專利名稱：：通過基于小寡核苷酸的化合物調(diào)節(jié)免疫刺激性質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及使用寡核苷酸作為免疫刺激劑(immunostimulatoryagent)的免疫學(xué)和免疫治療應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：寡核苷酸在現(xiàn)代分子生物學(xué)中已成為不可或缺的工具用于各種各樣的技術(shù)，其范圍從診斷性探測(probing)方法到PCR到基因表達的反義抑制(antisenseinhibition)和免疫治療應(yīng)用。寡核苷酸的此普遍的用途已導(dǎo)致對于快速、廉價和有效地合成寡核苷酸的方法的需要增加。合成用于反義和診斷應(yīng)用的寡核苷酸現(xiàn)在可以常規(guī)完成。參見，例如，MethodsinMolecularBiology，Vol.20ProtocolsforOligonucleotideandAnalogspp.165-189(S.Agrawal，ed.，HumanaPress，1993)；OligonucleotideandAnalogues，APracticalApproach，pp.87-108(F.Eckstein，ed.，1991)；和Uhlmann和Peyman，supra；Agrawal和Iyer，Curr.Op.inBiotech.612(1995)；和AntisenseResearchandApplications(Crooke和Lebleu，eds.，CRCPress，BocaRaton，1993)。早期的合成方法包括磷酸二酯(phosphodiester)和磷酸三酯化學(xué)方法。例如，Khorana等，J.Molec.Biol.72209(1972)公開了用于寡核苷酸合成的磷酸二酯化學(xué)。Reese，TetrahedronLett.343143-3179(1978)公開了用于合成寡核苷酸和多核苷酸的磷酸三酯化學(xué)方法。這些早期方法很大程度上為更有效的亞磷酰胺(phosphoramidite)和氫膦酸酯(H-phosphonate)合成方法所代替。例如，Beaucage和Caruthers，TetrahedronLett.221859-1862(1981)公開了脫氧核糖核苷亞磷酰胺在多核苷酸合成中的用途。Agrawal和Zamecnik，美國專利No.5,149,798(1992)公開了通過氫膦酸酯方法優(yōu)化合成寡核苷酸。這些現(xiàn)代方法兩者都被用于合成具有大量修飾的核苷間連接(internucleotidelinkage)的寡核苷酸。Agrawal和Goodchild，TetrahedronLett.283539-3542(1987)教導(dǎo)了使用亞磷酰胺化學(xué)合成寡核苷酸甲基膦酸酯。Connolly等，Biochem.233443(1984)公開了使用亞磷酰胺化學(xué)合成寡核苷酸硫代磷酸酯(phosphorothioate)。Jager等，Biochem.277237(1988)公開了使用亞磷酰胺化學(xué)合成寡核苷酸氨基磷酸酯(phosphoramidate)。Agrawal等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)857079-7083(1988)公開了使用氫膦酸酯化學(xué)合成寡核苷酸氨基磷酸酯和硫代磷酸酯。更近一些，幾位研究者已證明了在免疫治療應(yīng)用中使用寡核苷酸作為免疫刺激劑的有效性。磷酸二酯和硫代磷酸酯寡核苷酸可誘導(dǎo)免疫刺激的觀察已導(dǎo)致人們產(chǎn)生開發(fā)此副作用(sideeffect)作為治療工具的興趣。這些努力集中在含有二核苷酸天然CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸。Kuramoto等，Jpn.J.CancerRes.831128-1131(1992)教導(dǎo)了含有回文序列(palindrome)的磷酸二酯寡核苷酸可誘導(dǎo)干擾素-alpha和gamma合成并增強天然殺傷細(xì)胞(naturalkiller)活性，所述回文序列包括CpG二核苷酸。Krieg等，Nature371546-549(1995)公開了硫代磷酸酯含CpG的寡核苷酸是免疫刺激性的。Liang等，J.Clin.Invest.981119-1129(1996)公開了所述寡核苷酸激活人B細(xì)胞。Moldoveanu等，Vaccine161216-124(1998)教導(dǎo)了含CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸增強了抗流感病毒(influenzavirus)的免疫應(yīng)答。McCluskie和Davis，J.Immunol.1614463-4466(1998)教導(dǎo)了含CpG的寡核苷酸作為有效的佐劑，增強抗乙型肝炎病毒(hepatitisB)表面抗原的免疫應(yīng)答。含CpG的硫代磷酸酯寡核苷酸的其它修飾也可影響它們的作為免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)物的能力。參見，例如，Zhao等，Biochem.Pharmacol.(1996)51173-182；Zhao等，BiochemPharmacol.(1996)521537-1544；Zhao等，AntisenseNucleicAcidDrugDev.(1997)7495-502；Zhao等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(1999)93453-3458；Zhao等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(2000)101051-1054；Yu等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(2000)102585-2588；Yu等，Bioorg.Med.Chem.Lett.(2001)112263-2267；和Kandimalla等，Bioorg.Med.Chem.(2001)9807-813。含CpG的寡核苷酸可調(diào)節(jié)的一種應(yīng)答是哮喘(asthma)。過敏性哮喘應(yīng)答(allergicasthmaresponse)的特征在于2型T協(xié)助細(xì)胞(T-helpertype2)(Th2)淋巴細(xì)胞的活化。由Th2淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)的應(yīng)答在哮喘的變應(yīng)性炎癥的發(fā)病機制(pathogenesis)和傳播(propagation)中起到主要的作用。Th2細(xì)胞因子IL-5增加了嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophil)的產(chǎn)生和存活，導(dǎo)致出現(xiàn)的氣道嗜酸性粒細(xì)胞增多(airwayeosinophilia)增加。其它Th2細(xì)胞因子(IL-4、IL-9和IL-13)通過誘導(dǎo)產(chǎn)生變應(yīng)原特異性的(allergen-specific)IgE、肥大細(xì)胞增殖(mast-cellproliferation)、內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子表達(endothelial-celladhesion-moleculeexpression)和氣道高應(yīng)答性(hyper-responsiveness)也在變應(yīng)性炎癥中起到關(guān)連接的作用。皮質(zhì)類固醇(corticosteroid)是目前唯一廣泛使用的變應(yīng)性哮喘的治療方法。然后，類固醇治療只在使炎癥的表現(xiàn)最小化中是有效的，而且并不治愈疾病。需要持續(xù)的治療以防止變應(yīng)性哮喘的進展(progression)。這些報道闡明了仍然需要能夠增強并改進由免疫刺激性寡核苷酸引起的應(yīng)答。