一步是巨噬細(xì)胞刺激因子且促進Lagerhans細(xì)胞向樹突細(xì)胞的分化。與G-CSF類似，GM-CSF在化學(xué)療法后的骨髓替代中也具有臨床應(yīng)用。
盡管已證明G-CSF本身是治療性應(yīng)用的重要和有用化合物，但從重組細(xì)胞中生產(chǎn)G-CSF的現(xiàn)有方法導(dǎo)致如下產(chǎn)物，該產(chǎn)物具有相對短的生物學(xué)壽命、可潛在地導(dǎo)致免疫原性的不正確的糖基化模式、功能的喪失和對更大量和更頻繁服藥的需要以達到相同的效果等。
重構(gòu)的GM-CSF肽可施用于如下患者，該患者選自患有急性髓細(xì)胞性白血病(AML)或急性非淋巴細(xì)胞性白血病(ANLL)的患者、進行白細(xì)胞提取法以從外周血中收集造血祖先細(xì)胞的患者、進行自體外周血祖先細(xì)胞移植的患者、進行自體骨髓移植的非何杰金氏淋巴瘤(NHL)患者、進行自體骨髓移植的何杰金氏病患者和進行自體骨髓移植的急性成淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)患者。也可將重構(gòu)的GM-CSF肽施用于患者以加快骨髓植入、縮短化學(xué)療法后嗜中性粒細(xì)胞恢復(fù)的時間、調(diào)動造血祖先細(xì)胞進入外周血以通過白細(xì)胞提取法進行收集或者在自體或同種異體骨髓移植(BMT)后促進骨髓重建。也可將重構(gòu)的GM-CSF肽施用于骨髓移植失敗或骨髓植入延遲的患者。優(yōu)選地，患者是人患者。
已分離和克隆了GM-CSF，且其核酸和氨基酸序列分別如SEQ IDNO17和SEQ ID NO18所提出的(分別為圖66A和66B)。本發(fā)明包含修飾GM-CSF的方法，特別當(dāng)涉及GM-CSF充當(dāng)有效的和有功能的生物學(xué)分子的能力時。當(dāng)利用本發(fā)明的公開內(nèi)容和在此處的介紹時，技術(shù)人員易于理解本發(fā)明提供了修飾GM-CSF的組合物和方法。
本發(fā)明進一步包含GM-CSF變體，如在本領(lǐng)域中眾所周知的。作為例子，但決不意味著限制本發(fā)明，在WO 86/06358中已描述了GM-CSF變體，其中的蛋白質(zhì)修飾為一種替代的四級結(jié)構(gòu)。進一步地，美國專利No.6,287,557描述了為了基因治療的應(yīng)用與皰疹病毒的基因組連接的GM-CSF核酸序列。此外，歐洲專利出版物No.0288809(相應(yīng)于PCT專利出版物No.WO 87/02060)報道了包含IL-2和GM-CSF的融合蛋白質(zhì)。IL-2序列可在GM-CSF的N-或C-末端，從而在對融合蛋白質(zhì)的酸性切割后，可生成具有N-或C-末端序列修飾的GM-CSF。因此，GM-CSF衍生物、突變體和變體是本領(lǐng)域中眾所周知的，且包含于本發(fā)明的方法之內(nèi)。
本發(fā)明修飾的GM-CSF分子的表達和活性可用本領(lǐng)域中眾所周知及描述于如美國專利No.4,810,643中的方法進行測定。作為例子，活性可用放射性標(biāo)記的胸腺嘧啶攝取測定法進行測量。簡言之，使來自健康供體的人骨髓用Ficoll-Hypaque(1.077g/ml，Pharmacia，Piscataway，NJ)進行密度分離，且低密度的細(xì)胞懸浮于含有10％胎牛血清、谷氨酰胺和抗生素的Iscove氏培養(yǎng)基中(GIBCO，La Jolla，CA)中。使約2×104的人骨髓細(xì)胞與對照培養(yǎng)基或本發(fā)明的G-CSF在96-孔平底平板上在空氣中5％的CO2于約37℃溫育約2天。然后用0.5μCi/孔的3H-胸腺嘧啶(New England Nuclear，Boston，Mass.)對培養(yǎng)物脈沖處理約4小時，并如描述于Ventua等人(1983，Blood 61781)中的方法對攝取進行測量。與用對照化合物處理的骨髓細(xì)胞相比3H-胸腺嘧啶向人骨髓細(xì)胞中整合的增加是活性和有生活力的GM-CSF化合物的指示。
H.IFN-γ本發(fā)明的一個目的是包含修飾和/或重構(gòu)IFN-γ的方法。也稱為II型干擾素的IFN-γ與IFNα和IFNβ相反，其是包含約21-24kDa的兩個亞基的同二聚體糖蛋白。該大小變異歸因于變化的糖基化模式，該模式當(dāng)在本領(lǐng)域公知的各種表達系統(tǒng)中重組生產(chǎn)時通常不能再現(xiàn)。IFN-γ是巨噬細(xì)胞的有力激活劑，可增加I型MHC分子的表達，且在較低的程度上是II型MHC分子的刺激劑。進一步地，IFN-γ促進T-細(xì)胞的分化和B-細(xì)胞中同種型轉(zhuǎn)換。也充分證明IFN-γ是嗜中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞和導(dǎo)致巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的清除的抗體反應(yīng)的刺激劑。IFN-γ已計劃作為治療藥品用于細(xì)胞內(nèi)病原體的感染中，如結(jié)核病和利什曼病，或者可作為抗增殖治療劑用于以異常細(xì)胞增殖為特點的病癥中，如各種癌和其他的瘤形成。
IFN-γ已證明具有有力的免疫學(xué)活性，但由于來自目前用于表達IFN-γ的系統(tǒng)的糖基化的差異，其治療劑的能力、功效、生物學(xué)半衰期和其他重要的因素是可變的。本發(fā)明包含糾正該關(guān)鍵缺陷的方法。
重構(gòu)的IFN-γ肽可施用于如下患者，該患者選自患有慢性肉芽腫性疾病的患者、患有惡性骨硬化病的患者、患有肺纖維化的患者、患有結(jié)核的患者、患有隱球菌性腦膜炎的患者和患有肺鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)復(fù)合(MAC)感染的患者。優(yōu)選地，患者是人患者。
IFN-γ的核苷酸和氨基酸序列在此處分別以SEQ ID NO19和SEQ IDNO20提出(分別為圖67A和67B)。易于理解在此處提出的序列決不限制本發(fā)明。相反，IFN-γ的變體、衍生物和突變體是技術(shù)人員眾所周知的。作為例子，美國專利No.6,083,724描述了重組的鳥類IFN-γ，而美國專利No.5,770,191描述了人IFN-γ的C-末端變體。此外，美國專利No.4,758,656描述了新的IFN-γ衍生物及在各種表達系統(tǒng)中合成該衍生物的方法。因此本發(fā)明不局限于在文中別處公開的IFN-γ序列，但包含本領(lǐng)域中眾所周知的所有衍生物、變體、突變體等。
IFN-γ的表達系統(tǒng)同樣是本領(lǐng)域中眾所周知的，且包括原核生物和真核生物系統(tǒng)以及植物和昆蟲制劑，其方法是技術(shù)人員公知的。作為例子，美國專利No.4,758,656描述了在大腸桿菌中表達IFN-γ衍生物的系統(tǒng)，而美國專利No.4,889,803描述了應(yīng)用中國倉鼠卵巢細(xì)胞和SV40啟動子的表達系統(tǒng)。
對根據(jù)在此處公開的方法制備的重構(gòu)的IFN-γ的生物學(xué)活性的測定是本領(lǐng)域中技術(shù)人員眾所周知的。IFN-γ表達的生物學(xué)測定可發(fā)現(xiàn)于如美國專利No.5,807,744中。簡言之，將IFN-γ添加到CD34++CD38-細(xì)胞(每孔100個細(xì)胞)培養(yǎng)物中，該培養(yǎng)物用細(xì)胞因子組合進行了刺激以誘導(dǎo)CD34++CD38-細(xì)胞的增殖，其中細(xì)胞因子為如IL-3、c-kit配體和IL-1、IL-6或G-CSF。細(xì)胞增殖及第二集落形成性細(xì)胞的產(chǎn)生將以劑量依賴性的方式大大受到抑制，且在5000U/毫升IFN-γ時接近完全抑制。作為對IFN-γ抑制作用的證實性檢驗，可添加IFN-γ抗體作為對照。
I.α-蛋白酶抑制劑(α-抗胰蛋白酶)本發(fā)明進一步包括重構(gòu)α-蛋白酶抑制劑(A-1-PI、α-1-抗胰蛋白酶或α-1-胰蛋白酶抑制劑)的方法，該α-蛋白酶抑制劑也已知為α-抗胰蛋白酶。A-1-PI是分子量為53kDa的糖蛋白。A-1-PI在控制由內(nèi)源絲氨酸蛋白酶導(dǎo)致的組織破壞中起作用，且是血漿中最顯著的絲氨酸蛋白酶抑制劑。特別地，A-1-PI抑制各種彈性蛋白酶，包括嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶。彈性蛋白酶是降解組織的蛋白酶，且當(dāng)其活性在肺組織中不受調(diào)節(jié)時可為特別有問題的。該蛋白酶通過降解外源蛋白而行使功能。然而，當(dāng)API不以足以調(diào)節(jié)彈性蛋白酶活性的量存在時，彈性蛋白酶可降解肺組織。因此，該不平衡可導(dǎo)致慢性肺組織損害和肺氣腫。事實上，A-1-PI的遺傳缺陷已顯示與肺氣腫的過早發(fā)展相關(guān)。A-1-PI補充已成功地用于該類肺氣腫的治療中。進一步地，A-1-PI的缺陷也將導(dǎo)致其他疾病的惡化，如囊性纖維化和關(guān)節(jié)炎，其中白細(xì)胞移入肺中或關(guān)節(jié)中以對抗感染。
因此，A-1-PI可令人信服地用于治療疾病，在該疾病中抑制劑和蛋白酶尤其是嗜中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶之間的不平衡是疾病狀況發(fā)展的原因。A-1-PI也具有抗病毒活性。根據(jù)這些，可邏輯地推斷本發(fā)明可用于產(chǎn)生A-1-PI，該A-1-PI在肺的永遠(yuǎn)變化的環(huán)境中是安全、有效和有力的。
重構(gòu)的A-1-PI肽可施用于如下患者，該患者選自患有先天性α-1-抗胰蛋白酶不足和肺氣腫的患者、患有囊性纖維化的患者和患有肺纖維化的患者。優(yōu)選地，患者是人患者。
A-1-PI已進行了克隆和測序，且在SEQ ID NO21和SEQ ID NO22中提出(分別為圖68A和68B)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，A-1-PI的天然和加工的變體是存在的，且包含于本發(fā)明中。作為例子，美國專利No.5,723,316描述了在位置356-361具有氨基酸替代并進一步包含約3個氨基酸的N-末端延伸的A-1-PI衍生物。美國專利No.5,674,708描述了在一級氨基酸序列的位置358具有氨基酸替代的A-1-PI類似物。技術(shù)人員將易于認(rèn)識到本發(fā)明包含已知的和要發(fā)現(xiàn)的A-1-PI變體、衍生物和突變體。
根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的重構(gòu)的A-1-PI的表達和活性確定方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，且描述于如美國專利No.5,674,708和美國專利No.5,723,316中。簡言之，生物學(xué)活性可通過測量胰凝乳蛋白酶催化的底物N-suc-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide(0.1ml的90％DMSO中的10mM溶液)的水解的抑制而用對胰凝乳蛋白酶活性的測定法確定，如描述于DelMar等人(1979，Anal.Biochem.99316)中的。一般的1.0毫升胰凝乳蛋白酶測定物包含100mM Tris-Cl緩沖液，pH8.3，0.005％(v/v)Triton X-100，牛胰凝乳蛋白酶(18kmmol)和本發(fā)明的A-1-PI。使該測定混合物在室溫預(yù)先溫育約5分鐘，加入底物(0.01ml的90％DMSO中的10mM溶液)，且剩余的胰凝乳蛋白酶活性是通過由對硝基酰苯胺釋放導(dǎo)致的在410nm吸收的改變范圍確定的。光吸收的測量是在25℃用安裝了溫控樣品室的分光光度計進行的。
J.葡糖腦苷脂酶在此處描述的本發(fā)明進一步包括修飾葡糖腦苷脂酶的方法。葡糖腦苷脂酶是催化糖脂葡糖腦苷脂水解為葡萄糖和神經(jīng)酰胺的溶酶體糖蛋白酶。葡糖腦苷脂酶的變體是以CerezymeTM和CeredaseTM在商業(yè)上銷售的，且是已批準(zhǔn)的治療高歇病的治療劑。CeredaseTM是具有完全N-連接的結(jié)構(gòu)的葡糖腦苷脂酶的胎盤衍生化形式。CerezymeTM是長度為497個氨基酸且在CHO細(xì)胞中表達的葡糖腦苷脂酶的重組變體。已對Cerezyme的4個N-連接聚糖進行修飾以終止于三甘露糖核心。
葡糖腦苷脂酶目前是在重組哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生的，因此反映了那些細(xì)胞的糖基化模式，通常為嚙齒動物細(xì)胞如中國倉鼠卵巢細(xì)胞或幼倉鼠腎細(xì)胞，該糖基化模式與人的糖基化模式有巨大的不同，從而導(dǎo)致免疫原性和效能喪失等。
重構(gòu)的葡糖腦苷脂酶肽可施用于如下患者，該患者選自患有溶酶體貯積癥的患者、患有葡糖腦苷脂酶不足的患者和患有高歇病的患者。優(yōu)選地，患者是人患者。
葡糖腦苷脂酶的核酸和氨基酸序列在此處以SEQ ID NO23和24提出(分別為圖69A和69B)。然而，如技術(shù)人員所理解的，在此處代表的序列是原型序列，且不限制本發(fā)明。事實上，葡糖腦苷脂酶的變體是眾所周知的且描述于如美國專利No.6,015,703，該專利描述了葡糖腦苷脂酶類似物及其變體的增強的產(chǎn)生。進一步地，美國專利No.6,087,131描述了另外一個葡糖腦苷脂酶變體的克隆和測序。本發(fā)明將包含這些和其他已知的或在將來可發(fā)現(xiàn)的衍生物、變體和突變體。
用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)表達葡糖腦苷脂酶的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，且詳細(xì)描述于如美國專利No.6,015,703中。對根據(jù)本發(fā)明的方法制備的葡糖腦苷脂酶分子的生物學(xué)功效的測定也是本領(lǐng)域中眾所周知的，且用于估計和應(yīng)用葡糖腦苷脂酶治療劑的小鼠高歇病模型描述于如Marshall等人(2002，Mol.Ther.6179)中。
K.TPA本發(fā)明進一步包含重構(gòu)組織型活化因子(TPA)的方法。TPA活化纖溶酶原以形成溶解血纖蛋白的纖溶酶，該血纖蛋白是血栓蛋白質(zhì)底物的主要成分。TPA制劑已發(fā)展為溶栓劑治療中的溶栓劑，該溶栓劑對導(dǎo)致心肌梗死和大腦梗塞的血栓形成的血栓具有高度的選擇性。
進一步地，為了獲得對血纖蛋白的更高親和力和比天然TPA更長的血液半衰期的目的，通過基因工程已產(chǎn)生各種修飾的TPA。TPA是通常極難溶于水的蛋白質(zhì)。特別地，修飾的TPA比天然的TPA更難溶于水，從而使得修飾的TPA的制備非常困難。因而在給予患者時修飾的TPA難以溶于水。然而，修飾的TPA具有各種優(yōu)點，如對血纖蛋白增加的親和力和血液中的更長的半衰期。本發(fā)明的目的是增加修飾的TPA的溶解性。
重構(gòu)的TPA肽可施用于如下患者，該患者選自患有急性心肌梗死的患者和患有急性缺血性發(fā)作的患者。重構(gòu)的TPA肽也可施用于患者以改善急性心肌梗死后的心室功能、減少急性心肌梗死后充血性心力衰竭的發(fā)病率或減少與急性心肌梗死相關(guān)的死亡率。重構(gòu)的TPA肽也可施用于患者以改善急性缺血性發(fā)作后的神經(jīng)學(xué)恢復(fù)或減少急性缺血性發(fā)作后的殘疾和癱瘓的發(fā)病率。優(yōu)選地，患者是人患者。
TPA的核酸和氨基酸序列在此處分別以SEQ ID NO25和SEQ ID NO26提出(分別為圖70A和70B)。如上所述，已構(gòu)建了TPA變體并用于治療應(yīng)用中。例如，美國專利No.5,770,425描述了其中一些或所有血纖蛋白結(jié)構(gòu)域被刪除的TPA變體。進一步地，美國專利No.5,736,134描述了對位置276的氨基酸進行修飾了的TPA。技術(shù)人員利用本發(fā)明的公開內(nèi)容和在此處的介紹將易于理解本發(fā)明包含在此處提出的TPA序列以及精通文獻的技術(shù)人員眾所周知的那些變體。
TPA從編碼TPA的核酸序列中的表達是眾所周知的，且詳細(xì)描述于如美國專利No.5,753,486中。用于確定根據(jù)本發(fā)明的方法制備的TPA分子的生物學(xué)性質(zhì)的測定是本領(lǐng)域中眾所周知的。簡言之，用文中別處公開的方法合成的TPA分子可根據(jù)Carlsen等人(1988，Anal.Biochem.168428)的方法在飽和濃度的纖溶酶原存在時測定其裂解血纖蛋白的能力。體外凝塊裂解測定法用微量離心機分析儀通過濁度測定來測量組織型活化因子的活性。使凝血酶和TPA的混合物離心入血纖蛋白原和纖溶酶原的混合物中以起始凝塊形成和隨后的凝塊溶解。對結(jié)果所得的吸收-時間關(guān)系進行分析以確定測定終點。將TPA變體的活性與TPA的標(biāo)準(zhǔn)曲線進行了比較。在測定過程中所用的緩沖液是含有0.01％(v/v)TWEEN80和0.01％(w/v)疊氮化鈉的0.06M磷酸鈉，pH7.4。人的凝血酶的濃度為約33單位/ml。將血纖蛋白原(2.0mg/ml可成塊的蛋白質(zhì))在濕冰上冷凍以沉淀纖連蛋白，然后進行重力過濾。Glu-纖溶酶原濃度為1mg/ml。分析儀區(qū)室溫度設(shè)為37℃。裝料器設(shè)定為分配20微升TPA(約500納克/毫升～約1.5微克/毫升)作為標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品，或者以可導(dǎo)致在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)裂解的濃度分配20微升TPA變體。用20微升凝血酶作為二級試劑，并用200微升50∶1(v/v)的血纖蛋白原∶纖溶酶原混合物作為一級試劑。吸收/時間程序應(yīng)用5分鐘的溫育時間、340-納米-濾波器和90秒間隔的讀數(shù)。
L.IL-2本發(fā)明進一步包含重構(gòu)和修飾IL-2的方法。IL-2是T淋巴細(xì)胞的主要生長因子且可通過刺激細(xì)胞毒性CD8 T細(xì)胞和NK細(xì)胞增加體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。因此IL-2在對抗腫瘤和病毒感染的防御機制中是關(guān)鍵的。IL-2也用于對抗轉(zhuǎn)移性黑素瘤和腎腺癌的治療中，且已用于許多形式癌癥的臨床試驗中。進一步地，IL-2也已用于HIV感染的患者中，在其中它導(dǎo)致CD4數(shù)目的顯著增加。
由于IL-2在處理和治療危害生命的疾病如各種癌癥和AIDS中的成功，那么本發(fā)明的方法對于發(fā)展如下IL-2分子是有用的，該IL-2分子具有更長的生物學(xué)半衰期、增加的能力及通常與在健康人中合成分泌的野生型IL-2更類似的治療性質(zhì)。
重構(gòu)的IL-2肽可施用于如下患者，該患者選自患有轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌的患者、患有轉(zhuǎn)移性黑素瘤的患者、患有卵巢癌的患者、患有急性髓細(xì)胞性白血病(AML)的患者、患有非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的患者、感染了HIV的患者和感染了丙型肝炎的患者。重構(gòu)的IL-2肽也可施用于患者作為癌疫苗佐劑。優(yōu)選地，患者是人患者。
IL-2已進行了克隆和測序，且核酸和氨基酸序列在此處以SEQ ID NO27和SEQ ID NO28提出(分別為圖71A和71B)。本發(fā)明決不應(yīng)解釋為局限于在此處提出的IL-2核酸和氨基酸序列。IL-2的變體描述于如美國專利No.6,348,193中，其中位置88的天冬酰胺由精氨酸替代，及美國專利No.5,206,344中，其中描述了包含具有各種氨基酸替代的IL-2變體的多聚體。本發(fā)明包含這些和本領(lǐng)域中眾所周知的其他IL-2變體。
IL-2的表達和活性確定的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，且描述于如美國專利No.5,417,970中。簡言之，IL-2或其變體的表達可在各種原核生物和真核生物系統(tǒng)中實現(xiàn)，包括大腸桿菌、CHO細(xì)胞、BHK細(xì)胞、應(yīng)用桿狀病毒表達系統(tǒng)的昆蟲細(xì)胞，它們?nèi)渴潜绢I(lǐng)域中眾所周知的。
對根據(jù)本發(fā)明的方法制備的修飾的IL-2的活性的測定可進行如下。通過描述于如A.Boyum等人(Methods in Enzymology，1984，108卷，88頁，Academic Press，Inc.)的方法在Ficoll-Hypaque(Pharmacia，Piscataway，NJ)梯度上離心以從紅細(xì)胞和粒細(xì)胞分離外周血淋巴細(xì)胞。隨后在培養(yǎng)基中將淋巴細(xì)胞洗滌約3次，該培養(yǎng)基由RPMI 1640(Gibco-BRL，La Jolla，CA)和加熱(于56℃進行1小時)失活的10％AB人血清(CTS Purpan，Toulouse，法國)、2mM丙酮酸鈉、5mM HEPES、4mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素和0.25μg/ml兩性霉素組成(完全培養(yǎng)基)。通過附著到塑料上而將粘著細(xì)胞(單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)去除，將剩余的細(xì)胞以每毫升約5～10×105細(xì)胞的濃度重懸于完全培養(yǎng)基中并以每平方厘米約1-2×105細(xì)胞的密度接種于培養(yǎng)瓶中。然后使瓶在5％CO2中于37℃溫育約1小時，其后在輕輕攪動培養(yǎng)瓶后通過吸引術(shù)回收非附著的淋巴細(xì)胞。
將非附著的淋巴細(xì)胞洗滌一次，并以每毫升約105細(xì)胞的濃度在本發(fā)明的IL-2存在時在完全培養(yǎng)基上于如上所述的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約48小時。然后將細(xì)胞洗滌一次。
細(xì)胞的細(xì)胞毒性活性是在與抗NK細(xì)胞細(xì)胞毒性的人T淋巴樣細(xì)胞系C8166-45/C63(HT1細(xì)胞)的目標(biāo)細(xì)胞接觸約4小時后估計的，如由Salahuddin等人(1983，Virology 12951-64；1984，Science 223703-707)所描述的。使6×105個HT1細(xì)胞于37℃在無血清的完全培養(yǎng)基中用約200μCi的51Cr(鉻酸鈉，Amersham，Arlington Heights，IL)放射性標(biāo)記約1小時，然后洗滌幾次。使目標(biāo)細(xì)胞和有效細(xì)胞以不同的有效細(xì)胞對目標(biāo)細(xì)胞的比例(50∶1、10∶1、1∶1)在圓底的微量滴定板上進行分配。將微量滴定板離心，并在如上所述的溫育之后，從每一個孔回收上清液并用γ計數(shù)器測量放射性。細(xì)胞毒性是從由死亡目標(biāo)細(xì)胞釋放的51Cr量確定的。非特異性的細(xì)胞毒性是從在不存在有效細(xì)胞時從目標(biāo)細(xì)胞中自發(fā)釋放的放射性量確定的。
本發(fā)明的方法僅是用于本領(lǐng)域中眾所周知的測量效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性的許多方法中的一個，且不應(yīng)該解釋為限制本發(fā)明。
M.凝血因子VIII本發(fā)明進一步包含重構(gòu)和修飾凝血因子VIII的方法。如在前文對凝血因子VII和凝血因子IX所描述的，凝血因子VIII是血液凝結(jié)途徑中的一個關(guān)鍵成分。人凝血因子VIII(抗血友病因子；FVIIIC)是由兩個肽(分子量為80kDa的輕鏈和分子量依賴于糖基化狀態(tài)在90～220kDa的重鏈)組成的人血漿蛋白質(zhì)。它是凝結(jié)途徑中基本的輔因子且是凝血因子X向其活性形式(凝血因子Xa)轉(zhuǎn)變所必需的。凝血因子VIII在血漿中作為與馮·維勒布蘭德(Von willibrand)因子的非共價復(fù)合物(akaVIIIRP)循環(huán)，該馮·維勒布蘭德因子為2050個aa的肽(參見美國專利No.6,307,032)。低于正常值的20％的凝血因子VIII血液濃度導(dǎo)致稱為血友病A的流血性疾病。低于1％的凝血因子VIII血液水平導(dǎo)致嚴(yán)重的流血性病癥，其中自發(fā)的關(guān)節(jié)流血是最常見的癥狀。
與其他血液凝結(jié)因子類似，凝血因子VIII是對各種流血性病癥如血友病A和血友病B的治療具有巨大潛力的治療劑。由于重鏈的糖基化，從重組細(xì)胞中制備凝血因子VIII的現(xiàn)有方法導(dǎo)致不如天然凝血因子VIII有效的產(chǎn)物。從人血漿的純化方法導(dǎo)致較不有效且比重組凝血因子VIII更難制備的粗組合物。本發(fā)明尋求改善該狀況。
重構(gòu)的凝血因子VIII肽可施用于如下患者，該患者選自患有維勒布蘭德病的患者、患有A型血友病的患者、患有凝血因子VIIIC不足的患者、患有血纖蛋白原不足的患者、患有凝血因子XIII不足的患者和具有獲得的凝血因子VIII抑制劑(獲得性血友病)的患者。重構(gòu)的凝血因子VIII肽也可施用于患者以預(yù)防、治療或控制流血或出血發(fā)作。優(yōu)選地，患者是人患者。
凝血因子VIII的核酸和氨基酸序列在此處分別以SEQ ID NO29和SEQ ID NO30提出(分別為圖72A和72B)。各種凝血因子VIII在本領(lǐng)域中是普遍的，如描述于美國專利No.5,668,108中的，其中位置1241的天冬氨酸由谷氨酸替代，且伴隨著核酸的同樣變化。美國專利No.5,149,637描述了包含糖基化的或非糖基化的C-末端片段的凝血因子VIII變體，且美國專利No.5,661,008描述了包含與氨基酸1649～2332通過至少3個氨基酸殘基連接的氨基酸1-740的凝血因子VIII變體。因此，凝血因子VIII的變體、衍生物、修飾物和復(fù)合物是本領(lǐng)域中眾所周知的并包含于本發(fā)明中。
產(chǎn)生凝血因子VIII的表達系統(tǒng)是本領(lǐng)域中眾所周知的，且包括原核和真核細(xì)胞，如在美國專利No.5,633,150、5,804,420和5,422,250中所示例的。
為了確定根據(jù)本發(fā)明的方法合成的凝血因子VIII分子的生物學(xué)活性，技術(shù)人員將認(rèn)識到在此處描述的用于估計凝血因子VII和凝血因子IX的測定可應(yīng)用于凝血因子VIII。
N.尿激酶本發(fā)明也包括重構(gòu)和/或修飾尿激酶的方法。尿激酶是將纖溶酶原活化為纖溶酶的絲氨酸蛋白酶。該蛋白質(zhì)是在各種組織中合成的，包括內(nèi)皮和腎，且以痕量排泄到尿中。純化的尿激酶以兩種活性形式存在，即高分子量的形式(HUK；約50kDa)和低分子量的形式(LUK；約30kDa)。已顯示LUK源自HUK，其通過在賴氨酸135后的蛋白水解，從而從HUK中釋放前135個氨基酸。一般認(rèn)為HUK或LUK必須通過在賴氨酸158和異亮氨酸159之間對稱為尿激酶原的單鏈前體進行蛋白水解以生成兩鏈的活性形式(該形式繼續(xù)相應(yīng)于HUK或LUK)而轉(zhuǎn)變?yōu)榈鞍姿饣钚缘男问?。從該蛋白水解修剪中得到的蛋白水解活性的尿激酶種類含有通過單個二硫鍵連接在一起的兩個氨基酸鏈。通過活化修剪形成的該兩個鏈稱為A或A1鏈(分別為HUK或LUK)，和包含分子的蛋白酶結(jié)構(gòu)域的B鏈。
已顯示尿激酶是有效的溶栓劑。然而，由于它天然地是以痕量產(chǎn)生的，所以有效劑量的酶的成本是高的。尿激酶已在重組細(xì)胞培養(yǎng)物中生產(chǎn)，且編碼尿激酶的DNA以及適當(dāng)?shù)妮d體和宿主微生物都是已知的?，F(xiàn)有的包含尿激酶的組合物及重組生產(chǎn)尿激酶的方法受具有缺陷的糖基化模式的產(chǎn)物的阻礙，且由于在尿激酶活化時有復(fù)雜的蛋白水解切割事件，該異常的糖基化導(dǎo)致低效的和低能力的產(chǎn)物。
重構(gòu)的尿激酶肽可施用于如下患者，該患者選自患有栓塞的患者、患有急性肺動脈大塊栓塞的患者和患有冠狀動脈血栓形成的患者。優(yōu)選地，患者是人患者。重構(gòu)的尿激酶肽也可用于恢復(fù)靜脈內(nèi)導(dǎo)管的開放，包括由凝結(jié)的血或血纖蛋白堵塞的中央靜脈導(dǎo)管。
編碼尿激酶一級氨基酸鏈的核苷酸序列描述于SEQ ID NO33和SEQID NO34中(分別為圖73A和73B)。尿激酶的變體是本領(lǐng)域中眾所周知的，因此本發(fā)明不局限于在此處提出的序列。事實上，技術(shù)人員易于認(rèn)識到在美國專利No.5,219,569、5,648,253和4,892,826中描述的尿激酶變體作為有功能的部分存在，且因此包含于本發(fā)明中。
對根據(jù)本發(fā)明的方法制備的尿激酶分子的表達和估計也是本領(lǐng)域中眾所周知的。作為非限制性的例子，尿激酶在各種系統(tǒng)中的表達詳細(xì)描述于美國專利No.5,219,569中。確定根據(jù)在此處提供的方法制備的尿激酶的活性和功能性的測定法在該文獻中有描述，且與在別處描述的其他纖溶酶原和血纖蛋白相關(guān)的測定類似。一個確定在此處所述的方法合成的尿激酶分子的活性的測定法描述于如Ploug等人(1957，Biochim.Biophys.Acta 24278-282)中，該測定法應(yīng)用包含1.25％瓊脂糖、4.1mg/ml人纖溶酶原、0.3單位/ml凝血酶和0.5μg/ml大豆胰蛋白酶抑制劑的血纖蛋白平板。
O.人DNase本發(fā)明進一步包含重構(gòu)和/或修飾重組人DNase的方法。人DNase I已驗證為治療劑且顯示可在體外減少囊性纖維化粘液的粘度。已確定的是化膿性的粘液含有約10-13mg/ml的DNA，即影響呼吸道流體的流變學(xué)性質(zhì)的離子聚合物。因此，可降解DNA的酶牛胰DNase I在多年前即驗證為粘液溶解劑，但未進入臨床實踐，這是因為由抗原性和/或污染的蛋白酶導(dǎo)致的副作用。目前重組人DNase可用作治療劑以減輕如囊性纖維化疾病的癥狀。
重構(gòu)的rDNase肽可施用于患有囊性纖維化的患者。重構(gòu)的rDNase肽也可施用于囊性纖維化患者以改善肺功能。優(yōu)選地，患者是人患者。
與源自牛來源的DNase類似，重組人DNase也引起了一些問題，大多數(shù)是由于降低的功效，這歸因于由目前所用的哺乳動物表達系統(tǒng)導(dǎo)致的不適當(dāng)?shù)奶腔?。本發(fā)明描述了重構(gòu)DNase的方法，該方法可導(dǎo)致增加的功效和更好的治療結(jié)果。
人DNase的核苷酸和氨基酸序列在此處以SEQ ID NO39和SEQ ID NO40提出(分別為圖74A和74B)。包含DNase的肽變體是本領(lǐng)域中眾所周知的。作為例子，美國專利No.6,348,343描述了在整個一級結(jié)構(gòu)中具有多個氨基酸替代的人DNase。此外，美國專利No.6,391,607描述了在位置9、14、74、75和205具有多個氨基酸替代的極度活躍的DNase變體。本實施例和其他本領(lǐng)域中眾所周知的或?qū)砜砂l(fā)現(xiàn)的均包含于本發(fā)明中。
產(chǎn)生DNase肽的表達系統(tǒng)是技術(shù)人員眾所周知的，且已描述于原核生物和真核生物系統(tǒng)中。例如，PCT專利出版物No.WO 90/07572相當(dāng)詳細(xì)地描述了這些方法。
確定根據(jù)本發(fā)明的方法發(fā)展的DNase分子的生物學(xué)活性的測定法是本領(lǐng)域中眾所周知的。作為例子，但決不意味著限制本發(fā)明，在此處提供了確定人DNase I的DNA-水解活性的測定法。簡言之，應(yīng)用了兩個不同的質(zhì)粒消化測定法。第一個測定法(“超螺旋DNA消化測定法”)測量超螺旋雙鏈質(zhì)粒DNA向松弛的(具缺口的)、線性的和降解的形式的轉(zhuǎn)變。第二個測定法(“線性DNA消化測定法”)測量線性雙鏈質(zhì)粒DNA向降解的形式的轉(zhuǎn)變。特定地，將根據(jù)本發(fā)明的方法制備的DNase加入到160微升溶液中，該溶液包含每毫升25微克的在25mM HEPES(pH7.1)中的超螺旋質(zhì)粒DNA或EcoR I-消化的線性化的質(zhì)粒DNA、100μg/ml牛血清白蛋白、1mM MgCl2、2.5mM CaCl2、150mM NaCl，且將樣品在室溫進行溫育。在各個時間獲取等份試樣的反應(yīng)混合物并通過添加25mM EDTA及二甲苯腈藍(lán)、溴酚藍(lán)和甘油而終止反應(yīng)。終止的樣品中質(zhì)粒DNA的完整性可通過將樣品在瓊脂糖凝膠上進行電泳而分析。在電泳后，將凝膠用溴化乙錠染色，并通過紫外線使凝膠中的DNA顯現(xiàn)。質(zhì)粒DNA中超螺旋的、松弛的和線性形式的相對量是通過用熒光圖象儀(如MolecularDynamics Model 575 FluorImager)掃描凝膠并對凝膠上相應(yīng)于不同形式的條帶中的DNA進行定量而確定的。
P.胰島素本發(fā)明進一步包括重構(gòu)胰島素的方法。胰島素是眾所周知的對I型糖尿病的最有效的治療藥品，在I型糖尿病中胰臟的β胰島細(xì)胞不產(chǎn)生用于調(diào)節(jié)血液葡萄糖水平的胰島素。糖尿病和失控的血液葡萄糖的后果包括循環(huán)和足部問題，和失明，以及各種其他由糖尿病導(dǎo)致的或由糖尿病惡化的并發(fā)癥。
在對人胰島素進行克隆和測序之前，將豬胰島素用作糖尿病的治療藥物。目前胰島素是重組生產(chǎn)的，但是成熟分子的51個氨基酸短序列是包含多個二硫鍵的復(fù)雜結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)有重組生產(chǎn)胰島素的方法導(dǎo)致與在健康的非胰島素被試者中產(chǎn)生的天然蛋白質(zhì)缺乏相似性的產(chǎn)物。本發(fā)明尋求彌補該缺點。
重構(gòu)的胰島素肽可施用于如下患者，該患者選自患有I型糖尿病(糖尿病)的患者和患有2型糖尿病而需要基礎(chǔ)(長期作用的)胰島素以控制高血糖的患者。重構(gòu)的胰島素肽也可施用于糖尿病患者以控制高血糖。優(yōu)選地，患者是人患者。
人胰島素的核苷酸和氨基酸序列分別在SEQ ID NO43和SEQ ID NO44中描述(分別為圖75A和75B)。胰島素變體在本領(lǐng)域中是大量的。美國專利No.6,337,194描述了胰島素融合蛋白質(zhì)類似物，美國專利No.6,323,311描述了包含二羧酸的環(huán)狀酐的胰島素衍生物，且美國專利No.6,251,856描述了包含多個氨基酸替代和親脂基團的胰島素衍生物。技術(shù)人員將認(rèn)識到下面胰島素衍生物的例子決不是排他性的，僅僅代表了那些本領(lǐng)域中眾所周知的一個小部分。因此，本發(fā)明包含已知或?qū)l(fā)現(xiàn)的胰島素衍生物。
用于產(chǎn)生胰島素的表達系統(tǒng)是本領(lǐng)域中眾所周知的，且可用分子生物學(xué)技術(shù)來實現(xiàn)，如描述于Sambrook等人(1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York)中的。
用于確定根據(jù)本發(fā)明的方法制備的胰島素分子的功能性的測定法也是本領(lǐng)域中眾所周知的。例如，一個葡萄糖抑制的體外模型可用于估計用本發(fā)明的方法合成的胰島素的生物學(xué)活性。可用于該目的的是大鼠模型。在實驗前使動物禁食過夜(16個小時)，然后用腹膜內(nèi)給予戊巴比妥鈉或其他適當(dāng)?shù)穆樽韯┤缏劝吠M行麻醉。每一個動物接受特定胰島素衍生物(20μg/ml/kg)的靜脈內(nèi)注射(尾部靜脈)。在注射前15和5分鐘及注射后15、30、60、90、120、180和240分鐘從頸靜脈獲取血液樣品。血液葡萄糖水平是用血液葡萄糖監(jiān)控器測量的，該監(jiān)控器可購自各個商業(yè)供應(yīng)商。
Q.乙型肝炎疫苗(HBsAg)本發(fā)明進一步包含重構(gòu)用于乙型肝炎疫苗的抗原(HbsAg或乙型肝炎表面抗原)的方法。HBsAg是重組生產(chǎn)的乙型肝炎S-蛋白質(zhì)的表面抗原，并用于引起對乙型肝炎病毒的免疫反應(yīng)，該病毒是日益危險的病毒，可導(dǎo)致肝疾病如肝硬變和癌等，并導(dǎo)致全世界每年超過1百萬的死亡。目前HBsAg疫苗在6個月的時間間隔給予3次以引起保護性和中和性的免疫反應(yīng)。
目前HBsAg是在酵母品系中產(chǎn)生的，因此反映了真菌天然的糖基化模式。本發(fā)明提供了重構(gòu)HBsAg的方法，該方法還導(dǎo)致改善的免疫原性、具有改善的對病毒的親和力的抗體等。
重構(gòu)的HBsAg肽可施用于患者，以對患者進行抗由乙型肝炎病毒引起的疾病的免疫接種。重構(gòu)的HBsAg肽也可施用于透析前(predialysis)或透析患者，以對患者進行抗由乙型肝炎病毒引起的疾病的免疫接種。優(yōu)選地，患者是人患者。
來自乙型肝炎病毒S-蛋白質(zhì)(HBsAg)的核酸和一級氨基酸鏈的序列在此處以SEQ ID NO45和SEQ ID NO46提出(分別為圖76A和76B)。核苷酸長度為1203個堿基。氨基酸為400個殘基長。最后226個氨基酸殘基是小S-抗原，該抗原可用于GlaxoSmithKline疫苗和Merck疫苗。小S-抗原上游的55個氨基酸是Pre-S起始密碼子。該Pre-S加S區(qū)域是中S-抗原，該抗原可用于Aventis Pasteur疫苗。從第一個密碼子到Pre-S的起始密碼子之間包含S-蛋白質(zhì)的其余部分，且稱為大S-蛋白質(zhì)。這僅是用于疫苗中的HBsAg的一個例子，且其他亞型是眾所周知的，如由GenBank Acc No.AF415222、AF415221、AF415220和AF415219所示例的。在此處提出的序列僅是本領(lǐng)域中公知的HBsAg的例子。類似的抗原已從乙型肝炎病毒的其他品系分離，且已對其作為疫苗候選物的抗原性和潛力做了或未做估計。因此本發(fā)明包含已知或?qū)l(fā)現(xiàn)的乙型肝炎病毒疫苗S-蛋白質(zhì)表面抗原。
