專利名稱：用于維持近交動物品系遺傳穩(wěn)定性的方法
相關(guān)申請的交叉引用本申請要求2003年8月22日提交的美國臨時申請60/497,451的優(yōu)先權(quán)；此處全文引入該申請作為參考。
政府基金此處所述工作完全或部分地由來自國家癌癥研究所，NIH的撥款No.R01-GM020919資助。美國政府享有本發(fā)明的相應(yīng)權(quán)利。
背景技術(shù)：
實驗動物可用作研究人類疾病的有效模型。轉(zhuǎn)基因和靶突變技術(shù)的發(fā)展使得小鼠不僅成為用于人基因組分析的成功的替代生物體，而且成為研究人類疾病的遺傳學(xué)和發(fā)病原理最有價值的模型系統(tǒng)。對獲自小鼠研究的實驗結(jié)果的正確解釋依賴于所用的小鼠模型是遺傳上純種并且明確界定的保證。為此，研究人員一般利用近交系用于試驗，因為這些小鼠與遠(yuǎn)交小鼠原種不同，其提供基因型的均一性和恒定性。近交系小鼠可以純合的實驗個體重復(fù)獲得，其具有可預(yù)計的表型和既定的等位基因組成。
然而，由于新突變的出現(xiàn)以及與殘留雜合性的連續(xù)等位基因固定的逐步積累，近交系小鼠中基因型的恒定性還未曾完全實現(xiàn)。近交小鼠內(nèi)基因型的這些變化稱作遺傳漂變。在每個世代，都有自發(fā)新突變產(chǎn)生的可能性。這些突變最初以雜合突變存在。當(dāng)近交系的兩個原代碰巧成為一個自發(fā)突變的純合子時，該突變就在該近交系中固定，隨后所有該近交小鼠品系的后代將攜帶該突變。
作為自發(fā)突變增長的結(jié)果，遺傳漂變將影響對源自一個近交系的動物進(jìn)行的遺傳分析。對利用近交動物生成的實驗數(shù)據(jù)的正確解釋受到遺傳漂變的破壞。最近的出版物例舉了這一點。在2001，Specht和Schoepfer發(fā)現(xiàn)C57BL/6JOlaHsd小鼠中(參見Specht和Schoepfer，Deletion of the alpha-synuclein locus in a subpopulation of C57BL/6Jinbred mice，BMC Neurosci.2，11(2001))的染色體缺失。該突變?yōu)槌^79kb的α-共核蛋白(synuclein)位點的切除。該基因編碼突觸前終腦蛋白，其與帕金森和阿爾茨海默疾病的病因有關(guān)。許多研究人員已將C57BL/6JOlaHsd小鼠作為野生型對照用于他們的實驗或者與其他的突變體回交，而沒有意識到該問題。現(xiàn)在他們的試驗結(jié)果需要根據(jù)該品系中存在的α-共核蛋白缺失而重新評估。參見Wotjak，C57Black/Box？The importance of exact mouse strain nomenclature，Trends in Genetics 19183-184(2003)。
此外，研究人員常常需要比較很長時期內(nèi)獲自近交動物的數(shù)據(jù)。由于遺傳漂變的影響，隨著時間的推移，在較早的時間點近交系小鼠變得在遺傳上不同于“同樣的”近交小鼠。時間間隔越長，則遺傳學(xué)差異越可能積累且固定。遺傳漂變的存在因此破壞了很長時期內(nèi)進(jìn)行有效比較的能力。
為此，需要在近交動物品系中減少遺傳漂變并且長時間維持其遺傳穩(wěn)定性。本領(lǐng)域中急需用于維持近交動物品系遺傳穩(wěn)定性的方法。在此提供了所述方法。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了維持非-人動物近交小鼠品系遺傳穩(wěn)定性的新的方法。在本發(fā)明中，維持了純種原代群體用于獲得近交小鼠品系。該近交小鼠品系的原代群體源自單一的兄妹交配個體。每年兩次至四次，從該原代群體選擇新的兄-妹配偶作為新的原代配偶以重建克隆。利用該方法，由于隨著時間的過去在近交小鼠品系中自發(fā)突變的累積以及等位基因的固定，現(xiàn)今的原代群體將在遺傳上不同于今后數(shù)年的原代群體。
申請人設(shè)計了通過產(chǎn)生源自原代群體的冷藏胚胎的追蹤-譜系的原種以及利用該原種以合適的時間間隔重建原代群體而限制近交小鼠的遺傳漂變以及維持遺傳穩(wěn)定性的新方法。冷藏原種作為該原代群體的貯藏庫且利用該冷藏原種定期重建原代群體降低了在既定時期內(nèi)的世代數(shù)目且因此有效地降低了遺傳漂變的實際比率。由于原種中每個胚胎的譜系是已知的，可以選擇性地僅恢復(fù)兄-妹配偶的胚胎。因此，該近交小鼠品系通過連續(xù)的兄-妹交配，保持該小鼠品系完整的近交狀態(tài)而繁殖。該方法可以合適的時間間隔重復(fù)，由此允許維持具有有限遺傳漂變的近交小鼠品系而不影響該品系近交狀態(tài)。
通過獲得和冷藏來自源自原代群體的兄-妹配偶的胚胎而產(chǎn)生冷藏胚胎的追蹤-譜系的原種?？赏ㄟ^該兄-妹配偶交配而獲得胚胎?？赏ㄟ^交配(性交)或通過體外或體內(nèi)的人工方法產(chǎn)生胚胎。人工方法包括，但不限于，人工受精、體外或體內(nèi)的成熟卵細(xì)胞的體外受精、胚胎移植、胞質(zhì)內(nèi)精子注射、無性繁殖、受精卵細(xì)胞的體外培養(yǎng)和胚胎分裂等等。
該追蹤-譜系的冷藏原種也可以是胚胎干細(xì)胞的原種、配子的原種或前-配子的原種。配子、前-配子或胚胎干細(xì)胞源自近交小鼠品系的原代群體。上述冷藏原種可用作原代群體的冷凍貯藏庫以維持近交系的遺傳穩(wěn)定性。本發(fā)明提供了產(chǎn)生追蹤-譜系的冷藏原種的方法以及利用該原種維持近交系遺傳穩(wěn)定性的方法。
本發(fā)明還提供了冷藏的非-人動物胚胎、配子、前-配子或胚胎干細(xì)胞的追蹤-譜系的原種。每個這些原種源自一個近交系的原代群體。追蹤并記錄每個品系各自胚胎、配子、前-配子或胚胎干細(xì)胞的譜系以允許在將來有選擇的恢復(fù)。
申請人進(jìn)一步提供了遺傳穩(wěn)定的非-人動物近交小鼠品系，其通過此處所述方法制得。非-人動物可以是嚙齒類，例如大鼠或小鼠。
申請人進(jìn)一步提供了用于進(jìn)行提供遺傳穩(wěn)定的非-人動物近交系的業(yè)務(wù)的方法。根據(jù)本發(fā)明，原代群體用于近交系的維持，并且產(chǎn)生源自該原代群體的胚胎的追蹤-譜系的冷藏原種。以合適的時間間隔，選擇源自單一兄-妹配偶的兄-妹胚胎對且由該同胞胚胎產(chǎn)生活的動物。從產(chǎn)生的動物中選擇兄-妹配偶且用作新的原代配偶以重建原代原種。根據(jù)顧客的要求，提供給顧客遺傳穩(wěn)定的近交小鼠品系的一個或多個動物。
這些方法的進(jìn)行使得有可能維持具有有限遺傳漂變的近交系而不影響該品系的近交狀態(tài)。因此，動物研究人員可得到具有長時期明確-界定基因型的真正遺傳均一的近交動物，其非常有助于進(jìn)行正確的數(shù)據(jù)解釋和有價值的數(shù)據(jù)比較。
附圖
簡述該附圖顯示了生成足夠數(shù)量源自原代群體的追蹤-譜系的胚胎以產(chǎn)生用于維持近交系遺傳穩(wěn)定性的追蹤-譜系的冷藏胚胎的示意圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了維持非-人動物近交系遺傳穩(wěn)定性的新方法。如此處所述的，近交動物品系的遺傳穩(wěn)定性通過產(chǎn)生源自原代群體的追蹤-譜系的冷藏胚胎并且以合適的時間間隔用此重建原代群體而維持。該方法的使用降低了既定時期內(nèi)傳代的次數(shù)并且因此降低了遺傳漂變的風(fēng)險。由于每個冷藏胚胎的譜系是已知的，可以選擇性地僅恢復(fù)兄妹的胚胎，即源自相同父母。因此，該近交小鼠品系通過持續(xù)的兄-妹交配，保持該小鼠品系完整的近交狀態(tài)而進(jìn)行繁殖。
I.利用冷藏胚胎維持遺傳穩(wěn)定性
本發(fā)明提供了維持非-人動物近交系遺傳穩(wěn)定性的方法。在一個實施方案中，該方法包括(1)培養(yǎng)近交系的原代群體；(2)產(chǎn)生源自該原代群體的冷藏胚胎的追蹤-譜系的原種；(3)以合適的時間間隔選擇近交配偶的冷藏胚胎，并且從該胚胎產(chǎn)生活的動物；(4)從產(chǎn)生的動物中選擇近交配偶對且利用該配偶作為新的原代配偶以產(chǎn)生該品系的動物；和(5)以合適的時間間隔重復(fù)步驟(3)至(4)。如此，該近交小鼠品系的遺傳漂變減到最低程度并且該品系的遺傳穩(wěn)定性得以有效維持。