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供了用于增強并改進由寡核苷酸化合物引起的免疫應(yīng)答的方法。本發(fā)明的方法允許增加免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激作用用于免疫治療應(yīng)用。本發(fā)明者令人驚訝地發(fā)現(xiàn)對可選地存在于免疫刺激性寡核苷酸5’末端的修飾顯著地增強了其免疫刺激能力。所述寡核苷酸在本文中稱為″致免疫物(immunomer)″。因此，在第一個方面，本發(fā)明提供致免疫物，其包含在它們的3’末端，核苷酸間連接，或通過非-核苷酸接頭在功能化的核堿基或糖連接的至少兩個寡核苷酸，所述寡核苷酸中的至少一個作為免疫刺激性寡核苷酸并具有可接近的5′末端。在一個實施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸致免疫物包含SEQIDNO170的序列。在第二個方面，本發(fā)明提供免疫調(diào)節(jié)性組合物，其包括含有SEQIDNO170的序列的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸致免疫物；而且還包含共-刺激分子，所述共-刺激分子選自細(xì)胞因子、趨化因子、蛋白質(zhì)配體、反式-活化因子、肽和包含經(jīng)修飾的氨基酸的肽組成的組。在本發(fā)明的這個方面，所述共-刺激分子可選地與所述免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸致免疫物結(jié)合，而且所述免疫調(diào)節(jié)性組合物還可選地包含佐劑和/或可藥用的載體。在第三個方面，本發(fā)明提供免疫調(diào)節(jié)性組合物，其包括含有SEQIDNO170的序列的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸致免疫物；而且還包含抗原，其中所述抗原選自肽(peptide)、糖蛋白(glycoprotein)、脂蛋白(lipoprotein)、多糖(polysaccharide)和脂質(zhì)(lipid)，或其中所述抗原是變應(yīng)原(allergen)。在本發(fā)明的這個方面，所述免疫調(diào)節(jié)性組合物還可選地包含佐劑和/或可藥用的載體。在另一個實施方案，所述免疫刺激性寡核苷酸致免疫物包含SEQIDNO171的序列。在第四個方面，本發(fā)明提供免疫調(diào)節(jié)性組合物，其包括含有SEQIDNO171的序列的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸致免疫物；而且還包含共-刺激分子，所述共-刺激分子選自細(xì)胞因子、趨化因子、蛋白質(zhì)配體、反式-活化因子、肽和包含經(jīng)修飾的氨基酸的肽組成的組。在本發(fā)明的這個方面，所述共-刺激分子可選地與所述免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸致免疫物結(jié)合，而且所述免疫調(diào)節(jié)性組合物還可選地包含佐劑和/或可藥用的載體。在第五個方面，本發(fā)明提供免疫調(diào)節(jié)性組合物，其包括含有SEQIDNO171的序列的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸致免疫物；而且還包含抗原，其中所述抗原選自肽、糖蛋白、脂蛋白、多糖和脂質(zhì)組成的組，或其中所述抗原是變應(yīng)原。在本發(fā)明的這個方面，所述免疫調(diào)節(jié)性組合物還可選地包含佐劑和/或可藥用的載體。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供治療患有如下病癥的患者的方法氣道炎癥(airwayinflammation)、炎性疾病(inflammatorydisorder)、過敏癥(allergy)或哮喘(asthma)，所述方法包含對所述患者施用致免疫物。在第六個方面，本發(fā)明提供治療患者的方法，其中所述致免疫物包含通過非核苷酸接頭連接并具有多于一個5’末端的至少兩個寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中至少一個是具有可接近的5’末端并包含免疫刺激性二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸。所述免疫刺激性二核苷酸選自CpG、C*pG、CpG*和C*pG*組成的組，其中C是胞苷(cytidine)或2′-脫氧胞苷(2′-deoxycytidine)，C*是2′-脫氧胸苷(2’-deoxythymidine)、阿糖胞苷(arabinocytidine)、1-(2’-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤(1-(2′-deoxy-β-D-ribofuranosyl)-2-oxo-7-deaza-8-methyl-purine)、2’-脫氧-2’-取代的阿糖胞苷(2’-deoxy-2’-substitutedarabinocytidine)、2’-O-取代的阿糖胞苷(2’-O-substitutedarabinocytidine)、2′-脫氧-5-羥基胞苷(2′-deoxy-5-hydroxycytidine)、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷(2′-deoxy-N4-alkyl-cytidine)、2′-脫氧-4-硫代尿苷(2′-deoxy-4-thiouridine)，或其它非天然嘧啶核苷，G是鳥苷(guanosine)或2’脫氧鳥苷(2′-deoxyguanosine)，G*是2′脫氧-7-脫氮-鳥苷(2’deoxy-7-deazaguanosine)、2′-脫氧-6-硫代鳥苷(2’-deoxy-6-thioguanosine)、阿糖鳥苷(arabinoguanosine)、2′-脫氧肌苷(2′-deoxyinosine)、2’-脫氧-2’取代的-阿糖鳥苷(2’-deoxy-2’substituted-arabinoguanosine)、2’-O-取代的-阿糖鳥苷(2’-O-substituted-arabinoguanosine)。在第七個方面，本發(fā)明提供治療患者的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO170的序列，或SEQIDNO171的序列，或SEQIDNO172的序列，或SEQIDNO173的序列。在第八個方面，本發(fā)明提供治療患者的方法，其還包括施用與所述疾病或病癥有關(guān)的抗原，其中所述致免疫物和/或抗原連接于免疫原性蛋白質(zhì)或非免疫原性蛋白質(zhì)，和/或還包含施用佐劑。在另一個實施方案中，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)患有氣道炎癥、炎性疾病、過敏癥或哮喘的患者中的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含對所述患者施用致免疫物。其中所述免疫應(yīng)答是Th1和/或Th2免疫應(yīng)答。在第九個方面，本發(fā)明提供調(diào)節(jié)患者中的免疫應(yīng)答的方法，其中所述致免疫物包含通過非核苷酸接頭連接并具有多于一個5’末端的至少兩個寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中至少一個是具有可接近的5’末端并包含免疫刺激性二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸。所述免疫刺激性二核苷酸選自CpG、C*pG、CpG*和C*pG*組成的組，其中C是胞苷或2′-脫氧胞苷，C*是2′-脫氧胸苷、阿糖胞苷、1-(2’-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-脫氧-2’-取代的阿糖胞苷、2’-O-取代的阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷，或其非天然嘧啶核苷，G是鳥苷或2’脫氧鳥苷，G*是2′脫氧-7-脫氮鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷、2’-脫氧-2’取代的-阿糖鳥苷、2’-O-取代的-阿糖鳥苷。在第十個方面，本發(fā)明提供在患者體內(nèi)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO170的序列，或SEQIDNO171的序列，或SEQIDNO172的序列，或SEQIDNO173的序列。在第十一個方面，本發(fā)明提供治療患者的方法，其還包括施用與所述疾病或病癥有關(guān)的抗原，其中所述致免疫物和/或抗原連接于免疫原性蛋白質(zhì)或非免疫原性蛋白質(zhì)，和/或還包括施用佐劑。圖1是本發(fā)明的有代表性的致免疫物的圖示。圖2顯示本發(fā)明的幾種有代表性的致免疫物。圖3顯示一組有代表性的小分子接頭，其適于線性(linear)合成本發(fā)明的致免疫物。圖4顯示一組有代表性的小分子接頭，其適于平行(parallel)合成本發(fā)明的致免疫物。圖5是線性合成本發(fā)明的致免疫物的合成方案。DMTr＝4，4′二甲氧基三苯甲基，CE＝氰乙基。圖6是平行合成本發(fā)明的致免疫物的合成方案。DMTr＝4，4′二甲氧基三苯甲基，CE＝氰乙基。圖7A圖示了通過致免疫物1-3在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)IL-12。這些數(shù)據(jù)顯示具有可接近的5’-末端的致免疫物2是比單體的Oligo1更強的IL-12誘導(dǎo)物，而不具有可接近的5’-末端的致免疫物3與oligo1相比具有相等或較弱的產(chǎn)生免疫刺激的能力。圖7B圖示了通過致免疫物1-3在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)IL-6(分別為由頂至底)。這些數(shù)據(jù)顯示具有可接近的5’-末端的致免疫物2是比單體的Oligo1更強的IL-6誘導(dǎo)物，而不具有可接近的5’-末端的致免疫物3與oligo1相比具有相等或較弱的產(chǎn)生免疫刺激的能力。圖7C圖示了通過致免疫物1-3在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)IL-10(分別為由頂至底)。圖8A圖示了通過不同濃度的致免疫物5和6在細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)BALB/c小鼠脾細(xì)胞增殖，所述的致免疫物5和6分別具有不可接近的和可接近的5’-末端。圖8B圖示了由致免疫物4-6引起的BALB/c小鼠脾增大，所述的致免疫物4-6在CpG基序的5’-側(cè)翼序列具有免疫原性化學(xué)修飾。而且具有可接近的5’-末端的致免疫物(6)與不具有可接近的5’-末端的致免疫物5和單體的Oligo4相比，具有更強的使脾增大增加的能力。圖9A圖示了通過不同濃度的Oligo4和致免疫物7和8在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)IL-12。圖9B圖示了通過不同濃度的Oligo4和致免疫物7和8在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)IL-6。圖9C圖示了通過不同濃度的Oligo4和致免疫物7和8在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)IL-10。圖10A圖示了通過致免疫物14、15和16在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。圖10B圖示了通過不同濃度的致免疫物14和16在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)由IL-12引起的細(xì)胞增殖。圖10C圖示了通過不同濃度的致免疫物14和16在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)由IL-6引起的細(xì)胞增殖。圖11A圖示了通過Oligo4和17和致免疫物19和20在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。圖11B圖示了通過不同濃度的Oligo4和17和致免疫物19和20在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)由IL-12引起的細(xì)胞增殖。圖11C圖示了通過不同濃度的Oligo4和17和致免疫物19和20在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)由IL-6引起的細(xì)胞增殖。圖12圖示了使用寡核苷酸4和致免疫物14、23和24引起的BALB/c小鼠脾增大。圖13圖示了寡核苷酸的3′-末端核苷，其顯示非-核苷酸連接(non-nucleotidiclinkage)可在核堿基，在3’位置，或在2’位置與核苷連接。圖14顯示用于實施例13的化學(xué)取代。圖15顯示使用實施例13的修飾的寡核苷酸得到的細(xì)胞因子曲線(profile)。圖16顯示與氨基接頭(aminolinker)相比，甘油接頭(glycerollinker)的相對細(xì)胞因子誘導(dǎo)。圖17顯示各種接頭和接頭組合的相對細(xì)胞因子誘導(dǎo)。圖18A-E顯示各種PS和PO致免疫物和寡核苷酸的相對核酸酶抗性(relativenucleaseresistance)。圖19顯示在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中，與PS致免疫物相比PO致免疫物的相對細(xì)胞因子誘導(dǎo)。圖20顯示在C3H/Hej小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中，與PS致免疫物相比PO致免疫物的相對細(xì)胞因子誘導(dǎo)。圖21顯示在C3H/Hej小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中，在高濃度的致免疫物條件下，與PS致免疫物相比PO致免疫物的相對細(xì)胞因子誘導(dǎo)。圖22顯示致免疫物(IMOs)的序列和化學(xué)修飾。圖23A和23B顯示小鼠中OVA-誘導(dǎo)的Th2免疫應(yīng)答的IMO預(yù)防(prevention)，如通過脾細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞因子應(yīng)答所顯示的那樣。圖24A和24B顯示小鼠中OVA-誘導(dǎo)的Th2免疫應(yīng)答的IMO預(yù)防，如通過血清抗體應(yīng)答所顯示的那樣。圖25顯示IMOs1和2對于小鼠中建立的OVA-誘導(dǎo)的變應(yīng)性哮喘的劑量依賴性影響(dose-dependentefiect)。細(xì)胞因子分泌在OVA-回憶應(yīng)答(OVA-recallresponse)的脾細(xì)胞培養(yǎng)物中。IMOs1和2以劑量依賴性的方式顯著地抑制IL-5分泌。IL-13被所述兩種IMO化合物顯著地抑制。兩種IMO化合物誘導(dǎo)劑量依賴性的IFN-g分泌。圖26顯示血清抗原-特異性的抗體和總抗體。IMOs1和2產(chǎn)生OVA-特異性IgE的劑量依賴性減少和OVA-特異性IgG2a的增加。圖27顯示單次高劑量的IMO化合物相對于多次低劑量的IMO化合物對于初次接受試驗的小鼠(navemice)中局部和系統(tǒng)Th1細(xì)胞因子水平的影響。單劑量的100mg誘導(dǎo)更高水平的系統(tǒng)性細(xì)胞因子應(yīng)答。與此相反，三次較小劑量(3×33mg)誘導(dǎo)更高的局部(BALF)細(xì)胞因子應(yīng)答。圖28顯示IMO化合物的低量多次給藥(lowmultipleadministration)對于初次接受試驗的小鼠中局部和系統(tǒng)細(xì)胞因子水平的劑量依賴性影響。