HBsAg在表達系統(tǒng)中的表達對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是常規(guī)程序，且描述于如美國專利No.5,851,823中。對疫苗免疫原性的測定是本領(lǐng)域中眾所周知的，且包含產(chǎn)生中和抗體的各種測定，并應(yīng)用如ELISA、中和測定、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀等技術(shù)。簡言之，描述了用于探測有效的抗-HBsAg抗體的夾心式ELISA。Enzygnost HBsAg測定(AventisBehring，King of Prussia，PA)可用于這種方法中。將孔用抗-HB覆蓋。將血清血漿或純化的蛋白質(zhì)和適當(dāng)?shù)膶φ仗砑拥娇字胁⑦M行溫育。洗滌后，使抗HBsAg的過氧化物酶標(biāo)記的抗體與剩余的抗原決定簇反應(yīng)。通過洗滌去除未結(jié)合的酶聯(lián)抗體，且固相上的酶活性是由本領(lǐng)域中眾所周知的方法確定的。對過氧化氫和色素原的酶催化的反應(yīng)是通過加入稀釋的硫酸而終止的。顏色強度與樣品中HBsAg的濃度成比例，且是通過對未知樣品的顏色強度與伴隨的負(fù)對照和正對照血清的顏色強度的光度比較而獲得的。
R.人生長激素本發(fā)明進一步包含重構(gòu)人生長激素(HGH)的方法。在人的垂體中分泌的HGH同種型由191個氨基酸組成并具有約21,500的分子量。在胎盤中制備的HGH同種型是糖基化的形式。HGH參與正常人生長和發(fā)育的許多調(diào)節(jié)，包括線性生長(體質(zhì)發(fā)生)、泌乳、巨噬細(xì)胞活化和胰島素樣及致糖尿作用等。
HGH是復(fù)雜的激素，且其作用作為與各種細(xì)胞受體的相互作用的結(jié)果而有變化。盡管包含HGH的組合物已用于臨床情況下，尤其是治療侏儒癥中，但其功效受到重組產(chǎn)生的HGH中不存在糖基化的限制。
重構(gòu)的HGH肽可施用于如下患者，該患者選自患有生長激素不足的患者、患有特納綜合征的患者、患有由于缺乏足夠的內(nèi)源生長激素分泌而生長不足的患者、患有由于普-韋綜合征(PWS)而生長不足的患者、患有與慢性腎機能不全相關(guān)的生長不足的患者和患有AIDS相關(guān)的消瘦或惡病質(zhì)的患者。重構(gòu)的HGH肽也可施用于身材小的患者。優(yōu)選地，患者是人患者。
HGH的核酸和氨基酸序列在此處以SEQ ID NO47和SEQ ID NO48提出(分別為圖77A和77B)。技術(shù)人員將認(rèn)識到HGH的變體、衍生物和突變體是眾所周知的。例子可發(fā)現(xiàn)于美國專利No.6,143,523中，其中位置10、14、18、21、167、171、174、176和179的氨基酸殘基是替代的，及發(fā)現(xiàn)于美國專利No.5,962,411中，該專利描述了HGH的剪接變體。本發(fā)明包含這些本領(lǐng)域中公知的HGH變體和將發(fā)現(xiàn)的變體。
在重組細(xì)胞中表達HGH的方法描述于如美國專利No.5,795,745中。除其他因素之外，在原核生物、真核生物、昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)、植物和體外翻譯系統(tǒng)中表達HGH的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的。
用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的HGH分子可用技術(shù)人員公知的各種方法進行活性測定。例如，美國專利No.5,734,024描述了確定表達的HGH的生物學(xué)功能的方法。
S.抗凝血酶III抗凝血酶(抗凝血酶III，AT-III)是血液中凝結(jié)級聯(lián)的有力抑制劑。它是抑制凝血酶以及其他前凝血劑因子(procoagulant factor)(如凝血因子Xa)的非維生素K依賴性蛋白酶。先天性抗凝血酶III不足是常染色體顯性病征，其中個體遺傳了一個拷貝的缺陷基因。該狀況導(dǎo)致增加的靜脈和動脈血栓形成的風(fēng)險，臨床表現(xiàn)的發(fā)作一般出現(xiàn)于年輕成人期。個體遺傳兩個缺陷基因的嚴(yán)重先天性抗凝血酶III不足是與增加的血栓形成相關(guān)的常染色體隱性狀況，一般在幼年時顯著。獲得性抗凝血酶III不足最常見于凝結(jié)系統(tǒng)不正確活化的情形中。導(dǎo)致獲得性抗凝血酶III不足的一般狀況包括彌散性血管內(nèi)凝血、由于內(nèi)皮損傷的微血管病性溶血性貧血(即溶血性尿毒性綜合征)和見于進行骨髓移植的患者中的靜脈閉塞性病(VOD)。AT-III不足可通過輸注AT-III濃縮物進行短期矯正。
重構(gòu)的AT-III肽可施用于如下患者，該患者選自患有與外科或產(chǎn)科手術(shù)相關(guān)的遺傳性AT-III不足的患者和患有血栓栓塞的遺傳性AT-III不足患者。優(yōu)選地，患者是人患者。
抗凝血酶III(AT-III)是分子量為58,000的α2-糖蛋白。它以Thrombate IIITM進行商業(yè)銷售(Bayer Corp.，West Haven，CT)。人抗凝血酶III的核酸和氨基酸序列分別示于圖78A(SEQ ID NO63)和78B(SEQ ID NO64)中。
制備抗凝血酶III的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。例如，人抗凝血酶III(參見美國專利No.4,517,294)和人抗凝血酶III的突變型(參見美國專利No.5,420,252、5,618,713、5,700,663)的公布的核酸和氨基酸序列是可獲得的。本發(fā)明的方法可應(yīng)用任何這些氨基酸序列及任何其編碼序列，但不局限于這些序列。產(chǎn)生重組抗凝血酶III的示例性方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，且?guī)追N方法描述于美國專利No.5,420,252、5,843,705、6,441,145和5,994,628中。純化重組抗凝血酶III的示例性方法描述于美國專利No.5,989,593、6,268,487、6,395,888、6,395,881、6,451,978和6,518,406中。
重組抗凝血酶III有許多公知的用途?？鼓窱II可被用作外科手術(shù)中的抗凝劑(美國專利No.5,252,557、5,182,259)、作為抑制血栓形成的藥物制劑或方法的部分(美國專利No.5,565,471、6,001,820)以及減少細(xì)胞移植的有害副作用(美國專利No.6,387,366)。此外，抗凝血酶III制劑可用于增加胎盤血流(美國專利No.5,888,964)、抑制受精(美國專利No.5,545,615)、治療哮喘(美國專利No.6,355,626)和治療關(guān)節(jié)炎(美國專利No.5,252,557)和其他炎癥(美國專利No.6,399,572)?？鼓窱II也可用于制造替換血漿(美國專利No.4,900,720)或制備用于輸血的穩(wěn)定細(xì)胞血液產(chǎn)品(美國專利No.6,139,878)。抗凝血酶III可以作為藥物制劑施用(美國專利No.5,084,273、5,866,122、6,399,572、6,156,731和6,514,940)或應(yīng)用基因治療方法施用(美國專利No.6,410,015)。包含抗凝血酶III的組合物可用作組織粘合劑(美國專利No.6,500,427)或引入到患者中的醫(yī)療設(shè)備的潤滑劑(美國專利No.6,391,832)?？鼓窱II通常也可用于包被血管內(nèi)支架(美國專利No.6,355,055、6,240,616、5,985,307、5,685,847和5,222,971)、眼植入物(美國專利No.5,944,753)和假器官(美國專利No.6,503,556、6,491,965和6,451,373)。抗凝血酶III也可用于定位患者中內(nèi)部流血位點(美國專利No.6,314,314)和確定患者中止血機能障礙(美國專利No.6,429,017)的方法中。
T.人絨毛膜促性腺激素人絨毛膜促性腺激素(hCG)是由α亞基和β亞基組成的糖蛋白。HCG與另外兩個促性腺激素黃體生成素(LH)和促卵泡激素(FSH)以及促甲狀腺激素(TSH)密切相關(guān)，所有該三種激素均是糖蛋白激素。這些不同糖蛋白激素的α亞基在結(jié)構(gòu)上非常相似，但β亞基在氨基酸序列上不同。
人絨毛膜促性腺激素α亞基的核酸和氨基酸序列分別示于圖79A(SEQ ID NO69)和79B(SEQ ID NO70)中。人絨毛膜促性腺激素β亞基的核酸和氨基酸序列分別示于圖79C(SEQ ID NO71)和79D(SEQ IDNO72)中。
人絨毛膜促性腺激素用于不育治療中以促進不能自己排卵的女性排卵或從卵巢中釋放卵子。人絨毛膜促性腺激素也施用于年輕男性以治療未降到陰囊的或發(fā)育不全的睪丸。它用于男性中刺激睪酮的產(chǎn)生。一些醫(yī)生也給患有缺乏性欲的勃起機能障礙的患者和對男性“絕經(jīng)期”的治療開具人絨毛膜促性腺激素處方。
重構(gòu)的hCG肽可施用于如下患者，該患者選自進行輔助生殖技術(shù)(ART)的患者、進行體外受精(IVF)的患者、進行胚胎移植的患者、不育患者、患有不是由于解剖學(xué)阻塞的青春前期隱睪癥的男性患者和患有低促性腺素功能減退癥的男性患者。也可在不育女性患者中施用重構(gòu)的hCG肽以誘導(dǎo)最終的卵泡成熟，其中該不育女性患者已進行了垂體脫敏和用促卵泡激素進行了預(yù)治療。也可在不排卵不育患者中施用重構(gòu)的hCG肽以誘導(dǎo)排卵和懷孕。優(yōu)選地，患者是人患者。
制備人絨毛膜促性腺激素的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。異二聚體hCG可在目前用于工業(yè)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的許多表達系統(tǒng)中的任何一種中進行重組制備。一種制備重組hCG的方法描述于美國專利No.5,639,639中。通過在相同細(xì)胞中表達兩個亞基制備重組異二聚體蛋白質(zhì)的方法通常是本領(lǐng)域中眾所周知的，且?guī)追N方法描述于美國專利No.5,643,745(在絲狀真菌中表達)、5,985,611和6,087,129(在分泌細(xì)胞中表達)。可選擇地，每一個亞基可單獨在細(xì)胞中表達，且以后在體外將兩個亞基置于一起以裝配成異二聚體。
應(yīng)用人絨毛膜促性腺激素的方法非常多且是本領(lǐng)域中眾所周知的。通常，hCG用于誘導(dǎo)哺乳動物排卵或使哺乳動物排卵同步化(參見美國專利No.6,489,288、5,589,457、5,532,155、4,196,123、4,062,942和4,845,077)。此外，hCG可用于懷孕試驗中，特別是基于凝集的試驗中(參見美國專利No.3,991,175、4,003,988、4,071,314和4,088,749)。hCG也可用于避孕藥疫苗中(參見美國專利No.4,161,519和4,966,888)。此外，hCG可用于治療與年老和改變的激素平衡相關(guān)的狀況如良性前列腺肥大(參見美國專利No.5,610,136)和常見于老年人中的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(參見美國專利No.4,791,099)。
可選擇地，hCG可用于探測和治療表達hCG或其一個亞基的癌。表達hCG的腫瘤包括，但不局限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌和胃癌，以及成神經(jīng)細(xì)胞瘤如卡波西肉瘤?？梢援a(chǎn)生抗hCG的抗體，該hCG已進行糖重構(gòu)從而具有與在腫瘤表達的hCG上發(fā)現(xiàn)的聚糖相似的聚糖結(jié)構(gòu)，且這些抗體可用于根據(jù)本領(lǐng)域中眾所周知的方法在患者中探測表達hCG的腫瘤(參見美國專利No.4,311,688、4,478,815和4,323,546)。此外，重構(gòu)的hCG可用于引起對表達hCG的腫瘤的免疫反應(yīng)(參見美國專利No.5,677,275、5,762,931、5,877,148、4,970,071和4,966,753)。
hCG也可用于通常對動物進行免疫調(diào)制的方法中，如描述于美國專利No.5,554,595、5,851,997和5,700,781中的方法。此外，hCG可在從這種治療中獲益的狀況中用作基質(zhì)金屬蛋白酶的抑制劑，該狀況如慢性炎癥、多發(fā)性硬化和依賴血管發(fā)生的疾病(參見美國專利No.6,444,639)。
U.α-艾杜糖苷酶α-艾杜糖苷酶以AldurazymeTM進行商業(yè)銷售(BioMarin andGenzyme)。它用于MPS I(一種溶酶體貯積癥)的替代治療。MPS I(也稱為胡爾勒病)是由α-L-艾杜糖苷酶不足導(dǎo)致的遺傳疾病，該酶通常是某些稱為糖胺聚糖(GAG)的復(fù)合糖分解所必需的。如果酶不以足夠的量存在，那么GAG的正常分解是不完全的或被阻斷的。從而細(xì)胞不能排出糖殘基，于是它們在細(xì)胞的溶酶體中累積并導(dǎo)致MPS I。
重構(gòu)的α-艾杜糖苷酶肽可施用于如下患者，該患者選自患有溶酶體貯積癥的患者、患有α-L-艾杜糖苷酶不足的患者、患有粘多糖貯積癥I(MPS I)的患者和患有胡爾勒病的患者。優(yōu)選地，患者是人患者。
生產(chǎn)和純化α-艾杜糖苷酶的方法以及治療某些遺傳病征的方法描述于美國專利No.6,426,208中，該遺傳病征包括α-L-艾杜糖苷酶不足和粘多糖貯積癥I(MPS I)。人類α-艾杜糖苷酶的核酸和氨基酸序列分別見于圖80A(SEQ ID NO65)和80B(SEQ ID NO66)中。
V.α-半乳糖苷酶Aα-半乳糖苷酶A(也稱為agalsidaseβ)以FabrazymeTM進行商業(yè)銷售(Genzyme)。α-半乳糖苷酶A用于治療法布里病。法布里病是由關(guān)鍵的α-半乳糖苷酶A不足導(dǎo)致的罕見遺傳病征。沒有該酶時，法布里患者不能分解其體內(nèi)稱為globotriasylceramide(GL-3)的脂肪酸物質(zhì)，該物質(zhì)在心、腎、腦和其他關(guān)鍵器官血管中的細(xì)胞中累積。該物質(zhì)的逐漸累積使患者具有中風(fēng)、心臟病發(fā)作、腎損傷和debilitating pain的風(fēng)險。許多患者在成人期發(fā)展為腎衰竭，且嚴(yán)重的器官并發(fā)癥在約四十歲時導(dǎo)致死亡。
重構(gòu)的α-半乳糖苷酶A肽可施用于如下患者，該患者選自患有溶酶體貯積癥的患者、患有α-半乳糖苷酶A不足的患者和患有法布里病的患者。優(yōu)選地，患者是人患者。
α-半乳糖苷酶A是水解globotriaosylceramide和相關(guān)具有末端α-半乳糖苷酶鍵的糖脂的溶酶體酶。它是在X染色體長臂上編碼的45kDa的N-糖基化蛋白質(zhì)。在人成纖維細(xì)胞或Chang肝細(xì)胞中合成的初始糖基化形式(Mr＝55,000～58,000)被加工成成熟糖基化形式(Mr＝50,000)。從人組織和血漿中純化的成熟活性酶是同二聚體(Bishop等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834859-4863)。α-半乳糖苷酶A的核酸和氨基酸序列分別見于圖81A(SEQ ID NO67)和81B(SEQ ID NO68)中。其他有用的α-半乳糖苷酶A的核酸和氨基酸序列見于美國專利No.6,329,191中。
教導(dǎo)如何制備α-半乳糖苷酶A的參考文獻見于美國專利No.5,179,023和5,658,567(在昆蟲細(xì)胞中表達)、美國專利No.5,356,804(在哺乳動物細(xì)胞中表達和分泌，包括CHO細(xì)胞)、美國專利No.5,401,451(在哺乳動物細(xì)胞中表達)、美國專利No.5,580,757(在哺乳動物細(xì)胞中作為融合蛋白質(zhì)表達)和美國專利No.5,929,304(在植物細(xì)胞中表達)。用于純化重組α-半乳糖苷酶A的方法見于美國專利No.6,395,884中。
教導(dǎo)如何應(yīng)用α-半乳糖苷酶A以治療患者的參考文獻包括，但不局限于美國專利No.6,066,626(基因治療)和美國專利No.6,461,609(用蛋白質(zhì)進行治療)。用于本發(fā)明方法中的α-半乳糖苷酶A突變型包括，但不局限于那些描述于美國專利No.6,210,666中的突變型。
W.抗體本發(fā)明進一步包含重構(gòu)各種包括嵌合抗體制劑的抗體制劑的方法，包括嵌合的TNFR、嵌合的抗-糖蛋白IIb/IIIa、嵌合的抗-HER2、嵌合的抗-RSV、嵌合的抗-CD20和嵌合的抗-TNF。嵌合抗體制劑包含來自IgG抗體的人Fc部分和來自對抗原特異性的單克隆抗體的可變區(qū)。其他制劑包含與人IgG Fc部分融合的受體，如75kDa的TNF受體。這些分子進一步包括包含來自人和小鼠的輕鏈和重鏈的Fab片段。嵌合的TNFR可用于治療炎癥疾病，如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。嵌合的抗-糖蛋白IIb/IIIa可用于治療心臟異常、血液凝結(jié)和血小板功能紊亂。嵌合的抗-HER2可用作乳腺癌的治療藥物，嵌合的抗-RSV可用于治療呼吸道合胞病毒，嵌合的抗-CD20可用于治療非何杰金氏淋巴瘤，且嵌合的抗-TNF可用于治療Crohn氏病。
盡管這些嵌合抗體已證明可用于處理各種疾病，但由于在嚙齒類細(xì)胞中產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)的相對短的半衰期而需要相當(dāng)頻繁且以相當(dāng)高的劑量給予。盡管大多數(shù)嵌合抗體是人的，因此由免疫系統(tǒng)識別為“自身的”，但它們由于非天然的糖基化模式將被降解并破壞。本發(fā)明要解決該問題，從而大大增加這些新藥物的功效。
抗體及其生成方法如在此處所用的，術(shù)語“抗體”指能夠特異性地與抗原上的特定抗原決定部位結(jié)合的免疫球蛋白分子。抗體可為源自天然來源或源自重組來源的完整免疫球蛋白，或者完整免疫球蛋白的免疫反應(yīng)性部分?？贵w一般是免疫球蛋白分子四聚體。本發(fā)明中的抗體可以以各種形式存在，該形式包括如多克隆抗體、單克隆抗體、Fv、Fab和F(ab)2以及單鏈抗體和人源化的抗體(Harlow等人，1999，Using AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY；Harlow等人，1989，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York；Houston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 855879-5883；Bird等人，1988，Science 242423-426)。
如在此處所用的，術(shù)語“合成抗體”指用重組DNA技術(shù)生成的抗體，如由在此處所描述的噬菌體表達的抗體。該術(shù)語也應(yīng)該解釋為通過合成編碼和表達抗體的DNA或編碼抗體的氨基酸序列而生成的抗體，其中DNA或氨基酸序列以用本領(lǐng)域中可用的且眾所周知的合成DNA或氨基酸序列技術(shù)獲得。
針對全長肽或肽片段的單克隆抗體可用任何眾所周知的單克隆抗體制備程序制備，如那些描述于Harlow等人(1988，Antibodies，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY)和Tuszynski等人(1988，Blood，72109-115)中的。想要的肽也可用化學(xué)合成技術(shù)合成。可選擇地，編碼想要的肽的DNA可進行克隆并在適合于生成大量的肽的細(xì)胞中從適當(dāng)?shù)膯幼有蛄斜磉_。針對肽的單克隆抗體是用如在此處所參考的標(biāo)準(zhǔn)程序從用該肽免疫接種的小鼠中生成的。
編碼用在此處描述的程序獲得的單克隆抗體的核酸可用本領(lǐng)域中可用的技術(shù)進行克隆和測序，且描述于如Wright等人(1992，Critical Rev.in Immunol.12(3，4)125-168)及在其中引用的參考文獻中。進一步地，本發(fā)明的抗體可用描述于Wright等人(見上文)及在其中引用的參考文獻和Gu等人(1997，Thrombosis and Hematocyst 77(4)755-759)中的技術(shù)進行“人源化”。
為了生成噬菌體抗體文庫，首先從分離自細(xì)胞(如雜交瘤)的mRNA中獲得cDNA文庫，該mRNA表達要表達于噬菌體表面上的想要的肽，如想要的抗體。mRNA的cDNA拷貝是用反轉(zhuǎn)錄酶產(chǎn)生的。編碼免疫球蛋白片段的cDNA是通過PCR獲得的，且將結(jié)果所得的DNA克隆入適當(dāng)?shù)氖删w載體中以生成噬菌體DNA文庫，該文庫包含DNA限定的免疫球蛋白基因。制備包含異源DNA的噬菌體文庫的程序是本領(lǐng)域中眾所周知的，且描述于如Sambrook和Russell(2001，Molecular CloningA LaboratoryManual，Cold Spring Harbor，NY)。
可對編碼想要的抗體的噬菌體進行加工，從而肽以這樣一種方式在其表面上展示，即這些肽能夠與其相應(yīng)的結(jié)合肽結(jié)合，如抗體所針對的抗原。因此，當(dāng)表達特定抗體的噬菌體在表達相應(yīng)抗原的細(xì)胞存在時進行溫育時，噬菌體將結(jié)合到細(xì)胞上。不表達抗體的噬菌體將不結(jié)合到細(xì)胞上。這種淘選技術(shù)是本領(lǐng)域中眾所周知的且描述于如Wright等人(見上文)中。
已發(fā)展了用M13噬菌體展示來生產(chǎn)人抗體的方法，如那些在上面所描述的(Burton等人，1994，Adv.Immunol.57191-280)?；镜?，cDNA文庫是從mRNA中生成的，該mRNA是從產(chǎn)生抗體的細(xì)胞群體中獲得的。該mRNA編碼重排的免疫球蛋白基因，因而cDNA編碼同樣的重排的免疫球蛋白基因。將擴增的cDNA克隆入M13表達載體中，從而生成在其表面表達人抗體片段的噬菌體文庫。通過抗原結(jié)合選擇展示目標(biāo)抗體的噬菌體，并使其在細(xì)菌中繁殖以產(chǎn)生可溶性的人免疫球蛋白。因而，與常規(guī)單克隆抗體合成相反，該程序使編碼人免疫球蛋白的DNA而不是表達人免疫球蛋白的細(xì)胞永生化。
對抗體分子聚糖的重構(gòu)一類肽即免疫球蛋白的特定糖基化對這些肽的生物學(xué)活性具有特別重要的作用。本發(fā)明不應(yīng)解釋為僅局限于IgG類的免疫球蛋白，而應(yīng)解釋為包括IgA、IgE和IgM類抗體的免疫球蛋白。
進一步地，本發(fā)明不應(yīng)解釋為僅局限于任何類型的常規(guī)抗體結(jié)構(gòu)。相反，本發(fā)明應(yīng)該解釋為包括所有類型的抗體分子，包括如抗體片段、嵌合抗體、人抗體、人源化抗體等。
一般的免疫球蛋白分子包含效應(yīng)部分和抗原結(jié)合部分。對于免疫球蛋白的綜述，參見Harlow等人，1988，AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，New York；和Harlow等人，1999，Using AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY。免疫球蛋白的效應(yīng)部分位于分子的Fc部分并部分負(fù)責(zé)免疫球蛋白向其相關(guān)的細(xì)胞受體的有效結(jié)合。免疫球蛋白分子特別是該分子Fc部分的CH2結(jié)構(gòu)域中的不正確的糖基化可影響免疫球蛋白的生物學(xué)活性。
關(guān)于免疫球蛋白IgG，更特定的是，IgG效應(yīng)功能大部分是由IgG是否含有N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)殘基決定的，該殘基附著于IgG分子CH2結(jié)構(gòu)域中天冬酰胺(Asn)297上的N-連接聚糖的三甘露糖核心的分支甘露糖的4-0位置。該殘基已知為“等分的GlcNAc”。將等分的GlcNAc添加到天然或重組IgG分子或含有IgG-Fc的嵌合構(gòu)建體的N-聚糖鏈中的目的是使該分子Fc部分的Fc免疫效應(yīng)功能最優(yōu)化。這種效應(yīng)功能可包括依賴抗體的細(xì)胞毒性(ADCC)和任何其他的生物學(xué)作用，該生物學(xué)作用需要對FcγR受體的有效結(jié)合及與補體的C1成分的結(jié)合。已描述了等分的GlcNAc對于實現(xiàn)IgG分子的最大免疫效應(yīng)功能的重要性(Lifely等人，1995，Glycobiology 5(8)813-822；Jeffris等人，1990，Biochem.J.268(3)529-537)。
在IgG分子CH2結(jié)構(gòu)域的Asn 297的糖基化位點發(fā)現(xiàn)的聚糖在結(jié)構(gòu)上對于發(fā)現(xiàn)循環(huán)于人和動物血液血漿中的IgG分子，由骨髓瘤細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞和各種轉(zhuǎn)染的永生化哺乳動物和昆蟲細(xì)胞系產(chǎn)生的IgG是特征性的。在所有情況下，N-聚糖是高甘露糖鏈或具有或不具有等分的GlcNAc的完全的(Man3、GlcNAc4、Gal2、NeuAc2、Fuc1)或可變的不完全的雙觸角鏈(Raju等人，2000，Glycobiology 10(5)477-486；Jeffris等人，1998，Immunological.Rev.163L59-76；Lerouge等人，1998，Plant Mol.Biol.3841-48；James等人，1995，Biotechnology 13592-596)。
本發(fā)明提供了在體外定制的糖基化免疫球蛋白分子。該免疫球蛋白分子可為任何免疫球蛋白分子，包括但不局限于單克隆抗體、合成抗體、嵌合抗體、人源化的抗體等。生成抗體及對其進行表征的特定方法在別處描述。優(yōu)選地，免疫球蛋白是IgG，且更優(yōu)選地IgG是人源化的或人IgG，最優(yōu)選地為IgG1。
本發(fā)明特定地涉及使用β1，4-甘露糖基-糖肽β1，4-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶GnT-IIIEC2.4.1.144作為體外試劑，以使N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)通過糖苷鍵連接到IgG分子CH2結(jié)構(gòu)域中位于Asn 297的N-聚糖的三甘露糖核心的分支甘露糖的4-0位置上。然而，如從在此處提供的公開內(nèi)容可以理解的，本發(fā)明不應(yīng)解釋為僅僅包括應(yīng)用該酶以向免疫球蛋白分子提供等分的GlcNAc。相反，已發(fā)現(xiàn)可能的是對抗體分子的糖基化模式進行調(diào)節(jié)，從而該抗體分子除其他性質(zhì)如穩(wěn)定性等的潛在增強之外具有增強的生物學(xué)活性，即效應(yīng)功能。
在本發(fā)明中提供了為了增強對Fc-γRIIIA的結(jié)合和增強的依賴抗體的細(xì)胞毒性的目的而從Asn(297)N-連接的聚糖中去除巖藻糖分子的一般方法(參見Shields等人，2002，J.Biol.Chem.27726733-26740)。該方法需要使抗體分子與適合于抗體聚糖上巖藻糖分子的連接的巖藻糖苷酶接觸?？蛇x擇地，重組抗體可表達于表達巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的細(xì)胞中，如CHO細(xì)胞的Lec13變體。巖藻糖從抗體聚糖中的去除可單獨進行，或與其他重構(gòu)聚糖的方法如添加等分的GlcNAc結(jié)合進行?？贵w在缺乏GnT-I的細(xì)胞中的表達也產(chǎn)生缺乏核心巖藻糖的Fc聚糖，該聚糖可進一步通過本發(fā)明進行修飾。
在本發(fā)明中提供了為了在IgG分子制劑中增強Fc免疫效應(yīng)功能的目的而引入等分的GlcNAc的一般方法，其中該IgG分子在CH2結(jié)構(gòu)域中特別是在Asn 297含有N-連接的寡糖。該方法需要使IgG分子群體達到一定的糖基化狀態(tài)，從而聚糖鏈?zhǔn)荊nT-III的受體。這是通過下面3個途徑的任何一個實現(xiàn)的1)通過對宿主表達系統(tǒng)的選擇或遺傳操作，該宿主表達系統(tǒng)分泌作為GnT-III的底物的具有N-聚糖鏈的IgG；2)通過用外切糖苷酶對IgG糖形式群體進行處理，從而在外切糖苷酶處理后剩余的聚糖結(jié)構(gòu)是GnT-III的受體；3)如上文1)和2)中宿主選擇和外切糖苷酶處理的一些組合，再加上隨后由GnT-I和GnT-II添加GlcNAc以生成GnT-III的受體。
例如，從雞血漿中獲得的IgG主要含有高甘露糖鏈，且需要用一種或多種α-甘露糖苷酶進行消化以生成底物，從而由GnT-I將GlcNAc添加到甘露糖核心的α1，3甘露糖分支上。該底物可為基本的三甘露糖核心，即Man3GlcNAc2。用GnT-I、GnT-II和GnT-III的組合以UDP-GlcNAc作為糖供體對該核心結(jié)構(gòu)的處理生成如
圖1所示的Man3GlcNAc5。這些糖基轉(zhuǎn)移酶的作用順序可進行改變以使所需產(chǎn)物的生產(chǎn)最優(yōu)化?？蛇x擇地，該結(jié)構(gòu)然后可用β1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶處理而進行延伸。如果需要，半乳糖基化的寡糖可進一步用α2，3-或α2，6-唾酸轉(zhuǎn)移酶進行延伸以得到完整的雙觸角結(jié)構(gòu)。利用本方法，可如任何開發(fā)中的治療性IgG的最適Fc免疫效應(yīng)功能所必需的對雙觸角聚糖鏈進行重構(gòu)(圖3)。
可選擇地，發(fā)現(xiàn)于大多數(shù)動物的血漿中的IgG分子或作為重組產(chǎn)物由大多數(shù)動物細(xì)胞或由轉(zhuǎn)基因動物分泌的IgG一般包括一系列雙觸角糖形式，該糖形式包括具有或不具有等分的GlcNAc的完全形式(NeuAc2、Gal2、GlcNAc4、Man3、±Fuc1)(圖3)或可變的不完全形式(Raju等人，2000，Glycobiology 10(5)477-486；Jeffris等人，1998，Immunological Rev.16359-76)。為了確保等分的GlcNAc存在于這樣產(chǎn)生的整個免疫球蛋白群體中，可依次地或在混合物中用下面的外切糖苷酶處理分子混合物神經(jīng)氨酸酶、β-半乳糖苷酶、β-氨基己糖苷酶、α-巖藻糖苷酶。然后結(jié)果所得的三甘露糖核心可用如上所述的糖基轉(zhuǎn)移酶進行重構(gòu)。
在一些情形中，需要從現(xiàn)存的抗體分子中消除效應(yīng)子功能。本發(fā)明也包括用適當(dāng)?shù)奶擒彰负吞腔D(zhuǎn)移酶修飾Fc聚糖，以消除效應(yīng)子功能。同樣預(yù)期的是添加用PEG或其他聚合物修飾的糖，該PEG或其他聚合物用于阻礙或消除Fc受體或補體與抗體的結(jié)合。
此外，對由轉(zhuǎn)基因動物分泌的和由轉(zhuǎn)基因植物作為“植物體(plantibodies)”貯藏的IgG進行了表征。在轉(zhuǎn)基因植物中產(chǎn)生的具有含有β1，2連接的木糖和/或α1，3連接的巖藻糖的N-聚糖的IgG分子還可用除上述外切糖苷酶之外的外切糖苷酶處理以去除這些殘基，從而生成三甘露糖核心或Man3GlcNAc4結(jié)構(gòu)，然后用糖基轉(zhuǎn)移酶處理以重構(gòu)上述N-聚糖。
本發(fā)明的主要創(chuàng)新方面是適當(dāng)?shù)奶腔D(zhuǎn)移酶的應(yīng)用，該應(yīng)用具有或不具有預(yù)先的外切糖苷酶處理，并以正確的順序應(yīng)用以使抗體的效應(yīng)功能最優(yōu)化。在一個示例性的實施方案中，將等分的GlcNAc引入到需要該等分的GlcNAc的IgG分子或其他IgG-Fc-嵌合構(gòu)建體的聚糖中。在另一個示例性的實施方案中，將核心巖藻糖從IgG分子或其他IgG-Fc-嵌合構(gòu)建體的聚糖中去除。
X.TNF受體-IgG Fc融合蛋白質(zhì)75kDa的人TNF受體的核苷酸和氨基酸序列在此處分別以SEQ ID NO31和SEQ ID NO32提出(分別為圖82A和82B)。嵌合的抗-HER2的輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別以SEQ ID NO35和SEQ ID NO36提出(分別為圖83A和83B)。嵌合的抗-RSV的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別以SEQ ID NO38和SEQ ID NO37提出(分別為圖84A和84B)?？?TNF的非人的可變區(qū)的氨基酸序列在此處分別以SEQ ID NO41和SEQ ID NO42提出(分別為圖85A和85B)。人IgG的Fc部分的核苷酸和氨基酸序列分別以SEQ ID NO49和SEQ ID NO50提出(分別為圖86A和86B)。
重構(gòu)的嵌合ENBRELTM可施用于如下患者，該患者選自患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患者和患有多關(guān)節(jié)過程的少年關(guān)節(jié)炎的患者。重構(gòu)的嵌合ENBRELTM也可施用于關(guān)節(jié)炎患者以減輕患者中的病征、癥狀或結(jié)構(gòu)損傷。優(yōu)選地，患者是人患者。
重構(gòu)的SynagisTM抗體可施用于患者以對患者進行抗呼吸道合胞病毒(RSV)感染的免疫接種。重構(gòu)的SynagisTM抗體也可施用于患者以預(yù)防或減輕由RSV導(dǎo)致的下呼吸道疾病的嚴(yán)重性。優(yōu)選地，患者是人患者。
Y.MAb抗-糖蛋白IIb/IIIa鼠抗-糖蛋白IIb/IIIa抗體可變區(qū)的氨基酸序列分別以SEQ ID NO52(鼠成熟的可變的輕鏈，圖87)和SEQ ID NO54提出(鼠成熟的可變的重鏈，圖88)。這些鼠的序列可根據(jù)美國專利No.5,777,085中的程序與人IgG氨基酸序列SEQ ID NO51(人成熟的可變的輕鏈，圖89)、SEQ ID NO53(人成熟的可變的重鏈，圖90)、SEQ ID NO55(人的輕鏈，圖91)和SEQ ID NO56(人的重鏈，圖92)進行組合以生成嵌合的人源化鼠抗-糖蛋白IIb/IIIa抗體。其他抗-糖蛋白IIb/IIIa人源化的抗體可發(fā)現(xiàn)于美國專利No.5,877,006中。表達抗-糖蛋白IIb/IIIa MAb7E3的細(xì)胞系可商業(yè)上從ATCC(Manassas，VA)以目錄號no.HB-8832購得。
所選抗體的適應(yīng)癥重構(gòu)的ReoproTM可施用于如下患者，該患者選自進行經(jīng)皮膚的冠狀介入的患者和患有不穩(wěn)定心絞痛的患者(其中該患者計劃在24小時內(nèi)進行經(jīng)皮膚的冠狀介入。重構(gòu)的ReoproTM也可施用于進行經(jīng)皮膚的冠狀介入的患者以減輕或預(yù)防患者中的心臟缺血并發(fā)癥。優(yōu)選地，患者是人患者。
重構(gòu)的HerceptinTM可施用于患有超表達HER2蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者。優(yōu)選地，患者是人患者。
重構(gòu)的RemicadeTM可施用于如下患者，該患者選自患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的患者、患有Crohn氏病的患者和患有成瘺的Crohn氏病的患者。重構(gòu)的RemicadeTM也可施用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者以減輕患者中類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的病征和癥狀。RemicadeTM也可施用于Crohn氏病患者以減輕患者中Crohn氏病的病征和癥狀。優(yōu)選地，患者是人患者。
Z.MAb抗-CD20嵌合的抗-CD20抗體的核酸和氨基酸序列在SEQ ID NO59(鼠可變區(qū)輕鏈的核酸序列，圖93A)、SEQ ID NO60(鼠可變區(qū)輕鏈的氨基酸序列，圖93B)、SEQ ID NO61(鼠可變區(qū)重鏈的核酸序列，圖94A)和SEQID NO62(鼠可變區(qū)重鏈的氨基酸序列，圖94B)中提出。為了使鼠抗體人源化，可方便地應(yīng)用含有人IgG重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的TCAE 8(SEQID NO57，圖95A-95E)。根據(jù)美國專利No.5,736,137給出的說明將上述鼠可變區(qū)編碼DNA克隆入TCAE 8載體中構(gòu)建了一個載體(SEQ ID NO58，圖96A-96E)，該載體當(dāng)轉(zhuǎn)化入哺乳動物細(xì)胞系中時可表達嵌合的抗-CD20抗體。其他人源化的抗-CD20抗體可發(fā)現(xiàn)于美國專利No.6,120,767中。表達抗-CD20抗體MAb C273的細(xì)胞系可商業(yè)上從ATCC(Manassas，VA)以目錄號no.HB-9303購得。