如此處使用的術(shù)語″遺傳穩(wěn)定性″指和如果利用現(xiàn)行的方法維持近交系將出現(xiàn)的遺傳漂變相比，近交系中的遺傳漂變得以有效降低。遺傳漂變有效降低指近交系中基因型改變的降低。取決于基因組中發(fā)生的改變，該基因型的改變可能或未必引起表型的改變。例如，基因組非編碼區(qū)中的突變可能導(dǎo)致動物表型的無變化。重要的是，在該遺傳穩(wěn)定性方案下維持的品系的原代種中發(fā)生的突變將不會在該品系中持續(xù)，因為其將隨冷藏胚胎的解凍以及利用其作為新的原代種而從全部的動物群體中被清除。遺傳漂變可通過檢驗各種指數(shù)，包括，例如毛色、生化和免疫標(biāo)記同工酶、主要組織相容性復(fù)合體(MHC)、紅細(xì)胞抗原、溶血補(bǔ)體(Hc-前C5)、尾部植皮以及行為改變而評價。遺傳漂變也可以通過利用現(xiàn)有技術(shù)中任何可用的技術(shù)包括，例如雙向蛋白質(zhì)凝膠、PCR、SNPs、基因表達(dá)圖譜和測序檢驗各種分子標(biāo)記而評價。
通過引起雜合性降低的可控制的育種方案產(chǎn)生近交系?？山邮艿挠N方案包括親-子交配和兄-妹交配。近交系一般通過兄弟與姐妹10或更多連續(xù)世代的交配產(chǎn)生。近交系第10代或其后代中的動物可追溯到單一的祖先配偶。在一個優(yōu)選的實施方案中，近交系通過兄弟與姐妹20或更多連續(xù)世代的交配產(chǎn)生，且第20代或其后代中的動物可追溯到單一的祖先配偶。
如此處使用的術(shù)語″近交配偶″指任何其交配引起雜合性降低的配偶。近交配偶可以是親-子對或兄-妹配偶。在一個優(yōu)選的實施方案中，近交配偶是兄-妹配偶。為了便于說明，兄-妹配偶將用作貫穿整個申請的例證以描述本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將意識到在本申請中親-子配偶可代替兄-妹配偶。
a.近交系的原代群體的維持利用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)維持近交小鼠品系的原代群體。如此處使用的，術(shù)語″原代群體″指該品系所有后代的動物都源于其的群體。原代配偶為近交配偶，其產(chǎn)生特定品系的所有后代動物。原代選自該原代群體。
非-人動物優(yōu)選嚙齒類，例如大鼠或小鼠。非-人動物也可以是倉鼠、豚鼠、馬、豬、山羊、綿羊、雞、火雞、靈長類或用于培養(yǎng)近交小鼠品系的任何其他的非-人動物。
近交小鼠品系包括但不限于129S1、129T2、129X1、129P3、129P1、A、AKR、BALB/c、C3H、C57BL/10、C57BL/6、C57BLKS、C57BR/cd、C57L、CBA、DBA/1、DBA/2、FVB、MRL、NOD、SJL、SWR、NOR、NZB、NZW、RBF、BUB、I、LP、NON、P、PL、RIIS、SM、C58、ALR、ALS、BPH、BPL、BPN、DDY、EL、KK、LG、MA、NH、NZM2410、NZO、RF、SB、SEA、SI、SOD1、YBR和每個這些小鼠品系的所有近交亞系。公認(rèn)的小鼠品系命名慣例要求每個品系通過在其品系代碼的末尾添加實驗室代碼而進(jìn)一步標(biāo)識，實驗室代碼的當(dāng)前列表通過維持世界實驗室代碼登記的實驗動物研究機(jī)構(gòu)維持，且可在http://dels.nas.edu/ilar/codes.asp登錄。
如此處使用的術(shù)語″亞系″指相同的小鼠品系內(nèi)彼此遺傳不同的群體。當(dāng)同樣的近交系的兩個群體已經(jīng)分離超過10個世代時可能出現(xiàn)亞系，或者當(dāng)已知同樣的品系的分離群體之間存在遺傳差異時可能出現(xiàn)。不同亞系之間的遺傳差異可能是祖先在分離的時候殘留的雜合性固定的結(jié)果，和/或在隨后的世代中自發(fā)突變的結(jié)果(遺傳漂變)。亞系的實例包括但不限于，129S1/SvImJ、129T2/SvEmsJ、129X1/SvEmsJ、129X1/SvJ、129P3/J、A/J、AKR/J、BALB/cByJ、BALB/cJ、C3H/HeJ、C3H/HeOuJ、C3HeB/FeJ、C57BL/10J、C57BL/6J、CBA/CaHN-Btkxid/J、CBA/J、DBA/1J、DBA/1LacJ、DBA/2J、FVB/NJ、MRL/MpJ、NOD/LtJ、SJL/J、SWR/J、NOR/LtJ、NZB/B1NJ、NZW/LacJ、RBF/DnJ、129S6/SvEvTac、AJTAC、BALB/cAnNTac、BALB/cJBomTac、BALB/cABomTac、C57BL/6NTac、C57BL/6JBomTac、C57BL/10SgAiTac、C3H/HeNTac、CBA/JBomTac、DBA/1JBomTac、DBA/2NTac、DBA/2JBomTac、FVB/NTac、NOD/MrkTac、NZM/AegTac、SJL/JcrNTac、BALB/cAnNCrlBR、C3H/HeNCrlBR、C57BL/6NCrlBR、DBA/2NCrlBR、FVB/NCrlBR、C.B-17/IcrCrlBR、129/SvPasIcoCrlBR、SJL/JorlIcoCrlBR、A/JolaHsd、BALB/cAnNHsd、C3H/HeNHsd、C57BL/10ScNHsd、C57BL/6NHsd、CBA/JCrHsd、DBA/2NHsd、FVB/NHsd、SAMP1/KaHsd、SAMP6/TaHsd、SAMP8/TaHsd、SAMP10/TaHsd、SJL/JCrHsd、AKR/OlaHsd、BiozziABH/RijHsd、C57BL/6JOlaHsd、FVB/NhanHsd、MRL/MpOlaHsd、NZB/OlaHsd、NZW/OlaHsd、SWR/OlaHsd、129P2/OlaHsd和129S2/SvHsd。
近交小鼠品系還包括通過任何轉(zhuǎn)基因的、基因敲除或siRNA(小干擾RNA)或?qū)淼倪z傳操作技術(shù)產(chǎn)生的所有品系，其已經(jīng)過兄弟與姐妹交配10或更多的連續(xù)世代。
b.產(chǎn)生冷藏胚胎的追蹤-譜系的原種如此處所述，本發(fā)明的一個方面涉及產(chǎn)生源自原代群體的冷藏動物胚胎的追蹤-譜系原種的方法。
追蹤-譜系的原種為其中該原種中每個胚胎的譜系已知的原種。胚胎的譜系可通過沿著胚胎的家譜并且記載該家譜的信息而追蹤。例如，每個胚胎可用其譜系信息獨立標(biāo)記?；蛘撸咛タ梢砸黄鹞锢肀２睾蜆?biāo)記。如此處使用的術(shù)語″同胞胚胎″指源自單個兄-妹配偶(或一個近交配偶)交配的胚胎。冷藏胚胎可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法保藏。在一個實施方案中，冷藏胚胎保藏在無菌的塑料受精管中。每個管僅包含同胞胚胎。一個管可能僅包含一個胚胎或可能包含多個同胞胚胎?；蛘?，冷藏胚胎可以保藏在其他合適的容器例如塑料小瓶或玻璃安瓿瓶中。
本發(fā)明追蹤-譜系的原種的胚胎可以是能被成功冷藏和恢復(fù)產(chǎn)生活動物的任何階段的胚胎。所述胚胎包括從受精卵到胚泡的移植前胚胎的所有階段。因此，本發(fā)明的胚胎可以是，例如單細(xì)胞的胚胎(受精卵)、雙細(xì)胞胚胎、四細(xì)胞胚胎、八細(xì)胞胚胎、桑椹胚或胚泡。桑椹胚是單細(xì)胞胚胎裂解產(chǎn)生的球狀細(xì)胞團(tuán)塊；胚泡由桑椹胚發(fā)育而來且具有囊胚腔和不對稱位置的細(xì)胞簇，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。
如此處使用的術(shù)語″冷藏″指被冷凍。本發(fā)明的細(xì)胞、胚胎、配子或前-配子在通常低于0℃的溫度下冷凍。例如，-80℃可用于短期保藏，而-196℃或更低溫度可用于長期保藏。本發(fā)明中的細(xì)胞、胚胎、配子或前-配子可以冷藏不定長度的時間。用于冷藏的方法和設(shè)備是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見，例如美國專利5,160,312,題為″CryopreservationProcess for Direct Transfer of Embryos″，Glenister和Hall，″Cryopreservation and rederivation of embryos and gametes″，in MouseGenetics & TransgenicsA Practical Approach，2ndEdition(I Jackson &CAbbott，eds.)Oxford Univ.Press，Oxford，pp.27-29。