當(dāng)多次以小劑量給藥時，IMO1使小鼠中局部(BALF)細(xì)胞因子水平，而不是系統(tǒng)細(xì)胞因子水平增加。此影響是劑量依賴性的。圖29比較了IMO和皮質(zhì)類甾醇(corticosteriod)在體外的作用。IMO1和布地奈德(budesonide)兩者都抑制OVA-誘導(dǎo)的Th2細(xì)胞因子分泌。然而，只有IMO1顯示強的Th1細(xì)胞因子誘導(dǎo)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及寡核苷酸作為免疫刺激劑用于免疫治療應(yīng)用的治療用途。本文中引用的已頒布的(issued)專利、專利申請和參考文獻摻入本文作為參考，其程度如同具體而單獨地指出將每一篇摻入作為參考。在本文引用的任何文獻的任何教導(dǎo)與本發(fā)明說明書之間不一致的情況下，對于本發(fā)明而言應(yīng)以后者為準(zhǔn)。本發(fā)明提供了增強和改進由免疫刺激化合物引起的免疫應(yīng)答的方法用于免疫治療應(yīng)用，如，但不限于，治療癌癥、自身免疫性疾病(autoimmunedisorder)、哮喘、呼吸過敏(respiratoryallergies)、食物過敏(foodallergy)和成年及兒科的(pediatric)人體內(nèi)細(xì)菌、寄生的(parasitic)和病毒的感染和獸醫(yī)的(veterinary)應(yīng)用。變應(yīng)性哮喘是特別優(yōu)選的用于通過本方法和化合物治療的病癥。因此，本發(fā)明還提供具有最佳水平的免疫刺激作用用于免疫治療的化合物，和用于制備和使用所述化合物的方法。此外，本發(fā)明的致免疫物用作佐劑與DNA疫苗、抗體、變應(yīng)原、化學(xué)治療劑和反義寡核苷酸聯(lián)用。本發(fā)明人已令人吃驚地發(fā)現(xiàn)對可選地存在于免疫刺激性寡核苷酸5’末端的修飾顯著地影響了其免疫刺激能力。所述寡核苷酸在本文中稱為″致免疫物″。在第一個方面，本發(fā)明提供致免疫物，其包含在它們3’末端，或核苷間連接或功能化的核堿基或糖與非-核苷酸接頭連接的至少兩個寡核苷酸，至少所述寡核苷酸中的一個作為免疫刺激性寡核苷酸并具有可接近的5′末端。如本文所使用的，術(shù)語“可接近的5’末端”指寡核苷酸的5’末端是充分可用的以致于識別和結(jié)合致免疫物并刺激免疫系統(tǒng)的因子具有接近它的通路。在具有可接近的5’末端的寡核苷酸中，末端糖的5’OH位置不與多于兩個核苷殘基共價連接?？蛇x地，可將所述5′OH連接于磷酸酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)部分，芳香族或脂肪族接頭，膽固醇(cholesterol)，或不干擾可接近性的其它實體。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“致免疫物”指任何化合物，其包含在它們3’末端或核苷間連接，或功能化的核堿基或糖直接連接與通過非-核苷酸接頭連接的至少兩個寡核苷酸，至少所述寡核苷酸中的一個(在致免疫物的上下文中)作為免疫刺激性寡核苷酸并具有可接近的5′末端，其中當(dāng)給藥于脊椎動物(vertebrate)時，所述化合物誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在一些實施方案中，所述脊椎動物是哺乳動物，包括人。在一些實施方案中，致免疫物包含兩個或更多個免疫刺激性寡核苷酸，其(在致免疫物的上下文中)可相同或不同。優(yōu)選地，每個所述的免疫刺激性寡核苷酸具有至少一個可接近的5’末端。在一些實施方案中，除了免疫刺激性寡核苷酸以外，致免疫物還包含至少一個與基因互補的寡核苷酸。如本文所使用的，術(shù)語“與...互補”指在生理條件下寡核苷酸與基因的區(qū)域雜交。在一些實施方案中，寡核苷酸下調(diào)基因的表達。所述的下調(diào)的寡核苷酸優(yōu)選自反義寡核苷酸、核酶(ribozyme)寡核苷酸、小抑制RNA和誘餌(decoy)寡核苷酸組成的組。如本文所使用的，術(shù)語“下調(diào)基因”指抑制基因的轉(zhuǎn)錄或基因產(chǎn)物的翻譯。因此，根據(jù)本發(fā)明的這些實施方案的致免疫物可用于靶向一個或多個具體的疾病靶物(diseasetarget)，同時也刺激免疫系統(tǒng)。在一些實施方案中，致免疫物包括核酶(ribozyme)或誘餌寡核苷酸。如本文所使用的，術(shù)語“核酶”指具有催化活性的寡核苷酸。優(yōu)選地，核酶與特異的核酸靶物結(jié)合并切割該靶物。如本文所使用的，術(shù)語“誘餌寡核苷酸”指以序列特異性的方式與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄活性的寡核苷酸。優(yōu)選地，核酶或誘餌寡核苷酸顯示二級結(jié)構(gòu)，其包括，但不限于莖-環(huán)(stem-loop)或發(fā)卡結(jié)構(gòu)(hairpinstructure)。在一些實施方案中，至少一個寡核苷酸包含poly(I)-poly(dC)。在一些實施方案中，至少一組Nn包括一串3至10個dGs和/或Gs或2’-取代的核糖(ribo)或阿拉伯糖(arabino)Gs。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“寡核苷酸”指由多個連接的核苷單元形成的多核苷。所述的寡核苷酸可由已存在的核酸來源，包括基因組或cDNA中得到，但優(yōu)選通過合成方法制備。在優(yōu)選的實施方案中，每個核苷單元包括雜環(huán)的堿基和呋喃戊糖基(pentofuranosyl)、海藻糖(trehalose)、阿拉伯糖(arabinose)、2’-脫氧-2’-取代阿拉伯糖、2’-O-取代阿拉伯糖或己糖基(hexosesugargroup)。核苷殘基可通過已知的核苷間連接中的任一種彼此偶聯(lián)。這樣的核苷間連接包括，但不限于，磷酸二酯，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，烷基膦酸酯(alkylphosphonate)，烷基硫代磷酸酯(alkylphosphonothioate)，磷酸三酯(phosphotriester)，氨基磷酸酯，硅氧烷(siloxane)，碳酸酯(carbonate)，烷氧羰基(carboalkoxy)，乙酰胺化物(acetamidate)，氨基甲酸酯(carbamate)，嗎林代(morpholino)，硼烷(borano)，硫醚(thioether)，橋連的氨基磷酸酯(bridgedphosphoramidate)，橋連的亞甲基膦酸酯(bridgedmethylenephosphonate)，橋連的硫代磷酸酯(bridgedphosphorothioate)和砜(sulfone)核苷間連接。術(shù)語“寡核苷酸”也包括具有一個或多個立體特異性核苷間連接的多聚核苷(例如，(RP)-或(SP)-硫代磷酸酯、烷基膦酸酯或磷酸三酯連接)。如本文所使用的，術(shù)語“寡核苷酸”和“二核苷酸”明顯地旨在包括具有任意上述核苷間連接的多聚核苷和二核苷，而無論所述的連接是否包含磷酸基團。在一些優(yōu)選實施方案中，這些核苷間連接可以是磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯連接，或其組合。在一些實施方案中，每個寡核苷酸具有約3至約35個核苷殘基，優(yōu)選約4至約30個核苷殘基，更優(yōu)選約4至約20個核苷殘基。在一些實施方案中，所述的寡核苷酸具有約5-約18或約5-約14個核苷殘基。如本文所使用的，術(shù)語“約”意味著確切的數(shù)字并不重要。因而在所述的寡核苷酸中核苷殘基的數(shù)目并不重要，具有1或2個較少的核苷殘基的寡核苷酸或者有一個至幾個額外核苷殘基的寡核苷酸，可作為前述的每個實施方案的相等物。