技術(shù)人員將易于理解在此處提出的序列不是排他性的，而是嵌合抗體的可變區(qū)、受體和其他結(jié)合部分的例子。進一步地，構(gòu)建嵌合的或“人源化的”抗體的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，且描述于如美國專利No.6,329,511和美國專利No.6,210,671中。結(jié)合本公開內(nèi)容和本領(lǐng)域中眾所周知的方法，技術(shù)人員將認(rèn)識到本發(fā)明不局限于在此處公開的序列。
嵌合抗體的表達是本領(lǐng)域中眾所周知的，且詳細(xì)描述于如美國專利No.6,329,511中。表達系統(tǒng)可為原核生物的、真核生物的等。進一步地，嵌合抗體在用桿狀病毒表達系統(tǒng)的昆蟲細(xì)胞中的表達描述于Putlitz等人(1990，Bio/Technology 8651-654)中。此外，表達編碼融合或嵌合蛋白質(zhì)的核酸的方法是本領(lǐng)域中眾所周知的，且描述于如Sambrook等人(2001，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York)和Ausubel等人(1997，Current Protocolsin Molecular Biology，Green &amp; Wiley，New York)中。
對根據(jù)本發(fā)明的方法產(chǎn)生的嵌合抗體的功能和生物學(xué)活性的確定對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言也是基本的操作。通過競爭測定法確定抗體親和力的方法詳細(xì)描述于Berzofsky(J.A.Berzofsky和I.J.Berkower，1984，F(xiàn)undamental Immunology(ed.W.E.Paul)，Raven Press(NewYork)，595)中。簡言之，使用放射性碘化的單克隆抗體將嵌合抗體的親和力與單克隆抗體的進行比較，其中該嵌合抗體是從該單克隆抗體中衍生的。
重構(gòu)的抗-CD20抗體可施用于如下患者，該患者患有復(fù)發(fā)的或難治的低級或卵泡性、CD20-陽性、B-細(xì)胞非何杰金氏淋巴瘤。優(yōu)選地，患者是人患者。
VII.藥物組合物在另一方面，本發(fā)明提供了藥物組合物。該藥物組合物包括藥物可接受的稀釋劑和在非天然存在的水溶性聚合物、治療部分或生物分子和糖基化或非糖基化的肽之間的共價綴合物。該聚合物、治療部分或生物分子是通過完整糖基連接基團與肽綴合的，該糖基連接基團插入肽和聚合物、治療部分或生物分子之間并共價地與兩者連接。
本發(fā)明的藥物組合物適用于各種藥物送遞系統(tǒng)。用于本發(fā)明的適當(dāng)?shù)闹苿┛砂l(fā)現(xiàn)于Remington’s Pharmaceutical Sciences，MacePublishing Company，Philadelphia，PA，17thed.(1985)。對于藥物送遞方法的簡述，參見Langer，Science 2491527-1533(1990)。
該藥物組合物可制備為任何適當(dāng)?shù)慕o予方式，包括如局部的、口服的、鼻的、靜脈內(nèi)的、顱內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、皮下的或肌內(nèi)的給予。對于腸胃外的給予，如皮下注射，載體優(yōu)選地包含水、鹽水、醇、脂肪、蠟或緩沖液。對于口服給予，可應(yīng)用任何上述載體或固體載體，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、滑石、纖維素、葡萄糖、蔗糖和碳酸鎂。生物可降解的微球體(如polylactate polyglycolate)也可用作本發(fā)明的藥物組合物的載體。適當(dāng)?shù)纳锟山到獾奈⑶蝮w公開于如美國專利No.4,897,268和5,075,109中。
通常，藥物組合物是腸胃外給予的，如靜脈內(nèi)給予。因而，本發(fā)明提供了用于腸胃外給予的組合物，該組合物包含溶解或懸浮于適當(dāng)?shù)妮d體中的化合物，優(yōu)選地為水相載體，如水、緩沖的水、鹽水、PBS等。該組合物可含有接近生理學(xué)狀況所需的藥物可接受的輔助物質(zhì)，如調(diào)節(jié)pH的和緩沖的試劑、張力調(diào)節(jié)劑、潤濕劑、去污劑等。
這些組合物可通過常規(guī)的滅菌技術(shù)進行滅菌，或可為過濾滅菌的。結(jié)果所得的水溶液可原樣進行包裝以供使用，或者可以凍干，凍干的制劑在給予之前是與無菌的水相載體組合的。制劑的pH一般為3～11，更優(yōu)選地為5～9，最優(yōu)選地為7～8。
在一些實施方案中，本發(fā)明的肽可整合入從標(biāo)準(zhǔn)的小泡形成性脂質(zhì)形成的脂質(zhì)體中。制備脂質(zhì)體的各種方法是可用的，如描述于Szoka等人，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467(1980)，美國專利No.4,235,871、4,501,728和4,837,028。應(yīng)用各種導(dǎo)向劑(如本發(fā)明的唾液酸半乳糖苷)對脂質(zhì)體的導(dǎo)向是本領(lǐng)域中眾所周知的(參見美國專利No.4,957,773和4,603,044)。
可應(yīng)用使導(dǎo)向劑與脂質(zhì)體偶聯(lián)的標(biāo)準(zhǔn)方法。這些方法一般包括將脂質(zhì)成分整合入脂質(zhì)體中，如可進行活化以附著導(dǎo)向劑的磷脂酰乙醇胺，或者衍生化的親脂化合物，如本發(fā)明的脂質(zhì)衍生的肽。
導(dǎo)向機制一般需要導(dǎo)向劑以這樣的方式定位于脂質(zhì)體的表面，從而導(dǎo)向部分能夠與目標(biāo)如細(xì)胞表面受體相互作用。本發(fā)明的糖可用本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的方法(如分別用長鏈烷基鹵化物或脂肪酸對存在于糖上的羥基基團的烷基化或酰基化)在形成脂質(zhì)體前附著于脂質(zhì)分子上。可選擇地，可以以這樣的方式形成脂質(zhì)體，從而連接體部分在膜形成時可首先整合入膜中。該連接體部分必須具有親脂的部分，該部分可堅固地嵌入并錨定在膜中。它也必須具有反應(yīng)部分，該部分是在脂質(zhì)體的水相表面可化學(xué)利用的。對反應(yīng)部分進行選擇，從而它在化學(xué)上適合于與后來添加的導(dǎo)向劑或糖形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵。在一些情況下，可能的是使導(dǎo)向劑與連接體分子直接附著，但在大多數(shù)情況下，更適合于用第三個分子作為化學(xué)橋接，從而連接膜中的連接體分子和導(dǎo)向劑或糖，該導(dǎo)向劑或糖是從小泡表面三維延伸的。本發(fā)明的肽給予的劑量范圍是大到足以產(chǎn)生想要的作用的劑量，其中免疫反應(yīng)的癥狀顯示了一些程度的抑制。該劑量不應(yīng)該太大而導(dǎo)致副作用。通常，該劑量將依年齡、狀況、性別及動物中疾病的程度而變化，且可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員確定。該劑量可由單個醫(yī)生在出現(xiàn)任何禁忌癥的情況下進行調(diào)節(jié)。
額外的藥物方法可應(yīng)用于控制作用的持續(xù)時間。控釋制劑可通過應(yīng)用聚合物而綴合、復(fù)合或吸附肽而實現(xiàn)?？蒯屗瓦f可通過選擇適當(dāng)?shù)拇蠓肿?如聚酯、多氨基羧甲基纖維素和魚精蛋白硫酸鹽)和大分子的濃度以及整合方法來實踐以控制釋放。控制控釋制劑作用時間的另一個可能的方法是將肽整合入聚合材料的顆粒中，如聚酯、多氨基酸、水凝膠、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。
為了防止肽與血漿蛋白質(zhì)結(jié)合，優(yōu)選地是將肽捕獲于通過凝聚技術(shù)或界面聚合制備的微囊中，如分別為羥甲基纖維素或明膠-微囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊，或者將肽捕獲于膠體藥物送遞系統(tǒng)中，如脂質(zhì)體、白蛋白微球體、微乳、納米顆粒(nanoparticle)和納米囊(nanocapsule)或大乳劑中。這種介紹公開于Remington’s Pharmaceutical Sciences(16thEd.，A.Oslo，ed.，Mark，Easton，Pa.，1980)。
本發(fā)明的肽非常適用于可導(dǎo)向的藥物送遞系統(tǒng)，如大分子復(fù)合物、納米囊、微球體或珠子形式的合成或天然的聚合物，且適用于基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括水包油乳劑、微團、混合的微團、脂質(zhì)體和重封紅細(xì)胞。這些系統(tǒng)共同已知為膠體藥物送遞系統(tǒng)。一般地，含有分散的肽的這種膠體顆粒直徑約為50nm-2μm。膠體顆粒的大小使得其能夠通過注射經(jīng)靜脈內(nèi)給予或者作為氣溶膠而給予。用于膠體系統(tǒng)制劑中的材料一般是通過過濾滅菌而滅菌的、無毒性的及生物可降解的，例如白蛋白、乙基纖維素、酪蛋白、明膠、卵磷脂、磷脂和豆油。聚合的膠體系統(tǒng)是通過與凝聚微囊化類似的方法制備的。
在一個示例性的實施方案中，肽是用作導(dǎo)向送遞系統(tǒng)的脂質(zhì)體的成分。當(dāng)將磷脂輕輕分散在水相介質(zhì)中時，它們膨脹、水合并自發(fā)地形成多層同心的雙層小泡，在該小泡中，水相介質(zhì)層分隔脂雙層。這種系統(tǒng)通常稱為多層脂質(zhì)體或多層小泡(MLV)，且直徑范圍為約100nm～約4μm。當(dāng)對MLV進行超聲處理時，則形成直徑范圍為約20～約50nm的小的單層小泡(SUVS)，該小的單層小泡在SUV核心含有水溶液。
用于脂質(zhì)體生產(chǎn)中的脂質(zhì)的例子包括磷脂?；衔?，如磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸和磷脂酰乙醇胺。特別有用的是二?；字８视?，其中脂質(zhì)部分含有14-18個碳原子，特別地為16-18個碳原子，且是飽和的。示例性的磷脂包括卵磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿。
在制備含有本發(fā)明的肽的脂質(zhì)體中，應(yīng)該考慮這些變量，如肽被囊化的效率、肽的不穩(wěn)定性、結(jié)果所得的脂質(zhì)體群體的同質(zhì)性和大小、肽-脂質(zhì)比例、制劑的滲透不穩(wěn)定性和制劑的藥物可接受性。Szoka等人，Annual Review of Biophysics and Bioengineering，9467(1980)；Deamer等人，Liposomes，Marcel Dekker，New York，1983，27；Hope等人，Chem.Phys.Lipids，4089(1986))。
含有本發(fā)明的肽的導(dǎo)向送遞系統(tǒng)可以各種方式給予宿主，特別是哺乳動物宿主，如靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、皮下的、腹膜內(nèi)的、血管內(nèi)的、局部的、腔內(nèi)的、經(jīng)皮膚的、鼻內(nèi)的或吸入的。肽的濃度將依賴于特定的應(yīng)用、疾病的特性、給予的頻率等而變化。導(dǎo)向的送遞系統(tǒng)被囊化的肽可以在包含其他適當(dāng)?shù)幕衔锖退嗌韺W(xué)可接受的介質(zhì)的制劑中提供，該介質(zhì)如鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水等。
由本發(fā)明的方法制備的化合物也可用作診斷試劑。例如，標(biāo)記的化合物可用于在懷疑具有炎癥的患者中定位炎癥或腫瘤轉(zhuǎn)移的區(qū)域。為此應(yīng)用，該化合物可用125I、14C或氚進行標(biāo)記。
實驗實施例現(xiàn)在本發(fā)明將結(jié)合下面的實施例進行描述。這些實施例是僅僅為了闡明的目的而提供的，且本發(fā)明決不應(yīng)解釋為局限于這些實施例，而應(yīng)解釋為包含由于在此處提供的介紹而變?yōu)轱@而易見的任何和所有變異。
現(xiàn)在描述了用于在本實施例中提出的實驗中的材料和方法。
A.一般方法1.CMP-SA-PEG的制備本實施例提出了對CMP-SA-PEG的制備。
2-(芐氧基酰胺)-甘氨酰酰胺-2-脫氧-D-吡喃甘露糖的制備。將N-芐氧基羰基-甘氨酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯(3.125g，10.2mmol)添加到含有溶解于MeOH(10mL)和H2O(6mL)中的D-甘露糖胺-HCl(2g，9.3mmol)和三乙胺(1.42mL，10.2mmol)的溶液中。將反應(yīng)物在室溫攪動16小時并用回旋蒸發(fā)(rotoevaporation)進行濃縮。層析(硅，10％MeOH/CH2Cl2)得到了1.71g(50％產(chǎn)量)白色固體產(chǎn)物Rf＝0.62(硅，CHCl3∶MeOH∶H2O，6/4/1)；1H NMR(CD3OD，500MHz)δ3.24-3.27(m，2H)，3.44(t，1H)，3.55(t，1H)，3.63-3.66(m，1H)，3.76-3.90(m，6H)，3.91(s，2H)，4.0(dd，2H)，4.28(d，1H，J＝4.4)，4.41(d，1H，J＝3.2)，5.03(s，1H)，5.10(m，3H)，7.29-7.38(m，10H)。
5-(N-芐氧基酰胺)甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate的制備。將2-(N-芐氧基酰胺)甘氨酰酰胺-2-脫氧-D-吡喃甘露糖(1.59g，4.3mmol)溶解于0.1M HEPES(12mL，pH7.5)和丙酮酸鈉(4.73g，43mmol)的溶液中。使神經(jīng)氨酸醛縮酶(在45mL含有0.1M NaCl的pH6.9的10mM磷酸鹽緩沖溶液中540U的酶)和反應(yīng)混合物加熱到37℃持續(xù)24小時。然后將反應(yīng)混合物離心并將上清液進行層析(C18硅，從H20(100％)到30％MeoH/水的梯度)。收集合適的級分，濃縮，將殘余物進行層析(C18硅，從10％MeOH/CH2Cl2到CH2Cl2/MeOH/H2O 6/4/1的梯度)。收集適當(dāng)?shù)募壏郑瑢⑵錆饪s并將剩余物重懸于水中。凍干后，獲得了白色固體產(chǎn)物(1.67g，87％產(chǎn)量)Rf＝0.26(硅，CHCl3∶MeOH∶H2O為6/4/1)；1H NMR(D2O，500MHz)δ1.82(t，1H)，2.20(m，1H)，3.49(d，1H)，3.59(dd，1H)，3.67-3.86(m，2H)，3.87(s，2H)，8.89-4.05(m，3H)，5.16(s，2H)，7.45(m，5H)。
5-甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate的制備。將5-(N-芐氧基酰胺)甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-D-甘油-D-半乳糖-nonulopyranosuronate(1.66g，3.6mmol)溶解于20mL 50％的水/甲醇中。將燒瓶重復(fù)地抽真空并置于氬中，然后加入10％的Pd/C(0.225g)。在重復(fù)抽真空之后，將氫(約1atm)加入到燒瓶中，并將反應(yīng)混合物攪動18小時。使反應(yīng)混合物通過硅藻土過濾，用旋轉(zhuǎn)的蒸發(fā)器進行濃縮并凍干以得到1.24g(100％產(chǎn)量)的白色固體產(chǎn)物Rf＝0.25(硅，IPA/H2O/NH4OH 7/2/1)；1H NMR(D2O，500MHz)δ1.83(t，1H，J＝9.9)，2.23(dd，1H，J＝12.9，4.69)，3.51-3.70(m，2H)，3.61(s，2H)，3.75-3.84(m，2H)，3.95-4.06(m，3H)。
胞苷-5’-單磷酰-[5-(N-芴甲氧基-酰胺)甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulooyranosuronate]的制備。將含有溶解于20mL H2O中的5-甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate(0.55g，1.70mmol)的溶液添加到Tris(1.38g，11.4mmol)、1M MgCl2(1.1mL)和BSA(55mg)的溶液中。用1MNaOH(2mL)將溶液的pH調(diào)節(jié)到8.8并添加CTP-2Na+(2.23g，4.2mmol)。反應(yīng)混合物的pH是由pH控制器控制的，該控制器可釋放所需要的1MNaOH以維持pH8.8。將融合蛋白質(zhì)(唾酸轉(zhuǎn)移酶/CMP-神經(jīng)氨酸合成酶)添加到溶液中并在室溫攪動反應(yīng)混合物。2日后，加入額外量的融合蛋白質(zhì)并將反應(yīng)物攪動額外的40小時。使反應(yīng)混合物在EtOH中沉淀，并將沉淀用冷的EtOH洗滌5次以得到2.3克白色固體。將約1.0g粗產(chǎn)物溶解于1，4二_烷(4mL)、H2O(4mL)和飽和的NaHCO3(3mL)中，并逐滴加入溶解于2ml二_烷中的FMOC-Cl(308mg，1.2mmol)溶液。在室溫攪動16小時后，將反應(yīng)混合物通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮到約6mL并用層析(C18硅，從100％H2O到30％MeOH/H2O的梯度)進行純化。組合并濃縮適當(dāng)?shù)募壏帧⑹Ｓ辔锶芙庥谒胁龈梢垣@得253mg白色固體Rf＝0.50(硅，IPA/H2O/NH4OH 7/2/1)；1H NMR(D2O，500MHz)δ1.64(dt，1H，J＝12.0，6.0)，2.50(dd，1H，J＝13.2，4.9)，3.38(d，J＝9.67，1H)，3.60(dd，J＝11.65，6.64，1H)，3.79(d，J＝4.11，1H)，3.87(dd，J＝12.24，1.0，1H)，3.97(m，2H)，4.07(td，J＝10.75，4.84，1H)，4.17(dd，J＝10.68，1.0，1H)，4.25(s，2H)，4.32(t，J＝4.4，1H)，4.37(t，J＝5.8，1H)，4.6-4.7(m，由溶劑的峰而導(dǎo)致模糊)，5.95(d，J＝4，1H)，6.03(d，J＝7.4，1H)，7.43-7.53(m，3H)，7.74(m，2H)，7.94(q，J＝7，3H)。MS(ES)；對C35H42N5O18P([M-H]-)的計算值為851.7；實測值850.0。
胞苷-5’-單磷酰-(5-甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate)的制備。將二異丙基胺(83μL，0.587μmol)添加到溶解于水(3mL)和甲醇(1mL)中的胞苷-5’-單磷酰-[5-(N-芴甲氧基-酰胺)甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate](100mg，0.117mmol)中。將反應(yīng)混合物在室溫攪動16小時并將反應(yīng)物甲醇通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)從反應(yīng)混合物中去除。將粗的反應(yīng)混合物通過應(yīng)用水的C18硅膠柱過濾，并將洗脫液收集且凍干以得到白色固體產(chǎn)物(87mg，100％)Rf＝0.21(硅，IPA/H2O/NH4OH 7/2/1)；1H NMR(D2O，500MHz)δ1.66(td，1H，J＝5.3)，2.50(dd，1H，J＝13.2，4.6)，3.43(d，J＝9.58，1H)，3.63(dd，J＝11.9，6.44，1H)，3.88(dd，J＝11.8，1.0，1H)，3.95(td，J＝9.0，2.3，1H)，4.10(t，J＝10.42，1H)，4.12(td，J＝10.34，4.66，1H)，4.18(d，J＝10.36，1H)，4.24(m，2H)，4.31(t，J＝4.64，1H)，4.35(t，1H)，6.00(d，J＝4.37，1H)，6.13(d，J＝7.71，1H)，7.98(d，J＝7.64，1H)。MS(ES)；對C21H32N5O11P([M-H]-)的計算值為629.47；實測值627.9。
胞苷-5’-單磷酰-[5-(N-甲氧基-聚氧乙烯-(1kDa)-3-氧代丙酰胺)-甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate]的制備。將芐基三唑-1-基氧-三(二甲基氨基)-_六氟磷酸鹽(BOP，21mg，48μmol)添加到溶解于無水DMF(700μL)和三乙胺(13μL，95μmol)中的甲氧基聚氧乙烯-(1kDa平均分子量)-3-氧代丙酸(48mg，48μmol)溶液中。30分鐘后，添加含有胞苷-5’-單磷酰-(5-甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate)(30mg，48μmol)、水(400μL)和三乙胺(13μL，95μmol)的溶液。將該溶液在室溫攪動20分鐘，然后進行層析(C18硅，甲醇/水梯度)。收集適當(dāng)?shù)募壏?，將其濃縮并將剩余物重懸于水中，且凍干以獲得40mg(50％產(chǎn)量)白色固體Rf＝0.36(硅，IPA/H2O/NH4OH 7/2/1)；1H NMR(D2O，500MHz)δ1.66(td，1H，J＝5.3)，2.50(dd，1H，J＝13.2，4.6)，2.64(t，J＝5.99，3H)，3.43(d，J＝9.58，1H)，3.63(m，1H)，3.71(s，70H)，3.79(m，由3.71的峰導(dǎo)致模糊)，3.82(t，J＝6.19，1H)，3.88(dd，J＝11.8，1.0，1H)，3.95(t d，J＝9.0，2.3，1H)，3.98(t，J＝5.06，1H)，4.12(td，J＝10.34，4.66，1H)，4.18(d，J＝10.36，1H)，4.23(d，J＝4.85，2H)，4.31(t，J＝4.64，1H)，4.35(t，1H)，6.00(d，J＝4.55，1H)，6.13(d，J＝7.56，1H)，7.98(d，J＝7.54，1H)。MS(MALDI)，觀察的[M-H]；1594.5，1638.5，1682.4，1726.4，1770.3，1814.4，1858.2，1881.5，1903.5，1947.3。
胞苷-5’-單磷酰-[5-(N-甲氧基-聚氧乙烯-(10kDa)-氧代酰胺)-甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate]的制備。將胞苷-5’-單磷酰-(5-甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate)(2.5mg，4μmol)和水(180μL)添加到含有三乙胺(1.1μL，8μmol)的無水DMF(800μL)中的(甲氧基聚氧乙烯-(10kDa，平均分子量)-氧代羰基-(N-氧代苯并三唑)酯(40mg，4μmol)溶液中，并將反應(yīng)混合物在室溫攪動1小時。然后用水(8mL)稀釋反應(yīng)混合物并通過反相快速層析(C18硅，甲醇/水梯度)進行純化。合并適當(dāng)?shù)募壏?，將其濃縮并將剩余物溶解于水中，且凍干以得到20mg(46％產(chǎn)量)白色固體產(chǎn)物Rf＝0.35(硅，IPA/H2O/NH4OH 7/2/1)；1H NMR(D2O，500MHz)δ1.66(td，1H)，2.50(dd，1H)，2.64(t，3H)，3.55-3.7(m，由3.71的峰導(dǎo)致模糊)，3.71(s，488H)，3.72-4.0(m，由3.71的峰導(dǎo)致模糊)，4.23(m，3H)，4.31(t，1H)，4.35(t，1H)，6.00(d，J＝4.77，1H)，6.12(d，J＝7.52，1H)，7.98(d，J＝7.89，1H)。MS(MALDI)，觀察的[M-CMP+Na]；10780。
2.CMP-SA-PEG II的制備本實施例提出了制備CMP-SA-PEG的一般方法，且具體是制備CMP-SA-PEG(1kDa)和CMP-SA-PEG(20kDa)的方法。
制備胞苷-5’-單磷酰-(5-甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate)的一般方法。將胞苷-5’-單磷酰-(5-甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate)(870mg，1.02mmol)溶解于25mL水中，并添加5.5mL 40wt％的二甲胺水溶液。將反應(yīng)物攪動1小時，然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除過量的二甲胺。將水溶液通過C-18硅膠柱過濾，并用水洗滌該柱。將洗脫液合并且凍干以得到638mg(93％)白色固體產(chǎn)物Rf＝0.10(硅，IPA/H2O/NH4OH 7/2/1)；1H NMR(D2O，500MHz)δ1.66(td，1H，J＝5.3)，2.50(dd，1H，J＝13.2，4.6)，3.43(d，J＝9.58，1H)，3.63(dd，J＝11.9，6.44，1H)，3.88(dd，J＝11.8，1.0，1H)，3.95(td，J＝9.0，2.3，1H)，4.10(t，J＝10.42，1H)，4.12(t d，J＝10.34，4.66，1H)，4.18(d，J＝10.36，1H)，4.24(m，2H)，4.31(t，J＝4.64，1H)，4.35(t，1H)，6.00(d，J＝4.37，1H)，6.13(d，J＝7.71，1H)，7.98(d，J＝7.64，1H)。MS(ES)；對C21H32N5O11P([M-H]-)的計算值為629.47；實測值627.9。
應(yīng)用mPEG-(對硝基苯酚)碳酸酯制備CMP-SA-PEG的一般方法。
將胞苷-5’-單磷酰-(5-甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate)(175mg，0.259mMol)溶解于pH8.5的水和DMF或THF的混合物(比例為1∶2)中。于室溫在8小時內(nèi)將mPEG-硝基苯酚碳酸酯(2～20kDa mPEG)(0.519mMole)分幾部分加入，并將反應(yīng)混合物于室溫攪動3日。當(dāng)完成時，加入水(40ml)和1.5ml NH4OH(29％的水溶液)。將黃色的反應(yīng)混合物再攪動2小時，然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進行濃縮。然后用水(pH8.5)將反應(yīng)混合物稀釋至約500ml體積，并通過反相快速層析法(Biotage 40M，C18硅柱)用甲醇/水梯度進行純化。合并適當(dāng)?shù)募壏?，并濃縮以得到白色固體產(chǎn)物。Rf(硅；1-丙醇/水/29％NH4OH；7/2/1)；(2kDa PEG)＝0.31；(5kDa PEG)＝0.33；(10kDaPEG)＝0.36；(20kDa PEG)＝0.38(TLC硅，IPA/H2O/NH4OH 7/2/1)；MS(MALDI)，[M-CMP+Na]觀察值；(2kDa)＝2460；(5kDa)＝5250；(10kDa)＝10700；(20kDa)＝22500。
制備胞苷-5’-單磷酰-[5-(N-芴甲氧基-甲酰胺)-甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate]的一般方法。
將丙酮酸鈉(2.4g，218mmol)、HEPES緩沖液(0.25M，pH7.34)和1.0g(22mmol)Fmoc-甘氨酰甘露糖酰胺在150mL的聚碳酸酯瓶中混合。然后加入神經(jīng)氨酸醛縮酶溶液(19mL，～600U)，并將反應(yīng)混合物在定軌搖床上于30℃進行溫育。23小時后，薄層層析(TLC)顯示已經(jīng)發(fā)生了大約75％向產(chǎn)物的轉(zhuǎn)變。然后向反應(yīng)混合物中加入CTP(1.72g，33mmol)和0.1M MnCl2(6mL)。用1M NaOH(5.5mL)將pH調(diào)節(jié)到7.5，并加入含有CMP-神經(jīng)氨酸合成酶(奈瑟氏球菌屬)的溶液(25mL，386U)。反應(yīng)在24小時后完成，并將反應(yīng)混合物進行層析(C-18硅，H2O(100％)到10％MeOH/H2O的梯度)。合并適當(dāng)?shù)募壏郑瑵饪s和凍干以得到白色固體。Rf(IPA/H2O/NH4OH，7/2/1)＝0.52.1H NMR(D2O，500MHz)δ1.64(dt，1H，J＝12.0，6.0)，2.50(dd，1H，J＝13.2，4.9)，3.38(d，J＝9.67，1H)，3.60(dd，J＝11.65，6.64，1H)，3.79(d，J＝4.11，1H)，3.87(dd，J＝12.24，1.0，1H)，3.97(m，2H)，4.07(td，J＝10.75，4.84，1H)，4.17(dd，J＝10.68，1.0，1H)，4.25(s，2H)，4.32(t，J＝4.4，1H)，4.37(t，J＝5.81H)，4.6-4.7(m，由溶劑的峰而導(dǎo)致模糊)，5.95(d，J＝4，1H)，6.03(d，J＝7.4，1H)，7.43-7.53(m，3H)，7.74(m，2H)，7.94(q，J＝7，3H).MS(ES)；對C35H42N5O18P([M-H]-)的計算值為850.7；實測值850.8。
制備胞苷-5’-單磷酰-[5-(N-甲氧基-聚氧乙烯-(1kDa)-3-氧代丙酰胺)-甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate]的一般方法。將甲氧基-聚氧乙烯-(1kDa平均分子量)-3-氧代丙酸-N-琥珀酰亞胺酯(52mg，52μmol)溶解于無水DMF(450μL)和三乙胺(33μL，238μmol)中。加入固體胞苷-5’-單磷酰-(5-甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate)(30mg，48μmol)。加入pH8的水(330μL)，且30分鐘后，加入另外28mg NHS-活化的PEG。再過5分鐘后，將反應(yīng)混合物進行層析(C-18硅，甲醇/水梯度)，并濃縮適當(dāng)?shù)募壏值玫?2mg(40％產(chǎn)量)的白色固體。Rf＝0.31(硅，IPA/H2O/NH4OH 7/2/1)；1H NMR(D2O，500MHz)δ1.66(td，1H，J＝5.3)，2.50(dd，1H，J＝13.2，4.6)，2.64(t，J＝5.99，3H)3.43(d，J＝9.58，1H)，3.63(m，1H)，3.71(s，70H)，3.79(m，由3.71的峰而導(dǎo)致模糊)，3.82(t，J＝6.19，1H)3.88(dd，J＝11.8，1.0，1H)，3.95(td，J＝9.0，2.3，1H)，3.98(t，J＝5.06，1H)，4.12(td，J＝10.34，4.66，1H)，4.18(d，J＝10.36，1H)，4.23(d，J＝4.85，2H)，4.31(t，J＝4.64，1H)，4.35(t，1H)，6.00(d，J＝4.55，1H)，6.13(d，J＝7.56，1H)，7.98(d，J＝7.54，1H).MS(MALDI)，[(M-CMP)-H]觀察值；1506.4，1550.4，1594.5，1638.5，1682.4，1726.4，1770.3，1814.4，1858.2。
制備胞苷-5’-單磷酰-{5-[N-(2，6-二甲氧基-聚氧乙烯-(20kDa)-3-氧代丙酰胺-賴氨酰酰胺-甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate}的一般方法。將2，6-二[甲氧基-聚氧乙烯-(20kDa平均分子量)-3-氧代丙酰胺]-賴氨酰酰胺-N-琥珀酰亞胺酯(367mg，9μmol)溶解于無水THF(7mL)和三乙胺(5μL，36μmol)中。將胞苷-5’-單磷酰-(5-甘氨酰酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate)(30mg，48μmol)溶解于1.0mL水中，并加入到反應(yīng)混合物中。將反應(yīng)物于室溫攪動4小時，然后進行層析(HPLC，Waters Xterra RP8，水/NH4OH，100％到20％甲醇/水/NH4OH的梯度，1mL/分鐘)以獲得白色固體，其Rt＝22.8分鐘。MS(MALDI)，[(M-CMP)-H]觀察值；43027.01(40,000-45,500)。
3.UDP-Gal-PEG的制備本實施例提出了制備UDP-Gal-PEG的一般方法。
將THF(0.5ml)中的348mg甲氧基-聚氧乙烯丙酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(mPEG-SPA，MW1,000)加入到25mg半乳糖胺-1-磷酸在1ml水的溶液中，隨后添加67μL三乙胺。將結(jié)果所得的混合物于室溫攪動17小時。在減壓下濃縮提供粗的反應(yīng)混合物，該粗的反應(yīng)混合物通過層析(C-18硅，應(yīng)用10％、20％、30％、40％含水MeOH的分級梯度)進行純化，以在合并適當(dāng)?shù)募壏植饪s至干燥后得到90mg(74％)的產(chǎn)物。Rf＝0.5(硅，丙醇/H2O/NH4OH 30/20/2)；MS(MALDI)，觀察值1356，1400，1444，1488，1532，1576，1620。-2-脫氧-2-(甲氧基-聚氧乙烯-丙酰胺-1kDa)-α-D-半乳糖胺。將2-脫氧-2-(甲氧基-聚氧乙烯-丙酰胺-1kDa)-α-1-單磷酸-D-半乳糖胺(58mg)溶解于6mL DMF和1.2mL吡啶中。然后加入UMP-morpholidate(60mg)，并于70℃將結(jié)果所得的混合物攪動48小時。濃縮后，將殘余物進行層析(C-18硅，應(yīng)用10％、20％、30％、40％、50％、80％MeOH的分級梯度)以在濃縮適當(dāng)?shù)募壏趾蟮玫?0mg產(chǎn)物。Rf＝0.54(硅，丙醇/H2O/NH4OH 30/20/2)。MS(MALDI)；觀察值1485，1529，1618，1706。-6-脫氧-6-(甲氧基-聚氧乙烯-氨基-2kDa)-α-D-半乳糖。將[α-1-(尿苷-5’-二磷酰)]-6-羰基醛(carboxaldehyde)-α-D-半乳糖(10mg)溶解于2mL 25mM的磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中，并用甲氧基-聚乙二醇胺(MW 2,000，70mg)處理，然后用25uL 1M NaBH3CN溶液于0℃進行處理。將結(jié)果所得的混合物于-20℃冷凍3日。將反應(yīng)混合物進行層析(HPLC，Water Xterra P8)，應(yīng)用0.015M NH4OH作為流動相A，MeOH作為流動相B，流速為1.0mL/分鐘。收集產(chǎn)物，濃縮得到固體Rt＝9.4分鐘。Rf＝0.27(硅，EtOH/H2O7/3)。-6-氨基-6-脫氧-α-D-半乳糖。將15mg乙酸銨加入到[α-1-(尿苷-5’-二磷酰)]-6-羰基醛(carboxaldehyde)-α-D-吡喃型半乳糖(10mg)在磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中的溶液中。然后加入1M NaBH3CN溶液(25μL)，并將混合物攪動24小時。將溶液進行濃縮并將殘余物進行層析(Sephadex G10)以獲得10mg白色固體。Rf＝0.62(硅，EtOH/0.1M NH4Ac)。-6-脫氧-6-(甲氧基-聚氧乙烯-丙酰胺，～2kDa)-α-D-吡喃型半乳糖。將[α-1-(尿苷-5’-二磷酰)]-6-氨基-6-脫氧-α-D-吡喃型半乳糖(5mg)溶解于1mL H2O中。然后加入甲氧基-聚乙二醇丙酰-NHS酯(MW～2,000，66mg)，然后加入4.6μL三乙胺。將結(jié)果所得的混合物在室溫攪動過夜，然后在HPLC(C-8硅)上純化以得到產(chǎn)物，Rt＝9.0分鐘。-6-脫氧-6-(甲氧基-聚氧乙烯-甲酰胺，～2kDa)-α-D-吡喃型半乳糖。將[α-1-(尿苷-5’-二磷酰)]-6-氨基-6-脫氧-α-D-吡喃型半乳糖(10mg)與甲氧基-聚乙二醇羧基-HOBT(MW 2,000，67mg)在1mL H2O中混合，隨后加入6.4mg EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亞胺鹽酸和4.6μL三乙胺。將結(jié)果所得的混合物在室溫攪動24小時。將混合物層析(C-8硅)以得到產(chǎn)物。
4.UDP-GlcNAc-PEG的制備本實施例提出了制備UDP-GlcNAc-PEG的一般方法。在方案17的左側(cè)，將保護的氨基糖二磷酸-核苷酸進行氧化以在糖的6-位形成醛。通過希夫堿的形成和還原將該醛轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的伯胺。使結(jié)果所得的加合物與m-PEG的對硝基苯酚碳酸酯接觸，該酯與胺反應(yīng)，從而使m-PEG通過酰胺鍵結(jié)合到糖核上。在方案17上部的右側(cè)，用化學(xué)氧化劑處理保護的氨基糖二磷酸-核苷酸以在糖核的6位碳上形成羧基。使羧基活化并與m-PEG胺反應(yīng)，從而使m-PEG通過酰胺鍵結(jié)合到糖核上。在方案17下部的右側(cè)，反應(yīng)基本與右側(cè)上部的相同，只是使起始的糖核苷酸與氧化性酶如脫氫酶接觸，而不是與化學(xué)氧化劑接觸。
方案17.