如此處使用的″源自原代群體的胚胎″包括直接獲自原代配偶的胚胎和獲自原代配偶子代的胚胎。
需要冷藏的胚胎數(shù)目取決于許多因素，包括例如維持遺傳穩(wěn)定性方案所經(jīng)過的持續(xù)時間、冷藏原種用于重建原代群體的頻率以及從冷藏胚胎產(chǎn)生活的動物的效率。這些因素在不同的動物種類中和在相同動物種類的不同品系中不同。例如，已知來自不同近交系的小鼠在冷藏胚胎的回收率方面有差異。
產(chǎn)生所需胚胎數(shù)所要求的雌性動物數(shù)目也將不同。所需雌性動物的數(shù)目與可從每個雌性獲得的卵細(xì)胞數(shù)目、受精卵細(xì)胞的比例以及胚胎轉(zhuǎn)移后發(fā)育至分娩期的胚胎比例負(fù)相關(guān)。因此，所需雌性的數(shù)目是每個步驟效率的函數(shù)。每個步驟的高效率降低了所需雌性的總數(shù)。
在一個實施方案中，冷藏胚胎的追蹤-譜系的原種可通過首先從原代群體的兄-妹配偶(原代配偶)獲得胚胎，隨后冷藏該胚胎而產(chǎn)生。追蹤和記載譜系信息以使每個冷藏胚胎具有確切的譜系。在該實施方案中，胚胎通過原代配偶交配直接產(chǎn)生。因此，該追蹤-譜系的原種僅包括同胞胚胎。
或者，首先擴(kuò)大原代群體以產(chǎn)生足夠多數(shù)量的兄-妹配偶。因此，在另一實施方案中，源自原代群體的冷藏胚胎的追蹤-譜系的原種可由下方法產(chǎn)生(1)從原代群體獲得子代以使該子代包括合適數(shù)量的兄-妹配偶；(2)從獲自(1)的子代中的兄-妹配偶產(chǎn)生胚胎；以及(3)冷藏(2)中產(chǎn)生的胚胎。追蹤和記載譜系信息以使每個冷藏胚胎具有確切的譜系。該實施方案中產(chǎn)生的追蹤-譜系的原種包括源自將超過一個兄-妹配偶交配獲得的胚胎。
兩對之間只要雄性或雌性不同，則一個兄-妹配偶就不同于另一對。例如，雄性A和雌性B與雄性A和雌性C以及雄性D和雌性B不同。如此處使用的″子代″指源自原代配偶動物的世代，包括，例如F1、F2、F3和F4世代?！宀煌?妹配偶的合適數(shù)目″是為了創(chuàng)建冷藏原種以維持近交系遺傳穩(wěn)定性而生成足夠數(shù)量胚胎的數(shù)目。
從原代群體獲得子代可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的育種技術(shù)實現(xiàn)，包括，例如自然交配、人工受精和體外受精。
可通過兄-妹原代配偶交配而獲得胚胎。如此處使用的″交配″指雌雄配子的結(jié)合以發(fā)生受精。所述結(jié)合可通過交配(性交)或體外或體內(nèi)的人工方法完成。人工方法包括但不限于，人工受精、體外受精、胚胎移植、胞質(zhì)內(nèi)精子注射、無性繁殖、受精卵細(xì)胞的體外培養(yǎng)和胚胎分裂?？衫卯a(chǎn)生合適時期胚胎的任何方法。
人工受精是通過精子的人工注射或施用而對雌性動物受精的方法。在上述方法中，受精的時候并不需要雄性動物，精子從之前的動物獲得。參見Wolfe，1967以及Sato和Kumura，2002。當(dāng)通過自然交配或人工受精完成交配時，可通過交配和人工受精后沖洗雌性的輸卵管或子宮獲得胚胎。參見Hogan等，2003。胚胎分裂技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。胚胎分裂可通過，例如用顯微操作或類似的方法分裂正常的胚胎(從2細(xì)胞到桑椹期)進(jìn)行。
體外受精(IVF)也是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如Hogan等.，Manipulating the Mouse Embryos，A Laboratory Manual，2ndEd.Page146-147(1994)。IVF通常包括分別從雌性和雄性收集卵細(xì)胞和精子、將來自雌性的卵細(xì)胞用來自雄性的精子受精且為了受精卵到胚胎的發(fā)育，在適宜條件下培養(yǎng)得到的受精卵?？稍诓煌A段收集胚胎。在卵細(xì)胞收集用于IVF之前雌性可以超排卵。參見，例如Hogan等，2003。如此處所述的，卵細(xì)胞和精子從兄-妹配偶獲得。IVF可以是提高從單個雌性獲得的胚胎數(shù)目的有效方法。
胞質(zhì)內(nèi)的精子注射(ICSI)可用于提高受精率。ICSI方法包括通常通過玻璃吸管除去卵細(xì)胞周圍的卵丘細(xì)胞以及將精子注入卵細(xì)胞。參見Kimura和Yanagimachi，1995。
作為從雌性收集用于IVF的成熟卵細(xì)胞的一個選擇，可獲得未成熟的卵細(xì)胞且允許其體外成熟，稱為“體外成熟”技術(shù)。哺乳動物中，未成熟卵細(xì)胞僅小部分發(fā)育為成熟卵細(xì)胞，其他的退化和死亡。通過從動物分離未成熟的卵細(xì)胞且允許其體外成熟，可以從給定的雌性獲得更多的適于IVF的卵細(xì)胞。哺乳動物卵細(xì)胞經(jīng)受體外成熟是已知的。至于小鼠、牛及其他哺乳動物，體外成熟的卵細(xì)胞已在體外受精且當(dāng)將胚胎轉(zhuǎn)入合適的子宮時產(chǎn)生正常健康的后代(Schroeder和Eppig1984 Dev.Biol.102493；Sirard等.1988，Biol.Reprod.39546)。體外成熟技術(shù)在本領(lǐng)域為大家所熟知。參見，例如Chiu等.，Effects ofMyo-inositol on the in-vitro Maturation and Subsequent Development ofMouse Oocytes，Human Reprod.18408-416(2003)和O′Brien等.，ARevised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes fromPrimordial Follicles Dramatically Improves Their DevelopmentalCompetence，Biol.Reprod.681682-1686(2003)。
在另一選擇中，可從″宿主″雌性收集卵細(xì)胞，之前來自所需雌性的卵巢部分已經(jīng)植入其中。所需的雌性來自源于原代群體的兄-妹配偶的妹，需要其卵細(xì)胞用于IVF。此通過從兄-妹配偶的妹采集卵巢、亞-分割該卵巢為幾部分、通過對宿主雌性的外科手術(shù)將每部分植入切除卵巢的或是經(jīng)化學(xué)或遺傳學(xué)處理的宿主雌性，以及從每個宿主雌性收集卵細(xì)胞而完成。該方法產(chǎn)生更多獲得用于所給雌性的卵細(xì)胞。
c.從冷藏胚胎的原種產(chǎn)生活的動物在合適的時間間隔，選擇冷藏的同胞胚胎且從這些同胞胚胎產(chǎn)生活的動物。在一個實施方案中，活的動物從一組同胞胚胎中產(chǎn)生。在另一個實施方案中，活的動物從超過一組以上的同胞胚胎中產(chǎn)生。
從冷藏胚胎產(chǎn)生活的動物可利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的技術(shù)進(jìn)行。在一個實施方案中，活的動物通過以下從冷藏胚胎產(chǎn)生(1)解凍冷藏胚胎；(2)將解凍的胚胎植入至少一個假孕雌性受體中；和(3)在適于產(chǎn)生活的動物的條件下培養(yǎng)假孕雌性受體。由此，產(chǎn)生活的動物。
如此處使用的術(shù)語″解凍″指提高冷藏材料溫度的過程。解凍冷藏材料的方法，即能在解凍過程后產(chǎn)生活的動物的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