在一些實施方案中，一或多種寡核苷酸有11個核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸”也包括含有額外的取代基的多聚核苷，所述的取代基包括，但不限于，蛋白質(zhì)基團(proteingroup)，親脂基團(lipophilicgroup)，嵌入劑(intercalatingagent)，二元胺(diamine)，葉酸(folicacid)，膽固醇和金剛烷(adamantane)，術(shù)語“寡核苷酸”也包括任何其它含有聚合物的核堿基，所述的聚合物包括，但不限于，肽核酸(peptidenucleicacid)(PNA)，具有磷酸基團的肽核酸(PHONA)，封閉的核酸(lockednucleicacid)(LNA)，嗎林代-骨架寡核苷酸和具有帶烷基接頭或氨基接頭的骨架部分的寡核苷酸。如本文應(yīng)用的，所述的術(shù)語“二級結(jié)構(gòu)”是指分子內(nèi)和分子間的氫連接連接(hydrogenbonding)。分子內(nèi)氫連接連接導(dǎo)致莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的形成，分子間氫連接連接導(dǎo)致雙鏈體核酸分子的形成。本發(fā)明的寡核苷酸可以包括天然存在的核苷，經(jīng)修飾的核苷或其混合物。如本文所使用的，術(shù)語“經(jīng)修飾的核苷”是指包括經(jīng)修飾的雜環(huán)堿基，經(jīng)修飾的糖基部分，或其組合的核苷。在一些實施方案中，經(jīng)修飾的核苷酸是如本文所描述的非-天然的嘧啶或嘌呤核苷。在一些實施方案中，經(jīng)修飾的核苷是2′-取代核糖核苷，阿拉伯糖核苷或2’-脫氧-2’-取代阿拉伯糖苷。為了本發(fā)明目的，術(shù)語“2′-取代核糖核苷”包括核糖核苷，其中在該戊糖部分的2′位置的羥基被取代而產(chǎn)生2′-O-取代核糖核苷。優(yōu)選地，這樣的取代是以含有1-6個飽和的或不飽和的碳原子的低級烷基，或者以具有6-10個碳原子的芳基取代，其中，所述的烷基或芳基可為未取代的或可為取代的，例如以鹵基(halo)，羥基，三氟甲基(trifluoromethyl)，氰基(cyano)，硝基(nitro)，酰基(acyl)，酰氧基(acyloxy)，烷氧基(alkoxy)，羧基(carboxyl)，烷氧羰基(carboalkoxy)或氨基進行取代。2′-O-取代核糖核苷的實例包括，但不限于2′-O-甲基核糖核苷，2′-O-甲基阿拉伯糖苷和2′-O-甲氧基乙基核糖核苷(2′-O-methoxyethylribonucleoside)。術(shù)語“2′-取代核糖核苷”也包括其中2′-羥基被含有1-6個飽和或不飽和碳原子的低級烷基所取代或被氨基或鹵素基團取代的核糖核苷。所述的2′-取代核糖核苷的實例包括，但不限于，2’-氨基，2’-氟(2’-fluoro)，2’-烯丙基(2’-allyl)和2’-炔丙基(2’-propargyl)核糖核苷。術(shù)語“寡核苷酸”包括雜合(hybrid)寡核苷酸和嵌合(chimeric)寡核苷酸?！扒逗瞎押塑账帷笔蔷哂幸粋€以上類型的核苷間連接的寡核苷酸。所述的嵌合寡核苷酸的一個優(yōu)選實例是包含硫代磷酸酯，磷酸二酯或二硫代磷酸酯區(qū)域和非-離子鍵例如烷基膦酸酯或烷基硫代膦酸酯鍵的嵌合寡核苷酸(參見，例如Pederson等，美國專利No.5,635,377和5,366,878)?！半s合寡核苷酸”是具有一個以上類型核苷的寡核苷。所述的雜合寡核苷酸的一個優(yōu)選實例是包含核糖核苷酸或2′取代核糖核苷酸區(qū)域，和脫氧核糖核苷酸區(qū)域(參見，例如Metelev和Agrawal，美國專利No.5,652,355，6,346,614和6,143,881)。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“免疫刺激性寡核苷酸”指如上所述的當(dāng)對脊椎動物，諸如魚、禽類或哺乳動物施用時誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的寡核苷酸。如本文所使用的，術(shù)語“哺乳動物”包括，但不限于大鼠、小鼠、貓、狗、馬、牛、奶牛、豬、兔、非人靈長類動物(non-humanprimate)和人。有用的免疫刺激性寡核苷酸的描述可見于1998年11月5日公開的Agrawal等，WO98/49288；2001年2月22日公開的WO01/12804；2001年8月2日公開的WO01/55370；2001年4月30日提交的PCT/US01/13682；和2001年9月26日提交的PCT/US01/30137。優(yōu)選地，所述免疫刺激性寡核苷酸包含至少一個磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯核苷間連接。在一些實施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸包含式5′-Pyr-Pur-3′的免疫刺激性二核苷酸，其中Pyr是天然的或合成的嘧啶核苷而Pur是天然的或合成的嘌呤核苷。如本文所使用的，術(shù)語“嘧啶核苷”是指核苷，其中所述核苷的堿基組成是嘧啶堿基。類似地，術(shù)語“嘌呤核苷”是指核苷，其中所述核苷的堿基組成是嘌呤堿基。為了本發(fā)明目的，“合成的”嘧啶或嘌呤核苷包括非天然存在的嘧啶或嘌呤堿基，非天然存在的糖部分，或其組合。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的嘧啶核苷，具有結(jié)構(gòu)(I)(i)其中D是氫連接供體(hydrogenbonddonor)；D′選自氫、氫連接供體、氫連接受體、親水基團、疏水基團、吸電子基團或給電子基團；A是氫連接受體或親水基團；A’選自氫連接受體、親水基團、疏水基團、吸電子基團和給電子基團；X是碳或氮；和S′是戊糖環(huán)或己糖環(huán)或非-天然存在的糖。優(yōu)選地，糖環(huán)是利用磷酸部分、修飾的磷酸部分或其它適于連接所述的嘧啶核苷與其它核苷或核苷類似物的接頭部分衍生的。優(yōu)選的氫連接供體包括，但不限于，-NH-，-NH2，-SH和-OH。優(yōu)選的氫連接受體包括，但不限于，C＝O，C＝S，和芳香雜環(huán)中的氮原子，例如，胞嘧啶的N3。在一些實施方案中，(I)中的堿基部分是非天然存在的嘧啶堿基。優(yōu)選的非天然存在的嘧啶堿基的實例包括，但不限于，5-羥基胞嘧啶(5-hydroxycytosine)，5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcytosine)，N4-烷基胞嘧啶(N4-alkycytosine)，優(yōu)選N4-乙基胞嘧啶(N4-ethylcytosine)和4-硫尿嘧啶(4-thiouracil)。然而，在一些實施方案中，特別將5-溴胞嘧啶(5-bromocytosine)除外。在一些實施方案中，(I)中的糖部分S′是非天然存在的糖部分。為了本發(fā)明之目的，“天然存在的糖部分”是天然作為核酸的一部分存在的糖基，例如，核糖和2′-脫氧核糖，而且“非天然存在的糖部分”是任何不天然作為核酸的一部分存在的糖基，但其可以用作寡核苷酸的骨架，例如，己糖。阿拉伯糖或阿拉伯糖衍生物是優(yōu)選的糖部分的實例。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的嘌呤核苷類似物具有結(jié)構(gòu)(II)(ii)其中D是氫連接供體；D’選自氫連接、氫連接供體和親水基團；A是氫連接受體或親水基團；X是碳或氮；每個L獨立地選自C，O，N或S；和S′是戊糖環(huán)或己糖環(huán)，或非-天然存在的糖。優(yōu)選地，糖環(huán)是用磷酸酯部分、修飾的磷酸酯部分或其它適于將所述的嘧啶核苷與其它核苷或核苷類似物連接的接頭部分衍生的。優(yōu)選的氫連接供體包括，但不限于，-NH-，-NH2，-SH和-OH。優(yōu)選的氫連接受體包括，但不限于，C＝O，C＝S，-NO2和芳香雜環(huán)中的氮原子，例如，鳥嘌呤的N1。在一些實施方案中，(II)中的堿基部分是非天然存在的嘌呤堿基。優(yōu)選的非天然存在的嘌呤堿基的實例包括，但不限于，6-硫代鳥嘌呤(6-thioguanine)和7-脫氮鳥嘌呤(7-deazaguanine)，在一些實施方案中，(II)中的糖部分S′是天然存在的糖部分，如前面的結(jié)構(gòu)(I)所述。