5.UDP-GalNAc-PEG的制備本實施例(方案18)提出了制備UDP-GalNAc-PEG的一般方法。上面提出的反應(yīng)開始于糖二磷酸-核苷酸，其中R是羥基1或保護的胺2。在步驟a中，用氧化酶和過氧化氫酶的混合物處理起始的糖，從而將糖的6位轉(zhuǎn)變?yōu)槿┎糠?3和4)。在步驟c中，通過希夫堿的形成和還原將該醛轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的胺(7和8)。在步驟e中，任選用活化的m-PEG衍生物處理該胺，從而將胺?；援a(chǎn)生相應(yīng)的m-PEG酰胺(11和13)?？蛇x擇地，在步驟f中，使胺與活化的m-PEG種類如m-PEG活性酯接觸，從而形成相應(yīng)的m-PEG酰胺(12和14)。在步驟b中，也用過氧化氫酶和氧化酶處理起始材料，完全氧化羥甲基部分，從而在6-位形成羧基。在步驟d中，將羧基部分活化，并隨后通過與m-PEG胺中間物反應(yīng)而轉(zhuǎn)變?yōu)閙-PEG加合物(9和10)。這示于方案18中。
方案18.
R1＝COCH2CH2(OCH2CH2)nOCH3R1＝NHCH2CH2(OCH2CH2)nOCH3a和b)半乳糖氧化酶和過氧化氫酶，溶于25mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中；c)NH4Ac，NaBH3CN，溶于25mM磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中；d)CH3(OCH2CH2)NH2，EDC，H2O；e).CH3(OCH2CH2)nNH2，NaBH3CN，H2O對于15和16；f)CH3O(CH2CH2O)nCH2CH2CONHS，H2O，Et3N
使氨基-糖磷酸與m-PEG N-羥基琥珀酰亞胺活性酯接觸，從而形成相應(yīng)的糖-PEG-酰胺。使該酰胺與UMP-morpholidate接觸以形成相應(yīng)的活性糖二磷酸-核苷酸。
方案19.
6.CMP-SA-乙酰丙酸的合成本實施例提出了合成CMP-SA-乙酰丙酸的程序。
2-乙酰丙酰胺-2-脫氧-D-吡喃甘露糖的制備。將氯甲酸異丁酯(100μL，0.77mmol)逐滴加入到乙酰丙酸(86μL，0.84mmol)、無水THF(3mL)和三乙胺(127μL，0.91mmol)的溶液中。將該溶液在室溫攪動3小時，然后逐滴加入到含有D-甘露糖胺鹽酸(151mg，0.7mmol)、三乙胺(127μL，0.91mmol)、THF(2mL)和水(2mL)的溶液中。將反應(yīng)混合物攪動15小時，然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干燥。將層析(硅，5-15％MeOH/CH2Cl2逐級梯度)用于分離產(chǎn)物，從而得到了0.156g(73％產(chǎn)量)白色固體Rf＝0.41(硅，CHCl3/MeOH/水 6/4/1)；1H NMR(D2O，500MHz)δ2.23(s，3H)，2.24(s，3H)，2.57(td，J＝6.54，3.68，2H)，2.63(t，J＝6.71，2H)，2.86-2.90(m，4H)，3.42(m，1H)，3.53(t，J＝9.76，1H)，3.64(t，J＝9.43，1H)，3.80-3.91(m，4H)，4.04(dd，J＝9.79，4.71，1H)，4.31(dd，J＝4.63，1.14，1H)，4.45(dd，J＝4.16，1.13，1H)，5.02(d，J＝1.29，1H)，5.11(s，J＝1.30，1H)，MS(ES)；C11H19NO7的計算值，277.27；實測值[M+1]277.9。
5-乙酰丙酰胺-3，5-雙脫氧-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate的制備。將丙酮酸鈉(0.616g，5.6mmol)和N-乙酰神經(jīng)氨酸醛縮酶(50U)添加到0.1M HEPES(pH7.5)中的2-乙酰丙酰胺-2-脫氧-D-吡喃甘露糖溶液中(0.156g，0.56mmol)。將反應(yīng)混合物加熱到37℃持續(xù)20小時，并隨后冷凍。然后將反應(yīng)混合物通過C18硅過濾、冷凍并凍干。將粗固體用快速層析(硅，首先應(yīng)用10-40％MeOH/CH2Cl2然后為CH2Cl2/MeOH/H2O 6/4/0.5)進行純化。合并并濃縮適當(dāng)?shù)募壏郑瑥亩玫?5mg(80％產(chǎn)量)白色固體Rf＝0.15(硅，CHCl3/MeOH/水 6/4/1)；1H NMR(D2O，500MHz)δ1.82(t，J＝11.9，1H)，2.21(dd，J＝13.76，4.84，1H)，2.23(s，3H)，2.57(appq，J＝6.6，2H)，2.86-2.95(m，2H)，3.15-3.18(m，1H)，3.28-3.61(復(fù)合的，1H)，3.60(dd，J＝11.91，6.66，1H)，3.75(td，J＝6.65，2.62，1H)，3.84(dd，J＝11.89，2.65，1H)，3.88-4.01(復(fù)合的，2H)，4.04(td，J＝11.18，4.67，1H)，MS(ES)；對C14H23NO10的計算值，365.33；實測值([M-1]-)，363.97。
胞苷-5’-單磷酰-(5-乙酰丙酰胺-3，5-雙脫氧-β-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate)的制備。將5-乙酰丙酰胺-3，5-雙脫氧-D-甘油-D-半乳糖-2-nonulopyranosuronate(50mg，137μmol)溶解于2mL的100mM HEPES(pH7.5)的緩沖液中，并加入1M MnCl2(300μL，300μmol)。將CTP-2Na+(79mg，1.5μmol)溶解于5mL HEPES緩沖液中并添加到糖中。添加唾酸轉(zhuǎn)移酶/CMP-神經(jīng)氨酸合成酶融合酶(11U)并將反應(yīng)混合物在室溫攪動45小時。將反應(yīng)混合物通過10,000MWCO濾器過濾并將含有反應(yīng)產(chǎn)物的濾液不經(jīng)進一步純化而直接應(yīng)用Rf＝0.35(硅，IPA/水/NH4OH 7/2/1)。
B.肽的糖綴合和糖PEG化α-蛋白酶抑制劑(α-抗胰蛋白酶)7.重組糖蛋白抗凝血酶III、胎球蛋白和α1-抗胰蛋白酶的唾液酸化本實施例提出了對幾種重組肽的唾液酸化形式的制備。
用ST3Gal III對重組糖蛋白的唾液酸化.檢查了幾個糖蛋白由重組大鼠ST3Gal III唾液酸化的能力。對于這些糖蛋白中的每一個，唾液酸化在各個糖蛋白作為商業(yè)產(chǎn)物的開發(fā)中將是有價值的加工步驟。
反應(yīng)條件.反應(yīng)條件總結(jié)于表11中。唾酸轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)在室溫和37℃之間進行24小時。唾液酸化的程度是通過確定整合入糖蛋白連接的寡糖中的14C-NeuAc的量而確定的。對于每一個蛋白質(zhì)的反應(yīng)條件參見表11。
表11.反應(yīng)條件
1“循環(huán)”指用描述于說明書中的標(biāo)準(zhǔn)條件(20mM NeuAc和2mM CMP)“原位”酶促生成CMP-NeuAc。緩沖液為0.1M HEPES，pH7.5。
表12中提出的結(jié)果證明盡管應(yīng)用了低水平的酶，但在每一個情況下均實現(xiàn)了顯著程度的唾液酸化?；镜兀趯傻玫哪┒税肴樘堑墓烙嫬@得了完全的唾液酸化。表12顯示唾液酸化反應(yīng)的結(jié)果。在各個研究<p>表7
a.用1μg/劑量天然Pn 7F型多糖或所述Pn 7F型多糖-TT軛合物的第三次免疫后兩周小鼠分組(每組10只)的抗-Pn 7F型多糖抗體水平的幾何平均值(與抗-Pn7F型多糖抗體水平為3200單位/mL的參考血清相比)與1SD置信區(qū)間。
方法C-9V血清型肺炎球菌軛合物對TT進行活化使其含有醛基在pH6.5，20-24℃，存在有20mM EDC，0.1M MES的條件下，用0.42M 1-氨基-2，3-丙二醇(APDO)活化破傷風(fēng)類毒素(4.2mg/mL)。反應(yīng)4小時之后，用1N NaOH中止反應(yīng)，所述反應(yīng)混合物的pH會升高至7.5-10。然后使用12-14kDa的透析膜，在4℃，用pH約為10.5的30mM NaCl，3mM Na2CO3進行緩沖液更換。采用紫色分析方法(參見Lee等人，Anal.Biochem.2001；29673-82)和Lowry分析(參見PierceCatalog 2003-2004，306頁)方法測定APDO對TT的修飾程度。將等分的TT-APDO與6mM NalO4反應(yīng)1小時，然后用pH約為10.5的30mMNaCl，3mM Na2CO3進行緩沖液更換。由此制備的TT的活化程度為每TT分子中約有26個APDO或醛基。
對Pn 9V型多糖進行活化使其含有酰肼基在20-24℃，在存在有36μL 0.2M三乙醇胺的條件下，用36μLCDAP(100mg/mL溶解于乙腈)將Pn 9V型多糖(0.4mL，10mg/mL)活化2-2.5分鐘?；罨Y(jié)束時，加入0.4mL 0.5M ADH并進行攪拌。將所述反應(yīng)混合物在20-24℃孵育18小時。使用12-14kDa的透析膜，在4℃，用pH7.5的10mM HEPES透析所述樣品。采用蒽酮分析方法測定所述多糖濃度，參見Keleti等人，《生物科學(xué)微量測定方法手冊61卷己糖(蒽達150mU/mg以實現(xiàn)完全唾液酸化。
本實施例證明用ST3Gal III唾酸轉(zhuǎn)移酶對重組糖蛋白的唾液酸化需要比預(yù)期更少的酶。對于一個千克級的反應(yīng)，需要約7,000單位的ST3GalIII唾酸轉(zhuǎn)移酶，而不是早期研究中所顯示的100,000-150,000單位。這些酶從天然來源的純化是不現(xiàn)實的，在大規(guī)模制備中于1-2個月后僅得到1-10個單位的產(chǎn)量。假設(shè)ST6Gal I和ST3Gal III唾酸轉(zhuǎn)移酶均是作為重組唾酸轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)的，且實現(xiàn)了兩個酶的相同的表達水平，那么相對于ST3Gal III唾酸轉(zhuǎn)移酶，ST6Gal I唾酸轉(zhuǎn)移酶需要14-21倍高(或更高)的發(fā)酵規(guī)模。對于ST6Gal I唾酸轉(zhuǎn)移酶，已報道了酵母中0.3U/l的表達水平(Borsig等人(1995)Biochem.Biophys.Res.Commun.21014-20)。在黑曲霉中已實現(xiàn)了ST3Gal III唾酸轉(zhuǎn)移酶1000U/升的表達水平。在現(xiàn)有的表達水平上，將需要300-450,000升的酵母發(fā)酵物以產(chǎn)生用ST6Gal I唾酸轉(zhuǎn)移酶對1kg糖蛋白進行唾液酸化所需要的足夠的酶。相反地，用ST3Gal III唾酸轉(zhuǎn)移酶對1kg糖蛋白進行唾液酸化需要少于10升黑曲霉發(fā)酵物。因而，生產(chǎn)用于大規(guī)模唾液酸化反應(yīng)的ST3Gal III唾酸轉(zhuǎn)移酶所需的發(fā)酵能力比生產(chǎn)ST6Gal I所需的低10-100倍；生產(chǎn)唾酸轉(zhuǎn)移酶的成本將成比例地減少。
Cri-IgG抗體8.Cri-IgG1抗體的糖重構(gòu)本實施例提出了對Cri-IgG1抗體進行體外重構(gòu)的方法。
在單克隆抗體Fc結(jié)構(gòu)域中Asn297的一個保守位點的N-糖基化可以調(diào)節(jié)其藥物代謝動力學(xué)性能和效應(yīng)子功能(Dwek等人，1995，J.Anat.187279-292；Boyd等人，1995，Mol.Immunol.321311-1318；Lund等人，1995，F(xiàn)ASEB J.1995，9115-119；Lund等人，1996，J.Immunol.1574963-4969；Wright &amp; Morrison，1998，J.Immunol.1603393-3402；Flynn &amp; Byrd，2000，Curr.Opin.Oncol.12574-581)。在細(xì)胞培養(yǎng)發(fā)酵或某些病理學(xué)狀況過程中，在該位點的糖基化模式中產(chǎn)生了顯著的異質(zhì)性。在Fc結(jié)構(gòu)域上結(jié)果所得的不同糖基化模式特征為具有0個、1個和2個末端半乳糖殘基的復(fù)雜二觸角結(jié)構(gòu)(分別為G0、G1和G2，參見表13)。觀察到的糖形式變異，如在末端半乳糖基化、截短的N-糖形式和等分的修飾中的變異已顯示可影響抗體的治療性質(zhì)，尤其是其通過補體結(jié)合和活化而調(diào)節(jié)靶細(xì)胞殺傷的能力(Boyd等人，1995，同上；Wright&amp; Morrison，1998，同上；Mimura等人，2000，Molec.Immunol.37697-706；Davies等人，2001，Biotechnol.Bioeng.74288-294)。
為了獲得Cri-IgG1抗體的不同糖形式并檢驗其Fc效應(yīng)子功能，應(yīng)用外切糖苷酶逐步修剪Cri-IgG1抗體以生成缺乏唾液酸的糖形式(G2，G1)、缺乏唾液酸和半乳糖的糖形式(G0)以及缺乏唾液酸、半乳糖和N-乙酰葡糖胺的糖形式(M3N2F)，如表13所示。這些分子隨后用不同的糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)奶沁M行修飾。將修飾條件發(fā)展為導(dǎo)致初始抗體聚糖結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌切问降臈l件M3N2、GnT-I-M3N2(應(yīng)用GnT-I添加了GlcNAc部分的M3M2形式)、G0、等分-G0(用GnT-III添加了等分的GlcNAc的G0部分)、半乳糖基化的等分-G0(添加了末端半乳糖部分的等分-G0糖形式)、G2、單唾液酸化的S1(α2，6)-G2(具有一個用α2，6-唾酸轉(zhuǎn)移酶添加的末端唾液酸部分的G2糖形式)、S1(α2，3)-G2(具有一個用α2，3-唾酸轉(zhuǎn)移酶添加的末端唾液酸部分的G2糖形式)和脫唾液酸化的S2(α2，3)-G2(G2糖形式)。在每一個糖重構(gòu)步驟后，聚糖結(jié)構(gòu)從抗體蛋白質(zhì)上酶促釋放，并用各種方法進行分析，包括通過毛細(xì)管電泳、2-AA HPLC表征和MALDI-TOF質(zhì)譜分析法進行分離。
表13.糖形式結(jié)構(gòu)的縮寫 ◇＝巖藻糖，□＝GlcNAc，○＝甘露糖，●＝半乳糖現(xiàn)在描述在這些實驗中應(yīng)用的材料和方法。
Cri-IgG1單克隆抗體.Cri-IgG1抗體獲自R.Jefferies(MRCCenter for Immune Regulation，The Medical School，Uniyersity ofBirmingham，英國)?？贵w是非重組抗體，且從人骨髓瘤中分離。抗體應(yīng)用三種方法制備。在第一種方法中，該方法稱為“DEAE”，抗體在相對溫和的條件下應(yīng)用DEAE離子交換柱進行分離。在第二種方法中，該方法稱為“SPA”，抗體在A蛋白柱(金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)A蛋白)上進行純化，其中具有低pH的洗脫步驟。在第三種方法中，該方法稱為“Fc”，用蛋白酶處理抗體，從而僅保留抗體的Fc部分，而去除了抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。這些抗體純化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，且不在此處詳細(xì)重述。
重構(gòu)抗體的親和純化.將通過外切糖苷酶或糖基轉(zhuǎn)移酶修飾的抗體在ProA-瓊脂糖4-快速流動柱(Amersham Bioscience，Arlington Heights，IL)上進行純化，用0.1M甘氨酸-HCl緩沖液(pH2.7)洗脫，并立即用1M pH9.5的Tris進行中和。將洗脫物應(yīng)用NAP-10柱(Amersham Bioscience，Arlington Heights，IL)進行緩沖液更換，更換為進行下一步糖基化的適當(dāng)緩沖液，如100mM pH6.5的MES或50mMpH7.2的Tris-HCl。于4℃在Tube-O-DialyzersTM(ChemiconInternational，Temecula，CA)上將重構(gòu)的終產(chǎn)物對PBS進行充分透析，MWCO為8kDa。
Cri-抗體的體外糖苷酶處理.應(yīng)用NAP-10柱(AmershamBioscience，Arlington Heights，IL)對抗體進行緩沖液更換，更換為50mM pH6.0的磷酸鈉/檸檬酸鈉。通過使抗體(5mg/mL)與20mU/mg蛋白質(zhì)神經(jīng)氨酸酶于37℃接觸過夜(以去除末端唾液酸部分)，與20mU/mg蛋白質(zhì)β-半乳糖苷酶于37℃接觸過夜(以去除末端半乳糖部分，從而導(dǎo)致G0糖形式)，和/或與2mU/mgβ-N-乙酰氨基己糖苷酶(來自刀豆，Seikagaku，Tokyo，日本)于37℃接觸過夜(以去除末端N-乙酰葡糖胺，從而導(dǎo)致M3N2糖形式)，以逐步在體外修剪糖部分。將樣品如上文所述進行親和純化。
Cri-抗體的體外糖基化.利用如下條件進行體外GnT1修飾，即應(yīng)用1mg/ml M3N2糖形式抗體作為底物，應(yīng)用25mU/mg重組人β1，2-甘露糖基-UDP-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶，在100mM pH6.5的MES、5mM MnCl2、5mM UDP-GlcNAc和0.02％NaN3的緩沖液中于32℃進行24小時。獲取等分試樣進行聚糖分析，且結(jié)果所得的產(chǎn)物如上文所述進行親和純化。
利用如下條件進行等分-糖形式的體外修飾，即應(yīng)用1mg/ml M3N2糖形式抗體作為底物，應(yīng)用25mU/mg β1，2-重組人甘露糖基-UDP-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶I，應(yīng)用25mU/mg β1，2-重組人甘露糖基-UDP-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶II，和應(yīng)用3.5mU/mg β1，4-重組小鼠甘露糖基-UDP-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶III，在100mM pH6.5的MES、10mM MnCl2、5mMUDP-GlcNAc和0.02％NaN3的緩沖液中于32℃進行24小時。獲取等分試樣進行聚糖分析，且剩余的產(chǎn)物如上文所述進行親和純化。
利用如下條件應(yīng)用G0糖形式抗體或等分糖形式抗體進行體外半乳糖基化，即通過使抗體與0.6U/mg重組牛奶β1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶在50mMpH7.4的Tris-HCl、150mM NaCl、5mM UDP-半乳糖、5mM MnCl2的緩沖液中于32℃接觸24小時。獲取等分試樣進行聚糖分析，且剩余的產(chǎn)物如上文所述進行親和純化。
利用如下條件應(yīng)用G2糖形式抗體(1mg/ml)進行體外唾液酸化，即通過使抗體與0.1U/mg ST3Gal3或0.1U/mg ST6Gal1、5mM CMP-唾液酸在50mM pH7.4的Tris、150mM NaCl和3mM CMP-SA的緩沖液中于32℃接觸24小時。獲取等分試樣進行聚糖分析，且剩余的產(chǎn)物如上文所述進行親和純化。
聚糖分析具有激光誘導(dǎo)的熒光探測的毛細(xì)管電泳.通過稀釋和在MicroconTMYM-30微量濃縮器(Millipore，Bedford，MA)上進行濃縮從糖重構(gòu)的抗體的等分試樣中去除緩沖劑成分和核苷酸糖。通過應(yīng)用制造商提供的方法使蛋白質(zhì)與PNGase F(Prozyme，San Leandro，CA)接觸而從該蛋白質(zhì)上釋放N-連接的寡糖。簡言之，使樣品于100℃在50mM pH7.5的磷酸鈉、0.1％SDS和50mM β-巰基乙醇的緩沖液中變性10分鐘。然后加入TX100至0.75％(v/v)以及10U PNGase F/200μg蛋白質(zhì)。于37℃溫育3小時后，將蛋白質(zhì)進行乙醇沉淀，并使上清液干燥。然后將釋放的游離寡糖用8-氨基芘-1，3，6-三磺酸進行標(biāo)記，并應(yīng)用購自Beckman-Coulter，Inc.(Fullerton，CA)的糖類標(biāo)記和分析試劑盒通過毛細(xì)管電泳進行分析，如制造商所顯示的(也參見Ma和Nashabeh，1999，Anal.Chem.715185-5192)。
毛細(xì)管電泳(CE)在eCAPTMN-CHO包被的毛細(xì)管(50μm I.D.，到探測器的長度為40cm；Beckman-Coulter，Inc.，F(xiàn)ullerton，CA)上進行，其中應(yīng)用具有激光誘導(dǎo)的熒光探測器(Beckman-Coulter，Inc.Fullerton，CA)的P/ACETMMDQ糖蛋白系統(tǒng)(Beckman-Coulter，Inc.Fullerton，CA)。通過20磅/英寸2的壓力作用10秒鐘將樣品引入到柱體中，然后在25kV下用反極性分離20分鐘。柱體溫度控制在20℃。電泳圖是由激光誘導(dǎo)的熒光探測法在488nm的激發(fā)波長和520nm的發(fā)射波長生成的。
糖類標(biāo)準(zhǔn)物(Calbiochem_，EMD Biosciences，Inc.，San Diego，CA)包括M3N2(無核心巖藻糖的N-連接的三甘露糖核心)、G0(脫唾液酸、脫半乳糖、雙觸角具有核心巖藻糖的N-連接的寡糖)、G2(脫唾液酸、雙觸角具有核心巖藻糖的N-連接的寡糖)和無巖藻糖的G2、S1-G2(無核心巖藻糖的單唾液酸化、半乳糖基化雙觸角寡糖)和S2-G2(無核心巖藻糖的二唾液酸化、半乳糖基化雙觸角寡糖)(購自Glyko，參見Prozyme，San Leandro，CA)、M3N2F(具有核心巖藻糖的N-連接的三甘露糖核心)和NGA2F(脫唾液酸、脫半乳糖、雙觸角具有核心巖藻糖和具有等分GlcNAc的N-連接的寡糖)，將這些糖類標(biāo)準(zhǔn)物用1-氨基芘-3，6，8-三磺酸鹽(APTS，Beckman-Coulter，Inc.，F(xiàn)ullerton，CA)進行標(biāo)記并用于鑒定從抗體釋放的聚糖的分布。
2-AA HPLC.根據(jù)略作修改的由Anumula和Dhume描述的方法(1998，Glycobiology 8685-694)，將PNGase F釋放的聚糖用2-AA(2-鄰氨基苯甲酸)進行標(biāo)記。將還原性胺化的N-聚糖用ShodexAsahipak NH2P-504D氨基柱(4.6mm×150mm)(Showa Denko K.K.，Tokyo，Japan)進行分析。用于分離的兩種溶劑為A)2％乙酸和1％四氫呋喃，溶于乙腈中，和B)5％乙酸、3％三乙胺和1％四氫呋喃，溶于水中。
為了分離2-AA標(biāo)記的中性聚糖，將柱子用70％A等度洗脫5分鐘，隨后為在60分鐘時間段內(nèi)從70％到50％B的線性梯度，隨后為在5分鐘時間段內(nèi)從50％到5％B的陡坡梯度，最后為用5％B等度洗脫10分鐘。洗脫的峰用熒光探測進行探測，其中在230nm激發(fā)，探測波長為420nm。在該梯度條件下，G0糖形式將在約30.5分鐘洗脫，G1糖形式將在約34.0分鐘洗脫，而G2糖形式將在約37.0分鐘洗脫。在這些條件下，巖藻糖的存在不改變洗脫時間。
為了分離2-AA標(biāo)記的陰離子聚糖，將柱子用70％A等度洗脫2.5分鐘，隨后為在97.5分鐘時間段內(nèi)從70％到5％A的線性梯度，最后為用5％A等度洗脫15分鐘。洗脫的峰用熒光探測進行探測，其中在230nm激發(fā)，在420nm探測。在該梯度條件下，中性聚糖預(yù)期在18.00-29.00分鐘之間洗脫，具有一個電荷的聚糖預(yù)期在30.00-40.00分鐘之間洗脫，具有兩個電荷的聚糖預(yù)期在43.00-52.00分鐘之間洗脫，具有三個電荷的聚糖預(yù)期在54.00-63.00分鐘之間洗脫，具有四個電荷的聚糖預(yù)期在65.00-74.00分鐘之間洗脫。
對還原性胺化的N-聚糖的MALDI分析.將用2-鄰氨基苯甲酸(2AA)標(biāo)記的PNGase-釋放的N-聚糖的小等分試樣在MF-Millipore薄膜濾器(0.025μm的孔，直徑47mm)上透析45分鐘，該薄膜濾器漂浮在水上。將透析的等分試樣在SpeedvacTM(ThermoSavant，Holbrook，NY)上干燥，重新溶解于小量水中，并與溶于水/乙腈(50∶50)中的2，5-二羥基苯甲酸(10g/L)溶液混合。
將混合物干燥于MALDI目標(biāo)上，并應(yīng)用在線性/負(fù)離子模式運行的Biosystems DE-Pro質(zhì)譜分析儀(Applied Biosystems，Inc.，F(xiàn)osterCity，CA)進行分析?；谟^察到的質(zhì)荷比和以前的文獻確定寡糖的結(jié)構(gòu)。未嘗試充分表征等壓結(jié)構(gòu)。
SDS-PAGE.為了確定糖重構(gòu)的抗體的穩(wěn)定性，將所有樣品通過SDS-PAGE進行分析。將樣品的終產(chǎn)物用8-16％Tris-甘氨酸凝膠(Invitrogen，Carlsbad，CA)在非還原條件下進行電泳。牛血清白蛋白在還原條件下進行電泳以作為定量標(biāo)準(zhǔn)物。將凝膠用GelCode BlueStain Reagent(Pierce Chemical Co.，Rockford，IL)進行染色，以進行顯色。
現(xiàn)在描述實驗的結(jié)果。
表達于人骨髓瘤細(xì)胞中的Cri的天然糖形式.從患有多發(fā)性骨髓瘤的患者血清中純化的Cri-IgG1抗體含有不定的糖形式。圖97A-97C顯示了從Cri-IgG1抗體中酶促釋放的聚糖的HPLC曲線。圖98A-98C顯示了從表達于人骨髓瘤細(xì)胞的Cri-IgG1抗體中酶促釋放的聚糖的MALDI曲線。主要的形式是半乳糖基化不足的G0、G1，而G2和唾液酸化結(jié)構(gòu)是相對少的(表14和圖97C)。為了檢驗修飾的聚糖對單克隆抗體治療性質(zhì)的影響，通過進行體外外切糖苷酶修剪和體外糖基化重構(gòu)對Cri-IgG1抗體進行修飾，以生成該抗體不同的糖形式。
表14.通過HPLC分離的人骨髓瘤細(xì)胞表達的Cri-IgG1不同糖形式的相對量是從各自的峰的面積計算得來的。
最初，外切糖苷酶修剪和糖基化中每一個步驟的優(yōu)化是在小規(guī)模上進行的(各100μg)。
Cri-IgG1抗體的三甘露糖核心糖形式(M3N2).通過糖苷酶的逐步處理生成M3N2，該糖苷酶包括神經(jīng)氨酸酶、β1，4-半乳糖苷酶和β1-2，3，4，6N-乙酰氨基己糖苷酶。為了估計糖重構(gòu)的Cri-IgG1抗體樣品上末端半乳糖和G1cNAc的去除，應(yīng)用了定量毛細(xì)管電泳(CE)方法。聚糖是用PNGase F從糖重構(gòu)的抗體上酶促釋放的，并用8-氨基芘-1，3，6-三磺酸(APTS)在還原性末端進行衍生化。結(jié)果所得的產(chǎn)物通過具有柱上激光誘導(dǎo)的熒光探測(LIF)的CE進行分析(Ma &amp; Nashabeh，1999，同上)。由于聚糖的分離是基于流體力學(xué)大小的不同，所以APTS標(biāo)記的聚糖以大小逐漸增加的順序進行遷移(M3N2＜M3N2F＜G0＜G1＜G2)。
圖99A-99D顯示從糖重構(gòu)的Cri-IgG1抗體釋放的聚糖以及用APTS衍生化的聚糖標(biāo)準(zhǔn)物(圖99A)的電泳圖。糖形式是通過將其電泳遷移率與標(biāo)準(zhǔn)物進行比較而鑒定的。每一個聚糖種類的相對量是從每一個所示的峰的相對面積百分比計算得來的，且結(jié)果示于表15中。M3N2F糖形式代表91％的DEAE-Cri聚糖、80％的SPA-Cri聚糖和100％的Fc-Cri聚糖。在來自DEAE-Cri(8.6％)和SPA-Cri(～20％)的聚糖結(jié)構(gòu)中觀察到導(dǎo)致GnT-I-M3N2F糖形式的GlcNAc部分的不完全去除(參見表15)。糖形式GnT-I-M3N2F是具有一個額外的GlcNAc的M3N2F糖形式，如可由GnT-I添加的。
表15.計算了圖99中CE曲線單獨的峰的面積，并確定了M3N2F和GnT-I-M3N2F糖形式的相對量。
脫半乳糖基化的糖形式(G0).具有G0糖形式的Cri-IgG1抗體是通過用神經(jīng)氨酸酶和β1，4-半乳糖苷酶逐步處理天然Cri-IgG1抗體而獲得的，每一個反應(yīng)進行24小時。從糖重構(gòu)的抗體釋放的聚糖通過CE、HPLC和MALDI進行分析。
圖100A顯示了釋放的聚糖的CE曲線。在所有三個樣品中，僅觀察到了一個峰，基于與標(biāo)準(zhǔn)物的比較將該峰命名為G0糖形式(
圖100A和表16)。
表16.通過CE和HPLC確定的Cri-IgG1 G0糖形式的相對量。
除了由CE提供的聚糖分析之外，定量HPLC方法也用于確定由Cri-IgG1抗體的重構(gòu)聚糖代表的G0糖形式的百分比。糖重構(gòu)抗體上的聚糖分布是通過用PNGase F酶促釋放聚糖和用2-鄰氨基苯甲酸(2-AA)在還原性末端衍生化釋放的產(chǎn)物而進行監(jiān)控的。衍生化的混合物在具有熒光探測的Shodex Asahipak NH2P-504D柱上通過HPLC進行分離。
圖101A-101C顯示從釋放的聚糖獲得的層析譜。由于在所有三個樣品中僅發(fā)現(xiàn)了一個主要的峰，所以HPLC結(jié)果證實了CE分析。與CE和HPLC數(shù)據(jù)一致，MALDI分析也顯示幾乎完全糖重構(gòu)為G0糖形式(
圖102A-102C)。
完全半乳糖基化的G2糖形式(G2).用神經(jīng)氨酸酶處理Cri-IgG抗體以獲得脫唾液酸糖形式，該糖形式也是半乳糖基化不足的。然后用0.6U/ml牛β1，4半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和半乳糖供體分子處理這些脫唾液酸糖形式，以將抗體糖重構(gòu)為具有G2糖形式。
末端半乳糖基化的程度是通過聚糖分析確定的。在CE和HPLC曲線中僅觀察到一個主要的峰(
圖103A-103C和
圖104A-104C)。該峰相應(yīng)于每一種情形中的G2糖形式。百分比總峰面積的計算顯示幾乎完全(～90％)從最初樣品的半乳糖基化不足糖形式轉(zhuǎn)變?yōu)镚2(參見表14)。這些結(jié)果總結(jié)于表17中。聚糖的MALDI分析進一步支持在所有樣品中幾乎完全糖重構(gòu)為G2糖形式(
圖105A-105C)。
表17.由CE和HPLC分析中百分比總峰面積確定的重構(gòu)Cri-IgI1抗體G2糖形式的相對量。
GnT-I-糖形式(GnT-I-M3N2).通過向分子添加一個GlcNAc部分而將M3N2糖形式Cri-IgG抗體糖重構(gòu)為GnT-I-M3N2糖形式。使該分子與25mU GnT-I/mg抗體和適當(dāng)?shù)腉lcNAc供體分子接觸。釋放的聚糖的CE、HPLC和MALDI分析(分別為
圖106A-106D、
圖107A-107C和
圖108A-108C)顯示最初的M3N2F糖形式被完全重構(gòu)。然而，僅有40-60％的修飾結(jié)構(gòu)是GnT-I-M3N2糖形式，而約30％是G0糖形式。G0糖形式的存在可能是在制備最初的M3N2形式時不完全的GlcNAc修剪的結(jié)果。
等分糖形式(NGA2F).通過使M3N2糖形式Cri-IgG抗體與三種轉(zhuǎn)移酶GnT-I、GnT-II和GnT-III的組合以及適當(dāng)?shù)腘-乙酰葡糖胺供體分子接觸而將其糖重構(gòu)為NGA2F糖形式。反應(yīng)在24小時內(nèi)完成。為了確定等分-G1cNAc部分添加到聚糖中的程度，應(yīng)用CE分析確定存在于糖重構(gòu)抗體上的糖形式。
圖109A-109D顯示從糖重構(gòu)的Cri-IgG1抗體釋放的聚糖的CE分析獲得的電泳圖。在重構(gòu)后出現(xiàn)了4個峰。一個主要的峰以與NGA2F標(biāo)準(zhǔn)糖形式相同的保留時間進行遷移。3個其他的次要峰可能是不完全重構(gòu)的聚糖。為了進行比較，也應(yīng)用了定量HPLC方法，其中2-AA標(biāo)記的聚糖以大小逐漸增加的順序洗脫(Gn1＜G0＜NGA2F)。如
圖110A-110C所示，從聚糖的CE分析中獲得了類似的結(jié)果。應(yīng)用CE或HPLC分析均未發(fā)現(xiàn)M3N2F。NGA2F聚糖是CE和HPLC分析的主要峰。仍然保留在樣品中的Gn1和G0聚糖可能是不完全修飾的結(jié)果。大多數(shù)最初的M3N2F糖形式通過3個GlcNAc部分重構(gòu)為NGA2F糖形式(60～70％)，約15～18％通過添加2個GlcNAc部分重構(gòu)為G0糖形式，而僅有少量(～7％)通過僅添加一個GlcNAc部分進行重構(gòu)。釋放的聚糖的MALDI分析(
圖111A-111C)顯示了具有1個、2個或3個末端GlcNAc部分的糖形式的峰，其與CE和HPLC分析(
圖109和110)一致。每一種聚糖種類的相對量是從每一個所示峰的相對面積百分比計算得來的，并總結(jié)于表18中。
表18.來自GnT-I、II和III重構(gòu)的Cri-IgG1的不同糖形式的相對量，由CE和HPLC所確定。
半乳糖基化的等分(Gal-NGA2F)糖形式.Cri-IgG1抗體的NGA2F糖形式是用牛β1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和適當(dāng)?shù)陌肴樘枪w進行糖重構(gòu)的。應(yīng)用0.6U/ml β1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶添加末端半乳糖部分。
圖112A-112D顯示用2-AA HPLC方法獲得的電泳圖。簡言之，末端為GalNAc的糖形式幾乎100％是半乳糖基化的。比較DEAE Cri-IgG1的
圖112A～112B和Fc Cri-IgG1的
圖112C～112D，GnT-I、II和III修飾的聚糖的2-AA HPLC曲線(
圖112A和112C)被GalT1修飾，從而所有聚糖的峰均由于添加半乳糖部分后大小增加而變得較晚洗脫(
圖112B和112D)。這些結(jié)果進一步得到了MALDI-MS分析的證實。
Cri-IgG1的唾液酸化(S2G2)糖形式.Cri-IgG1抗體的糖重構(gòu)G2糖形式進一步應(yīng)用ST3Gal3和ST6Gal1進行重構(gòu)。
圖113A-113C顯示了用ST3Gal3重構(gòu)的G2糖形式的HPLC曲線。大多數(shù)G2糖形式轉(zhuǎn)變?yōu)镾2G2糖形式(具有2個額外末端唾液酸部分的G2糖形式；～70％，參見表19)，僅有少量為S1G2糖形式(具有1個額外末端唾液酸部分的G2糖形式；＜25％，參見表19)。這些結(jié)果進一步得到了示于
圖114A-114C中的MALDI分析的證實。MALDI數(shù)據(jù)也顯示所有G2糖形式均被唾液酸化為S2G2或S1G2糖形式。
表7.實驗設(shè)計
從上述數(shù)據(jù)中可以推斷出用cH36處理過的動物對膿毒病具有較少的高動力型全身應(yīng)答。
如果需要的話，下述材料和方法被用于進行本實施例中的實驗。在表明的情況下，它們還可被用于本公開文本中的其它地方。