如此處使用的關(guān)于胚胎的術(shù)語″植入″指一個或多個胚胎向具有此處所述胚胎的雌性動物的移植。假孕雌性受體是即使自身的未受精的卵退化，其生殖道也能接納所移植胚胎的雌性動物。假孕雌性動物例如通過雌性和不育雄性交配生成。植入假孕雌性的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見，例如，Recovery，Culture and Transfer of Embryos inHogan等，Manipulating the Mouse Embryos，A Laboratory Manual，2ndEd.Page170-181。胚胎可以在子宮內(nèi)發(fā)育，或者胎兒可在分娩之前從子宮環(huán)境移走。
d.從產(chǎn)生的活的動物中選擇新的原代配偶從步驟(c)產(chǎn)生的活的動物選擇兄-妹配偶成為新的原代配偶以重建原代群體。小鼠品系中所有后代動物將源自該新的原代配偶，直至重復(fù)如下節(jié)所描述的利用冷藏原種重建原代群體的過程。
可隨機(jī)選擇兄-妹配偶作為原代配偶。或者，可通過表型篩選、基因型篩選或兩者相結(jié)合的方法選擇原代配偶。表型篩選可通過例如毛色和行為改變的外觀檢查而進(jìn)行。表型篩選也可通過肌肉握力的定量分析、在有或沒有呼吸刺激時呼吸速率、潮氣量及其他呼吸指數(shù)的自由測定、同時進(jìn)行CO2產(chǎn)量、O2吸收量、食物和進(jìn)水量、運動活力和晝夜節(jié)律模式的測定、臨床化學(xué)檢驗和血液化學(xué)檢驗、組織樣品的表達(dá)特征而進(jìn)行?；蛐秃Y選可通過檢驗各種指數(shù)，包括，例如生化和免疫標(biāo)記同工酶、主要組織相容性復(fù)合體(MHC)、紅細(xì)胞抗原、溶血補(bǔ)體(Hc-前C5)、微衛(wèi)星和單核苷酸多態(tài)性(SNP)而進(jìn)行?；蛐秃Y選可通過現(xiàn)有技術(shù)中的任何可用技術(shù)，包括例如PCR和測序進(jìn)行。
e.重復(fù)步驟(c)-(d)以合適的時間間隔，重復(fù)從追蹤-譜系的原種產(chǎn)生活的動物以及選擇兄-妹作為新的原代配偶的過程。″合適的時間間隔″是用于利用冷藏原種重建原代群體從而維持近交系遺傳穩(wěn)定性的時間間隔。對于一個品系，可以憑經(jīng)驗確定合適的時間間隔，例如通過對該品系中遺傳漂變速率的評估。由此確定的合適的時間間隔在不同的近交動物種類中和在相同動物種類內(nèi)不同品系中不同?；蛘撸线m的時間間隔可以是之前定義的時間間隔。合適的時間間隔可以是1至40間的任何世代數(shù)，例如舉例來說，每個世代、每5個世代、每10個世代每20個世代或每40個世代。
本發(fā)明的另一個方面涉及維持一個近交動物品系遺傳穩(wěn)定性的方法。該方法包括從源自近交系原代群體的追蹤-譜系的原種的冷藏胚胎產(chǎn)生活的動物、利用選自該活的動物的兄-妹配偶作為新的原代配偶以及以合適的時間間隔重復(fù)該過程。
本發(fā)明另一個方面還提供了源自原代群體的冷藏胚胎的追蹤-譜系的原種。該譜系-原種可通過此處所述的任何方法或這些方法的任何改變的方法產(chǎn)生。上述追蹤-譜系的冷藏胚胎可以合適的時間間隔用于重建原代群體。在一個實施方案中，追蹤-譜系的冷藏胚胎僅包括通過將兄-妹原代配偶交配獲得的胚胎。在另一個實施方案中，追蹤-譜系的冷藏胚胎包括通過將源自原代群體的超過一對兄-妹配偶交配獲得的胚胎。
此外，本發(fā)明的一方面涉及通過此處所述方法制得的遺傳穩(wěn)定的非-人動物近交系。
本發(fā)明更進(jìn)一步的方面提供了供應(yīng)具有有限遺傳漂變的非-人動物近交系的經(jīng)營方法。該方法包括(1)培養(yǎng)近交系的原代群體；(2)產(chǎn)生源自該原代群體的冷藏胚胎的追蹤-譜系的原種；(3)以合適的時間間隔，選擇同胞的冷藏胚胎并且從該胚胎產(chǎn)生活的動物；(4)從所產(chǎn)生的動物選擇兄-妹配偶并且利用其作為新的原代配偶以得到該品系將來的動物；(5)以合適的時間間隔重復(fù)步驟(1)至(4)和(6)根據(jù)客戶訂貨單給顧客提供動物。
II.利用冷藏配子或前-配子原種維持遺傳穩(wěn)定性為了維持近交系的遺傳穩(wěn)定性，或者，使用源自近交系的原代群體的胚胎、配子或前-配子用以創(chuàng)建追蹤-譜系的原種。
因此，本發(fā)明提供了維持近交系遺傳穩(wěn)定性的方法，包括(1)維持近交系的原代群體；(2)產(chǎn)生源自該原代群體的冷藏配子或前-配子的追蹤-譜系的原種；(3)以合適的時間間隔，選擇獲自單一兄-妹配偶的冷藏配子或前-配子，并且由其產(chǎn)生活的動物；(4)從所得的動物選擇兄-妹配偶并且利用其作為新的原代配偶以產(chǎn)生該品系將來的動物；和(5)以合適的時間間隔重復(fù)步驟(3)至(4)。
此處使用的術(shù)語″配子″指能促使新的二倍體個體生成的任何雄性或雌性生殖細(xì)胞。配子的實例為精子和卵細(xì)胞。配子可存在于獲自動物的液體、組織和器官中(例如，精子存在于精液中)。
術(shù)語″前-配子″包括能產(chǎn)生配子的任何前體細(xì)胞。這種前體細(xì)胞可以是配子的祖細(xì)胞。精子的祖細(xì)胞包括，但不限于，原生殖細(xì)胞、精原細(xì)胞(包括A1、A2、A3和A4型精原細(xì)胞)、精原細(xì)胞干細(xì)胞、中間型精原細(xì)胞、B型精原細(xì)胞、初級精母細(xì)胞、次級精母細(xì)胞和精細(xì)胞。卵細(xì)胞的祖細(xì)胞包括，但不限于，原生殖細(xì)胞、卵原細(xì)胞、初級卵細(xì)胞和次級卵細(xì)胞。上述前體細(xì)胞也可以是胚胎干細(xì)胞，其能產(chǎn)生配子。參見，例如Hubner等，Science 3001251-6(2003)。術(shù)語″前-配子″也指能產(chǎn)生配子的任何細(xì)胞、組織或器官，包括例如，卵巢和睪丸。
原生殖細(xì)胞是能成為生殖細(xì)胞的二倍體體細(xì)胞。原生殖細(xì)胞可例如從生殖嵴分離。生殖嵴是正發(fā)育胚胎已知確定的區(qū)域，且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見，例如Strelchenko，1996，Theriogenology 45130-141和Lavoir 1994，J.Reprod.Dev.37413-424。
本發(fā)明的一個方面涉及產(chǎn)生源自原代群體的冷藏配子或前-配子的追蹤-譜系原種的方法。
利用對胚胎原種相同的考慮確定創(chuàng)建用于維持遺傳穩(wěn)定性追蹤-譜系的原種所需的配子或前-配子數(shù)目。同樣地，基于如上所述對上下文中胚胎原種相同的考慮，確定產(chǎn)生足夠數(shù)目原種的配子或前-配子所需的動物數(shù)。由此，配子或前-配子可直接從原代配偶中獲得?；蛘?，對于胚胎原種，原代群體首先擴(kuò)大至產(chǎn)生足夠數(shù)量的不同的兄-妹配偶，并且隨后可從這些兄-妹配偶中獲得配子和前-配子。
配子和前-配子獲自活的動物或胚胎的兄-妹配偶。獲得配子或前-配子的技術(shù)在本領(lǐng)域是已知的。參見，例如Ogura和Yanagimachi，1995，以及Kubota等，2003。
配子和前-配子可利用本領(lǐng)域已知的任何方法冷藏。參見，例如美國專利5,758,763，題為″Methods for Cryopreservation of Primordial GermCells and Germ Cells″，美國申請20020131957，題為″Cryopreservation ofSperm″，Sztein等，Biol.Reprod.581071-1074(1998)以及Candy等，2000。
追蹤-譜系的配子或前-配子原種是原種內(nèi)每個配子或前-配子的譜系已知的原種。配子或前-配子的譜系可通過沿著其譜系并且記載該譜系的信息而追蹤。例如，每個配子或前-配子可用其譜系信息獨立標(biāo)記。另一個實例，來自單一個體的配子或前-配子可以物理保藏并且標(biāo)記為同胞組。如此，可以僅選擇獲自單一兄-妹將來配偶的配子或前-配子。例如，配子可以使得能夠僅選擇來自特定雌性的卵細(xì)胞以及來自該雌性兄弟的精子的方式保藏。
以合適的時間間隔，可以選擇獲自單一兄-妹配偶的冷藏配子或前-配子，并且由其產(chǎn)生活的動物。冷藏的前-配子可經(jīng)解凍并且在適宜條件下培養(yǎng)以使前-配子產(chǎn)生配子，其隨后經(jīng)體外受精而產(chǎn)生活的動物。