在優(yōu)選的實施方案中，所述免疫刺激性二核苷酸選自CpG、C*pG、CpG*和C*pG*組成的組，其中C是胞苷或2′-脫氧胞苷，C*是2′-脫氧胸苷、1-(2’-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、阿糖胞苷、2′-脫氧胸苷、2’-脫氧-2’-取代的阿糖胞苷、2’-O-取代的阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷，或者其它非天然嘧啶核苷或極少存在的嘧啶核苷，G是鳥苷或2’-脫氧鳥苷，G*是2′脫氧-7-脫氮-鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2’-脫氧-2’取代的-阿糖鳥苷、2’-O-取代的-阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷或極少存在的嘌呤核苷，而且p是選自磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯的核苷間連接。在一些優(yōu)選實施方案中，所述的免疫刺激性二核苷酸不是CpG。所述免疫刺激性寡核苷酸可包括在免疫刺激性二核苷酸的一側(cè)或兩側(cè)的免疫刺激部分。因此，在一些實施方案中，所述免疫刺激性寡核苷酸包含結(jié)構(gòu)(III)的免疫刺激區(qū)域5’-Nn-N1-Y-Z-N1-Nn-3’(III)其中Y是胞苷、2’脫氧胸苷、2’脫氧胞苷、阿糖胞苷、2’-脫氧-2’-取代的阿糖胞苷、2’-脫氧胸苷、2’-O-取代的阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷或其它非天然嘧啶核苷；Z是鳥苷或2′脫氧鳥苷，G*是2’脫氧-7-脫氮鳥苷、2’-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2’-脫氧-2’取代的-阿糖鳥苷、2’-O-取代-阿糖鳥苷、2’脫氧肌苷，或其它非天然嘌呤核苷；N1，每次出現(xiàn)時，優(yōu)選為天然存在的或合成的核苷或免疫刺激部分，其選自無堿基核苷(abasicnucleoside)、阿糖核苷、2′-脫氧尿苷、α-脫氧核糖核苷、β-L-脫氧核糖核苷，和通過磷酸二酯或修飾的核苷間連接與鄰近的核苷在3′側(cè)連接的核苷，所述修飾的核苷間連接選自，而不限于，具有大約2埃(angstrom)至大約200埃長度的接頭、C2-C18烷基接頭、聚(乙二醇)接頭、2-氨基丁基-1，3-丙二醇接頭(2-aminobutyl-1，3-propanediollinker)、甘油基接頭(glyceryllinker)、2′-5′核苷間連接，和硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷間連接；Nn，每次出現(xiàn)時，優(yōu)選為天然存在的核苷或免疫刺激部分，其選自無堿基核苷、阿糖核苷、2′脫氧尿苷、α-脫氧核糖核苷、2′-O-取代核糖核苷，和通過修飾的核苷間連接與鄰近的核苷在3′側(cè)連接的核苷，所述修飾的核苷間連接優(yōu)選自氨基接頭、2′-5′核苷間連接和甲基膦酸酯核苷間連接；假設(shè)至少一個N1或Nn是免疫刺激部分；其中n是0至30的數(shù)；和其中3’端，其為核苷間接頭，或衍生的核堿基或糖，直接或通過非-核苷酸接頭與另一個寡核苷酸連接，所述另一個寡核苷酸可為或可不為免疫刺激的。在一些優(yōu)選的實施方案中，YZ是阿糖胞苷或2’-脫氧-2’-取代的阿糖胞苷和阿糖鳥苷或2’脫氧-2’-取代阿糖鳥苷。優(yōu)選的免疫刺激部分包括磷酸骨架中的修飾，其包括，但不限于甲基膦酸酯、甲基硫代膦酸酯(methylphosphonothioates)、磷酸三酯、硫代磷酸三酯(phosphothiotriester)、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、三酯前藥(triesterprodrug)、砜、磺胺(sulfonamide)、氨基磺酸酯、甲乙縮醛(formacetal)、N-甲基羥胺(N-methylhydroxylamine)、碳酸酯、氨基甲酸酯、嗎林代、硼膦酸酯(boranophosphonate)、氨基磷酸酯，具體是伯氨基-氨基磷酸酯(primaryamino-phosphoramidate)、N3氨基磷酸酯和N5氨基磷酸酯，和立體特異性的連接(例如，(RP)-或(SP)-硫代磷酸酯、烷基膦酸酯或磷酸三酯連接)。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的免疫刺激部分還包括具有糖修飾的核苷，所述糖修飾包括，但不限于2’取代戊糖，其包括，而不限于2’-O-甲基核糖、2’-O-甲氧基乙基核糖、2’-O-炔丙基核糖和2’-脫氧-2′-氟核糖；3’取代的戊糖，其包括，而不限于3’-O-甲基核糖；1′，2′雙脫氧核糖；阿糖；取代的阿糖，其包括，而不限于1’甲基阿糖、3’-羥基甲基阿糖、4’羥基甲基阿糖和2’取代的阿糖；己糖，其包括，而不限于1，5-無水己糖醇(1，5-anhydrohexitol)；和alpha-端基異構(gòu)體(alpha-anomers)。在修飾的糖是3′-脫氧核糖核苷或′-O-取代的核糖核苷的實施方案中，免疫刺激部分通過2′-5核苷間連接與鄰近的核苷連接。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的免疫刺激部分還包括具有其它碳水化合物骨架修飾和取代的寡核苷酸，包括肽核酸(peptidenucleicacid)(PNA)、具有磷酸基團的肽核酸(PHONA)、封閉的(locked)核酸(LNA)、嗎啉代骨架寡核苷酸，和具有骨架接頭部分的寡核苷酸，所述骨架接頭部分具有大約2埃至大約200埃的長度，其包括而不限于，烷基接頭或氨基接頭。所述烷基接頭可為分枝的或不分枝的，取代的或不取代的，和手性純的或外消旋混合物。最優(yōu)選地，所述烷基接頭具有大約2至大約18個碳原子。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述烷基接頭具有大約3至大約9個碳原子。一些烷基接頭包括一個和多個官能團，所述官能團選自羥基、氨基、硫醇(thiol)、硫醚(thioether)、醚、酰胺、硫代酰胺(thioamide)、酯、脲和硫醚。一些所述功能化的烷基接頭是式-O-(CH2-CH2-O-)n(n＝1-9)的聚乙二醇接頭。一些其它功能化的烷基接頭是肽或氨基酸。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的免疫刺激部分還包括DNA同種型(isoform)，其包括，但不限于β-L-脫氧核糖核苷和α-脫氧核糖核苷。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的免疫刺激部分摻入3’修飾，而且還包括具有非天然核苷間連接位置的核苷，包括，但不限于2’-5’、2′-2′、3’-3’和5’-5’連接。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的免疫刺激部分還包括具有修飾的雜環(huán)堿基的核苷，所述雜環(huán)堿基包括，但不限于5羥基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、N4-烷基胞嘧啶，優(yōu)選N4-乙基胞嘧啶、4-硫尿嘧啶、6-硫鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、肌苷、硝基吡咯(nitropyrrole)、C5-丙烯基嘧啶(propynylpyrimidine)和二氨基嘌呤(diaminopurine)，其包括，但不限于2，6-二氨基嘌呤。為了具體的說明而不是為了限制，例如，在結(jié)構(gòu)(III)的免疫刺激區(qū)域中，在位置N1或Nn的甲基膦酸酯核苷間連接是免疫刺激部分，具有大約2埃至大約200埃的長度的接頭、在位置X1的C2-C18烷基接頭是免疫刺激部分，而且在位置X1的β-L-脫氧核糖核苷是免疫刺激部分。免疫刺激部分的代表性位置和結(jié)構(gòu)參見下述表1?？梢岳斫?，將接頭稱為在具體位置免疫刺激部分的意思是將在該位置的核苷殘基在其3′-羥基用指定的接頭取代，由此在該核苷殘基和鄰近核苷之間3′側(cè)產(chǎn)生修飾的核苷間連接。