C.材料和方法在活的E.coli(1-2×1010CFU/kg)膿毒病發(fā)作之前12小時，被機械通風(fēng)(21％O2)、麻醉的狒狒(Papio cyanocephalus)通過靜脈被給予熱殺死的E.coli的劑量(1×109CFU/kg)。藥物的靜脈載入劑量(對于cH36-Fab，1.8mg/kg，或者對于cH36，2.7mg/kg)在注入活的微生物后2小時開始(14小時)，此時施予抗生素，接著是勻速注入每小時50mcg/kg的cH36-Fab或75mcg/kg/小時的cH36?？偟目贵w劑量為對cH36-Fab而言，3.5mg/kg，對cH36而言，5.25mg/kg。107細(xì)胞/mL重懸于HBSS-BSA中。將U937細(xì)胞(100μl，2×106細(xì)胞/mL)加入到塑料試管中，并將硝酸雙-N-甲基吖啶(20μl，2.5mM)加入到試管中。將試管于37℃水浴中加溫5分鐘。然后將敏化的紅細(xì)胞(80μl，2.5×107細(xì)胞/mL)加入到試管中。超氧化物陰離子生產(chǎn)是通過應(yīng)用Berthold LV953發(fā)光計(Berthold Australia Pty Ltd，Bundoora，澳大利亞)在30分鐘時間段內(nèi)于37℃時硝酸雙-N-甲基吖啶增強的化學(xué)發(fā)光進行測量的。
與天然抗體相比，G0和M3N2糖形式Cri-IgG1抗體分別具有92％和85％的相對抑制值。然而，天然Cri-IgG1抗體缺乏核心巖藻糖。Shields等人(2002，J.Biol.Chem.27726733-26740)提示缺乏核心巖藻糖將抑制值改進10倍?；谶@些結(jié)果，預(yù)期半乳糖基化-等分-G0糖形式的抑制值將高于等分-G0糖形式，等分-G0糖形式將大大高于G2糖形式，G2糖形式將大約等于二唾液酸化-G2糖形式和單唾液酸化-G2糖形式，二唾液酸化-G2糖形式和單唾液酸化-G2糖形式將高于天然抗體糖形式，天然抗體糖形式將高于G0糖形式，G0糖形式將高于M3N2糖形式。
補體受體-19.TP10的唾液酸化和巖藻糖基化本實施例提出了對具有唾液酸Lewis X部分的TP10的制備和對增強的生物學(xué)活性的分析。
即使短時間內(nèi)中斷到腦中的血流也可觸發(fā)大腦微血管結(jié)構(gòu)中的炎癥事件，這將加劇大腦組織的損傷。產(chǎn)生的該組織損傷可通過炎癥和凝結(jié)級聯(lián)的活化而增大。在中風(fēng)的鼠模型中，P-選擇蛋白和ICAM-1的增加的表達可促進白細(xì)胞的募集。sCR-1是補體受體-1(CR-1)的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的重組形式。sCR-1是補體活化的有力抑制劑。sCRlsLeX(CD20)是sCR1的替代性糖基化形式，對其進行了替代性糖基化以展示唾液酸化的LewisX抗原。以前，發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)于工程化的Lecll CHO細(xì)胞中表達和糖基化的sCR-1sLeX正確定位于缺血的大腦微血管中和表達Clq的神經(jīng)元中，從而抑制嗜中性粒細(xì)胞和血小板積聚并減少大腦梗死體積(Huang等人，1999，Science 285595-599)。在本實施例中，在體外通過聚糖重構(gòu)制備的sCRlsLeX顯示與體內(nèi)糖基化的sCRsLeX相似的增強的生物學(xué)活性。
TP10肽是在BUK B11 CHO細(xì)胞中表達的。該CHO細(xì)胞系產(chǎn)生具有典型CHO細(xì)胞糖基化的TP10肽，該肽具有許多但不是全部用唾液酸加帽的聚糖。
66mg TP10的唾液酸化.將TP10(2.5mg/mL)、CMPSA(5mM)和ST3Gal3(0.1U/mL)在50mM Tris、0.15M NaCl、0.05％疊氮化鈉，pH7.2中于32℃溫育48小時。將放射性標(biāo)記的CMP唾液酸添加到小的等份試樣中以監(jiān)控整合。TP10是用SEC HPLC從核苷酸糖中分離的。在24小時和48小時分析的樣品證明反應(yīng)在24小時后結(jié)束。然后使反應(yīng)混合物冷凍。將反應(yīng)產(chǎn)物進行熒光團輔助的糖電泳(Fluorophore AssistedCarbohydrate Electrophoresis)(FACE_；Glyko，Inc，Novato CA)分析(
圖119)。
藥物代謝動力學(xué)研究.購買具有頸靜脈插管的大鼠。將10mg/kg唾液酸化前或唾液酸化后的TP10肽通過尾部靜脈注射給予每一組處理的3只大鼠(n＝3)。從0～50小時獲取14個血液樣品。0小時后在每一個時間點，血液中唾液酸化后的TP10肽的濃度均比唾液酸化前的TP10的高(
圖120)。唾液酸的添加與起始材料相比，使藥物代謝動力學(xué)曲線的血漿濃度-時間曲線(AUC)下的面積加倍了(
圖121)。
唾液酸化TP10的巖藻糖基化.將10mL(25mg TP10)上述唾液酸化混合物解凍，并添加GDP-巖藻糖至5mM，MnCl2至5mM，及FTVI(巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶VI)至0.05U/mL。使反應(yīng)物在32℃溫育48小時。將反應(yīng)產(chǎn)物進行熒光團輔助的糖電泳(Fluorophore Assisted CarbohydrateElectrophoresis)(FACE_；Glyko，Inc，Novato CA)分析(
圖122)。向小的等份試樣中添加放射性標(biāo)記的GDP-巖藻糖以監(jiān)控整合。TP10是用SEC HPLC從核苷酸糖中分離的。在24小時和48小時分析的樣品證明反應(yīng)在24小時結(jié)束。測量對E-選擇蛋白的結(jié)合的體外測定法顯示添加巖藻糖可產(chǎn)生生物學(xué)活性的E-選擇蛋白配體(
圖123)。
EnbrelTM10.抗體EnbrelTM的糖PEG化本實施例提出了對抗體分子的O-連接聚糖的PEG化程序。在此，將EnbrelTM用作例子，然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解本程序可應(yīng)用于許多抗體分子。
EnbrelTM-SA-PEG(10KDa)的制備.將在PEG化之前使O-連接聚糖唾液酸化的或未唾液酸化的EnbrelTM(TNF-受體-IgG1-嵌合體)以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、5mM MnCl2、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與5mM UDP-半乳糖和0.1U/mL半乳糖基轉(zhuǎn)移酶于32℃溫育2日以對半乳糖基化不足的聚糖用半乳糖進行加帽。為了監(jiān)控半乳糖的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了14C-半乳糖-UDP配體；整合入肽中的標(biāo)記是在甲醇和水中用Toso Haas G2000SW分析型柱通過凝膠過濾而與游離標(biāo)記分離的。整合入肽中的放射性標(biāo)記是用內(nèi)置(in-line)的放射性探測器進行定量的。
當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時，使該溶液與1mM CMP-唾液酸-連接體-PEG(10kDa)和0.1U/mL的ST3Gal3于32℃溫育2日。為了監(jiān)控唾液酸-連接體-PEG的整合，將肽在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾分離。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas TSK-Gel-3000制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。將含有產(chǎn)物的級分合并、濃縮、交換緩沖液，然后凍干。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
促紅細(xì)胞生成素(EPO)11.GlcNAc向EPO的添加本實施例給出了GlcNAc殘基向三甘露糖核心的添加。
GlcNAc向EPO的添加.EPO是在SF-9昆蟲細(xì)胞中表達并純化的(Protein Sciences，Meriden，CT)。從Epo的三甘露糖糖形式向“三甘露糖核心+2 GlcNAc”(峰1，
圖124中的P1)的100％轉(zhuǎn)變是于32℃與100mU/ml GlcNAcT-I和100mU/ml GlcNAcT-II在下面的終反應(yīng)濃度時溫育24小時而實現(xiàn)的100mM MES pH6.5，或100mM Tris pH7.55mM UDP-GlcNAc20mM MnCl2100mU/ml GlcNAcT-I100mU/ml GlcNAcT-II1mg/ml EPO(純化的，表達于Sf9細(xì)胞，購自Protein Sciences)。
糖形式的分析.本測定是K-R Anumula和ST Dhume，Glycobiolgy8(1998)685-69的細(xì)微修改。N-聚糖酶(PNGase)釋放的N-聚糖是用鄰氨基苯甲酸進行還原標(biāo)記的。將還原性氨基化的N-聚糖注射入ShodexAsahipak NH2P-504D氨基柱(4.6mm×150mm)上。將兩種溶劑用于分離A)5％(v/v)的乙酸、1％的四氫呋喃和3％的三乙胺，溶于水中；和B)2％的乙酸和1％的四氫呋喃，溶于乙腈。然后使柱子用70％B等度洗脫2.5分鐘，隨后為在97.5分鐘的時間段上從70％到5％B的線性梯度，最后用5％B等度洗脫15分鐘。洗脫的峰是用熒光探測器進行探測的，激發(fā)波長為230nm和發(fā)射波長為420nm。
在這些條件下，三甘露糖核心具有22.3分鐘的保留時間，且GnT反應(yīng)的產(chǎn)物具有30分鐘的保留時間。起始材料都為具有核心GlcNAc的三甘露糖核心(
圖124)。
12.具有多觸角復(fù)雜聚糖的EPO的制備本實施例提出了從昆蟲細(xì)胞表達的EPO制備PEG化的、雙觸角的EPO和三觸角的唾液酸化的EPO。
對來自桿狀病毒/Sf9表達系統(tǒng)的重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)(Protein Sciences Corp.，Meriden，CT)進行聚糖分析，且結(jié)果所得的聚糖顯示主要為具有核心巖藻糖的三甘露糖核心，只有小百分比的聚糖也具有單個GlcNAc。
用GnT-I和GnT-II添加N-乙酰葡糖胺.使兩批rhEPO(1mt/ml)與GnT-I和GnT-II、5mM UDP-GlcNAc、20mM MnCl2和0.02％疊氮化鈉在100mM pH6.5的MES中于32℃溫育24小時。A批含有20mg EPO和100mU/mL GnT-I和60mU/mL GnT-II。B批含有41mg EPO和41mU/mL GnT-I+50mU/mL GnT-II。在反應(yīng)后，將樣品通過凝膠過濾脫鹽(PD10柱子，Pharmacia LKB Biotechnology Inc.，Piscataway，NJ)。
由2-AA HPLC圖譜分析的EPO聚糖.該測定法是對Anumula和Dhume，Glycobiology 8(1998)685-69的細(xì)微修改。將還原性氨基化的N-聚糖注射入Shodex Asahipak NH2P-50 4D氨基柱(4.6mm×150mm)上。將兩種溶劑用于分離A)5％(v/v)的乙酸、1％的四氫呋喃和3％的三乙胺，溶于水中；和B)2％的乙酸和1％的四氫呋喃，溶于乙腈中。然后使柱子用70％B等度洗脫2.5分鐘，隨后為在100分鐘的時間段上從70％到5％B的線性梯度，最后用5％B等度洗脫20分鐘。洗脫的峰是用230nm的激發(fā)波長和420nm的發(fā)射波長進行熒光探測的。非唾液酸化的N-連接聚糖處于23-34分鐘的LC范圍內(nèi)，單唾液酸化的處于34-42分鐘，二唾液酸化的處于42-52分鐘，三唾液酸化的處于55-65分鐘，而四唾液酸化的處于68-78分鐘。
通過2AA HPLC的聚糖表征揭示A批中有92％轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袃蓚€GlcNAc的雙觸角結(jié)構(gòu)(其余(balance)具有單個GlcNAc)。B批顯示有97％轉(zhuǎn)變?yōu)橄胍漠a(chǎn)物(
圖125A和125B)。
用GnT-V引入第三個觸角分支.使來自GnT-I和GnT-II反應(yīng)的產(chǎn)物EPO(B批的1mg/mL)在PD-10柱子上脫鹽和隨后濃縮后與10mU/mLGnT-V和5mM UDP-GlcNAc在100mM pH6.5的MES中于32℃溫育24小時，該MES含有5mM MnCl2和0.02％疊氮化鈉。2AA HPLC分析證明轉(zhuǎn)變是以92％的效率發(fā)生的(
圖126)。
在脫鹽(PD-10)和濃縮后，用rGalTI添加半乳糖即將EPO(1mg/ml)與0.1U/ml GalT1、5mM UDP-半乳糖、5mM MnCl2于32℃溫育24小時。
對來自EPO的還原性氨基化的N-聚糖的MALDI分析.將已用鄰氨基苯甲酸進行還原性標(biāo)記的用PNGase從EPO釋放的N-聚糖的小等份試樣在漂浮于水上的MF-Millipore薄膜濾器(0.025μm的孔，直徑47mm)上透析45分鐘。透析的等份試樣在真空離心蒸發(fā)濃縮器中干燥，再次溶解于小量的水中，并與溶解于水/乙腈(50∶50)的2，5-二羥基苯甲酸(10g/L)溶液混合。使該混合物在目標(biāo)上干燥并用以線性/負(fù)離子模式運行的Applied Biosystems DE-Pro MALDI-TOF質(zhì)譜儀進行分析。寡糖是基于觀察到的質(zhì)荷比和以前的文獻而確定的。
由MALDI對釋放的聚糖的分析顯示半乳糖是定量添加到所有可用位點的(
圖127)。然后將來自上述的半乳糖基化的EPO通過在Superdex1.6/60柱子上于50mM Tris、0.15M NaCl，pH6中進行凝膠過濾而純化。
唾液酸化.在濃縮和脫鹽(PD-10)后，使10mg半乳糖基化的EPO(1mg/mL)與ST3Gal3(0.05U/mL)和CMP-SA(3mM)在含有0.02％疊氮化鈉的pH7.2的50mM Tris、150mM NaCl中溫育。單獨的等份試樣含有放射性標(biāo)記的CMP-SA。將結(jié)果所得的整合標(biāo)記和自由標(biāo)記通過等度的大小排阻層析/HPLC在45％MeOH、0.1％TFA中以0.5mL/分鐘進行分離(7.8mm×30cm的柱子，顆粒大小5μm，TSK G2000SWXL，Toso Haas，Ansys Technologies，Lake Forest，CA)。利用該程序，整合了12％的數(shù)目(360微摩爾，于33微摩爾EPO，或約10.9摩爾/摩爾)。理論值(3N-連接的位點，三觸角的)為約9摩爾/摩爾的整合。這些符合本方法的限制范圍。在用ST6Gal1代替ST3Gal3的相同反應(yīng)中，5.7％的放射性標(biāo)記整合入半乳糖基化的EPO中，或與ST3Gal3相比約48％。
13.昆蟲細(xì)胞中產(chǎn)生的EPO的糖PEG化本實施例提出了從昆蟲細(xì)胞表達的EPO制備PEG化的雙觸角EPO。
將來自桿狀病毒/Sf9表達系統(tǒng)的重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)(Protein Sciences Corp.，Meriden，CT)進行聚糖分析，且顯示聚糖主要為具有核心巖藻糖的三甘露糖核心，而小百分比的聚糖也具有單個的GlcNAc(
圖128)。
用GnT-I和GnT-II添加N-乙酰葡糖胺.使兩批rhEPO(1mg/ml)與GnT-I和GnT-II、5mM UDP-GlcNAc、20mM MnCl2和0.02％疊氮化鈉在100mM pH6.5的MES中于32℃溫育24小時。A批含有20mg EPO和100mU/mL GnT-I和60mU/mL GnT-II。B批含有41mg EPO和41mU/mL GnT-I+50mU/mL GnT-II。在反應(yīng)后，將樣品通過凝膠過濾脫鹽(PD10柱子，Pharmacia LKB Biotechnology Inc.，Piscataway，NJ)。
通過2AA HPLC的聚糖表征揭示A批有92％轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂袃蓚€GlcNAc的雙觸角結(jié)構(gòu)(其余具有單個GlcNAc)。B批顯示97％轉(zhuǎn)變?yōu)橄胍漠a(chǎn)物(
圖125A和125B)。
A批EPO的半乳糖基化.將EPO(～16mg的A批)用GnT-II處理以完成GlcNAc的添加。該反應(yīng)在含有150mM NaCl、EPOmg/mL、1mMUDP-GlcNAc、5mM MnCl2、0.02％疊氮化鈉和0.02U/ml GnT-II的pH7.2的50mM Tris中于32℃進行4小時。然后通過將UDP-半乳糖添加至3mM和將GalT1添加至0.5U/ml并于32℃溫育48小時而進行EPO的半乳糖基化。
半乳糖基化的EPO然后在50mM Tris、0.15M NaCl，pH6中于Superdex75 1.6/60柱子上通過凝膠過濾而純化。含有EPO的峰然后通過2AA HPLC進行分析?；贖PLC的數(shù)據(jù)，在半乳糖基化反應(yīng)后～85％的聚糖含有兩個半乳糖，且～15％的聚糖不具有任何半乳糖。
半乳糖基化的EPO的唾液酸化.半乳糖基EPO的唾液酸化是在100mM含有150mM NaCl、0.5mg/ml EPO、200U/ml ST3Gal3的Tris中與0.5mM CMP-SA或CMP-SA-PEG(1kDa)或CMP-SA-PEG(10kPa)于32℃進行48小時的。在與CMP-SA的唾液酸化反應(yīng)后幾乎所有具有兩個半乳糖殘基的聚糖均是完全唾液酸化的(2個唾液酸/聚糖)。MALDI-TOF分析證實了HPLC數(shù)據(jù)。
半乳糖基化的EPO的PEG化.對于應(yīng)用CMP-SA-PEG(1kDa)和CMP-SA-PEG(10kDa)的PEG化反應(yīng)，將反應(yīng)混合物的等份試樣用SDS-PAGE進行分析(
圖129)。EPO肽的分子量隨著添加每一個糖而增加，且在PEG化反應(yīng)后分子量有更急劇的增加。
EPO的體外生物測定.體外EPO測定(從Hammerling等人，1996，J.Pharm.Biomed.Anal.141455-1469改編)基于TF-1細(xì)胞系對多種濃度EPO的反應(yīng)性。TF-1細(xì)胞提供了研究髓樣祖先細(xì)胞增殖和分化的良好系統(tǒng)。該細(xì)胞系是由T.Kitamura等人于1987年10月從來自一個患有嚴(yán)重的各類血細(xì)胞減少癥的35歲日本男性的肝素化的骨髓吸取樣品中建立的。這些細(xì)胞完全依賴于白細(xì)胞介素3或粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。
TF-1細(xì)胞系(ATCC，Cat.No.CRL-2003)生長于RPMI+FBS 10％+GM-CSF(12ng/ml)中并于37℃在5％CO2中溫育。該細(xì)胞以5000個細(xì)胞/ml培養(yǎng)基的濃度存在于懸浮液中，并將200μl放置于96孔平板中。使該細(xì)胞與各種濃度的EPO(0.1μg/ml-10μg/ml)溫育48小時。然后進行MTT生存力測定，該測定如下添加25μl的5mg/ml MTT(SIGMA M5655)、使平板于37℃溫育20分鐘～4小時、添加100μl異丙醇/HCl溶液(100ml異丙醇+333μl HCl 6N)、在570nm和630nm或690nm讀取OD，并從570nm的讀數(shù)中減去630nm或690nm的讀數(shù)。
圖130含有當(dāng)將唾液酸化的EPO和用1kDa或10kDa PEG進行糖PEG化的EPO進行體外EPO生物活性檢驗時所得的結(jié)果。當(dāng)均在約5μg/ml的濃度時，用1kDa PEG進行糖PEG化的EPO與未進行糖PEG化的EPO具有幾乎相同的活性。當(dāng)均在約5μg/ml的濃度時，用10kDa PEG進行糖PEG化的EPO具有未進行糖PEG化的EPO約一半的活性。
14.CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的EPO的O-連接聚糖的糖PEG化O-連接的EPO-SA-PEG(10kDa)的制備.將最初由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的脫唾液酸化-EPO以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與5mM CMP-SA和0.1U/mL的ST3Gal3于32℃溫育2日。為了監(jiān)控唾液酸向N-連接聚糖中的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了CMP-SA-14C；肽是在應(yīng)用甲醇和水的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾分離的，產(chǎn)物是用放射探測器探測的。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時，將溶液用Centricon-20濾器進行濃縮。將剩余的溶液與0.05MTris(pH7.2)、0.15M NaCl、0.05％NaN3交換緩沖液到7.2mL的終體積，直到不再探測到CMP-SA。然后將存留物以2.5mg/mL蛋白質(zhì)重懸于0.05M Tris(pH7.2)、0.15M NaCl、0.05％NaN3中。為了使O-連接位點糖基化，使該溶液與1mM CMP-SA-PEG(10kDa)和ST3Gal1于32℃溫育2日。為了監(jiān)控唾液酸-PEG的整合，將反應(yīng)物的小等份試樣在應(yīng)用PBS pH7.0進行洗脫的Toso Haas TSK-凝膠-3000分析型柱上通過凝膠過濾分離并通過UV探測進行分析。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.0)的Toso Haas TSK-凝膠-3000制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
15.EPO-運鐵蛋白本實施例提出了使蛋白質(zhì)與O-連接聚糖進行糖綴合的程序，特別是將運鐵蛋白與EPO進行糖綴合。使唾液酸殘基從EPO的O-連接聚糖上去除，并制備EPO-SA-連接體-SA-CMP。用ST3Gal3使EPO-SA-連接體-SA-CMP與脫唾液酸化運鐵蛋白進行糖綴合。
O-連接的脫唾液酸化-EPO的制備.將CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的EPO(促紅細(xì)胞生成素)以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl中，并使其與300mU/mL唾液酸酶(霍亂弧菌(Vibrio cholera))-瓊脂糖綴合物于32℃溫育16小時。為了監(jiān)控反應(yīng)，將反應(yīng)物的小等份試樣用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋并根據(jù)Invitrogen的程序運行IEF凝膠。將混合物在10,000rpm離心并收集上清液。將上清液濃縮至50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3、pH7.2中約2.5mg/mL的EPO濃度。使該溶液與5mM CMP-唾液酸和0.1U/mL的ST3Gal3于32℃溫育2日。為了監(jiān)控唾液酸的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了CMP-SA-熒光配體；整合入肽中的標(biāo)記是在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而與游離標(biāo)記分離的。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。將樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
EPO-SA-連接體-SA-CMP的制備.將O-連接的脫唾液酸化-EPO以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與1mM CMP-唾液酸-連接體-SA-CMP和0.1U/mL的ST3Gal1于32℃溫育2日。為了監(jiān)控唾液酸-連接體-SA-CMP的整合，將肽在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而分離。
2日后，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso HaasG3000SW制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
運鐵蛋白-SA-連接體-SA-EPO的制備.將上述EPO-SA-連接體-SA-CMP以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與2.5mg/mL脫唾液酸化運鐵蛋白和0.1U/mL的ST3Gal3于32℃溫育2日。為了監(jiān)控運鐵蛋白的整合，將肽在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而分離，且產(chǎn)物通過UV吸收而探測。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時，使該溶液與5mM CMP-SA和0.1U/mL的ST3Gal3(以向任何未反應(yīng)的運鐵蛋白聚糖進行加帽)于32℃溫育2日。將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso HaasG3000SW制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
16.EPO-GDNF本實施例提出了對蛋白質(zhì)進行糖綴合的程序，特別是EPO-SA-連接體-SA-GDNF的制備。
EPO-SA-連接體-SA-GDNF的制備.將上述EPO-SA-連接體-SA-CMP以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與2.5mg/mL GDNF(在NSO細(xì)胞中產(chǎn)生)和0.1U/mL的ST3Gal3于32℃溫育2日。為了監(jiān)控GDNF的整合，將肽在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而分離，且產(chǎn)物通過UV吸收而探測。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時，使該溶液與5mM CMP-SA和0.1U/mL的ST3Gal3(以向任何未反應(yīng)的GDNF聚糖進行加帽)于32℃溫育2日。將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso HaasG3000SW制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
17.EPO的單觸角糖PEG化本實施例提出了制備糖PEG化的單觸角促紅細(xì)胞生成素(EPO)的方法，及其體外和體內(nèi)生物活性。
當(dāng)EPO(GenBank Accession No.P01588)表達于CHO細(xì)胞中時，在氨基酸殘基24、38和83形成N-連接的聚糖，而在氨基酸殘基126形成O-連接的聚糖(
圖131；Lai等人，1986，J.Biol.Chem.2613116-3121)。該糖蛋白的生物活性直接與NeuAc含量相關(guān)。增加的唾液酸降低了EPO在體外與其受體的結(jié)合；然而增加的唾液酸增加了EPO的體內(nèi)生物活性。O-連接的聚糖對EPO的體外或體內(nèi)活性或該分子的藥物代謝動力學(xué)沒有影響(Wasley等人，1991，Blood 772624-2632)。
當(dāng)EPO表達于昆蟲細(xì)胞中時，如應(yīng)用桿狀病毒/Sf9表達系統(tǒng)所實現(xiàn)的(也參見Wojchowshi等人，1987，Biochem.Biophys.Acta910224-232；Quelle等人，1989，Blood 74652-657)，在氨基酸殘基24、38和83形成N-連接的聚糖，而在氨基酸殘基126不形成O-連接的聚糖(
圖132)。這是因為昆蟲細(xì)胞不具有識別EPO的氨基酸殘基126周圍的氨基酸序列的糖基轉(zhuǎn)移酶。大多數(shù)N-連接的聚糖由GlcNAc2Man3Fuc組成。在本實施例中，對表達于昆蟲細(xì)胞中的EPO進行高效重構(gòu)以通過使蛋白質(zhì)在適當(dāng)?shù)墓w分子存在時連續(xù)地與GnT1、2、GalT-1和ST接觸而生成復(fù)合聚糖SA2Gal2GlcNAc2Man3FucGlcNAc2。這些酶促反應(yīng)是在昆蟲細(xì)胞表達的EPO上應(yīng)用此處所述的反應(yīng)條件進行的，從而92％的總效率產(chǎn)生此處的復(fù)合聚糖(表21)。任選地，也可添加O-連接的聚糖(O’Connell和Tabak，1993，J.Dent.Res.721554-1558；Wang等人，1993，J.Biol.Chem.26822979-22983)。
表21.在昆蟲細(xì)胞表達的EPO(“起始材料”)上和在每一個連續(xù)的酶促重構(gòu)步驟后在EPO上的聚糖結(jié)構(gòu)群體中每一種聚糖結(jié)構(gòu)種類的百分比。
◇＝巖藻糖，□＝GlcNAc，○＝甘露糖，◎＝半乳糖，▲＝N-乙酰神經(jīng)氨酸同樣在本實施例中，將表達于昆蟲細(xì)胞中的EPO進行重構(gòu)以形成單觸角的、雙觸角的和三觸角的聚糖，該聚糖隨后用本文中別處描述的方法用1kDa、10kDa和20kDa PEG分子進行糖PEG化。確定這些EPO形式的分子量，然后與具有3個N-連接的聚糖的EpoetinTM和具有5個N-連接的聚糖的NESP(AranespTM)進行比較(
圖133)。制備雙觸角和三觸角聚糖結(jié)構(gòu)的實例在此處的實施例7中給出。
具有單觸角PEG化聚糖結(jié)構(gòu)的EPO通過如下方法制備，即通過在昆蟲細(xì)胞中表達EPO肽，然后在GlcNAc供體存在時使EPO肽僅與GnTI(或者可選擇地僅與GnTII)接觸。然后在半乳糖供體存在時使EPO肽與GalT-I接觸。然后在SA-PEG供體分子存在時使EPO肽與ST接觸(
圖134A)以生成具有3個N-連接的單觸角PEG化聚糖結(jié)構(gòu)的EPO肽(
圖134B)。
從昆蟲細(xì)胞表達的EPO生成的EPO-SA和EPO-SA-PEG的體外生物活性是通過測量該分子刺激TF-1紅白血病細(xì)胞的增殖來估計。三觸角EPO-SA-PEG 1kDa展示幾乎所有三觸角EPO-SA的生物活性，而雙觸角EPO-SA-PEG 10kDa在某些EPO濃度范圍內(nèi)展示幾乎所有雙觸角EPO-SA的生物活性(
圖135)。生成于昆蟲細(xì)胞中的重構(gòu)和糖PEG化的EPO展示高達94％的EpogenTM的體外生物活性，該EpogenTM是不具有進一步的聚糖重構(gòu)或PEG化的表達于CHO中的EPO(表22)。
表22.在2μg/ml蛋白質(zhì)和48小時時與EpogenTM相比的EPO構(gòu)建體的體外活性。
1三觸角的-SA2，3構(gòu)建體具有以2，3鍵結(jié)合的SA分子。
確定了糖PEG化的和非糖PEG化的EPO的體內(nèi)藥物代謝動力學(xué)。將糖PEG化的和非糖PEG化的[I125]-標(biāo)記EPO推注到大鼠中，并確定分子的藥物代謝動力學(xué)。與雙觸角的EPO相比，雙觸角的EPO-PEG 1kDa的AUC高1.8倍，而雙觸角的EPO-PEG 10kDa的AUC高11倍(
圖136)。與雙觸角的EPO相比，雙觸角的EPO-PEG 1kDa的AUC高1.6倍，而雙觸角的EPO-PEG 10kDa的AUC高46倍(
圖136)。因此，糖PEG化大大改善了EPO的藥物代謝動力學(xué)。
也通過測量EPO構(gòu)建體刺激網(wǎng)狀細(xì)胞增多的程度來確定糖PEG化的和非糖PEG化的EPO的體內(nèi)生物活性。網(wǎng)狀細(xì)胞增多是紅細(xì)胞前體細(xì)胞成熟為成熟紅細(xì)胞(erythrocyte)的速率的測量。對每個處理組的8只小鼠進行10μg蛋白質(zhì)/Kg的單次皮下注射，并在96小時測量網(wǎng)狀細(xì)胞百分比(
圖137)。三觸角和雙觸角PEG化的EPO比非PEG化的EPO形式(包括EpogenTM)展示更高的體內(nèi)生物活性。
EPO構(gòu)建體體內(nèi)生物活性的進一步確定通過如下方法進行估計，即通過在以2.5μg肽/Kg體重的EPO構(gòu)建體進行每周三次的腹膜內(nèi)注射后15日測量CD-1雌性小鼠的血細(xì)胞比容(由紅細(xì)胞組成的全血的百分比)。血細(xì)胞比容增量隨EPO形式的大小而增加，82.7kDa的單觸角EPO-PEG 20kDa具有略大于35.6kDa的NESP(AranespTM)的活性，且其活性是28.5kDa的EpogenTM的生物活性的約2倍(
圖138)。
本實施例闡明生成更長作用時間的糖PEG化EPO是可行的。糖PEG化EPO的藥物代謝動力學(xué)特征可以通過改變糖PEG化位點數(shù)目和添加后用于改變肽在血流中的半衰期的PEG分子大小來定制。最后，糖PEG化的EPO保持了體外和體內(nèi)生物活性。
18.唾液酸化和PEG化的單-、雙-和三-觸角EPO的制備和生物活性本實施例闡明了糖PEG化的EPO的生產(chǎn)，特別是具有在其上連接了PEG的單觸角和雙觸角聚糖的PEG化的EPO。生產(chǎn)了下述EPO變體單觸角PEG(1kDa)和PEG(20kDa)；雙觸角2，3-唾液酸(SA)、雙觸角SA-PEG(1kDa)、雙觸角SA-PEG(10kDa)；用2，3-SA進行加帽的三觸角2，3-SA和三觸角2，6-SA。
表達于昆蟲細(xì)胞的重組促紅細(xì)胞生成素(rEPO)獲自ProteinSciences(Lot #060302，Meridan CT)。該批EPO的聚糖組成具有約98％的三甘露糖核心結(jié)構(gòu)。
圖139A描述了從該EPO釋放的聚糖的HPLC分析，其中峰“P2”表示三甘露糖核心。
圖139B顯示釋放的聚糖的MALDI分析，其中釋放的聚糖的結(jié)構(gòu)示于它們代表的峰旁邊。
單觸角分支進行了幾個步驟以產(chǎn)生單觸角分支的結(jié)構(gòu)。簡言之，第一步是GnT-I/GalT-1反應(yīng)，隨后用Superdex-75層析進行純化。該反應(yīng)向三甘露糖核心的一個分支添加GlcNAc部分，向GlcNAc部分添加半乳糖部分。分支通過用ST3Gal3反應(yīng)在末端半乳糖部分上添加SA-PEG(10kDa)部分或SA-PEG(20kDa)部分來延伸。最后的純化是用Superdex-200層析實現(xiàn)的(Amersham Biosciences，Arlington Heights，IL)。