在一個實施方案中，卵細(xì)胞收集自超排卵的雌性并且冷藏。精子收集自各自的雄性同胞并且冷藏。以合適的時間間隔，解凍來自同胞的卵細(xì)胞和精子并且通過IVF用于產(chǎn)生胚胎。將得到的胚胎移植入假孕受體以產(chǎn)生后代。
本發(fā)明的另一個方面涉及維持一個近交動物品系遺傳穩(wěn)定性的方法。該方法包括從源自近交系原代群體的追蹤-譜系的原種的冷藏配子或前-配子產(chǎn)生活的動物、利用選自該活的動物的兄-妹配偶作為新的原代配偶并且以合適的時間間隔重復(fù)該過程。
本發(fā)明另一個方面還提供了源自原代群體的冷藏配子或前-配子的追蹤-譜系的原種。這種追蹤-譜系的原種可以合適的時間間隔用于重建原代群體。
本發(fā)明另一方面涉及通過此處所述方法制得的遺傳穩(wěn)定的非-人動物近交系。
本發(fā)明更進(jìn)一步的方面提供了供應(yīng)具有有限遺傳漂變的非-人動物近交系的經(jīng)營方法。該方法包括(1)維持近交系的原代群體；(2)產(chǎn)生源自該原代群體的冷藏配子或前-配子的追蹤-譜系的原種；(3)以合適的時間間隔選擇獲自單一兄-妹配偶的冷藏配子或前-配子，并且由其產(chǎn)生活的動物；(4)從所得的動物中選擇兄-妹配偶并且利用其自作為新的原代配偶以產(chǎn)生將來的該品系的動物；和(5)以合適的時間間隔重復(fù)步驟(3)至(4)；和(6)根據(jù)客戶訂貨單給顧客提供小鼠。
III.利用冷藏的ES細(xì)胞原種維持遺傳穩(wěn)定性為了維持近交系的遺傳穩(wěn)定性，作為一個選擇，使用源自近交系的原代群體的胚胎、胚胎干細(xì)胞用以創(chuàng)建追蹤-譜系的原種。
因此，本發(fā)明提供了維持近交系遺傳穩(wěn)定性的方法，包括(1)培養(yǎng)近交系的原代群體；(2)產(chǎn)生源自該原代群體的冷藏胚胎的追蹤-譜系的原種；(3)以合適的時間間隔選擇獲自單一兄-妹配偶的冷藏的胚胎干細(xì)胞，并且由其產(chǎn)生活的動物；(4)從所得的動物中選擇兄-妹配偶并且利用其作為新的原代配偶以產(chǎn)生將來的該品系的動物；和(5)以合適的時間間隔重復(fù)步驟(3)至(4)。
胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)是分離自胚胎的多能細(xì)胞。ES細(xì)胞可在有或沒有飼養(yǎng)細(xì)胞時體外培養(yǎng)。ES細(xì)胞可從分離自早期胚胎，主要來自胚泡階段胚胎的胚細(xì)胞建立。用于ES細(xì)胞確立和培養(yǎng)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。參見，例如1997年10月9日公開的WO97/37009，題為″Cultured Inner Cell Mass Cell-Lines Derived from UngulateEmbryos，″Stice和Golueke，以及Yang & Anderson，1992，Theriogenology 38315-335，兩者在此處全文引入作為參考。此處使用的術(shù)語″胚胎干細(xì)胞″或″ES細(xì)胞″包括ES細(xì)胞系。
追蹤-譜系的原種的ES細(xì)胞可通過從原代群體的兄-妹配偶交配而產(chǎn)生的胚胎獲得。所述技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知。隨后冷藏ES細(xì)胞并且以允許僅選擇獲自單一兄-妹配偶的ES細(xì)胞的方式保藏。優(yōu)選該ES細(xì)胞在早期傳代時，例如舉例來說，3-20代內(nèi)冷藏。
用于創(chuàng)建維持遺傳穩(wěn)定性的追蹤-譜系的原種所需的ES細(xì)胞冷凍單位數(shù)取決于許多因素，包括例如，將要維持遺傳穩(wěn)定性所經(jīng)過的持續(xù)時間、該冷藏原種用于重建原代群體的頻率、從冷藏ES細(xì)胞產(chǎn)生活的動物的效率以及ES細(xì)胞產(chǎn)生完全來自該ES細(xì)胞的活的動物的效率。這些因素不僅在不同的動物種類中而且在相同動物種類的不同品系中不同。
ES細(xì)胞可從原代配偶交配而得到的胚胎中獲得?；蛘撸后w首先擴(kuò)大至產(chǎn)生足夠數(shù)量的不同的兄-妹配偶，并且隨后可從這些兄-妹配偶交配而得到的胚胎中獲得ES細(xì)胞。
ES細(xì)胞可利用本領(lǐng)域已知的方法冷藏。參見，例如Hogan等.，2003。
可以合適的時間間隔解凍追蹤-譜系的原種的冷藏ES細(xì)胞并且用于重建原代群體。在一個實施方案中，源自雄性和雌性(兄-妹)胚胎的ES細(xì)胞被分別導(dǎo)入桑椹胚或胚泡階段的胚胎中并且使得其參與該動物的發(fā)育。得到的子代一般為嵌合體，嵌合體的部分發(fā)育自宿主胚胎或是供體雄性或雌性的ES細(xì)胞。嵌合體的胚系可包含宿主和供體ES細(xì)胞的衍生物。通過利用毛色和/或其他的遺傳標(biāo)記，可以選擇完全源自所用ES細(xì)胞的子代。得到的子代因此可用于重建原代群體。
在一個可選擇的實施方案中，追蹤-譜系的原種的雄性ES細(xì)胞和雌性ES細(xì)胞分別與四倍體宿主胚胎聚合(四倍體胚胎互補(bǔ))，其可通過用例如電脈沖融合雙細(xì)胞期胚胎而制備。這種ES細(xì)胞將非常成功地定殖于小鼠胚胎，而另外的胚胎組織通過該四倍體宿主提供。這將產(chǎn)生完全源自雄性ES細(xì)胞或雌性ES細(xì)胞的子代，取決于用于和該四倍體宿主胚胎聚合的ES細(xì)胞。利用毛色和/或其他的遺傳標(biāo)記合適的監(jiān)控該過程可以將任何可能為宿主-胚胎-起源的子代和源自ES細(xì)胞的子代區(qū)分開。因此可以選擇完全源自每個ES細(xì)胞的子代。隨后可從源自雄性ES細(xì)胞(兄弟)和來自該雌性ES細(xì)胞的子代(姊妹)中選擇兄-妹配偶以重建原代群體。
所述技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。參見，例如Hogan等，2003。Derivationof completely cell culture-derived mice from early-passage embryonicstem cells，Proc Natl Acad Sci USA.90，8424-8428。也可參見http://www.mshri.on.ca/nagy/diploid/diploid.htn，和http://www.mshri.on.ca/nagy/Tetraploid/tetra.htm。
在另外的實施方案中，可從追蹤-譜系的原種的單一雄性ES細(xì)胞系產(chǎn)生雌雄子代。雄性ES細(xì)胞包含X染色體和Y染色體(XY)。已顯示在XY細(xì)胞系的亞克隆中Y染色體以高頻率消失，使得需要例行鑒定XY ES細(xì)胞系的亞克隆中的XO細(xì)胞。這些XO ES細(xì)胞可用于產(chǎn)生經(jīng)四倍體胚胎互補(bǔ)或嵌合體生成(參見Eggan等，2002)而可育的雌性子代?？蛇x擇一個雌性子代和源自該雄性ES細(xì)胞(XY)的一個雄性子代交配以重建原代群體。
已知ES細(xì)胞能在體外形成生殖細(xì)胞。參見Toyooka，Y.等，2003。因此，在另一個實施方案中，追蹤-譜系的原種的ES細(xì)胞用于在體外產(chǎn)生生殖細(xì)胞，其隨后用于產(chǎn)生源自該ES細(xì)胞的子代。
本發(fā)明的另一個方面涉及產(chǎn)生源自原代群體的冷藏ES細(xì)胞的追蹤-譜系原種的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步的一個方面涉及維持近交小鼠品系遺傳穩(wěn)定性的方法。該方法包括五個步驟(1)從源自近交系原代群體的追蹤-譜系的冷藏ES細(xì)胞原種中選擇獲自單一兄-妹配偶的冷藏的ES細(xì)胞并且由這些ES細(xì)胞產(chǎn)生活的動物；(2)從所產(chǎn)生的活的動物中選擇兄-妹配偶作為新的原代配偶；和(3)以合適的時間間隔重復(fù)步驟(1)-(2)。
本發(fā)明的另一個方面提供了源自原代群體的冷藏ES細(xì)胞的追蹤-譜系的原種。上述追蹤-譜系的原種可以合適的時間間隔用于重建原代群體。