類似地，將修飾的核苷間連接稱為在具體位置的免疫刺激部分的意思是通過所述的連接將在該位置的核苷殘基與鄰近的核苷在3’側(cè)連接。表1表2顯示具有上游增強區(qū)的免疫刺激性寡核苷酸內(nèi)的免疫刺激部分的代表性位置和結(jié)構(gòu)。如本文所使用的，術(shù)語“間隔區(qū)(spacer)9”指式-O-(CH2CH2-O)n-的聚(乙二醇)接頭，其中n為3。術(shù)語“間隔區(qū)18”指式-O-(CH2CH2-O)n-的聚(乙二醇)接頭，其中n是6。如本文所使用的，術(shù)語“C2-C18烷基接頭”指式-O-(CH2)q-O-的接頭，其中q是2至18的整數(shù)。因此，術(shù)語″C3-接頭″和″C3-烷基接頭″指式-O-(CH2)3-O-的接頭。對于每個間隔區(qū)9、間隔區(qū)18和C2-C18烷基接頭而言，將所述接頭通過磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯連接連接于鄰近的核苷。表2表3顯示具有下游增強區(qū)的免疫刺激性寡核苷酸內(nèi)的免疫刺激部分的代表性位置和結(jié)構(gòu)。表3根據(jù)本發(fā)明的致免疫物包含在它們3’末端核苷間連接或或通過非核苷酸接頭在功能化的核堿基或糖進行連接的至少兩個寡核苷酸。為了本發(fā)明的目的，″非核苷酸接頭″是能與寡核苷酸通過共價或非共價連接連接的任何部分。優(yōu)選所述接頭長度為大約2埃至大約200埃。優(yōu)選的接頭的幾個實例列在下面。非共價連接包括，但不限于，靜電相互作用(electrostaticinteraction)、疏水相互作用(hydrophobicinteraction)、π-堆積相互作用(π-stackinginteraction)，和氫連接連接。術(shù)語“非核苷酸接頭”并不是指如上所述的核苷間連接，例如，磷酸二酯、硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯官能團，其直接連接兩個核苷的3′-羥基基團。為了本發(fā)明的目的，所述的直接3′-3′連接被認(rèn)為是″核苷酸連接″。在一些實施方案中，所述非核苷酸接頭是金屬，包括，但不限于金粒子(goldparticle)。在一些其它實施方案中，所述非核苷酸接頭是可溶的或不可溶的生物可降解聚合物珠。在又一個實施方案中，所述非核苷酸接頭是有機部分，其具有允許與寡核苷酸連接的官能團。所述連接優(yōu)選通過任何穩(wěn)定的共價連接連接。作為非限制性的實例，可將接頭連接于核苷上任何合適的位置，如圖13所示。在一些優(yōu)選的實施方案中，將接頭連接于3′-羥基。在所述實施方案中，接頭優(yōu)選包含羥基官能團，其優(yōu)選通過磷酸二酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或非基于磷酸的連接(non-phosphate-basedlinkage)連接于3′-羥基。在一些實施方案中，所述非核苷酸接頭是生物分子，其包括，但不限于多肽、抗體、脂質(zhì)、抗原、變應(yīng)原和寡糖。在一些其它實施方案中，所述非核苷酸接頭是小分子。為了本發(fā)明的目的，小分子是具有小于1,000Da的分子量的有機部分。在一些實施方案中，小分子具有小于750Da的分子量。在一些實施方案中，小分子是脂肪族或芳香族碳?xì)浠衔铮涿糠N可選地可包括，以連接寡核苷酸的線狀鏈(linearchain)或附加于其上的形式，一個或多個官能團，其選自羥基、氨基、硫醇、硫醚、醚、酰胺、硫代酰胺、酯、脲(urea)和硫脲(thiourea)組成的組。所述小分子可為環(huán)狀或非環(huán)狀的。小分子接頭的實例包括，但不限于，氨基酸、碳水化合物、環(huán)糊精、金剛烷(adamantane)、膽固醇(cholesterol)、半抗原(hapten)和抗生素(antibiotics)。然而，為了描述非核苷酸接頭的目的，術(shù)語“小分子”并不意圖包括核苷。在一些實施方案中，所述小分子接頭是式HO-(CH2)o-CH(OH)-(CH2)p-OH的甘油或甘油同源物，其中o和p獨立地為1至大約6，1至大約4，或1至大約3的整數(shù)。在一些其它實施方案中，所述小分子接頭是1，3-二氨-2-羥基丙烷的衍生物。一些所述衍生物具有式HO-(CH2)m-C(O)NH-CH2-CH(OH)-CH2-NHC(O)-(CH2)m-OH，其中m為0至大約10，0至大約6，2至大約6，或2至大約4的整數(shù)。根據(jù)本發(fā)明的一些非核苷酸接頭允許多于兩個寡核苷酸的連接，如圖1所示。例如，小分子接頭甘油具有三個可與寡核苷酸共價連接的羥基。因此，根據(jù)本發(fā)明的一些致免疫物包含多于兩個寡核苷酸，其將它們的3’末端連接于非核苷酸。一些這樣的致免疫物包含至少兩個免疫刺激性寡核苷酸，每免疫刺激性寡核苷酸具有可接近的5’末端?？墒褂萌鐖D5和6所示并在實施例中進一步描述的自動合成儀和亞磷酰胺方法方便地合成本發(fā)明的致免疫物。在一些實施方案中，通過線性合成方法合成致免疫物(參見圖5)。如本文所使用的，術(shù)語“線性合成”指由致免疫物的一個末端開始呈線性進行到另一末端的合成。線性合成允許將相同的或不相同的(根據(jù)長度、堿基組成和/或化學(xué)修飾合并的)單體單元摻入致免疫物。合成的可替換模式是“平行合成”，其中合成從中心的接頭部分向外進行(參見圖6)。如美國專利No.5,912,332所述，附著于固體支持物的接頭可以用于平行合成?？商鎿Q地，可使用通用的固體支持物(如磷酸鹽附著的可控孔度玻璃支持物)。致免疫物的平行合成比線性合成具有幾個優(yōu)勢(1)平行合成允許合并相同的單體單元；(2)與線性合成不同，兩個(或所有)單體單元同時合成，因而合成的步驟數(shù)和合成所需要的時間與單體單元相同；并且(3)減少合成步驟會提高最終致免疫物產(chǎn)物的純度和收率。通過線性合成或平行合成方案，在合成的最后階段，致免疫物可方便地用濃縮的氨溶液脫保護，或如亞磷酰胺供應(yīng)商的推薦，如果合并修飾的核苷。產(chǎn)物致免疫物優(yōu)選用反相HPLC純化、脫三苯甲基(detritylate)、脫鹽和透析。表4A和4B顯示根據(jù)本發(fā)明的代表性的致免疫物。附加的致免疫物在實施例中描述。表4.致免疫物序列的實例<tablesid="tabl0002"num="0002"></tables>L＝C3-烷基接頭；X＝1′，2′-雙脫氧核糖核苷；Y＝50HdC；R＝7-脫氮-dG表4B<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="800">SEQIDNO.序列和修飾(5’-3’)1705’-CTGTCRTTCTC-X-CTCTTRCTGTC-5’1715’-TCRTCRTTG-X-GTTRCTRCT-5’1725’-TCTGTCRTTCT-X-TCTTRCTGTCT-5’1735’-TCTGTR’GTTCT-X-TCTTGR’TGTCT-5’1745’-TCRTCRTTG-X-GTTRCTRCT-5’1755’-YYCTGACGTTCTCTGT-X-TGTCTCTTGCAGTCYY-5’</table></tables>X＝甘油接頭；R＝阿糖鳥苷；R＝2’-脫氧-7’-脫氮鳥苷，R’＝1-(2’-脫氧-b-D-呋喃核糖基)-2-氧-7-脫氮-8-甲基-嘌呤；Y＝C3-接頭在另一個方面，本發(fā)明提供了包含至少2個寡核苷酸的免疫刺激核酸，其中該免疫刺激核酸具有二級結(jié)構(gòu)。在該方面，該免疫刺激核酸包含如式(I)詳述的結(jié)構(gòu)。A區(qū)-B區(qū)-C區(qū)(I)區(qū)域的長度可為大約2至大約12個核苷酸。