GnT-I/GalT-1反應(yīng).組合GnT-I和GalT-1反應(yīng)物，并于32℃溫育36小時。反應(yīng)物含有1mg/mL EPO、100mM Tris-Cl pH7.2、150mM NaCl、5mM MnCl2、0.02％NaN3、3mM UDP-GlcNAc、50mU/mg GnT-I、3mM UDP-Gal和200mU/mg GalT-1。
圖140描述了在GnT-I/Gal T-1反應(yīng)后從EPO釋放的聚糖的MALDI分析。聚糖分析顯示約90％的聚糖具有預(yù)期的單觸角分支結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有末端半乳糖部分。
Superdex-75純化.在GnT-I/GalT-1反應(yīng)后，應(yīng)用1.6cm×60cm的Superdex-75凝膠過濾層析(Amersham Biosciences，ArlingtonHeights，IL)在含有0.02％Tween 20的PBS(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)中從酶蛋白質(zhì)污染物和核苷酸糖純化EPO。
ST3Gal3反應(yīng).將ST3Gal3 PEG化反應(yīng)物干32℃溫育24小時。反應(yīng)物含有1mg/mL EPO、100mM Tris-Cl pH7.2、150mM NaCl、0.02％NaN3、200mU/mg ST3Gal3和0.5mM CMP-SA-PEG(10kDa)或0.5mM CMP-SA-PEG(20kDa)。
圖141描述了該反應(yīng)后的EPO的SDS-PAGE分析。蛋白質(zhì)條帶的相應(yīng)分子量顯示通過GnT-I/GalT-1反應(yīng)形成的EPO聚糖完全被PEG衍生物唾液酸化。
Superdex-200純化.然后應(yīng)用1.6cm×60cm的Superdex-200凝膠過濾層析(Amersham Biosciences，Arlington Heights，IL)在含有0.02％Tween 20的PBS中從ST3Gal3反應(yīng)污染物純化EPO。
單觸角PEG化EPO的TF-1細(xì)胞體外生物測定.將TF-1細(xì)胞系用于估計體外EPO的活性。TF-1細(xì)胞系是可從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Catalogue No.CRL-2003，Rockville，MD)獲得的骨髓祖先細(xì)胞系。該細(xì)胞系的生存力完全依賴于白細(xì)胞介素-3或粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子。TF-1細(xì)胞提供了研究EPO對增殖和分化的作用的良好系統(tǒng)。
TF-1細(xì)胞于37℃在5％CO2中生長于具有10％FBS和12ng/ml GM-CSF的RPMI培養(yǎng)基中。細(xì)胞以10,000個細(xì)胞/ml培養(yǎng)基的濃度懸浮。將200μl細(xì)胞等分試樣分散于96-孔平板中。使細(xì)胞與0.1～10μg/ml EPO溫育48小時。
然后通過首先添加25μl 5μg/ml的MTT(溴化3-[4，5-二甲基噻唑-2-基]-2，5-二苯基四氮唑或噻唑基藍(lán)(thiazolyl blue)；SigmaChemical Co.，St.Louis，Mo.，Catalogue No.M5655)來進行MTT生存力測定。將平板于37℃溫育4小時。加入100μl異丙醇/HCl溶液(100ml異丙醇和333μl HCl 6N)。在570nm和630或690nm讀取平板的吸光率，并從570nm的讀數(shù)中減去630或690nm的讀數(shù)。
圖142描述了在其單觸角聚糖進行PEG化后對EPO活性的生物測定結(jié)果。在該生物測定中，單觸角PEG化的EPO的活性比非PEG化的EPO(Epogen)低很多。
雙觸角分支進行了幾個反應(yīng)以實現(xiàn)EPO的雙觸角分支。簡言之，第一個反應(yīng)是GnT-I和GnT-II反應(yīng)的組合，以向兩個三甘露糖核心分支添加GlcNAc部分。第二個反應(yīng)即GalT-1反應(yīng)向每一個GlcNAc部分添加半乳糖部分。在ST3Gal3反應(yīng)前進行Superdex-75層析(Amersham Biosciences，Arlington Heights，IL)。雙觸角分支進一步用ST3Gal3反應(yīng)來延伸，以添加2，3-SA或SA-PEG(1kDa)、SA-PEG(10kDa)。應(yīng)用Superdex-200層析實現(xiàn)最后的純化(Amersham Biosciences，Arlington Heights，IL)。
GnT-I/GnT-II反應(yīng).組合GnT-I和GnT-II反應(yīng)物，并于32℃溫育48小時。反應(yīng)物含有1mg/mL EPO、100mM MES pH6.5、150mM NaCl、20mM MnCl2、0.02％NaN3、5mM UDP-GlcNAc、100mU/mg GnT-I、60mU/mgGnT-II。反應(yīng)實現(xiàn)了添加雙觸角GlcNAc部分的92％完成程度，而8％是單觸角GlcNAc部分。
圖143A顯示釋放的聚糖的HPLC分析，其中峰“P3”表示雙觸角GlcNAc聚糖。
圖143B顯示釋放的聚糖的MALDI分析，其中聚糖的結(jié)構(gòu)示于它們代表的峰旁邊。
為了進一步進行反應(yīng)，連同1mM UDP-GlcNAc、5mM MnCl2、0.02％NaN3一起添加另外20mU/mg GnT-II，使混合物于32℃溫育4小時。該反應(yīng)的大于99％實現(xiàn)了雙觸角GlcNAc聚糖的完成。
GalT-1反應(yīng).在完成第二個GnT-II反應(yīng)后，立即開始GalT-1反應(yīng)。以0.5mU/mg GalT-1和3mM UDP-Gal的濃度向完成的GnT-II反應(yīng)物中添加酶和核苷酸糖。
當(dāng)GalT-1反應(yīng)在每個反應(yīng)具有約100μg EPO的小規(guī)模進行時，大約95％的反應(yīng)產(chǎn)生具有雙觸角末端半乳糖部分的EPO。
圖144A顯示釋放的聚糖的HPLC分析，其中峰“P2”是具有末端半乳糖部分的雙觸角聚糖(聚糖的85％)，而峰“P1”是不具有末端半乳糖部分的雙觸角聚糖(聚糖的15％)。
GalT-1反應(yīng)在每個反應(yīng)具有約16mg EPO的大規(guī)模進行。
圖144B顯示從大規(guī)模GalT-1反應(yīng)釋放的聚糖的HPLC分析，其中峰“P2”是具有末端半乳糖部分的雙觸角聚糖，而峰“P1”是不具有末端半乳糖部分的雙觸角聚糖。
Superdex-75純化.在GnT-1/GalT1反應(yīng)后，應(yīng)用1.6cm×60cm的Superdex-75凝膠過濾層析(Amersham Biosciences，ArlingtonHeights，IL)在含有0.02％Tween 20的PBS中從酶蛋白質(zhì)污染物和核苷酸糖純化EPO。
圖145描述了Superdex 75凝膠過濾的層析譜，其中峰2是具有末端半乳糖部分的雙觸角聚糖。
圖146示出了每一個重構(gòu)步驟產(chǎn)物的SDS-PAGE分析，顯示了EPO分子量隨著每一個重構(gòu)步驟的增加。
ST3Gal3反應(yīng).將ST3Gal3反應(yīng)物于32℃溫育24小時。反應(yīng)物含有0.5mg/mL EPO、100mM Tris-Cl pH7.2、150mM NaCl、0.02％NaN3、100mU/mg ST3Gal3和0.5mM CMP-SA、0.5mM CMP-SA-PEG(1kDa)或0.5mM CMP-SA-PEG(10kDa)。
圖147描述了ST3Gal3反應(yīng)前和反應(yīng)后的EPO的SDS-PAGE分析?；谠揝DS-PAGE分析，在每一個ST3Gal3反應(yīng)后，含有末端Gal的雙觸角EPO不再能被可見地探測到。所有唾液酸化的EPO變體與反應(yīng)起始時非唾液酸化的EPO相比顯示大小增加。
Superdex-200純化.然后應(yīng)用1.6cm×60cm的Superdex-200凝膠過濾層析(Amersham Biosciences，Arlington Heights，IL)在含有0.02％Tween 20的PBS中從ST3Gal3反應(yīng)污染物純化EPO。表23總結(jié)了每一個重構(gòu)步驟時聚糖結(jié)構(gòu)的分布。
表23.每一個重構(gòu)步驟后EPO上聚糖結(jié)構(gòu)的總結(jié)。
菱形表示巖藻糖，且正方形表示GlcNAc，圓圈表示甘露糖，空心圓圈表示半乳糖。
三觸角分支進行了幾個反應(yīng)以實現(xiàn)EPO的三觸角分支化。簡言之，第一個反應(yīng)是GnT-I和GnT-II反應(yīng)的組合，以向聚糖的兩個外部三甘露糖核心分支添加GlcNAc部分。第二個反應(yīng)即GnT-V反應(yīng)向兩個外部三甘露糖核心分支之一添加第二個GlcNAc部分，從而現(xiàn)在有3個GlcNAc部分。第三個反應(yīng)即GalT-1反應(yīng)向每一個末端GlcNAc部分添加半乳糖部分。EPO產(chǎn)物然后通過Superdex-75層析進行分離。三觸角分支進一步用ST3Gal3反應(yīng)來延伸，以添加2，3-SA或2，6-SA部分，且用2，3-SA部分進行加帽。應(yīng)用Superdex-75層析實現(xiàn)最后的純化。
GnT-I/GnT-II反應(yīng).組合GnT-I和GnT-II反應(yīng)物，并于32℃溫育24小時。反應(yīng)物含有1mg/mL EPO、100mM MES pH6.5、150mM NaCl、20mM MnCl2、0.02％NaN3、5mM UDP-GlcNAc、50mU/mg GnT-I和41mU/mgGnT-II。反應(yīng)實現(xiàn)了添加雙觸角GlcNAc部分的97％完成程度，而剩余3％三甘露糖核心。
圖148描述了在GnT-I/GnT-II反應(yīng)后從EPO釋放的聚糖的HPLC分析。
GnT-V反應(yīng).GnT-V反應(yīng)物含有100mM MES pH6.5、5mM UDP-GlcNAc、5mM MnCl2、0.02％NaN3、10mU/mg GnT-V和1mg/mL EPO，并于32℃溫育24小時。該反應(yīng)向已經(jīng)含有GlcNAc部分的外部甘露糖部分添加GlcNAc部分。
圖149描述了在GnT-V反應(yīng)后從EPO釋放的聚糖的HPLC分析?；诰厶呛蚆ALDI分析，大約92％的從EPO釋放的聚糖是預(yù)期產(chǎn)物，即具有末端GlcNAc部分的三觸角分支的EPO。聚糖的剩余8％是含有末端GlcNAc部分的雙觸角分支的結(jié)構(gòu)。
GalT-1反應(yīng).GalT-1反應(yīng)物含有100mM Tris pH7.2、150mM NaCl、5mM UDP-Gal、100mU/mg GalT-1、5mM MnCl2、0.02％NaN3和1mg/mL EPO，并于32℃溫育24小時。
圖150描述了在該反應(yīng)后從EPO釋放的聚糖的HPLC分析。聚糖和MALDI分析顯示釋放的聚糖的97％在三觸角分支結(jié)構(gòu)上具有末端半乳糖部分。剩余的3％為含有末端半乳糖的雙觸角結(jié)構(gòu)。
Superdex-75純化.在GnT-I/GalT1反應(yīng)后，應(yīng)用1.6cm×60cm的Superdex-75凝膠過濾層析(Amersham Biosciences，ArlingtonHeights，IL)在含有0.02％Tween 20的PBS中從酶蛋白質(zhì)污染物和核苷酸糖純化EPO。純化的材料分為兩批，以產(chǎn)生具有末端2，6-SA部分的三觸角聚糖和具有用2，6-SA部分加帽的末端2，6-SA部分的三觸角聚糖。
ST3Gal3反應(yīng).將ST3Gal3反應(yīng)物干32℃溫育24小時。反應(yīng)物含有1mg/mL半乳糖基化的EPO、100mM Tris-Cl pH7.2、150mM NaCl、0.02％NaN3、50mU/mg ST3Gal3和3mM CMP-SA。
圖151描述了該步驟后從EPO釋放的聚糖的HPLC分析。基于聚糖和MALDI分析，大約80％的釋放的聚糖是具有末端2，3-SA部分的三觸角分支的結(jié)構(gòu)。釋放的聚糖的剩余20％是含有末端2，3-SA部分的雙觸角結(jié)構(gòu)。
ST3Gal3反應(yīng)后的ST6Gal1唾液酸化反應(yīng).將ST6Gal1反應(yīng)物于32℃溫育24小時。反應(yīng)物含有1mg/mL唾液酸化并半乳糖基化的EPO、100mM Tris-Cl pH7.2、150nM NaCl、0.02％NaN3、50mU/mg ST6Gal1和3mM CMP-SA。
圖152描述了ST6Gal1反應(yīng)后從EPO釋放的聚糖的HPLC分析?；诰厶呛蚆ALDI分析，大約80％的三觸角分支的聚糖含有末端2，3-SA部分。聚糖的剩余20％是含有末端2，3-SA部分的雙觸角的。
Superdex-75純化.應(yīng)用1.6cm×60cm的Superdex-75凝膠過濾層析(Amersham Biosciences，Arlington Heights，IL)在含有0.02％Tween20的PBS中從ST3Gal3反應(yīng)污染物純化EPO。
三觸角和雙觸角唾液酸化或PEG化EPO的生物測定.如上文所述，應(yīng)用TF-1細(xì)胞系和MTT生存力試驗測定三觸角和雙觸角唾液酸化EPO糖形式和PEG 10kDa和1kDa雙觸角糖形式的活性。
圖153描述了MTT細(xì)胞增殖測定的結(jié)果。在2μg/ml EDP時，雙觸角唾液酸化的EPO幾乎具有對照Epogen的活性，而三觸角唾液酸化的EPO具有顯著低的活性。
凝血因子IX19.由CHO細(xì)胞產(chǎn)生的凝血因子IX的糖PEG化本實施例提出了對脫唾液酸化凝血因子IX的制備和用CMP-唾液酸-PEG對其的唾液酸化。
rFactor IX的脫唾液酸化.重組形式的凝結(jié)凝血因子IX(r FacorIX)是在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的。將6000IU的rFactor IX溶解于總共12mL的USP H2O中。將該溶液與另外6mL USP H2O轉(zhuǎn)移到Centricon Plus 20，PL-10離心濾器中。將該溶液濃縮至2mL，然后用15mL的50M Tris-HClpH7.4、0.15M NaCl、5mM CaCl2、0.05％NaN3進行稀釋并再次濃縮。使稀釋/濃縮重復(fù)4次以有效地將緩沖液改變?yōu)?.0mL的終體積。將該溶液的2.9mL(約29mg rFactor IX)轉(zhuǎn)移到小的塑料試管中并向其中添加530mU α2-3，6，8-神經(jīng)氨酸酶-瓊脂糖綴合物(霍亂弧菌，Calbiochem，450μL)。將反應(yīng)混合物于32℃輕輕旋轉(zhuǎn)26.5小時。將混合物于10,000rpm離心2分鐘并收集上清液。將瓊脂糖珠子(含有神經(jīng)氨酸酶)用0.5mL的50M Tris-HCl pH7.12、1M NaCl、0.05％NaN3洗滌6次。將收集的洗滌液和上清液再次于10,000rpm離心2分鐘以去除任何殘留的瓊脂糖樹脂。將收集的脫唾液酸化的蛋白質(zhì)溶液用相同的緩沖液稀釋到19mL并在Centricon Plus 20 PL-10離心濾器中濃縮至～2mL。將該溶液用15mL的50M Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、0.05％NaN3稀釋兩倍并濃縮至2mL。將最終的脫唾液酸化的rFactor IX溶液用Tris緩沖液稀釋到3mL的終體積(～10mg/mL)。天然的和脫唾液酸化的rFactor IX樣品是用IEF-電泳進行分析的。Isoelectric Fousing Gels(pH3-7)是用1.5μL(15μg)樣品運行的，該樣品首先用10μL Tris緩沖液稀釋并與12μL樣品加樣緩沖液混合。凝膠是用標(biāo)準(zhǔn)程序加樣、運行和固定的。凝膠用Colloidal Blue Stain染色(
圖154)，顯示脫唾液酸化的凝血因子IX的條帶。
PEG(1kDa和10kDa)-SA-凝血因子IX的制備.將脫唾液酸化的rFactor-IX(29mg，3mL)在兩個1.5mL的離心管中分為兩個1.5mL(14.5mg)的樣品。每一個溶液均用12.67mL的50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、0.05％NaN3稀釋，并添加CMP-SA-PEG-1k或10k(7.25μmol)。將試管輕輕顛倒以混合，并添加2.9U ST3Gal3(326μL)(14.5mL總體積)。對試管再次進行顛倒，并輕輕于32℃旋轉(zhuǎn)65小時。該反應(yīng)通過于-20℃冷凍而停止。將10μg反應(yīng)樣品通過SDS-PAGE進行分析。PEG化的蛋白質(zhì)是在Toso Haas Biosep G3000SW(21.5×30cm，13um)HPLC柱子上進行純化的，該柱子應(yīng)用pH7.1的Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水(Gibco)，6mL/分鐘。反應(yīng)和純化是用SDS Page和IEF凝膠監(jiān)控的。在將樣品用2μL的50mM Tris-HCl pH7.4、150mM NaCl、0.05％NaN3緩沖液稀釋，與12μL樣品加樣緩沖液和1μL的0.5M DTT混合，并于85℃加熱6分鐘后，向Novex Tris-甘氨酸4-20％1mm凝膠加載10μL(10μg)該樣品。凝膠是用Colloidal Blue Stain染色的(
圖155)，顯示PEG(1kDa和10kDa)-SA-凝血因子IX的條帶。
20.凝血因子IX的直接唾液酸-糖PEG化本實施例提出了不經(jīng)預(yù)先唾液酸酶處理而對凝血因子IX進行唾液酸-PEG化。
應(yīng)用CMP-SA-PEG(10kDa)對凝血因子IX的唾液酸-PEG化.將凝血因子IX(1100IU)溶解于5mL的20mM組氨酸、520mM甘氨酸、2％蔗糖、0.05％NaN3和0.01％聚山梨酸酯80，pH5.0中，所述凝血因子IX表達于CHO細(xì)胞中，且是完全唾液酸化的。然后將CMP-SA-PEG-(10kDa)(27mg，2.5μmol)溶解于該溶液中并加入1U ST3Gal3。于32℃輕輕混合28小時后反應(yīng)結(jié)束。反應(yīng)物是用Invitrogen描述的SDS-PAGE進行分析的。產(chǎn)物蛋白質(zhì)在Amersham Superdex 200(10×300nm，13μm)HPLC柱子上進行純化，該柱子應(yīng)用pH7.0的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)，1mL/分鐘。Rt＝9.5分鐘。
應(yīng)用CMP-SA-PEG(20kDa)對凝血因子IX的唾液酸-PEG化.將凝血因子IX(1100IU)溶解于5mL的20mM組氨酸、520mM甘氨酸、2％蔗糖、0.05％NaN3和0.01％聚山梨酸酯80，pH5.0中，所述凝血因子IX表達于CHO細(xì)胞中，且是完全唾液酸化的。然后將CMP-SA-PEG-(20kDa)(50mg，2.3μmol)溶解于該溶液中并加入CST-II。于32℃輕輕混合42小時后反應(yīng)混合結(jié)束。反應(yīng)物是用Invitrogen描述的SDS-PAGE進行分析的。
產(chǎn)物蛋白質(zhì)在Amersham Superdex 200(10×300nm，13μm)HPLC柱子上進行純化，該柱子應(yīng)用pH7.0的磷酸鹽緩沖鹽水(Fisher)，1mL/分鐘。Rt＝8.6分鐘。
21.糖PEG化凝血因子IX的唾液酸加帽本實施例提出了對唾液酸-糖PEG化肽進行唾液酸加帽的程序。在此，凝血因子-IX是示例性的肽。
凝血因子-IX-SA-PEG(10kDa)的N-連接和O-連接聚糖的唾液酸加帽.將純化的rFactor-IX-PEG(10kDa)(2.4mg)在Centricon_Plus20PL-10(Millipore Corp.，Bedford，MA)離心濾器中進行濃縮，并將緩沖液改變?yōu)?.85mL終體積的50mM Tris-HCl pH7.2、0.15M NaCl、0.05％NaN3。將蛋白質(zhì)溶液用372μL相同的Tris緩沖液稀釋并添加7.4mg CMP-SA(12μmol)固體。將該溶液輕輕顛倒以混合并添加0.1U ST3Gal1和0.1U ST3Gal3。將反應(yīng)混合物于32℃輕輕旋轉(zhuǎn)42小時。
10μg反應(yīng)樣品是用SDS-PAGE進行分析的。Novex Tris-甘氨酸4-12％1mm凝膠是如Invitrogen描述的那樣運行并用Colloidd Blue染色的。簡言之，將10μL(10μg)樣品與12μL樣品加樣緩沖液和1μL的0.5M DTT混合，并于85℃加熱6分鐘(
圖156，泳道4)。
凝血因子VIIa22.BHK細(xì)胞中產(chǎn)生的量組凝血因子VIIa的糖PEG化本實施例提出了對BHK細(xì)胞中產(chǎn)生的重組凝血因子VIIa的PEG化。
脫唾液酸化凝血因子VIIa的制備.重組凝血因子VIIa是在BHK細(xì)胞(幼倉鼠腎細(xì)胞)中產(chǎn)生的。將凝血因子VIIa(14.2mg)以1mg/ml溶解于緩沖液(pH7.4，0.05M Tris、0.15M NaCl、0.001M CaCl2、0.05％NaN3)中，并與300mU/mL唾液酸酶(霍亂弧菌)-瓊脂糖綴合物于32℃溫育3日。為了監(jiān)控反應(yīng)，將反應(yīng)物的小等份試樣用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋，并根據(jù)Invitrogen的程序進行了IEF凝膠(
圖157)分析。將混合物于3,500rpm進行離心并收集上清液。將該樹脂用上述緩沖液(pH7.4，0.05M Tris、0.15M NaCl、0.05％NaN3)洗滌3次(3×2mL)并將合并的洗滌液在Centricon-Plus-20中濃縮。將剩余的溶液與0.05MTris(pH7.4)、0.15M NaCl、0.05％NaN3進行緩沖液交換以得到14.4mL的終體積。
凝血因子VIIa-SA-PEG(1kDa和10kDa)的制備.將脫唾液酸化的rFactorVIIa溶液分為兩份相等的7.2ml樣品。向每一個樣品中加入CMP-SA-5-PEG(1kDa)(7.4mg)或CMP-SA-5-PEG(10kDa)(7.4mg)。將ST3Gal3(1.58U)添加到兩個試管中，并使反應(yīng)混合物于32℃溫育96小時。該反應(yīng)是用Invitrogen描述的試劑和條件通過SDS-PAGE凝膠監(jiān)控的。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時，將反應(yīng)混合物用Toso Haas TSK-Gel-3000制備型柱子進行純化，該柱子應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)，并基于UV吸收收集級分。將合并的含有產(chǎn)物的級分于4℃在Centricon-Plus-20離心濾器(Millipore，Bedford，MA)中濃縮，并對濃縮的溶液進行重新配制以得到1.97mg(bicinchoninic acid蛋白質(zhì)測定，BCA測定，Sigma-Aldrich，St.Louis MO)凝血因子VIIa-PEG。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析法進行分析的。樣品是對水進行透析的并由MALDI-TOF分析。
圖158顯示從天然凝血因子VIIa得到的MALDI結(jié)果。
圖159含有對于用1kDa PEG進行PEG化的凝血因子VIIa的MALDI結(jié)果，其中用1kDa PEG進行PEG化的凝血因子VIIa的峰是明顯的。
圖160含有對于用10kDa PEG進行PEG化的凝血因子VIIa的MALDI結(jié)果，其中用10kDa PEG進行PEG化的凝血因子VIIa的峰是明顯的。
圖161描述了所有反應(yīng)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析，其中凝血因子VIIa-SA-PEG(10-kDa)的條帶是明顯的。
促卵泡激素(FSH)23.人垂體衍生的FSH的糖PEG化本實施例闡明了本發(fā)明綴合物的組裝。將促卵泡激素(FSH)脫唾液酸化然后與CMP-(唾液酸)-PEG綴合。
促卵泡激素的脫唾液酸化.將1mg促卵泡激素(FSH)(HumanPituitary，Calbiochem Cat No.869001)溶解于500μL的pH7.4的50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、5mM CaCl2中。將375μL該溶液轉(zhuǎn)移到小的塑料試管中，并向其中加入263mU神經(jīng)氨酸酶II(霍亂弧菌)。將反應(yīng)混合物于32℃輕輕搖動15小時。將反應(yīng)混合物加入到600μL N-(對氨基苯基)草氨酸-瓊脂糖綴合物中，該綴合物預(yù)先用50mM pH7.4的Tris-HCl、150mM NaCl和0.05％NaN3進行平衡，并于4℃輕輕旋轉(zhuǎn)6.5小時。將懸浮液于14,000rpm離心2分鐘并收集上清液。將珠子用0.5mL緩沖液洗滌5次并收集所有上清液。將酶溶液用2L含有50mMTris-HCl pH7.4、1M NaCl、0.05％NaN3的溶液于4℃透析(7000MWCO)15小時，然后于4℃在4小時內(nèi)向50mM Tris-HCl pH7.4、1M NaCl、0.05％NaN3中透析兩次。用Speed Vac將該溶液濃縮至2μg/μL并貯存于-20℃。反應(yīng)樣品是由IEF凝膠(pH3-7)(Invitrogen)分析的(
圖162)。
人垂體衍生的SA-FSH和PEG-SA-促卵泡激素的制備.將脫唾液酸化的FSH(100μg，50μL)和CMP-唾液酸或CMP-SA-PEG(1kDa或10kDa)(0.05μmol)在0.5mL塑料試管中溶解于13.5μL H2O(用NaOH調(diào)節(jié)到pH8)。將試管簡單地渦旋并添加40mU ST3Gal3(36.5μL)(100μL總體積)。對試管再次進行渦旋，并輕輕于32℃搖動24小時。將該反應(yīng)通過于-80℃冷凍而停止。對15μg反應(yīng)樣品用SDS-PAGE(
圖163)、IEF凝膠(
圖164)和MALDI-TOF進行分析。天然的FSH也用SDS-PAGE進行分析(
圖165)。
對反應(yīng)產(chǎn)物的SDS PAGE和IEF凝膠分析.用于SDS PAGE分析的Novex Tris-甘氨酸8-16％1mm凝膠購自Invitrogen。將7.5μL(15μg)FSH反應(yīng)樣品用5μL的50mM Tris-HCl pH7.4、150mM NaCl、0.05％NaN3緩沖液稀釋，與15μL樣品加樣緩沖液和1μL 9M μ-巰基乙醇混合并于85℃加熱6分鐘。凝膠是如Invitrogen所指示的運行的并用ColloidalBlue Stain染色(Invitrogen)。
將FSH樣品(15μg)用5μL Tris緩沖液稀釋并與15μL樣品加樣緩沖液混合(
圖162)。然后將樣品應(yīng)用于Isoelectric Focusing Gels中(pH3-7)(Invitrogen)(
圖165)。凝膠是如Invitrogen所指示的運行并固定的，然后用Colloidal Blue Stain染色。
24.CHO細(xì)胞中重組產(chǎn)生的重組FSH的糖PEG化本實施例闡明了對本發(fā)明綴合物的組裝。脫唾液酸化的FSH是與CMP-(唾液酸)-PEG綴合的。
重組脫唾液酸化-促卵泡激素的制備.將從CHO中產(chǎn)生的量組促卵泡激素(rFSH)用于這些研究中。將7,500IU的rFSH溶解于8mL水中。使FSH溶液在50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、5mM CaCl2中透析并在Centricon Plus 20離心濾器上濃縮至500μL。將該溶液的一部分(400μL)(～0.8mg FSH)轉(zhuǎn)移到小的塑料試管中并向其中添加275mU神經(jīng)氨酸酶II(霍亂弧菌)。使反應(yīng)混合物于32℃混合16小時。將反應(yīng)混合物添加于預(yù)先洗滌的N-(對氨基苯基)草氨酸-瓊脂糖綴合物(800μL)中并于4℃輕輕旋轉(zhuǎn)24小時。將混合物于10,000rpm離心并收集上清液。將珠子用0.6mL Tris-EDTA緩沖液洗滌3次，用0.4mL Tris-EDTA緩沖液洗滌1次并用0.2mL Tris-EDTA緩沖液洗滌1次，且收集所有上清液。將上清液于4℃對2L的50mM Tris-HCl pH7.4、1M NaCl、0.05％NaN3進行透析，然后再對50mM Tris-HCl pH7.4、1M NaCl、0.05％NaN3透析兩次。然后將透析的溶液在Centricon Plus 20離心濾器中濃縮至420μL并貯存于-20℃。
天然的和脫唾液酸化的rFSH樣品是用SDS-PAGE和IEF分析的(
圖166)。Novex Tris-甘氨酸8-16％1mm凝膠購自Invitrogen。將樣品(7.5μL，15μg)用5μL的50mM Tris-HCl pH7.4、150mM NaCl、0.05％NaN3緩沖液稀釋，與15μL樣品加樣緩沖液和1μL 9M β-巰基乙醇混合并于85℃加熱6分鐘。凝膠是如Invitrogen所指示的運行的并用ColloidalBlue Stain(Invitrogen)染色。Isoelectric Focusing Gels(pH3-7)購自Invitrogen。將樣品(7.5μL，15μg)用5μL Tris緩沖液稀釋并與15μL樣品加樣緩沖液混合。凝膠是如Invitrogen所指示的加樣、運行和固定的。凝膠用Colloidal Blue Stain染色。天然和脫唾液酸化的FSH樣品也對水進行透析并用MALDI-TOF進行分析。
重組促卵泡激素的唾液酸-PEG化.將脫唾液酸化的FSH(100μg，54μL)和CMP-SA-PEG(1kDa或10kDa)(0.05μmol)于0.5mL塑料試管中溶解于28μL的50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3pH7.2中。將試管簡單地渦旋并添加20mU ST3Gal3(100μL總體積)。對試管再次進行渦旋，并輕輕于32℃混合24小時，且該反應(yīng)通過于-80℃冷凍而停止。對該反應(yīng)的樣品用如上所述的SDS-PAGE(
圖167)、IEF凝膠(
圖168)和MALDI-TOF MS進行分析。
也對PEG化的rFSH進行了MALDI。在電離過程中，將SA-PEG從糖蛋白的N-聚糖結(jié)構(gòu)中去除。天然的FSH給出了在13928的峰；AS-rFSH(13282)；再次唾液酸化的r-FSH(13332)；PEG1000-rFSH(13515；14960(1)；16455(2)；17796(3)；19321(4))；和PEG 10000(23560(1)；34790(2)；45670(3)和56760(4))。
25.糖PEG化的FSH的藥物代謝動力學(xué)研究本實施例提出了根據(jù)本發(fā)明的方法制備的糖PEG化的促卵泡激素(FSH)與非PEG化的FSH相比的藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)的體內(nèi)檢驗。
將FSH、FSH-SA-PEG(1kDa)和FSH-SA-PEG(10kDa)用標(biāo)準(zhǔn)條件(Amersham Biosciences，Arlington Heights，IL)進行放射性碘化并在含有0.1％BSA的磷酸鹽緩沖鹽水中制備。在磷酸鹽緩沖液中稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛群?，將每一種檢驗的FSH蛋白質(zhì)(各自0.4μg)靜脈內(nèi)注射入雌性Sprague Dawley大鼠中(體重為250-300g)并在0～80小時的時間點抽血。血液樣品中的放射性是用γ計數(shù)器分析的，且藥物代謝動力學(xué)是用標(biāo)準(zhǔn)方法分析的(
圖169)。FSH比FSH-PEG(1kDa)更快地從血液中清除，而FSH-PEG(1kDa)比FSH-PEG(10kDa)被稍微快地清除的。
26.糖PEG化FSH體外活性的支持細(xì)胞生物測定本實施例提出了基于培養(yǎng)的支持細(xì)胞對促卵泡激素(FSH)的生物測定。該測定可用于確定聚糖重構(gòu)(包括糖綴合)后FSH的生物活性。
該生物測定基于雌二醇量之間存在的劑量-反應(yīng)關(guān)系，該雌二醇是當(dāng)FSH而不是黃體生成素(LH)添加到從不成熟的老齡大鼠中獲得的培養(yǎng)的支持細(xì)胞中時產(chǎn)生的。外源的睪酮在FSH存在時可轉(zhuǎn)變?yōu)?7β-雌二醇。
將7～10日齡的老Sprague-Dawley大鼠用于獲得支持細(xì)胞。在處死后，通過在膠原酶(1mg/ml)、胰蛋白酶(1mg/ml)、透明質(zhì)酸酶(1mg/ml)和DNase(5μg/ml)中溫育5～10分鐘而使睪丸脫被膜并使組織分散。將小管片段置于燒瓶底部并在PBS(1x)中洗滌。使小管片段再次與含有同樣酶的介質(zhì)溫育20分鐘膠原酶(1mg/ml)、胰蛋白酶(1mg/ml)、透明質(zhì)酸酶(1mg/ml)和DNase(5μg/ml)。
將小管片段勻漿并置于24孔平板上無血清的培養(yǎng)基中。每孔放置5×105個細(xì)胞。在于37℃和5％CO2中溫育48小時后，向細(xì)胞添加新鮮的培養(yǎng)基。無血清培養(yǎng)基的組成DMEM(1體積)、Ham’s F10營養(yǎng)混合物(1體積)、胰島素1μg/ml、運鐵蛋白5μg/ml、EGF 10ng/ml、T420pg/ml、氫化可的松10-8M、視黃酸10-6M。
刺激實驗為與標(biāo)準(zhǔn)FSH或樣品于37℃和5％CO2中溫育24小時。測定內(nèi)的平均變異系數(shù)為9％，且測定間的平均變異系數(shù)為11％。
將17B-雌二醇Elisa試劑盒DE2000(R&amp;D Systems，Minneapolis，MN)用于在與FSH、FSH-SA-PEG(1kDa)和FSH-SA-PEG(10kDa)溫育之后定量雌二醇的水平。
該程序如下將100μl雌二醇標(biāo)準(zhǔn)(由試劑盒提供并根據(jù)試劑盒的說明書制備)或樣品吸取到17B-雌二醇Elisa平板上；將50μl 17B-雌二醇綴合物(由試劑盒提供并根據(jù)試劑盒的說明書制備)添加到每一個孔中；將50μl 17B-雌二醇抗體溶液(由試劑盒提供并根據(jù)試劑盒的說明書制備)添加到每一個孔中；使平板于室溫在200rpm溫育2小時；將液體從每一個孔中吸出；將孔用洗滌溶液洗滌四次；將所有液體從孔中移去；將200μl pNPP底物(由試劑盒提供并根據(jù)試劑盒的說明書制備)添加到所有孔中并溫育45分鐘；添加50μl終止溶液(由試劑盒提供并根據(jù)試劑盒的說明書制備)并在405nm讀取平板(
圖170)。盡管FSH-PEG(10kDa)在1μl/ml時顯示對支持細(xì)胞的中等刺激，但FSH-PEG(1kDa)對支持細(xì)胞的刺激比未PEG化的FSH高50％。