本發(fā)明更進(jìn)一步的方面提供了供應(yīng)具有有限遺傳漂變的非-人動物近交系的經(jīng)營方法。該方法包括(1)維持近交系的原代群體；(2)產(chǎn)生源自該原代群體的冷藏ES細(xì)胞的追蹤-譜系的原種；(3)以合適的時間選擇獲自單一兄-妹配偶的冷藏的ES細(xì)胞，并且由其產(chǎn)生活的動物；(4)從所產(chǎn)生的活的動物中，選擇兄-妹配偶且利用其作為新的原代配偶以產(chǎn)生該品系將來的動物；(5)以合適的時間間隔重復(fù)步驟(3)至(4)；并且根據(jù)客戶訂貨單提供動物。
除非另有陳述，本發(fā)明的實驗操作將應(yīng)用小鼠遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)方法，其均在本領(lǐng)域的技術(shù)內(nèi)。所述技術(shù)描述在文獻(xiàn)中。參見，例如Bonifacino、Dasso、Lippincott-Schwartz、Harford和Yamada、John Wiley和Sons，Inc.，New York，1999的Current Protocolsin Cell Biology，Hogan等.的Manipulating the Mouse Embryos，ALaboratory Manual，3rdEd.Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York，2003，Gene TargetingA Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford，1993和Gene TargetingProtocols，Human Press，Totowa，New Jersey，2000。此處引用的所有專利、專利申請和參考文獻(xiàn)全文引入作為參考。
例證參考下列實施例將更容易理解當(dāng)前進(jìn)行一般性描述的本發(fā)明，其存在僅僅是為了本發(fā)明某些方面和實施方案的例證，而并意味著限制本發(fā)明。
實施例1.利用胚胎原種維持近交系的遺傳穩(wěn)定性附圖描述了創(chuàng)建用于維持遺傳穩(wěn)定性的源自原代群體的冷藏胚胎的追蹤-譜系的原種的示意圖。這僅是本發(fā)明的一個實施方案。附圖中的左側(cè)方格顯示第一個步驟選擇原代配偶(P代)并且多次交配以產(chǎn)生多個同窩仔。在所示的示意圖中，挑選六個姊妹和兩個兄弟(F1代)用于下一步。附圖中中間的方格顯示第二個步驟每個F1代姊妹分別裝入籠中以使其同窩仔能被追蹤。在所示的示意圖中，同一個雄性輪流與一組三個F1代姊妹交配。六個F1代姊妹的每個將與其各自的兄弟交配多次以產(chǎn)生多個F2代同窩仔。附圖右側(cè)的方格顯示第三個步驟九個F2代姊妹和源自單一F1代姊妹的一個兄弟將用于IVF以產(chǎn)生胚胎。對于約九個姊妹和一個兄弟的六個或更多組的每個進(jìn)行IVF。來自54個雌性(6×9)的每個的胚胎冷藏在單獨的管中。這將提供超過兩倍的覆蓋25年的豐余部分并且包括了用于對照和/或意外偶發(fā)事件的胚胎。
來自冷藏原種的同胞胚胎以合適的時間間隔解凍且移植入假孕雌性受體以產(chǎn)生子代。隨后從子代選擇兄-妹配偶作為新的原代配偶以重建原代群體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解以上所述的僅僅代表用于產(chǎn)生本發(fā)明追蹤-譜系的冷藏胚胎原種的一個實施方案。顯然，可以改變該方案的許多細(xì)節(jié)，包括例如，在制備胚胎原種前擴(kuò)大原代群體所需的世代數(shù)目、每代所用的雌性數(shù)目以及所用的近交配偶的類型。例如，可以選擇配偶并且從該配偶產(chǎn)生F(x+1)子代(其中x為選擇時的世代編號)。同時，獲得來自該配偶雄性的精子并且等份冷藏。雌性F(x+1)子代可通過IVF與解凍的精子配種(親-子配種)以產(chǎn)生F(x+2)胚胎，其可冷藏用以產(chǎn)生追蹤-譜系的原種。
實施例2.利用配子原種維持近交系的遺傳穩(wěn)定性在一個實施方案中，源自原代群體的雌性小鼠超排卵并且收集卵細(xì)胞以及冷藏。也收集和冷藏來自該雌性各個雄性同胞的精子。以合適的時間間隔，解凍來自同胞的卵細(xì)胞和精子并且通過IVF用于產(chǎn)生胚胎。得到的胚胎移植入假孕受體以生產(chǎn)后代。隨后從子代選擇兄-妹配偶作為新的原代配偶以重建原代群體。
實施例3.利用前-配子原種維持近交系的遺傳穩(wěn)定性冷藏的卵巢和精子與來自其各自的雄性同胞的精子一樣，冷藏源自原代群體的雌性的卵巢。以合適的時間間隔解凍和轉(zhuǎn)移卵巢。一旦證實受體雌性的受孕，其超排卵并且利用來自其一個同胞的冷藏精子人工受精以產(chǎn)生子代。隨后從子代選擇兄-妹配偶作為新的原代配偶以重建原代群體。冷藏的卵巢和精原細(xì)胞干細(xì)胞收集卵巢且如上所述冷藏。從該雄性同胞收集精原細(xì)胞干細(xì)胞自并且冷藏。解凍精原細(xì)胞干細(xì)胞并且以合適的時間間隔移植以產(chǎn)生可育的雄性。一旦證實該雄性的受孕，解凍來自其雌性同胞的卵巢并且移植。隨后交配動物以產(chǎn)生子代。隨后從子代選擇兄-妹配偶作為新的原代配偶以重建原代群體。參見Candy等.，2000，以及Nagano和Brinster1998。
實施例4.利用ES細(xì)胞原種維持近交系的遺傳穩(wěn)定性從近交、有譜系的兄-妹交配分離雌雄ES細(xì)胞并且冷藏。以合適的時間間隔，從保藏庫恢復(fù)源自兄妹交配的雌雄ES細(xì)胞。從遺傳不同，例如來自ES細(xì)胞的不同毛色的品系制備宿主胚胎，并且經(jīng)電脈沖誘導(dǎo)融合產(chǎn)生四倍體胚胎。存活的胚胎培養(yǎng)至桑椹期。多組雄性ES細(xì)胞(1-40個細(xì)胞)置于緊靠一個四倍體宿主胚胎處。同樣，多組雌性ES細(xì)胞(1-40個細(xì)胞)置于緊靠另一個四倍體宿主胚胎處。ES細(xì)胞和其各自的四倍體胚胎接合成單個胚胎后(過夜培養(yǎng))，胚胎引入假孕的雌性受體中。出生后合適的毛色和/或其他遺傳標(biāo)記可用于選擇源自ES細(xì)胞的子代。隨后可利用這些子代得到兄-妹配偶以重建原代群體。
雖然本發(fā)明已對本領(lǐng)域技術(shù)人員很詳細(xì)地描述和舉例說明了其制備和應(yīng)用，在不背離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)各種替代、修飾和改進(jìn)應(yīng)該是顯而易見的。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將很容易意識到，本發(fā)明非常適宜于實現(xiàn)所述目的并獲得結(jié)果及所提到的優(yōu)點以及那些固有的優(yōu)點。所述方法、胚胎原種和配子原種為優(yōu)選實施方案的代表，是例證性的，并不打算限制本發(fā)明的范圍。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，將出現(xiàn)其中的修改及其他用途。這些修改包括在本發(fā)明的精神范圍內(nèi)，其通過權(quán)利要求的范圍限定。
對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是對在此公開的發(fā)明可做不同的替代和改進(jìn)，只要不背離本發(fā)明的范圍和精神。
人們應(yīng)理解盡管已通過優(yōu)選實施方案和任選的特征詳細(xì)公開本發(fā)明，在此公開的改進(jìn)和概念的變化可由本領(lǐng)域技術(shù)人員采用，并且認(rèn)為如同所附的權(quán)利要求定義的那樣，這樣的改進(jìn)和變化在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
參考文獻(xiàn)Candy C J，Wood M J，Whittingham D G.2000.Restoration of a normalreproductive lifespan after grafting of cryopreserved mouse ovaries.HumReprod.Jun；15(6)1300-4.