27.糖PEG化FSH體內(nèi)活性的Steelman-Pohley生物測定在本實施例中，將Steelman-Pohley生物測定(Steelman和Pohley，1953，Endocrinology 53604-615)用于確定糖PEG化FSH的體內(nèi)活性。Steelman-Pohley生物測定利用大鼠卵巢重量的變化來測量FSH的體內(nèi)活性，該FSH是與人絨毛膜促性腺激素共同注射的。
Steelman-Pohley生物測定根據(jù)Christin-Maitre等人(2000，Methods 2151-57)描述的規(guī)程進行。將70只21-22日齡的雌性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Laboratories，Wilmington，MA)在開始測定程序之前在試驗設(shè)備中放置至少5日。在整個程序過程中，動物室的氣候控制為18～26℃、30～70％相對濕度和12小時人工光照/12小時黑暗。所有動物均用Certified Rodent Chow(Harlan Teklad，Madison WI)或等同物以及水飼喂，均可隨意獲得。在CalvertPreclinical Services，Inc.(Olyphant，PA)進行動物程序。
重組FSH表達于CHO細(xì)胞中，通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行純化并用PEG(1kDa)進行糖PEG化。將大鼠分為7個實驗組，每組10只動物。在-1日和0日，所有組的動物均用0.5ml 0.9％NaCl中的20I.U.人絨毛膜促性腺激素(HCG)進行皮下注射。在1、2和3日，對照動物用在0.9％NaCl中合有20I.U.HCG的0.5ml劑量進行皮下注射，而在其他組中，HCG劑量隨著每次給藥中0.14μg、0.4μg或1.2μg的rFSH或rFSH-SA-PEG(1kDa)而增加。在4日，通過CO2吸入無痛處死動物。獲取卵巢、修整并稱重。確定每一組的平均卵巢重量。
圖171表示4日時實驗組的平均卵巢重量。單獨接受HCG的組(對照)或接受低劑量(0.14μg)rFSH或rFSH-SA-PEG(1kDa)的組具有大約相等的卵巢重量。接受中等(0.4μg)或高(1.2μg)劑量rFSH或rFSH-SA-PEG(1kDa)的組具有大約兩倍于對照組的卵巢重量。在中等劑量(0.4μg)時，糖PEG化的rFSH具有與非PEG化的rFSH大約相同的體內(nèi)活性(由卵巢重量所確定)。在高劑量(1.2μg)時，糖PEG化的rFSH具有比非PEG化的rFSH略高的體內(nèi)活性。
G-CSF28.CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的G-CSF的糖PEG化脫唾液酸化-粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的制備.將CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的G-CSF以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、5mM CaCl2中并在Centricon Plus 20離心濾器中濃縮至500μL。使該溶液與300mU/ml神經(jīng)氨酸酶II(霍亂弧菌)于32℃溫育16小時。為了監(jiān)控反應(yīng)，將反應(yīng)物的小等份試樣用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋并運行IEF凝膠分析。然后將反應(yīng)混合物添加入預(yù)先洗滌的N-(對氨基苯基)草氨酸-瓊脂糖綴合物(800μL/mL反應(yīng)體積)，并使洗滌的珠子于4℃輕輕旋轉(zhuǎn)24小時。將混合物于10,000rpm離心并收集上清液。將珠子用Tris-EDTA緩沖液洗滌3次，用0.4mL Tris-EDTA緩沖液洗滌一次且用0.2mLTris-EDTA緩沖液洗滌一次，并收集所有上清液。將上清液于4℃對50mMTris-HCl pH7.4、1M NaCl、0.05％NaN3進行透析，然后再對50mM Tris-HClpH7.4、1M NaCl、0.05％NaN3透析兩次。透析的溶液然后用CentriconPlus 20離心濾器濃縮并貯存于-20℃。IEF凝膠的條件是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑運行的。將天然的和脫唾液酸化的G-CSF樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
G-CSF-(α2，3)-唾液酸-PEG的制備.將脫唾液酸化的G-CSF以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與1mM CMP-唾液酸-PEG和0.1U/mL的ST3Gal1于32℃溫育2日。為了監(jiān)控唾液酸-PEG的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了CMP-SA-PEG-熒光配體；整合入肽中的標(biāo)記是在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而與游離標(biāo)記分離的。整合入肽中的熒光標(biāo)記是用內(nèi)置的熒光探測器進行定量的。2日后，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使天然的和PEG化的G-CSF樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
G-CSF-(α2，8)-唾液酸-PEG的制備.將CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的含有α2，3-唾液酸化的O-連接聚糖的G-CSF以2.5mg/mL溶解于50mMTris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與1mM CMP-唾液酸-PEG和0.1U/mL的CST-II于32℃溫育2日。為了監(jiān)控唾液酸-PEG的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了CMP-SA-PEG-熒光配體；整合入肽中的標(biāo)記是在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而與游離標(biāo)記分離的。整合入肽中的熒光標(biāo)記是用內(nèi)置的熒光探測器進行定量的。2日后，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使天然的和PEG化的G-CSF樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
G-CSF-(α2，6)-唾液酸-PEG的制備.將僅含有0-連接的GalNAc的G-CSF以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與1mM CMP-唾液酸-PEG和0.1U/mL的ST6GalNAcI或II于32℃溫育2日。為了監(jiān)控唾液酸-PEG的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了CMP-SA-PEG-熒光配體；整合入肽中的標(biāo)記是在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而與游離標(biāo)記分離的。整合入肽中的熒光標(biāo)記是用內(nèi)置的熒光探測器進行定量的。2日后，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso HaasG3000SW制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使天然的和PEG化的G-CSF樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
將在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的G-CSF用節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)唾液酸酶進行處理，并在Superdex 75上通過大小排阻進行純化，用ST3Gal1或ST3Gal2進行處理，然后用CMP-SA-PEG 20kDa進行處理。結(jié)果所得的分子通過離子交換和凝膠過濾進行純化，且通過SDS PAGE的分析證明PEG化是完全的。這是O-連接的聚糖的糖PEG化的第一次證明。
葡糖腦苷脂酶29.CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的葡糖腦苷脂酶-甘露糖-6-磷酸本實施例提出了使甘露糖-6-磷酸與CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的肽如葡糖腦苷脂酶進行糖綴合的程序。
脫唾液酸化葡糖腦苷脂酶的制備.將CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的葡糖腦苷脂酶以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl中，并使其與300mU/mL唾液酸酶-瓊脂糖綴合物于32℃溫育16小時。為了監(jiān)控反應(yīng)，將反應(yīng)物的小等份試樣用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋并根據(jù)Invitrogen的程序運行IEF凝膠和SDS-PAGE。將混合物于10,000rpm離心并收集上清液。將珠子用Tris-EDTA緩沖液洗滌3次，用0.4mLTris-EDTA緩沖液洗滌一次且用0.2mL Tris-EDTA緩沖液洗滌一次。收集所有上清液。將上清液于4℃對50mM Tris-HCl pH7.4、1M NaCl、0.05％NaN3進行透析，然后再對50mM Tris-HCl pH7.4、1M NaCl、0.05％NaN3透析兩次。透析的溶液然后用Centricon Plus 20離心濾器濃縮。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。將樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
葡糖腦苷脂酶-SA-連接體-甘露糖-6-磷酸的制備(程序1).將上述脫唾液酸化的葡糖腦苷脂酶以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與1mM CMP-唾液酸-連接體-Man-6-磷酸和0.1U/mL的ST3Gal3于32℃溫育2日。為了監(jiān)控唾液酸-連接體-Man-6-磷酸的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了CMP-SA-PEG-熒光配體；整合入肽中的標(biāo)記是在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas TSK-凝膠-3000分析型柱上通過凝膠過濾而與游離標(biāo)記分離的。整合入肽中的熒光標(biāo)記是用內(nèi)置的熒光探測器進行定量的。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas TSK-凝膠-3000制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
葡糖腦苷脂酶-SA-連接體-甘露糖-6-磷酸的制備(程序2).將CHO中產(chǎn)生的但不完全唾液酸化的葡糖腦苷脂酶以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與1mM CMP-唾液酸-連接體-Man-6-磷酸和0.1U/mL的ST3Gal3于32℃溫育2日。為了監(jiān)控唾液酸-連接體-Man-6-磷酸的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了CMP-SA-PEG-熒光配體；整合入肽中的標(biāo)記是在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas TSK-凝膠-3000分析型柱上通過凝膠過濾而與游離標(biāo)記分離的。整合入肽中的熒光標(biāo)記是用內(nèi)置的熒光探測器進行定量的。當(dāng)反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso HaasTSK-凝膠-3000制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
30.葡糖腦苷脂酶-運鐵蛋白本實施例提出了對蛋白質(zhì)進行糖綴合的程序，特別是將運鐵蛋白與葡糖腦苷脂酶進行糖綴合。在葡糖腦苷脂酶上生成了GlcNAc-ASN結(jié)構(gòu)，并用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶使運鐵蛋白-SA-連接體-Gal-UDP與GDNF的GlcNAc-ASN結(jié)構(gòu)綴合。
GlcNAc-葡糖腦苷脂酶(CerezvmeTM)的制備.將CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的CerezymeTM(葡糖腦苷脂酶)以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl中，并使其與300mU/mL Endo-H-瓊脂糖綴合物于32℃溫育16小時。為了監(jiān)控反應(yīng)，將反應(yīng)物的小等份試樣用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋并根據(jù)Invitrogen的程序運行IEF凝膠和SDS-PAGE。將混合物于10,000rpm離心并收集上清液。將珠子用Tris-EDTA緩沖液洗滌3次，用0.4mLTris-EDTA緩沖液洗滌一次且用0.2mL Tris-EDTA緩沖液洗滌一次，并收集所有上清液。將上清液于4℃對50mM Tris-HCl pH7.4、1M NaCl、0.05％NaN3進行透析，然后再對50mM Tris-HCl pH7.4、1M NaCl、0.05％NaN3透析兩次。透析的溶液然后用Centricon Plus 20離心濾器濃縮。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。將樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
運鐵蛋白-SA-連接體-Gal-葡糖腦苷脂酶的制備.將上述的運鐵蛋白-SA-連接體-Gal-UDP以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、5mM MnCl2、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與2.5mg/mL GlcNAc-葡糖腦苷脂酶和0.1U/mL半乳糖基轉(zhuǎn)移酶于32℃溫育2日。為了監(jiān)控葡糖腦苷脂酶的整合，將肽在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而分離，且產(chǎn)物通過UV吸收而探測。然后將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
GM-CSF31.GlcNAc-ASN結(jié)構(gòu)的生成和PEG化糖酵母屬(Saccharomyces)中產(chǎn)生的GM-CSF本實施例提出了對具有PEG化的GlcNAc-Asn結(jié)構(gòu)的組織型激活物的制備。
酵母中表達的重組GM-CSF預(yù)期含有2個N-連接的和2個O-連接的聚糖。N-連接的聚糖應(yīng)該是分支的甘露糖類型。對該重組糖蛋白用選自內(nèi)切糖苷酶H、內(nèi)切糖苷酶-F1、內(nèi)切糖苷酶-F2、內(nèi)切糖苷酶-F3、內(nèi)切糖苷酶-M的內(nèi)切糖苷酶單獨處理或與甘露糖苷酶I、II和III組合處理以在肽/蛋白質(zhì)主鏈上的天冬酰胺(Asn)殘基上生成GlcNAc結(jié)節(jié)。
然后肽/蛋白質(zhì)主鏈上的GlcNAc-Asn結(jié)構(gòu)可分別用UDP-半乳糖或UDP-半乳糖-6-PEG及半乳糖基轉(zhuǎn)移酶如GalTl進行半乳糖或半乳糖-PEG修飾。在一種情況下，半乳糖-PEG是末端殘基。在第二種情況下，半乳糖可進一步用CMP-SA-PEG供體和唾酸轉(zhuǎn)移酶如ST3Gal III以SA-PEG進行修飾。在另一個實施方案中，肽/蛋白質(zhì)主鏈上的GlcNAc-Asn結(jié)構(gòu)可如上所述進行半乳糖基化和唾液酸化，然后進一步用CMP-SA-PEG和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶進行唾液酸化，如由空腸彎曲桿菌空腸亞種的cst-II基因編碼的酶。
HerceptinTM32.光神霉素與HerceptinTM的糖綴合本實施例提出了使小分子如光神霉素與哺乳動物細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體分子的Fc區(qū)域聚糖進行糖綴合的程序。在此，應(yīng)用了抗體HerceptinTM，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解該方法可應(yīng)用于許多其他的抗體。
HerceptinTM-Gal-連接體-光神霉素的制備.將HerceptinTM以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、5mM MnCl2、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與1mM UDP-半乳糖-連接體-光神霉素和0.1U/mL半乳糖基轉(zhuǎn)移酶于32℃溫育2日以在Fc區(qū)域的聚糖中引入光神霉素。為了監(jiān)控半乳糖的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了14C-半乳糖-UDP配體；整合入肽中的標(biāo)記是在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而與游離標(biāo)記分離的。整合入肽中的放射性標(biāo)記是用內(nèi)置的放射性探測器進行定量的。
當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的TosoHaas TSK-凝膠-3000制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。將含有產(chǎn)物的級分合并、濃縮、交換緩沖液，然后凍干。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
干擾素α和干擾素β33.哺乳動物或昆蟲系統(tǒng)中表達的蛋白質(zhì)的糖PEG化EPO、干擾素α和干擾素β本實施例提出了對表達于哺乳動物和昆蟲系統(tǒng)中的PEG化肽的制備。
來自哺乳動物表達系統(tǒng)的受體的制備.用CMP-唾液酸PEG進行糖PEG化的肽需要具有以半乳糖結(jié)尾的聚糖。大多數(shù)來自哺乳動物表達系統(tǒng)的肽將具有首先需要去除的末端唾液酸。
唾液酸酶消化.將肽用唾液酸酶進行脫唾液酸化。一般的程序包括使1mg/mL肽溶液在添加了5mM CaCl2的pH7.2的Tris-緩沖的鹽中與0.2U/mL來自霍亂弧菌的固定的唾液酸酶(Calbiochem)于32℃溫育24小時。微生物生長可通過無菌過濾或包含0.02％的疊氮化鈉而停止。然后通過離心或過濾去除該樹脂，并進行洗滌以回收捕獲的肽。在這時，可將EDTA添加到溶液中以抑制從樹脂中滲漏的任何唾液酸酶。
來自昆蟲表達系統(tǒng)的制劑.EPO、干擾素α和干擾素β也可表達于非哺乳動物系統(tǒng)中，如酵母、植物或昆蟲細(xì)胞中。用CMP-唾液酸PEG進行糖PEG化的肽需要具有以半乳糖結(jié)尾的聚糖。大多數(shù)表達于昆蟲細(xì)胞中的肽上的聚糖是例如三甘露糖核心。這些聚糖在成為唾酸轉(zhuǎn)移酶的受體之前首先構(gòu)建為以半乳糖結(jié)尾的聚糖。
從三甘露糖核心構(gòu)建受體聚糖.使肽(1mg/mL)在含有5mM MnCl2、5mM UDP-GlcNAc、0.05U/mL GLCNACTI、0.05U/mL GLCNACTII的pH7.2的Tris-緩沖鹽中于32℃溫育24小時或直到反應(yīng)基本結(jié)束。微生物生長可通過無菌過濾或包含0.02％的疊氮化鈉而停止。在交換緩沖液以去除UDP和其他小分子之后，將UDP-半乳糖和MnCl2各自添加至5mM，將半乳糖基轉(zhuǎn)移酶添加至0.05U/mL，并于32℃溫育24小時或直到反應(yīng)基本結(jié)束。微生物生長可通過無菌過濾或包含0.02％的疊氮化鈉而停止。然后該肽可用于進行糖PEG化。
構(gòu)建O-連接聚糖.類似的策略可應(yīng)用于干擾素α以酶促產(chǎn)生想要的0-聚糖Gal-GalNAc。如果需要，可用適當(dāng)?shù)碾腉alNAc轉(zhuǎn)移酶(如GalNAc T1、GalNAc T2、T3、T4等)和UDP-GalNAc將連接到絲氨酸或蘇氨酸上的GalNAc添加到肽上。同樣地，如果需要，可用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶和UDP-半乳糖添加半乳糖。
用唾酸轉(zhuǎn)移酶進行糖PEG化.使Tris緩沖的鹽水+0.02％疊氮化鈉中的具有末端半乳糖的糖肽(1mg/mL)與CMP-SA-PEG(0.75mM)和0.4U/mL唾酸轉(zhuǎn)移酶(對于EPO和干擾素β上的N-聚糖為ST3Gal3或ST3Gal4；對于干擾素α上的O-聚糖為ST3Gal4或ST3Gal1)于32℃溫育24小時。其他可用的轉(zhuǎn)移酶包括來自美人魚發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamsella)的α2，6唾酸轉(zhuǎn)移酶。受體肽濃度最優(yōu)選地為0.1mg/mL到肽的溶解極限。CMP-SA-PEG的濃度應(yīng)足以超過可用的位點，但不應(yīng)該太高而導(dǎo)致肽溶解性問題(PEG造成的)，且可為50μM～5mM，且溫度可為2℃～40℃。完成反應(yīng)需要的時間將依賴于溫度、酶對受體底物的相對量、供體底物的濃度及pH。
34.CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的干擾素α的糖PEG化脫唾液酸化-干擾素α的制備.將從CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的干擾素α以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl、5mM CaCl2中并在Centricon Plus 20離心濾器中濃縮至500μL。使該溶液與300mU/mL神經(jīng)氨酸酶II(霍亂弧菌)于32℃溫育16小時。為了監(jiān)控反應(yīng)，將反應(yīng)物的小等份試樣用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋并運行IEF凝膠分析。然后將反應(yīng)混合物添加入預(yù)先洗滌的N-(對氨基苯基)草氨酸-瓊脂糖綴合物(800μL/mL反應(yīng)體積)，并使洗滌的珠子于4℃輕輕旋轉(zhuǎn)24小時。將混合物于10,000rpm離心并收集上清液。將珠子用Tris-EDTA緩沖液洗滌3次，用0.4mL Tris-EDTA緩沖液洗滌一次且用0.2mL Tris-EDTA緩沖液洗滌一次，并收集所有上清液。將上清液于4℃對50mM Tris-HCl pH7.4、1M NaCl、0.05％NaN3進行透析，然后再對50mM Tris-HCl pH7.4、1M NaCl、0.05％NaN3透析兩次。透析的溶液然后用Centricon Plus 20離心濾器濃縮并貯存于-20℃。IEF凝膠的條件是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑運行的。將天然的和脫唾液酸化的G-CSF樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
干擾素α-(α2，3)-唾液酸-PEG的制備.將脫唾液酸化的干擾素α以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與1mM CMP-唾液酸-PEG和0.1U/mL的ST3Gal1于32℃溫育2日。為了監(jiān)控唾液酸-PEG的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了CMP-SA-PEG-熒光配體；整合入肽中的標(biāo)記是在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而與游離標(biāo)記分離的。整合入肽中的熒光標(biāo)記是用內(nèi)置的熒光探測器進行定量的。2日后，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使天然的和脫唾液酸化的干擾素α樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
干擾素α-(α2，8)-唾液酸-PEG的制備.將CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的含有α2，3-唾液酸化的O-連接聚糖的干擾素α以2.5mg/mL溶解于50mMTris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與1mM CMP-唾液酸-PEG和0.1U/mL的CST-II于32℃溫育2日。為了監(jiān)控唾液酸-PEG的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了CMP-SA-PEG-熒光配體；整合入肽中的標(biāo)記是在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而與游離標(biāo)記分離的。整合入肽中的熒光標(biāo)記是用內(nèi)置的熒光探測器進行定量的。2日后，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使天然的和PEG化的干擾素α樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
干擾素α-(α2，6)-唾液酸-PEG的制備.將僅含有O-連接的GalNAc的干擾素α以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與1mM CMP-唾液酸-PEG和0.1U/mL的ST6Gal NAcI或II于32℃溫育2日。為了監(jiān)控唾液酸-PEG的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了CMP-SA-PEG-熒光配體；整合入肽中的標(biāo)記是在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而與游離標(biāo)記分離的。整合入肽中的熒光標(biāo)記是用內(nèi)置的熒光探測器進行定量的。2日后，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使天然的和PEG化的干擾素α樣品對水進行透析并由MALDI-TOFMS進行分析。
35.用PEG(10kDa)和PEG(20kDa)對干擾素-β-1a的糖PEG化本實施例闡明了用PEG(10kDa)或PEG(20kDa)對干擾素-β進行PEG化的程序。
簡言之，干擾素-β-1a(INF-β)購自Biogen(AvonexTM)。INF-β首先通過Superdex-75進行純化。然后INF-β用霍亂弧菌唾液酸酶進行脫唾液酸化。然后INF-β用SA-PEG(10kDa)和SA-PEG(20kDa)進行PEG化，并用Superdex-200進行純化。
Superdex-75層析純化.將INF-β(150μg)應(yīng)用于Superdex-75柱上(Amersham Biosciences，Arlington Heights，IL)，并用具有0.5M NaCl、0.02Tween-20、20mM組氨酸和10％甘油的PBS進行洗脫。監(jiān)控洗脫液在280nm的吸收(
圖172A和172B)，并收集級分。匯集峰4和5，在Amicon Ultra 15旋轉(zhuǎn)濾器(Millipore，Billerica，MA)上濃縮，并將緩沖液交換為具有0.5M CaCl2、0.02％Tween-20、20mM組氨酸和10％甘油的TBS。
唾液酸酶反應(yīng).然后在具有5mM CaCl2、0.02％Tween-20、20mM組氨酸和10％甘油的TBS中的瓊脂糖上用霍亂弧菌唾液酸酶(70mU/ml，CALBIOCHEM_，EMD Biosciences，Inc.，San Diego，CA)對INF-β進行脫唾液酸化。反應(yīng)在32℃進行18小時。用0.22μm Spin-XTM濾器(CorningTechnology，Inc.，Norcross，GA)從瓊脂糖上獲取INF-β。
圖173A描述了從天然INF-β釋放的聚糖的MALDI分析。天然的INF-β具有許多含有末端唾液酸部分的糖形式。
圖173B描述了從脫唾液酸的INF-β釋放的聚糖的MALDI分析。脫唾液酸的INF-β主要具有一種含有末端唾液酸部分的雙觸角糖形式。
唾液酸化的凝集素斑點印跡分析.將來自脫唾液酸酶反應(yīng)的INF-β樣品斑點印跡在硝化纖維素上，然后用Tris緩沖的鹽水(TBS0.05MTris，0.15M NaCl，pH7.5)和DIG試劑盒(購自Roche#1 210 238的聚糖區(qū)別試劑盒)封閉緩沖液進行封閉。將一些印跡與用洋地黃毒苷(DIG)(Roche Applied Science，Indianapolis，IL)標(biāo)記的懷槐凝集素(MAA)一起溫育，以探測INF-β的α2，3-唾液酸化。將這些印跡用TBS進行洗滌，然后與用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗毛地黃皂苷一起溫育，然后再次用TBS洗滌，并用NBT/X-磷酸鹽溶液進行顯影，其中NBT是4-硝基藍(lán)氯化四氮唑，而X-磷酸鹽是5-溴-4-氯-3吲哚磷酸鹽。
圖174的左側(cè)描述了脫唾液酸化反應(yīng)后INF-β的MAA印跡的結(jié)果。INF-β是部分脫唾液酸化的，這通過與脫唾液酸化的樣品中的天然INF-β相比，在印跡顯影中的減弱所顯示。
將其他印跡與用生物素(Vector Laboratories，Burlingame，CA)標(biāo)記的Erthrina cristagalli凝集素(ECL)一起溫育，以探測在INF-β上暴露的半乳糖殘基。在與2.5μg/ml ECL一起溫育后，在TBS中洗滌印跡，并使其與用堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白一起溫育。然后再次洗滌印跡，并顯影。
圖174的右側(cè)描述了顯影后的ECL印跡。與天然INF-β相比脫唾液酸化的INF-β的印記增加的強度顯示更多暴露的半乳糖部分，因而顯示充分的脫唾液酸化。
用SA-PEG(10kDa)對脫唾液酸化的INF-β的PEG化.在適當(dāng)?shù)木彌_液中應(yīng)用ST3Gal3(50mU/ml)和CMP-SA-PEG(10kDa)(250μM)對脫唾液酸化的INF-β(0.05mg/ml)于32℃PEG化50小時，所述緩沖液為TBS+5mM CaCl2、0.02％Tween 20、20mM組氨酸、10％甘油。
圖175描述了反應(yīng)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析，顯示了大約98kDa的PEG化的INF-β。
用SA-PEG(20kDa)時脫唾液酸化的INF-β的PEG化.在適當(dāng)?shù)木彌_液中應(yīng)用ST3Gal3(170mU/ml)和CMP-SA-PEG(20kDa)對脫唾液酸化的INF-β(0.5mg/ml)于32℃PEG化50小時，所述緩沖液為TBS+5mM CaCl2、0.02％Tween 20、20mM組氨酸、10％甘油。
圖176描述了PEG化反應(yīng)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析。PEG化的INF-β具有許多在未修飾的INF-β中未見到的更高分子量的條帶，這表明其進行了更充分的PEG化。
用PEG(10kDa)PEG化的INF-β的Superdex-200純化.PEG化反應(yīng)產(chǎn)物在Superdex-200柱上(Amersham Biosciences，ArlingtonHeights，IL)進行分離，該柱子應(yīng)用具有0.5M NaCl、0.02 Tween-20、20mM組氨酸和10％甘油的PBS，流速為1ml/分鐘和30cm/小時。監(jiān)控洗脫液在280nm的吸收(
圖177)，并收集級分。匯集峰3和4，并在AmiconUltra 15旋轉(zhuǎn)濾器上濃縮。
用PEG(10kDa)PEG化的INF-β的生物測定.
該試驗是肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549增殖的抑制。A549細(xì)胞系是在37℃5％CO2生長于RPMI+10％FBS中的肺癌貼壁細(xì)胞。它們可從ATCC#CCL-185獲得。用10ml PBS洗滌細(xì)胞，并去除PBS。添加5ml胰蛋白酶，于室溫溫育5分鐘，或者于37℃溫育2分鐘。當(dāng)細(xì)胞離壁時，重懸于25ml培養(yǎng)基中并對細(xì)胞進行計數(shù)。以10000細(xì)胞/ml的濃度稀釋細(xì)胞，并以200μl/孔添加(96孔平板)。在37℃5％CO2溫育4小時。以0.1μg/ml的濃度制備1mlINF-β。在通風(fēng)櫥下用0.2μm濾器進行過濾。每孔添加100μl(8次重復(fù)＝1道)。溫育3日(不使細(xì)胞會合)。去除200μl培養(yǎng)基(每孔只剩100μl)。添加25μl MTT(Sigma)(5mg/ml，進行了0.22μm過濾)。在37℃和5％CO2溫育4小時。輕輕吸出培養(yǎng)基并添加100μl異丙醇(100ml)和6N HCl的混合物。上下抽吸以使結(jié)晶紫勻漿。讀取570nm的OD(去除在630或690nm的背景)。
圖178描述了對從Superdex-200柱洗脫的含有用PEG(10kDa)PEG化的INF-β的峰的生物測定。
用PEG(20kDa)PEG化的INF-β的Superdex-200純化.PEG(20kDa)PEG化反應(yīng)產(chǎn)物在Superdex-200柱上(Amersham Biosciences，Arlington Heights，IL)進行分離，該柱子應(yīng)用具有0.5NaCl、0.02Tween-20、20mM組氨酸和10％甘油的PBS，流速為1ml/分鐘。監(jiān)控洗脫液在280nm的吸收(
圖179)，并收集級分。峰3含有大部分用PEG(20kDa)PEG化的INF-β。
用PEG(20kDa)PEG化的INF-β的內(nèi)毒素測試.
進行了鱟裂解物試驗，Bio Whittaker#50-647U表24.用PEG(20kDa)PEG化的INF-β的內(nèi)毒素試驗結(jié)果。
RemicadeTM36.RemicadeTM抗體的糖PEG化本實施例提出了通過向Fc區(qū)域的聚糖引入PEG分子而對重組抗體分子進行糖PEG化的程序。在此，RemicadeTM，即TNF-RIgG Fc區(qū)域融合蛋白質(zhì)，是示例性的肽。
RemicadeTM-Gal-PEG(10kDa)的制備.將RemicadeTM以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、5mM MnCl2、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與1mM UDP-半乳糖-PEG(10kDa)和0.1U/mL半乳糖基轉(zhuǎn)移酶于32℃溫育2日以在Fc區(qū)域的聚糖中引入PEG。為了監(jiān)控半乳糖的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了14C-半乳糖-UDP配體；整合入肽中的標(biāo)記是在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而與游離標(biāo)記分離的。整合入肽中的放射性標(biāo)記是用內(nèi)置的放射性探測器進行定量的。
當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的TosoHaas TSK-凝膠-3000制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。將含有產(chǎn)物的級分合并、濃縮、交換緩沖液，然后凍干。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
RituxanTM37.格爾德霉素與RituxanTM的糖綴合本實施例提出了使小分子如格爾德霉素與CHO細(xì)胞中產(chǎn)生的抗體如RituxanTM的Fc區(qū)域聚糖進行糖綴合的程序。在此，應(yīng)用了抗體RituxanTM，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解該方法可應(yīng)用于許多其他的抗體。
RituxanTM-Gal-連接體-格爾德霉素的制備.將RituxanTM以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、5mM MnCl2、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與1mM UDP-半乳糖-連接體-格爾德霉素和0.1U/mL半乳糖基轉(zhuǎn)移酶于32℃溫育2日以在Fc區(qū)域的聚糖中引入格爾德霉素。為了監(jiān)控半乳糖的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了14C-半乳糖-UDP配體；整合入肽中的標(biāo)記是在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso HaasG3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而與游離標(biāo)記分離的。整合入肽中的放射性標(biāo)記是用內(nèi)置的放射性探測器進行定量的。
當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的TosoHaas TSK-凝膠-3000制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。將含有產(chǎn)物的級分合并、濃縮、交換緩沖液，然后凍干。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
Rnase38.將高甘露糖N-聚糖重構(gòu)為雜合的和復(fù)雜的N-聚糖牛胰RNase本實施例提出了對具有雜合的或復(fù)雜的N-聚糖的牛胰RNase的制備。對RNase的高甘露糖N-連接聚糖進行酶促消化和處理以生成雜合的N-連接聚糖。此外，可對RNase的高甘露糖N-連接聚糖進行酶促消化和處理以生成復(fù)雜的N-連接聚糖。
糖肽中N-連接寡糖的高甘露糖結(jié)構(gòu)可用α-甘露糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶的組合修飾為雜合的或復(fù)雜的形式。本實施例總結(jié)了用簡單的N-聚糖作為模型底物的這種努力的結(jié)果。
從牛胰臟中純化的核糖核酸酶B(RNaseB)(Sigma)是由124個氨基酸殘基組成的糖肽。它具有由高甘露糖結(jié)構(gòu)修飾的單個潛在的N-糖基化位點。由于其簡單性和低分子量(13.7kDa～15.5kDa)，所以核糖核酸酶B是證明從高甘露糖結(jié)構(gòu)向雜合的或復(fù)雜的N-連接寡糖的N-聚糖重構(gòu)的可能性的良好候選物。RNaseB的MALDI-TOF譜(
圖180A)與由N-聚糖酶從RNaseB切割的寡糖的HPLC圖(
圖180B)顯示除未修飾的肽的小部分之外，肽的大多數(shù)N-糖基化位點均用由5～9個甘露糖殘基組成的高甘露糖寡糖進行了修飾。
高甘露糖N-聚糖向雜合的N-聚糖的轉(zhuǎn)變.高甘露糖N-聚糖是用α1，2-甘露糖苷酶、GlcNAcT-I(β-1，2-N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶)、GalT-I(β1，4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)和α2，3-唾酸轉(zhuǎn)移酶/或α2，6-唾酸轉(zhuǎn)移酶的組合轉(zhuǎn)變?yōu)殡s合的N-聚糖的，如
圖181所示。
作為例子，將RNaseB中的高甘露糖結(jié)構(gòu)成功地轉(zhuǎn)變?yōu)殡s合的結(jié)構(gòu)。
Man5GlcNAc2-R是用從里氏木霉克隆的單個α1，2-甘露糖苷酶催化Man5-9GlcNAc2-R獲得的(
圖182)。使RNaseB(1g，約67μmol)與15mU重組里氏木霉的α1，2-甘露糖苷酶在MES緩沖液(50mM，pH6.5)在10mL總體積中于30℃溫育45小時。Man6-9GlcNAc2-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)已成功地用重組甘露糖苷酶高效地轉(zhuǎn)變?yōu)镸an5GlcNAc2-蛋白質(zhì)。
可選擇地，Man5GlcNAc2-R是用從Aspergillus saitoi純化的單個α1，2-甘露糖苷酶催化Man5-9GlcNAc2-R獲得的(
圖183)。使RNaseB(40μg，約2.7nmol)與25μU商業(yè)A.saitoi的α1，2-甘露糖苷酶(Glyko或CalBioChem)在NaOAC緩沖液(100mM，pH5.0)在20μL總體積中于37℃溫育42.5小時。Man6-9GlcNAc2-蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)已成功地用商業(yè)上可購得的甘露糖苷酶轉(zhuǎn)變?yōu)镸an5GlcNAc2-蛋白質(zhì)。然而，在譜中出現(xiàn)了相應(yīng)于GlcNAc-蛋白質(zhì)的新峰，從而顯示制劑中可能的內(nèi)切糖苷酶H的污染。盡管需要幾種哺乳動物α-甘露糖苷酶以實現(xiàn)該步驟，但真菌α1，2-甘露糖苷酶對于去除所有α1，2-連接的甘露糖殘基是非常有效的。
然后GlcNAcT-I將GlcNAc殘基添加到Man5GlcNAc2-R中(
圖184)。在里氏木霉的α1，2-甘露糖苷酶反應(yīng)后使含有RNaseB(600μg，約40nmol)的反應(yīng)混合物與非純化的重組GlcNAcT-I(34mU)在MES緩沖液(50mM，pH6.5)中在400μL的總體積中于37℃溫育42小時，該MES緩沖液含有MnCl2(20mM)和UDP-GlcNAc(5mM)。GlcNAc殘基是由重組GlcNAcT-I定量地添加到Man5GlcNAc2-蛋白質(zhì)中的。
然后用GalT1添加Gal殘基(
圖185)。在GnT-I反應(yīng)后使含有RNaseB(120μg，約8nmol)的反應(yīng)混合物與3.3mU重組GalT-1在Tris-HCl緩沖液(100mM，pH7.3)中在100μL的總體積中于37℃溫育20小時，該Tris-HCl緩沖液含有UDP-Gal(7.5mM)和MnCl2(20mM)。Gal殘基是由重組GalT1添加到約98％的GlcNAc-Man5GlcNAc2-蛋白質(zhì)中的。
下一個步驟是用α2，3-唾酸轉(zhuǎn)移酶或α2，6-唾酸轉(zhuǎn)移酶添加唾液酸(
圖186)。作為例子，應(yīng)用ST3GalIII，即一種α2，3-唾酸轉(zhuǎn)移酶。在GalT-1反應(yīng)后使含有RNaseB(13μg，約0.87nmol)的反應(yīng)混合物與8.9mU重組ST3Gal III在Tris-HCl緩沖液(100mM，pH7.3)中在20μL的總體積中于37℃溫育16小時，該Tris-HCl緩沖液含有CMP-唾液酸(5mM)和MnCl2(20mM)。唾液酸殘基是由重組ST3Gal III用CMP-SA作為供體添加到約90％的Gal-GlcNAc-Man5GlcNAc2-蛋白質(zhì)中的。該產(chǎn)量可進一步通過調(diào)節(jié)反應(yīng)條件而改善。
為方便起見，在上述每一個反應(yīng)之后不需要純化或透析。更有趣的是，GnT-I和ST3Gal III可組合在一個(one pot)反應(yīng)中。與分離的反應(yīng)相比可獲得類似的產(chǎn)量。在GlcNAcT-I反應(yīng)后使含有RNaseB(60μg，約4nmol)的反應(yīng)混合物與1.7mU重組GalT1、9.8mU重組ST3Gal III在Tris-HCl緩沖液(100mM，pH7.3)中在60μL的總體積中于37℃溫育20小時，該Tris-HCl緩沖液含有UDP-Gal(7.5mM)、CMP-唾液酸(5mM)和MnCl2(20mM)。
如
圖187所示，將SA-PEG(10kDa)成功地添加到RNaseB中。在GalT-1反應(yīng)后使含有RNaseB(6.7μg，約0.45nmol)的反應(yīng)混合物在室溫對H2O透析1小時，并與55mU重組ST3Gal III在Tris-HCl緩沖液(50mM，pH7.3)中在20μL的總體積中于37℃溫育15.5小時，該Tris-HCl緩沖液含有CMP-SA-PEG(10kDa)(0.25mM)和MnCl2(20mM)。PEG-修飾的唾液酸殘基是由重組ST3Gal III成功添加到Gal-GlcNAc-Man5GlcNAc2-肽中的。該產(chǎn)量可進一步通過調(diào)節(jié)反應(yīng)條件而改善。
高甘露糖N-聚糖向復(fù)雜N-聚糖的轉(zhuǎn)變.為了實現(xiàn)該轉(zhuǎn)變，獲得了GlGNAcβ1，2Man3GlGNAc2-肽中間物。如
圖188所示，至少有4個可行的路線可實現(xiàn)從Man5GlcNAc2-肽向該中間物的反應(yīng)路線I由真菌α1，2甘露糖苷酶產(chǎn)生的Man5GlGNAc2-肽是添加一個GlcNAc的GlGNAc轉(zhuǎn)移酶I(GlGNAGT-I，酶2)的底物。GlcNAcMan5GlGNAc2-肽的末端α1，3-和α1，6-連接的甘露糖殘基可由高爾基體α甘露糖苷酶II(ManII，酶5)去除。該路線是高等生物中進行的加工N-連接寡糖的天然途徑的一部分。
路線II首先用α甘露糖苷酶(酶6)去除2個甘露糖殘基，然后用GlGNAGT-I(酶2)添加GlcNAc。除其天然受體Man5GlcNAc2-R之外，GlcNAcT-I也可識別Man3GlcNAG2-R作為其底物并將一個GlGNAc添加到甘露糖核心結(jié)構(gòu)上以形成GlGNAcMan3GlGNAG2-肽。
路線IIIα1，6-連接的甘露糖是由α1，6-甘露糖苷酶去除的，隨后由GlcNAcT-I添加GlcNAc及由α1，3-甘露糖苷酶去除末端α1，3-連接的甘露糖。從獲得的實驗數(shù)據(jù)看，GlcNAcT-I可識別該Man4GlcNAc2-肽作為受體并添加一個GlcNAc殘基以形成GlcNAcMan4GlGNAc2-肽。
路線IV與路線III相似，α1，3-連接的甘露糖是由α1，3-甘露糖苷酶去除的，隨后為GlGNAGT-I反應(yīng)。然后末端α1，6-連接的甘露糖可由α1，6-甘露糖苷酶去除。
在GlcNAcT-I(負(fù)責(zé)在甘露糖核心上添加與α1，3-甘露糖β1，2連接的GlcNAc)和GlcNAGT-II(負(fù)責(zé)在甘露糖核心上添加第二個與α1，6-甘露糖β1，2連接的GlcNAc)作用之后，GlcNAc2Man3GlGNAc2-肽可由GalT 1和唾酸轉(zhuǎn)移酶進行加工以形成雙觸角的復(fù)雜N-聚糖。其他GlcNAc轉(zhuǎn)移酶如GlcNAcT-IV、GlcNAcT-V和/或GlcNAcT-VI(
圖188和
圖189)也可對GlcNAc2Man3GlcNAc2-肽進行糖基化。由GalT 1和唾酸轉(zhuǎn)移酶進行的額外的糖基化將形成多觸角的復(fù)雜N-聚糖。酶GlcNAcT-III催化等分的GlcNAc的插入，從而阻止了ManII的作用和隨后轉(zhuǎn)移酶GlcNAcT-II、GlcNAcT-IV和GlcNAcT-V的作用。
組織型纖溶酶原激活物(TPA)39.對TPA進行巖藻糖基化以生成唾液酸化Lewis X本實施例提出了帶有N-連接的唾液酸化Lewis X抗原的組織型纖溶酶原激活物(TPA)的制備。
唾液酸化.在哺乳動物細(xì)胞中表達的TPA常常含有大多數(shù)以唾液酸結(jié)尾的聚糖，但為了確保完全的唾液酸化，首先進行體外唾液酸化是有利的。使在適當(dāng)緩沖液(最優(yōu)選地在pH5.5～9，例如Tris緩沖的鹽，pH7.2)中的TPA與CMP唾液酸和唾酸轉(zhuǎn)移酶溫育足夠的時間，以將任何缺乏唾液酸的聚糖轉(zhuǎn)變?yōu)橥僖核峄姆N類。一般的條件為1mg/mL TPA、3mM CMP唾液酸、0.02U/mL ST3Gal3，32℃進行24小時。微生物生長可通過無菌過濾或包含0.02％的疊氮化鈉而抑制。TPA濃度最優(yōu)選地為0.1mg/mL到肽的溶解極限。CMP-SA的濃度應(yīng)足以超過可用的位點，且可在50μM～50mM，且溫度為2℃～40℃。完成反應(yīng)所需要的時間將依賴于溫度、酶對受體底物的相對量、供體底物的濃度及pH。能夠以2，3鍵添加唾液酸的其他唾酸轉(zhuǎn)移酶包括ST3Gal4；也可應(yīng)用微生物轉(zhuǎn)移酶。
巖藻糖基化.巖藻糖基化的一般條件為1mg/mL TPA、3mM GDP-巖藻糖、0.02U/mL FTVI、5mM MnCl2，在Tris緩沖的鹽中于32℃進行24小時。微生物生長可通過無菌過濾或包含0.02％的疊氮化鈉而抑制。TPA濃度最優(yōu)選地為0.1mg/mL到肽的溶解極限。GDP-巖藻糖的濃度應(yīng)足以超過可用的位點，且可在50μM～50mM，且溫度為2℃～40℃。完成反應(yīng)所需要的時間將依賴于溫度、酶對受體底物的相對量、供體底物的濃度及pH。能夠制備唾液酸化的Lewis X的其他巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶包括FTVII、FTV、FTIII，也可應(yīng)用微生物轉(zhuǎn)移酶。
40.修剪高甘露糖為三甘露糖核心結(jié)構(gòu)CHO中產(chǎn)生的組織型纖溶酶原激活物。
本實施例提出了通過修剪高甘露糖聚糖而制備具有三甘露糖核心的組織型纖溶酶原激活物。
組織型纖溶酶原激活物(TPA)的制備目前在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中生產(chǎn)且含有低量的高甘露糖N-連接的寡糖。該甘露糖可用各種特定的甘露糖苷酶修剪。第一個步驟是從Man9GlcNAc2(Fuc0-1)生成Man5GlcNAc2(Fuc0-1)。這可用甘露糖苷酶I進行。然后將GlcNAcTl(GlcNAc轉(zhuǎn)移酶I)用于制備GlcNAclMan5GlcNAc2(Fuc0-1)或?qū)⒏事短擒彰窱II用于制備Man3GlcNAc2(Fuc0-1)。GlcNAclMan3GlcNAc2(Fuc0-1)可用GlcNAcT1從Man3GlcNAc2(Fuc0-1)制備，或者GlcNAclMan3GlcNAc2(Fuc0-1)可用甘露糖苷酶II從GlcNAclMan5GlcNAc2(Fuc0-1)制備。然后用GlcNAc轉(zhuǎn)移酶II(GlcNAcTII)將GlcNAclMan3GlcNAc2(Fuc0-1)轉(zhuǎn)變?yōu)镚lcNAc2Man3GlcNAc2(Fuc0-1)。兩個末端GlcNAc殘基然后可用GalTI進行半乳糖基化，并然后用ST3Gal III以SA-PEG進行唾液酸化。
相反地，TPA可在酵母或真菌系統(tǒng)中產(chǎn)生。對于真菌衍生的材料將需要類似的過程。
41.GlcNAc-ASN結(jié)構(gòu)的生成和PEG化酵母中產(chǎn)生的TPA本實施例提出了對肽如酵母中表達的TPA上PEG化的GlcNAc-Asn結(jié)構(gòu)的制備。
酵母表達能夠得到含有單個N-連接的甘露糖型結(jié)構(gòu)的TPA。對該重組糖蛋白首先用內(nèi)切糖苷酶H處理以在肽上的天冬酰胺(Asn)殘基上生成GlcNAc結(jié)構(gòu)。
然后肽/蛋白質(zhì)主鏈上的GlcNAc-Asn結(jié)構(gòu)分別用UDP-半乳糖或UDP-半乳糖-6-PEG及半乳糖基轉(zhuǎn)移酶如GalT1進行半乳糖或半乳糖-PEG修飾。在一種情況下，半乳糖-PEG是末端殘基。在第二種情況下，半乳糖可進一步用CMP-SA-PEG供體和唾酸轉(zhuǎn)移酶如ST3Gal III以SA-PEG進行修飾。在另一個實施方案中，肽/蛋白質(zhì)主鏈上的GlcNAc-Asn結(jié)構(gòu)可如上所述進行半乳糖基化和唾液酸化，然后進一步用CMP-SA-PEG和α2，8-唾酸轉(zhuǎn)移酶進行唾液酸化，如由空腸彎曲桿菌空腸亞種的cst-II基因編碼的酶。
運鐵蛋白42.運鐵蛋白的糖PEG化本實施例提出了對脫唾液酸化運鐵蛋白的制備及用PEG-CMP-唾液酸進行的唾液酸化。
脫唾液酸化運鐵蛋白的制備.將人源的完整運鐵蛋白(10mg)溶解于500μL的50mM NaOAc、5mM CaCl2，pH5.5中。向該溶液中加入500mU神經(jīng)氨酸酶II(霍亂弧菌)，并將反應(yīng)混合物于37℃輕輕搖動20.5小時。將反應(yīng)混合物加入到預(yù)先洗滌的N-(對氨基苯基)草氨酸-瓊脂糖綴合物(600μL)中，并將洗滌的珠子于4℃輕輕旋轉(zhuǎn)24小時。將混合物于10,000rpm離心并收集上清液。通過向洗過的珠子加上100μl的30mM EDTA，從而將反應(yīng)混合物調(diào)節(jié)為5mM EDTA，該珠子然后在4℃輕輕旋轉(zhuǎn)20小時。將懸浮液在10,000rpm離心2分鐘，并收集上清液。將珠子用0.35mL的50mM NaOAc、5mM CaCl2、5mM EDTA，pH5.5洗滌5次并收集所有上清液。將酶溶液于4℃兩次透析于15mM Tris-HCl、1MNaCl，pH7.4中。獲取0.3mL運鐵蛋白溶液(總共3.3mL)并對水透析兩次。將剩余物再次于4℃對磷酸鹽緩沖鹽水透析兩次。將透析的溶液貯存于-20℃。蛋白質(zhì)樣品是由IEF電泳分析的。將樣品(9μL，25μg)用16μL Tris緩沖液稀釋并與25μL樣品加樣緩沖液混合，并應(yīng)用于Isoelectric Focusing Gels(pH3-7)。凝膠是用標(biāo)準(zhǔn)程序運行和固定的。凝膠用Colloidal Blue Stain染色。
脫唾液酸化運鐵蛋白的唾液酸-PEG化.將脫唾液酸化的運鐵蛋白(250μg)和CMP-唾液酸或CMP-SA-PEG(1kDa或10kDa)(0.05μmol)于1.5mL塑料試管中溶解于69μL的50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3，pH7.2中。將試管簡單地渦旋并添加100mU ST3Gal3(90μL)(250μL總體積)。對試管再次進行渦旋，并輕輕于32℃混合24小時。該反應(yīng)通過于-80℃冷凍而停止。將Novex Tris-甘氨酸8-16％1mm凝膠用于SDS-PAGE分析(
圖190)。將樣品(25μL，25μg)與25μL樣品加樣緩沖液和0.4μL β-巰基乙醇混合并于85℃加熱6分鐘。凝膠是用標(biāo)準(zhǔn)條件運行的并用Colloidal Blue Stain染色。IEF凝膠也如上所述進行(
圖191)。樣品也對水進行透析并由MALDI-TOF進行分析。
結(jié)果.也進行了MALDI。天然的運鐵蛋白(78729)；脫唾液酸化運鐵蛋白(78197)；再次唾液酸化的運鐵蛋白(79626/80703)；具有SA-PEG1k(79037(1)；80961(2)；82535(3)；84778(4))；具有SA-PEG 5k(90003(2)；96117(3)；96117(4))；具有SA-PEG 10k(100336(2)；111421(3)；122510(4))。
43.運鐵蛋白-GDNF本實施例提出了對蛋白質(zhì)進行糖綴合的程序，特別是將運鐵蛋白與GDNF進行糖綴合。運鐵蛋白-SA-連接體-Gal-UDP是從運鐵蛋白制備的。將半乳糖殘基從GDNF聚糖中去除，并用半乳糖基轉(zhuǎn)移酶使運鐵蛋白-SA-連接體-Gal-UDP與GDNF聚糖綴合。
脫半乳糖化(agalacto)-GDNF的制備.將NSO細(xì)胞(NSO鼠骨髓瘤細(xì)胞)中產(chǎn)生的GDNF以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl pH7.4、0.15M NaCl中，并使其與300mU/mL β-半乳糖苷酶-瓊脂糖綴合物于32℃溫育16小時。為了監(jiān)控反應(yīng)，將反應(yīng)物的小等份試樣用適當(dāng)?shù)木彌_液稀釋并根據(jù)Invitrogen的程序運行IEF凝膠分析。將混合物于10,000rpm離心并收集上清液。將上清液于4℃對50mM Tris-HCl pH7.4、1M NaCl、O.05％NaN3進行透析，然后再對50mM Tris-HCl pH7.4、1M NaCl、0.05％NaN3透析兩次。透析的溶液然后用Centricon Plus 20離心濾器濃縮并貯存于-20℃。IEF凝膠的條件是根據(jù)Invitrogen提供的程序和試劑運行的。將樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
運鐵蛋白-SA-連接體-Gal-UDP的制備.將脫唾液酸化的運鐵蛋白以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與CMP-唾液酸-連接體-Gal-UDP(摩爾總計為使1摩爾等價的核苷酸糖添加到運鐵蛋白上)和0.1U/mL的ST3Gal3于32℃溫育2日。為了監(jiān)控唾液酸的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了14C-SA-UDP配體；整合入肽中的標(biāo)記是在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso HaasG3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而與游離標(biāo)記分離的。整合入肽中的放射性標(biāo)記是用內(nèi)置的放射性探測器進行定量的。
使該溶液與5mM CMP-唾液酸和0.1U/mL的ST3Gal3(以對任何未反應(yīng)的運鐵蛋白聚糖進行加帽)于32℃溫育2日。向肽中的整合是用內(nèi)置的UV探測器進行定量的。2日后，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
運鐵蛋白-SA-連接體-Gal-GDNF的制備.將上述制備的運鐵蛋白-SA-連接體-Gal-UDP以2.5mg/mL溶解于50mM Tris-HCl、0.15M NaCl、5mM MnCl2、0.05％NaN3，pH7.2中。使該溶液與2.5mg/mL脫半乳糖化-GDNF和0.1U/mL半乳糖基轉(zhuǎn)移酶于32℃溫育2日。為了監(jiān)控半乳糖的整合，向反應(yīng)物的小等份試樣添加了14C-半乳糖-UDP配體；整合入肽中的標(biāo)記是在應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW分析型柱上通過凝膠過濾而與游離標(biāo)記分離的。整合入肽中的放射性標(biāo)記是用內(nèi)置的放射性探測器進行定量的。
當(dāng)反應(yīng)結(jié)束時，使該溶液與5mM UDP-Gal和0.1U/mL半乳糖基轉(zhuǎn)移酶(以對任何未反應(yīng)的運鐵蛋白聚糖進行加帽)于32℃溫育2日，隨后添加5mM CMP-SA和0.1U/mL的ST3Gal3。在額外的2日后，將反應(yīng)混合物用應(yīng)用PBS緩沖液(pH7.1)的Toso Haas G3000SW制備型柱進行純化并基于UV吸收收集級分。反應(yīng)產(chǎn)物是根據(jù)由Invitrogen提供的程序和試劑用SDS-PAGE和IEF分析進行分析的。使樣品對水進行透析并由MALDI-TOF MS進行分析。
在此處引用的每一個和全部專利、專利申請和出版物的公開內(nèi)容均在此處整體引入作為參考。
盡管本發(fā)明用某些特定的實施方案進行了公開，但顯而易見的是可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員設(shè)計本發(fā)明的其他實施方案和修改方案而不背離本發(fā)明的真正精神和范圍。附加的權(quán)利要求應(yīng)解釋為包括所有這種實施方案和等價的修改方案。
序列表&lt;110&gt;Neose Technologies，Inc.
DeFrees，ShawnZopf，DavidBayer，RobertHakes，DavidChen，XiBowe，Caryne&lt;120&gt;糖PEG化方法和由該方法生產(chǎn)的蛋白質(zhì)/肽&lt;130&gt;040853-01-5051WO&lt;150&gt;US 60/328,523&lt;151&gt;2001-10-10&lt;150&gt;US 60/334,233&lt;151&gt;2001-11-28&lt;150&gt;US 60/334,301&lt;151&gt;2001-11-28&lt;150&gt;US 60/344,692&lt;151&gt;2001-10-19&lt;150&gt;US 60/387,292&lt;151&gt;2002-06-07&lt;150&gt;US 60/391,777&lt;151&gt;2002-06-25&lt;150&gt;US 60/396,594&lt;151&gt;2002-07-17&lt;150&gt;US 60/404,249&lt;151&gt;2002-08-16&lt;150&gt;US 60/407,527&lt;151&gt;2002-08-28&lt;150&gt;PCT/US02/32263&lt;151&gt;2002-10-09&lt;150&gt;US 10/360,779&lt;151&gt;2003-02-19&lt;150&gt;US 10/360,770&lt;151&gt;2003-01-06&lt;150&gt;US 10/287,994&lt;151&gt;2002-11-05&lt;160&gt;75&lt;170&gt;PatentIn version 3.2&lt;210&gt;1&lt;211&gt;525&lt;212&gt;DNA
&lt;213&gt;Homo sapiens&lt;400&gt;1acccccctgg gccctgccag ctccctgccc cagagcttcc tgctcaagtg cttagagcaa60gtgaggaaga tccagggcga tggcgcagcg ctccaggaga agctgtgtgc cacctacaag120ctgtgccacc ccgaggagct ggtgctgctc ggacactctc tgggcatccc ctgggctccc180ctgagcagct gccccagcca ggccctgcag ctggcaggct gcttgagcca actccatagc240ggccttttcc tctaccaggg gctcctgcag gccctggaag ggatctcccc cgagttgggt300cccaccttgg acacactgca gctggacgtc gccgactttg ccaccaccat ctggcagcag360atggaagaac tgggaatggc ccctgccctg cagcccaccc agggtgccat gccggccttc420gcctctgctt tccagcgccg ggcaggaggg gtcctggttg cctcccatct gcagagcttc480ctggaggtgt cgtaccgcgt tctacgccac cttgcccagc cctga525&lt;210&gt;2&lt;211&gt;174&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;智人&lt;400&gt;2Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val35 40 45Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys50 55 60Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser65 70 75 80Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser85 90 95Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp100 105 110Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro115 120 125Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe
130 135 140Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe145 150 155 160Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro165 170&lt;210&gt;3&lt;211&gt;1733&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;智人&lt;400&gt;3gcgcctctta tgtacccaca aaaatctatt ttcaaaaaag ttgctctaag aatatagtta60tcaagttaag taaaatgtca atagcctttt aatttaattt ttaattgttt tatcattctt120tgcaataata aaacattaac tttatacttt ttaatttaat gtatagaata gagatataca180taggatatgt aaatagatac acagtgtata tgtgattaaa atataatggg agattcaatc240agaaaaaagt ttctaaaaag gctctggggt aaaagaggaa ggaaacaata atgaaaaaaa300tgtggtgaga aaaacagctg aaaacccatg taaagagtgt ataaagaaag caaaaagaga360agtagaaagt aacacagggg catttggaaa atgtaaacga gtatgttccc tatttaaggc420taggcacaaa gcaaggtctt cagagaacct ggagcctaag gtttaggctc acccatttca480accagtctag cagcatctgc aacatctaca atggccttga cctttgcttt actggtggcc540ctcctggtgc tcagctgcaa gtcaagctgc tctgtgggct gtgatctgcc tcaaacccac600agcctgggta gcaggaggac cttgatgctc ctggcacaga tgaggagaat ctctcttttc660tcctgcttga aggacagaca tgactttgga tttccccagg aggagtttgg caaccagttc720caaaaggctg aaaccatccc tgtcctccat gagatgatcc agcagatctt caatctcttc780agcacaaagg actcatctgc tgcttgggat gagaccctcc tagacaaatt ctacactgaa840ctctaccagc agctgaatga cctggaagcc tgtgtgatac agggggtggg ggtgacagag900actcccctga tgaaggagga ctccattctg gctgtgagga aatacttcca aagaatcact960
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Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser85 90 95Ala Ala Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr100 105 110Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Val Ile Gln Gly Val Gly Val115 120 125Thr Glu Thr Pro Leu Met Lys Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys130 135 140Tyr Phe Gln Arg Ile Thr Leu Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro145 150 155 160Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu16S 170 175Ser Thr Asn Leu Gln Glu Ser Leu Arg Ser Lys Glu180 185&lt;210&gt;5&lt;211&gt;757&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;智人&lt;400&gt;5atgaccaaca agtgtctcct ccaaattgct ctcctgttgt gcttctccac tacagctctt60tccatgagct acaacttgct tggattccta caaagaagca gcaattttca gtgtcagaag120ctcctgtggc aattgaatgg gaggcttgaa tattgcctca aggacaggat gaactttgac180atccctgagg agattaagca gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc attgaccatc240tatgagatgc tccagaacat ctttgctatt ttcagacaag attcatctag cactggctgg300aatgagacta ttgttgagaa cctcctggct aatgtctatc atcagataaa ccatctgaag360acagtcctgg aagaaaaact ggagaaagaa gattttacca ggggaaaact catgagcagt420ctgcacctga aaagatatta tgggaggatt ctgcattacc tgaaggccaa ggagtacagt480cactgtgcct ggaccatagt cagagtggaa atcctaagga acttttactt cattaacaga540cttacaggtt acctccgaaa ctgaagatct cctagcctgt ccctctggga ctggacaatt600gcttcaagca ttcttcaacc agcagatgct gtttaagtga ctgatggcta atgtactgca660
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Ala Trp Arg Ala Ala Val Leu Ile Tyr Ala Ser Asp Asp Thr Arg A1a435 440 445His Pro Asn Arg Ser Val Ala Val Thr Leu Arg Leu Arg Gly Val Pro450 455 460Pro Gly Pro Gly Leu Val Tyr Val Thr Arg Tyr Leu Asp Asn Gly Leu465 470 475 480Cys Ser Pro Asp Gly Glu Trp Arg Arg Leu Gly Arg Pro Val Phe Pro485 490 495Thr Ala Glu Gln Phe Arg Arg Met Arg Ala Ala Glu Asp Pro Val Ala500 505 510Ala Ala Pro Arg Pro Leu Pro Ala Gly Gly Arg Leu Thr Leu Arg Pro515 520 525Ala Leu Arg Leu Pro Ser Leu Leu Leu Val His Val Cys Ala Arg Pro530 535 540Glu Lys Pro Pro Gly Gln Val Thr Arg Leu Arg Ala Leu Pro Leu Thr545 550 555 560Gln Gly Gln Leu Val Leu Val Trp Ser Asp Glu His Val Gly Ser Lys565 570 575Cys Leu Trp Thr Tyr Glu Ile Gln Phe Ser Gln Asp Gly Lys Ala Tyr580 585 590Thr Pro Val Ser Arg Lys Pro Ser Thr Phe Asn Leu Phe Val Phe Ser595 600 605Pro Asp Thr Gly Ala Val Ser Gly Ser Tyr Arg Val Arg Ala Leu Asp610 615 620Tyr Trp Ala Arg Pro Gly Pro Phe Ser Asp Pro Val Pro Tyr Leu Glu625 630 635 640Val Pro Val Pro Arg Gly Pro Pro Ser Pro Gly Asn Pro645 650&lt;210&gt;67&lt;211&gt;1290&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;智人&lt;400&gt;67atgcagctga ggaacccaga actacatctg ggctgcgcgc ttgcgcttcg cttcctggcc60ctcgtttcct gggacatccc tggggctaga gcactggaca atggattggc aaggacgcct120accatgggct ggctgcactg ggagcgcttc atgtgcaacc ttgactgcca ggaagagcca180gattcctgca tcagtgagaa gctcttcatg gagatggcag agctcatggt ctcagaaggc240
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1 5 10 15Arg Phe Leu Ala Leu Val Ser Trp Asp Ile Pro Gly Ala Arg Ala Leu20 25 30Asp Asn Gly Leu Ala Arg Thr Pro Thr Met Gly Trp Leu His Trp Glu35 40 45Arg Phe Met Cys Asn Leu Asp Cys Gln Glu Glu Pro Asp Ser Cys Ile50 55 60Ser Glu Lys Leu Phe Met Glu Met Ala Glu Leu Met Val Ser Glu Gly65 70 75 80Trp Lys Asp Ala Gly Tyr Glu Tyr Leu Cys Ile Asp Asp Cys Trp Met85 90 95Ala Pro Gln Arg Asp Ser Glu Gly Arg Leu Gln Ala Asp Pro Gln Arg100 105 110Phe Pro His Gly Ile Arg Gln Leu Ala Asn Tyr Val His Ser Lys Gly115 120 125Leu Lys Leu Gly Ile Tyr Ala Asp Val Gly Asn Lys Thr Cys Ala Gly130 135 140Phe Pro Gly Ser Phe Gly Tyr Tyr Asp Ile Asp Ala Gln Thr Phe Ala145 150 155 160Asp Trp Gly Val Asp Leu Leu Lys Phe Asp Gly Cys Tyr Cys Asp Ser165 170 175Leu Glu Asn Leu Ala Asp Gly Tyr Lys His Met Ser Leu Ala Leu Asn180 185 190Arg Thr Gly Arg Ser Ile Val Tyr Ser Cys Glu Trp Pro Leu Tyr Met195 200 205Trp Pro Phe Gln Lys Pro Asn Tyr Thr Glu Ile Arg Gln Tyr Cys Asn210 215 220His Trp Arg Asn Phe Ala Asp Ile Asp Asp Ser Trp Lys Ser Ile Lys225 230 235 240Ser Ile Leu Asp Trp Thr Ser Phe Asn Gln Glu Arg Ile Val Asp Val245 250 255Ala Gly Pro Gly Gly Trp Asn Asp Pro Asp Met Leu Val Ile GlV Asn260 265 270Phe Gly Leu Ser Trp Asn Gln Gln Val Thr Gln Met Ala Leu Trp Ala275 280 285Ile Met Ala Ala Pro Leu Phe Met Ser Asn Asp Leu Arg His Ile Ser290 295 300Pro Gln Ala Lys Ala Leu Leu Gln Asp Lys Asp Val Ile Ala Ile Asn305 310 315 320Gln Asp Pro Leu Gly Lys Gln Gly Tyr Gln Leu Arg Gln Gly Asp Asn325 330 335
Phe Glu Val Trp Glu Arg Pro Leu Ser Gly Leu Ala Trp Ala Val Ala340 345 350Met Ile Asn Arg Gln Glu Ile Gly Gly Pro Arg Ser Tyr Thr Ile Ala355 360 365Val Ala Ser Leu Gly Lys Gly Val Ala Cys Asn Pro Ala Cys Phe Ile370 375 380Thr Gln Leu Leu Pro Val Lys Arg Lys Leu Gly Phe Tyr Glu Trp Thr385 390 395 400Ser Arg Leu Arg Ser His Ile Asn Pro Thr Gly Thr Val Leu Leu Gln405 410 415Leu Glu Asn Thr Met Gln Met Ser Leu Lys Asp Leu Leu420 425&lt;210&gt;69&lt;211&gt;351&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;智人&lt;400&gt;69atggattact acagaaaata tgcagctatc tttctggtca cattgtcggt gtttctgcat60gttctccatt ccgctcctga tgtgcaggat tgcccagaat gcacgctaca ggaaaaccca120ttcttctccc agccgggtgc cccaatactt cagtgcatgg gctgctgctt ctctagagca180tatcccactc cactaaggtc caagaagacg atgttggtcc aaaagaacgt cacctcagag240tccacttgct gtgtagctaa atcatataac agggtcacag taatgggggg tttcaaagtg300gagaaccaca cggcgtgcca ctgcagtact tgttattatc acaaatctta a351&lt;210&gt;70&lt;211&gt;116&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;智人&lt;400&gt;70Met Asp Tyr Tyr Arg Lys Tyr Ala Ala Ile Phe Leu Val Thr Leu Ser1 5 10 15Val Phe Leu His Val Leu His Ser Ala Pro Asp Val Gln Asp Cys Pro20 25 30Glu Cys Thr Leu Gln Glu Asn Pro Phe Phe Ser Gln Pro Gly Ala Pro35 40 45Ile Leu Gln Cys Met Gly Cys Cys Phe Ser Arg Ala Tyr Pro Thr Pro50 55 60
Leu Arg Ser Lys Lys Thr Met Leu Val Gln Lys Asn Val Thr Ser Glu65 70 75 80Ser Thr Cys Cys Val Ala Lys Ser Tyr Asn Arg Val Thr Val Met Gly85 90 95Gly Phe Lys Val Glu Asn His Thr Ala Cys His Cys Ser Thr Cys Tyr100 105 110Tyr His Lys Ser115&lt;210&gt;71&lt;211&gt;498&lt;212&gt;DNA&lt;213&gt;智人&lt;400&gt;71atggagatgt tccaggggct gctgctgttg ctgctgctga gcatgggcgg gacatgggca60tccaaggagc cgcttcggcc acggtgccgc cccatcaatg ccaccctggc tgtggagaag120gagggctgcc ccgtgtgcat caccgtcaac accaccatct gtgccggcta ctgccccacc180atgacccgcg tgctgcaggg ggtcctgccg gccctgcctc aggtggtgtg caactaccgc240gatgtgcgct tcgagtccat ccggctccct ggctgcccgc gcggcgtgaa ccccgtggtc300tcctacgccg tggctctcag ctgtcaatgt gcactctgcc gccgcagcac cactgactgc360gggggtccca aggaccaccc cttgacctgt gatgaccccc gcttccagga ctcctcttcc420tcaaaggccc ctccccccag ccttccaagc ccatcccgac tcccggggcc ctcggacacc480ccgatcctcc cacaataa498&lt;210&gt;72&lt;211&gt;165&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;智人&lt;400&gt;72Met Glu Met Phe Gln Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Met Gly1 5 10 15Gly Thr Trp Ala Ser Lys Glu Pro Leu Arg Pro Arg Cys Arg Pro Ile20 25 30Asn Ala Thr Leu Ala Val Glu Lys Glu Gly Cys Pro Val Cys Ile Thr35 40 45Val Asn Thr Thr Ile Cys Ala Gly Tyr Cys Pro Thr Met Thr Arg Val
50 55 60Leu Gln Gly Val Leu Pro Ala Leu Pro Gln Val Val Cys Asn Tyr Arg65 70 75 80Asp Val Arg Phe Glu Ser Ile Arg Leu Pro Gly Cys Pro Arg Gly Val85 90 95Asn Pro Val Val Ser Tyr Ala Val Ala Leu Ser Cys Gln Cys Ala Leu100 105 110Cys Arg Arg Ser Thr Thr Asp Cys Gly Gly Pro Lys Asp His Pro Leu115 120 125Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro130 135 140Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr145 150 155 160Pro Ile Leu Pro Gln165&lt;210&gt;73&lt;211&gt;165&lt;212&gt;PRT&lt;213&gt;智人&lt;400&gt;73Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu1 5 10 15Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His20 25 30Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe35 40 45Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp50 55 60Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu65 70 75 80Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp85 90 95Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu100 105 110Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala115 120 125Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val130 135 140Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala145 150 155 160Cys Arg Thr Gly Asp165
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Ser Ala Ala Trp Asn Met Thr Leu Leu Asp Gln Leu His Thr Gly Leu100 105 110His Gln Gln Leu Gln His Leu Glu Thr Cys Leu Leu Gln Val Val Gly115 120 125Glu Gly Glu Ser Ala Gly Ala Ile Ser Ser Pro Ala Leu Thr Leu Arg130 135 140Arg Tyr Phe Gln Gly Ile Arg Val Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser145 150 155 160Asp Cys Ala Trp Glu Val Val Arg Met Glu Ile Met Lys Ser Leu Phe165 170 175Leu Ser Thr Asn Met Gln Glu Arg Leu Arg Ser Lys Asp Arg Asp Leu180 185 190Gly Ser Ser19權(quán)利要求
1.對包含聚乙二醇的肽進行重構(gòu)的無細(xì)胞的體外方法，該肽具有分子式 其中AA是該肽的末端或內(nèi)部氨基酸殘基；X1-X2是與AA共價連接的糖，其中X1是第一個糖基殘基；而X2是與X1共價連接的第二個糖基殘基，其中X1和X2選自單糖和寡糖殘基，該方法包括(a)從該肽中去除X2或其糖亞單位，從而形成截短的聚糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述截短的聚糖是通過去除Sia殘基而形成的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述肽具有分子式 其中X3、X4、X5、X6、X7和X17是獨立選擇的單糖或寡糖殘基；和a、b、c、d、e和x獨立地選自整數(shù)0、1和2。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述寡糖殘基是選自GlcNAc-Gal-Sia和GlcNAc-Gal的成員。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中選自a、b、c、d、e和x的至少一個成員是1或2。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述步驟(a)中的去除產(chǎn)生了其中a、b、c、e和x中的至少一個為0的截短的聚糖。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中X3、X5和X7是獨立選自(甘露糖)z和(甘露糖)z-(X8)的成員其中X8是選自單糖和寡糖的糖基部分；和z是1-20之間的整數(shù)，其中當(dāng)z是3或更大時，每一個(甘露糖)z獨立地選自線性和分支的結(jié)構(gòu)。
8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中X4選自GlcNAc和木糖。
9.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中X3、X5和X7是(甘露糖)u，其中u選自1-20之間的整數(shù)，且當(dāng)u是3或更大時，每一個(甘露糖)u獨立地選自線性和分支的結(jié)構(gòu)。
10.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述肽具有分子式 其中r、s和t是獨立選自0和1的整數(shù)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述肽具有分子式 其中X9和X10是獨立選擇的單糖或寡糖殘基；和m、n和f是獨立選自0和1的整數(shù)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述肽具有分子式 其中X16是選自以下分子式的成員 和 其中s和i是獨立地選自0和1的整數(shù)。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述肽具有分子式 其中X13、X14和X15是獨立選擇的糖基殘基；和g、h、i、j、k和p獨立地選自整數(shù)0和1。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中g(shù)、h、i、j、k和p中的至少一個是1。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中X14和X15是獨立選自GlcNAc和Sia的成員；且i和k獨立地選自整數(shù)0和1。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中i和k中的至少一個是1，且如果k是1，則g、h和j是0。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其進一步包括(b)使截短的聚糖與至少一種糖基轉(zhuǎn)移酶和至少一種糖基供體在適合于將所述至少一種糖基供體轉(zhuǎn)移到截短的聚糖的條件下接觸，從而對所述包含聚乙二醇的肽進行重構(gòu)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述糖基供體包含與其共價連接的修飾基團。
19.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其進一步包括(c)去除X1，從而暴露AA。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其進一步包括(d)使AA與至少一種糖基轉(zhuǎn)移酶和至少一種糖基供體在適合于將所述至少一種糖基供體轉(zhuǎn)移到AA的條件下接觸，從而對包含聚乙二醇的所述肽進行重構(gòu)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20的方法，其中所述至少一種糖基供體包含與其共價連接的修飾基團。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述修飾基團是聚乙二醇。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述聚乙二醇具有基本單分散的分子量分布。
24.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其進一步包括(e)在步驟(b)之前，將在翻譯后修飾過程中添加到所述糖的基團去除。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的方法，其中所述基團是選自磷酸、硫酸、羧酸及其酯的成員。
26.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述肽具有分子式 其中Z是選自O(shè)、S、NH和交聯(lián)劑的成員。
27.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述肽具有分子式 其中X11和X12是獨立地選擇的糖基部分；且r和x是獨立選自0和1的整數(shù)。
28.根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其中X11和X12是(甘露糖)q，其中q是選自1-20的整數(shù)，且當(dāng)q是3或更大時，(甘露糖)q選自線性和分支的結(jié)構(gòu)。
29.藥物組合物，其包含藥物可接受的稀釋劑和根據(jù)權(quán)利要求1的重構(gòu)的肽。
30.對包含聚乙二醇的肽進行重構(gòu)的無細(xì)胞的體外方法，所述肽具有分子式 其中AA是該肽的末端或內(nèi)部氨基酸殘基；X1是與所述AA共價連接的糖基殘基，選自單糖和寡糖殘基；且u是選自0和1的整數(shù)，所述方法包含使該肽與至少一種糖基轉(zhuǎn)移酶和至少一種糖基供體在適合于將所述至少一種糖基供體轉(zhuǎn)移到截短的聚糖的條件下接觸，從而對肽進行重構(gòu)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述至少一種糖基供體包含與其共價連接的修飾基團。
32.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中所述修飾基團是聚乙二醇。
33.根據(jù)權(quán)利要求32的方法，其中所述聚乙二醇具有基本單分散的分子量分布。
34.藥物組合物，其包含藥物可接受的稀釋劑和根據(jù)權(quán)利要求30的重構(gòu)的肽。
全文摘要
本發(fā)明包括用于重構(gòu)肽分子的方法和組合物，包括向肽添加或刪除一個或多個糖基基團，和/或向肽添加修飾基團。
文檔編號A01N43/02GK1863458SQ200480015918
公開日2006年11月15日 申請日期2004年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月9日
發(fā)明者S·德弗里斯, D·措普夫, R·拜爾, C·鮑, D·哈克斯, 陳希 申請人:尼奧斯技術(shù)有限公司