Chiu等.，Effects of Myo-inositol on the in-vitro Maturation andSubsequent Development of Mouse Oocytes，Human Reprod.18408-416(2003)Eggan，K.等.(2002).″Male and female mice derived from the sameembryonic stem cell clone by tetraploid embryo complementation.″NatBiotechnol 20(5)455-9.
Glenister and Hall，″Cryopreservation and rederivation of embryosand gametes″in Mouse Genetics & TransgenicsA Practical Approach，2ndEdition(I Jackson & C Abbott，eds.)Oxford Univ.Press，Oxford，pp.27-59.
Han M S；Niwa K；Kasai M，Vitrification of rat embryos at variousdevelopmental stages.Theriogenology 2003 Apr.15；59(8)1851-63Hogan，B.，Beddington，R.，Costantini，F(xiàn).，Lacy，E.Manipulating theMouse Embryos，A Laboratory Manual，3<rd>Ed.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2003，Hubner等.，Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells，Science 3001251-6(2003).
Kimura and Yanagimachi，Intracytoplasmic sperm injection in themouse，Biol.Reprod.52709-20，1995.
Kimura and Yanagimachi，Development of normal mice from oocytesinjected with secondary spermatocyte nuclei，Biol.Reprod.53855-62，1995Kimura and Yanagimachi，Mouse oocytes injected with testicularspermatozoa or round spermatids can develop into normal offspring，Development 1212397-405，1995.
Kubota，Avarbock and Brinster，Spermatogonial stem cells sharesome，but not all，phenotypic and functional characteristics with other stemcell，Proc.Nat.Acad.Sci.1006487-6492，2003.
Lavoir等.，Isolation and identification of germ cells from fetalbovine ovaries.Molelular Reprod.Dev.37413-424(1994).
Nagano M，Brinster R L.1998.Spermatogonial transplantation andreconstitution of donor cell spermatogenesis in recipient mice.APMIS.Jan；106(1)47-55；discussion 56-7.
Nagy，A.；Rossant，J.；Nagy，R.；Abramownewerly，W.；Roder，J.C.(1993).Derivation of completely cell culture-derived mice fromearly-passage embryonic stem cells，Proc Natl Acad Sci USA.90，8424-8428.
O′Brien等.，A Revised Protocol for In Vitro Development of MouseOocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves TheirDevelopmental Competence，Biol.Reprod.681682-1686(2003).
Ogura and Yanagimachi，Spermatids as male gametes，Reprod.Fertil.Dev.7158-9，1995Sato M，Kimura M.2002.Comparison of intrabursal transfer ofspermatozoa，a new method for artificial insemination in mice，withintraoviductal transfer of spermatozoa.J Assist Reprod Genet.Nov；19(11)523-30.
Schroeder and Eppig 1984 Dev.Biol.102493Sirard等.1988，Biol.Reprod.39546Specht and Schoepfer，Deletion of the alpha-synuclein locus in asubpopulation of C57BL/6J inbred mice，BMC Neurosci.2，11(2001).
Strelchenko，Bovine Pluripotent stem cells，Theriogenology 45130-141(1996)Sztein，J M，Noble K，F(xiàn)arley J S，Mobraaten L E.2001.Comparisonof permeating and nonpermeating cryoprotectants for mouse spermcryopreservation.Cryobiology 42(1)28-39.
Sztein等.，Biol.Reprod.581071-1074(1998)Toyooka，Y.，N.Tsunekawa，等.(2003).Embryonic stem cells canform germ cells in vitro，Proc Natl Acad Sci USA 100(20)11457-62.
Wolfe H G.1967.Artificial insemination of the laboratory mouse(Mus musculus).Lab Anim Care.1967 Aug.17(4)426-32.
Wotjak，C57Black/Box？The importance of exact mouse strainnomenclature，Trends in Genetics 19183-184(2003).
Yang & Anderson，1992，Theriogenology 38315-335美國專利5,758,763，題為″Methods for Cryopreservation ofPrimordial Germ Cells and Germ Cells″美國申請系列號2002/0131957，題為″Cyropreservation of Sperm″美國專利5,160,312，題為″Cryopreservation Process for DirectTransfer of Embryos″WO 97/37009，題為″Cultured Inner Cell Mass Cell-Lines Derivedfrom Ungulate Embryos，″Stice and Golueke，published Oct.9，199權(quán)利要求
1.維持非-人動物近交系遺傳穩(wěn)定性的方法，包括(a)維持近交系的原代群體；(b)產(chǎn)生源自該原代群體的冷藏胚胎的追蹤-譜系的原種；(c)從該追蹤-譜系的原種的冷藏胚胎產(chǎn)生活的動物；(d)從該活的動物中選擇兄-妹配偶用于作為新的原代配偶以重建原代群體；(e)以合適的時間間隔重復(fù)步驟(c)至(d)，由此維持近交系的遺傳穩(wěn)定性。
2.權(quán)利要求1的方法，其中活的動物由追蹤-譜系的原種的同胞胚胎產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求2的方法，其中非-人動物為嚙齒類動物。
4.權(quán)利要求3的方法，其中嚙齒類動物為小鼠。
5.權(quán)利要求4的方法，其中產(chǎn)生源自原代群體的冷藏非-人動物胚胎的追蹤-譜系的原種的步驟包括(a)從原代群體的兄-妹配偶產(chǎn)生胚胎；和(b)冷藏(a)中產(chǎn)生的胚胎，其中追蹤原種中每個胚胎的譜系使得每個冷藏胚胎具有確定的譜系，由此產(chǎn)生冷藏的胚胎原種。
6.權(quán)利要求4的方法，其中產(chǎn)生源自原代群體的冷藏的非-人動物胚胎的追蹤-譜系的原種的步驟包括(a)從非-人動物品系的原代群體獲得子代，其中所述子代包括合適數(shù)目的兄-妹配偶；(b)從兄-妹配偶產(chǎn)生胚胎；(c)冷藏(b)中產(chǎn)生的胚胎，其中追蹤原種中每個胚胎的譜系使得每個冷藏胚胎具有可確定的譜系，由此產(chǎn)生冷藏的胚胎原種。
7.權(quán)利要求6的方法，其中通過如下步驟從兄-妹配偶產(chǎn)生胚胎(a)姊妹與兄弟交配，由此產(chǎn)生胚胎；和(b)采集胚胎。
8.權(quán)利要求7的方法，其中的交配通過性交進(jìn)行。
9.權(quán)利要求7的方法，其中的交配通過人工受精進(jìn)行。
10.權(quán)利要求7的方法，其中的交配通過體外受精進(jìn)行，其包括(a)從姊妹收集卵細(xì)胞；(b)從兄弟收集精子；(c)用(b)中收集的精子對(a)中收集的卵細(xì)胞受精，由此產(chǎn)生受精的卵細(xì)胞；和(d)在適于受精卵細(xì)胞發(fā)育為胚胎的條件下維持受精的卵細(xì)胞。
11.權(quán)利要求10的方法，進(jìn)一步包括從姊妹收集卵細(xì)胞之前使該姊妹超排卵。
12.權(quán)利要求11的方法，其中將冷藏胚胎保藏在管中使得每個管包含源自單一兄-妹配偶交配獲得的胚胎。
13.權(quán)利要求10的方法，其中卵細(xì)胞受精的步驟通過胞質(zhì)內(nèi)的游動精子顯微注射進(jìn)行。
14.權(quán)利要求6的方法，其中從兄-妹配偶產(chǎn)生胚胎包括(a)從姊妹分離卵巢；(b)在適于卵細(xì)胞體外成熟的條件下培養(yǎng)卵巢，由此產(chǎn)生體外成熟的卵細(xì)胞；(c)從兄弟收集精子；(d)用(c)中收集的精子對(b)中產(chǎn)生的體外成熟的卵細(xì)胞受精，由此產(chǎn)生受精的卵細(xì)胞；(e)在適于受精卵細(xì)胞發(fā)育為胚胎的條件下維持受精的卵細(xì)胞；和(f)采集胚胎。
15.權(quán)利要求6的方法，其中從兄-妹配偶產(chǎn)生胚胎包括(a)從姊妹采集卵巢；(b)將卵巢亞-分為幾部分，由此產(chǎn)生幾個卵巢部分；(c)將每個卵巢部分植入切除卵巢的宿主雌性中，由此產(chǎn)生已受孕的宿主雌性；(d)從該受孕的宿主雌性收集卵細(xì)胞；(e)從兄弟收集精子；(f)用(e)中收集的精子對(d)中收集的卵細(xì)胞受精，由此產(chǎn)生受精的卵細(xì)胞；(g)在適于受精卵細(xì)胞發(fā)育為胚胎的條件下維持受精的卵細(xì)胞；和(h)采集胚胎。
16.產(chǎn)生源自原代群體的冷藏的非-人動物胚胎的追蹤-譜系的原種的方法，包括(a)從原代群體的兄-妹配偶產(chǎn)生胚胎；和(b)冷藏(a)中產(chǎn)生的胚胎，其中追蹤原種中每個胚胎的譜系使得每個冷藏胚胎具有可確定的譜系，由此產(chǎn)生冷藏的胚胎原種。
17.產(chǎn)生源自原代群體的冷藏的非-人動物胚胎的追蹤-譜系的原種的方法，包括(a)從非-人動物品系的原代群體獲得子代，其中子代包括合適數(shù)目的兄-妹配偶；(b)從兄-妹配偶產(chǎn)生胚胎；(c)冷藏(b)中產(chǎn)生的胚胎，其中追蹤原種中每個胚胎的譜系使得每個冷藏胚胎具有可確定的譜系，由此產(chǎn)生冷藏的胚胎原種。
18.維持非-人動物近交系遺傳穩(wěn)定性的方法，包括(a)從源自原代群體的追蹤-譜系的原種的冷藏胚胎產(chǎn)生活的動物；(b)從(a)中產(chǎn)生的活的動物選擇兄-妹配偶用作新的原代配偶以重建原代群體；(c)以合適的時間間隔重復(fù)步驟(a)至(b)，由此維持近交系的遺傳穩(wěn)定性。
19.權(quán)利要求18的方法，其中活的動物從追蹤-譜系的原種的同胞胚胎產(chǎn)生。
20.權(quán)利要求19的方法，其中非-人動物為嚙齒類動物。
21.權(quán)利要求20的方法，其中嚙齒類動物為小鼠。
22.冷藏的非-人動物胚胎的追蹤-譜系的原種。
23.權(quán)利要求22的原種，其中的非-人動物為嚙齒類動物。
24.權(quán)利要求23的原種，其中嚙齒類動物為小鼠。
25.提供具有有限的遺傳漂變的非-人動物近交系的方法，包括(a)維持近交系的原代群體；(b)產(chǎn)生源自該原代群體的冷藏胚胎的追蹤-譜系的原種；(c)從該追蹤-譜系的原種的冷藏胚胎產(chǎn)生活的動物；(d)從(c)中產(chǎn)生的活的動物中選擇兄-妹配偶用作新的原代配偶以重建原代群體；(e)以合適的時間間隔重復(fù)步驟(c)至(d)，由此維持具有有限的遺傳漂變的非-人動物近交小鼠品系；(f)根據(jù)客戶定貨單給顧客提供非-人動物。
26.權(quán)利要求25的方法，其中活的動物從追蹤-譜系的原種的同胞胚胎產(chǎn)生。
27.權(quán)利要求26的方法，其中非-人動物為嚙齒類動物。
28.權(quán)利要求27的方法，其中嚙齒類動物為小鼠。
29.維持非-人動物近交系遺傳穩(wěn)定性的方法，包括(a)維持近交系的原代群體；(b)產(chǎn)生源自該原代群體的冷藏配子或前配子的追蹤-譜系的原種；(c)從該追蹤-譜系的原種的冷藏配子或前配子產(chǎn)生活的動物；(d)從該活的動物中選擇兄-妹配偶用作新的原代配偶以重建原代群體；(e)以合適的時間間隔重復(fù)步驟(c)至(d)，由此維持近交系的遺傳穩(wěn)定性。
30.權(quán)利要求29的方法，其中活的動物從獲自單一兄-妹配偶的配子或前-配子中產(chǎn)生。
31.權(quán)利要求30的方法，其中的非-人動物為嚙齒類動物。
32.權(quán)利要求31的方法，其中嚙齒類動物為小鼠。
33.產(chǎn)生源自原代群體的冷藏的非-人動物配子或前-配子的追蹤-譜系的原種的方法，包括(a)從非-人動物品系的原代種獲得子代，其中子代包括合適數(shù)目的兄-妹配偶；(b)從兄-妹配偶產(chǎn)生配子或前-配子；(c)冷藏(b)中產(chǎn)生的配子或前-配子，由此產(chǎn)生冷藏的配子或前-配子的原種；其中追蹤原種中每個配子或前-配子的譜系使得每個冷藏配子或前-配子具有可確定的譜系。
34.權(quán)利要求33的方法，其中非-人動物為嚙齒類動物。
35.權(quán)利要求34的方法，其中嚙齒類動物為小鼠。
36.維持非-人動物近交系遺傳穩(wěn)定性的方法，包括(a)從追蹤-譜系的原種的冷藏配子或前-配子產(chǎn)生活的動物；(b)從(a)中產(chǎn)生的活的動物中選擇兄-妹配偶用作新的原代配偶以重建原代群體；(c)以合適的時間間隔重復(fù)步驟(a)至(b)，由此維持近交系的遺傳穩(wěn)定性。
37.權(quán)利要求36的方法，其中活的動物從獲自單一兄-妹配偶的配子或前-配子產(chǎn)生。
38.權(quán)利要求37的方法，其中非-人動物為嚙齒類動物。
39.權(quán)利要求38的方法，其中嚙齒類動物為小鼠。
40.冷藏的非-人動物配子或前-配子的追蹤-譜系的原種。
41.權(quán)利要求40的原種，其中非-人動物為嚙齒類動物。
42.權(quán)利要求41的原種，其中嚙齒類動物為小鼠。
43.維持非-人動物近交系遺傳穩(wěn)定性的方法，包括(a)維持近交系的原代群體；(b)產(chǎn)生源自該原代群體的冷藏的胚胎干細(xì)胞的追蹤-譜系的原種；(c)從該追蹤-譜系的原種的冷藏胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生活的動物；(d)從該活的動物中選擇兄-妹配偶用作新的原代配偶；(e)以合適的時間間隔重復(fù)步驟(c)至(d)，由此維持近交系的遺傳穩(wěn)定性。
44.權(quán)利要求43的方法，其中活的動物從獲自單一兄-妹配偶的胚胎干細(xì)胞中產(chǎn)生。
45.權(quán)利要求44的方法，其中非-人動物為嚙齒類動物。
46.權(quán)利要求45的方法，其中嚙齒類動物為小鼠。
47.產(chǎn)生源自原代群體的冷藏的非-人動物胚胎干細(xì)胞的追蹤-譜系的原種的方法，包括(a)從非-人動物品系的原代種獲得子代，其中子代包括合適數(shù)目的兄-妹配偶；(b)從兄-妹配偶產(chǎn)生胚胎干細(xì)胞；(c)冷藏(b)中產(chǎn)生的胚胎干細(xì)胞，由此產(chǎn)生冷藏的胚胎干細(xì)胞原種；其中追蹤原種中每個胚胎干細(xì)胞的譜系使得每個胚胎干細(xì)胞具有可確定的譜系。
48.權(quán)利要求47的方法，其中非-人動物為嚙齒類動物。
49.權(quán)利要求48的方法，其中嚙齒類動物為小鼠。
50.維持非-人動物近交系遺傳穩(wěn)定性的方法，包括(a)從追蹤-譜系的原種的冷藏胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生活的動物；(b)從(a)中產(chǎn)生的活的動物中選擇兄-妹配偶用作新的原代配偶；(c)以合適的時間間隔重復(fù)步驟(a)至(b)，由此維持近交系的遺傳穩(wěn)定性。
51.權(quán)利要求50的方法，其中活的動物從獲自單一兄-妹配偶的胚胎干細(xì)胞產(chǎn)生。
52.權(quán)利要求51的方法，其中非-人動物為嚙齒類動物。
53.權(quán)利要求52的方法，其中嚙齒類動物為小鼠。
54.冷藏的非-人動物胚胎干細(xì)胞的追蹤-譜系的原種。
55.權(quán)利要求54的原種，其中非-人動物為嚙齒類動物。
56.權(quán)利要求55的原種，其中嚙齒類動物為小鼠。
57.通過權(quán)利要求1、29或43的任一項的方法制備的遺傳穩(wěn)定的非-人動物近交系。
58.權(quán)利要求57的遺傳穩(wěn)定的非-人動物近交系，其中非-人動物為嚙齒類動物。
59.權(quán)利要求58的遺傳穩(wěn)定的非-人動物近交系，其中嚙齒類動物為小鼠。
全文摘要
本發(fā)明提供了維持非－人動物近交系遺傳穩(wěn)定性的新方法。該方法中，產(chǎn)生了源自原代群體的追蹤－譜系的冷藏胚胎且以合適的時間間隔用于重建原代群體。
文檔編號A01K67/02GK1838880SQ200480023858
公開日2006年9月27日 申請日期2004年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月22日
發(fā)明者邁克爾·V·維萊斯, 羅伯特·塔夫脫, 伊娃·M·艾歇爾 申請人:杰克遜實驗室