A區(qū)可以是5’-3’或3’-5’或2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNA，它們具有或不具有一個回文區(qū)域或自我互補區(qū)域，該區(qū)域包含或不包含至少一個二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，YpG，YpR，CpR，R*pG和R*pR，其中C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或2’脫氧鳥苷，Y是胞苷、2′-脫氧胸苷、2′-脫氧胞苷、2’雙脫氧-5-鹵代胞苷、2’雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2’-脫氧-2’-取代的阿糖胞苷、2’-O-取代的阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷，其它非天然嘧啶核苷，R*是1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧-7-脫氮-8-甲基-嘌呤；R是鳥苷或2′脫氧鳥苷、2′脫氧-7-脫氮鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2’-脫氧-2’取代的-阿糖鳥苷、2′-O-取代-阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷、或其它非天然嘌呤核苷，而p是選自磷酸二酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯組成的組的核苷間連接。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些實施方案中，A區(qū)將具有一個以上二核苷酸，該二核苷酸選自位于A區(qū)寡核苷酸的5’端的CpG、YpG、YpR、CpR、R*pG和R*pR。B區(qū)是連接A區(qū)和C區(qū)的接頭，其可以是3’-5’連接、2’-5’連接、3’-3’連接，可以是磷酸基團、核苷，或者非核苷接頭，所述非核苷接頭可為脂肪族的、芳香族的、芳基的、環(huán)狀的，手性的、非手性的，可以是肽，碳水化合物、脂類、脂肪酸、單-、三-或六聚乙二醇，或者雜環(huán)部分。C區(qū)可以是5’-3’或3’-5’、2’-5’DNA、RNA、RNA-DNA、DNA-RNAPolyI-PolyC，它們具有或是不具有回文序列或自我互補序列，該序列可具有或不具有二核苷酸，該二核苷酸選自CpG，YqG，YpR，CpR，R*pG和R*pR，其中C是胞苷或2’-脫氧胞苷，G是鳥苷或2’脫氧鳥苷，Y是胞苷、2′-脫氧胸苷、2′-脫氧胞苷、2’雙脫氧-5-鹵代胞苷、2’雙脫氧-5-硝基胞苷、阿糖胞苷、2’-脫氧-2’-取代的阿糖胞苷、2’-O-取代的阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷，其它非天然嘧啶核苷，R*是1-(2′-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧-7-脫氮-8-甲基-嘌呤；R是鳥苷或2′脫氧鳥苷、2′脫氧-7-脫氮鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2’-脫氧-2’取代的-阿糖鳥苷、2′-O-取代-阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷、或其它非天然嘌呤核苷，而p是選自磷酸二酯、硫代磷酸酯和二硫代磷酸酯的核苷間連接。在一些優(yōu)選的實施方案中，所述免疫刺激性二核苷酸不是CpG。在一些實施方案中，B區(qū)優(yōu)選為連接A區(qū)和C區(qū)的寡核苷酸的非-核苷酸接頭，其被稱為“致免疫物”。在一些優(yōu)選實施方案中，C區(qū)不具有二核苷酸CpG，YpG，YpR，CpR，R*pG或R*pR。在一些實施方案中，式(I)中包含的寡核苷酸的長度是大約2至大約50個核苷酸。在一些實施方案中，式(I)中包含的寡核苷酸的長度是大約12至大約26個核苷酸。通過非限制性實施例的方式，在該方面的一些實施方案中，免疫刺激核酸會有如式(II)詳述的結(jié)構(gòu)。該領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，在該分子的3’端有分子內(nèi)莖環(huán)形式的二級結(jié)構(gòu)元件。通過非限制性實施例的方式，在該方面的一些實施方案中，免疫刺激核酸會有如式(III)詳述的結(jié)構(gòu)。式(III)中描述的結(jié)構(gòu)在本文中被稱為“末端二聚體(terminaldimer)”，因為兩個分子的3’端由于兩分子3’端互補允許分子間氫連接結(jié)合而封閉。另外，A區(qū)和A’區(qū)可以相同也可以不相同，B區(qū)和B’區(qū)可以相同也可以不相同，C區(qū)和C’區(qū)可以相同也可以不相同。通過非限制性實施例的方式，在該方面的一些實施方案中，免疫刺激核酸將有如式(IV)詳細(xì)描述的結(jié)構(gòu)。該領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，在所描述的分子的3’端有二級結(jié)構(gòu)，這是由于其3’端的互補序列通過氫連接結(jié)合在這個區(qū)域。在一些實施方案中，分子例如配體可結(jié)合在3’-端以利于細(xì)胞的攝取或改善分子的穩(wěn)定性。本發(fā)明的一些核酸分子的非限制性的實例顯示于表24B-C和25B-C中(參見下文)。在第二個方面，本發(fā)明提供致免疫物結(jié)合物，其包含如上所述的致免疫物和在除可接近的5’末端以外的位置與致免疫物結(jié)合的抗原。在一些實施方案中，非核苷酸接頭包含與寡核苷酸結(jié)合的抗原。在一些其它的實施方案，所述抗原在除其3’末端以外的位置與寡核苷酸結(jié)合。在一些實施方案中，所述抗原產(chǎn)生疫苗效應(yīng)(vaccineeffect)?？乖瓋?yōu)選自與病原體相關(guān)的抗原、與癌癥相關(guān)的抗原、與自身免疫性疾病相關(guān)的抗原和與其它疾病，諸如但不限于，獸醫(yī)的或兒科疾病相關(guān)的抗原，或其中所述抗原是變應(yīng)原。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“與...相關(guān)”的意思是當(dāng)病原體、癌癥、自身免疫性疾病、食物過敏(foodallergy)、皮膚過敏、呼吸過敏(respiratoryallergy)、哮喘或其它疾病存在時，抗原存在，而當(dāng)病原體、癌癥、自身免疫性疾病、食物過敏、皮膚過敏、呼吸過敏或疾病不存在時，抗原也不存在。致免疫物與抗原共價連接，或者它以其它方式與抗原可操作地連接。如本文所使用的，術(shù)語“與...可操作連接”指保持致免疫物和抗原兩者活性的任何連接。所述可操作連接的非限制性實例包括作為同一脂質(zhì)體或者其它所述的運載工具(deliveryvehicle)或試劑的一部分。在實施方案中，其中致免疫物與抗原共價連接，所述共價連接優(yōu)選在致免疫物上除免疫刺激性寡核苷酸的可接近的5′端以外的任何位置。例如，抗原可以附著在核苷間連接上，或連接于非核苷酸接頭?？商鎿Q地，抗原本身可為非核苷酸接頭。在第三個方面，本發(fā)明提供藥物制劑，其包含本發(fā)明的致免疫物或致免疫物結(jié)合物和生理上可接受的載體。如本文所使用的，術(shù)語“生理上可接受的”指不干擾致免疫物的有效性并與生物系統(tǒng)，諸如細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織或生物體相容的物質(zhì)。優(yōu)選地，所述生物系統(tǒng)是活的生物體，如脊椎動物。如在本文中使用的，術(shù)語“載體”包含任何賦形劑、稀釋劑、填充劑、鹽、緩沖液、穩(wěn)定劑、增溶劑、脂質(zhì)或本領(lǐng)域已知用于藥物制劑的其它物質(zhì)?？梢岳斫?，載體、賦形劑或稀釋劑的特性將依賴于具體應(yīng)用的給藥途徑。制備包含這些物質(zhì)的可藥用的制劑在例如，Remington’sPharmaceuticalSciences，18thEdition，ed.A.Gennaro，MackPublishingCo.，Easton，PA，1990中描述。在第四個方面，本發(fā)明提供了用于在脊椎動物中產(chǎn)生免疫應(yīng)答的方法，所述方法包括對脊椎動物施用本發(fā)明的致免疫物或致免疫物結(jié)合物。在一些實施方案中，所述脊椎動物是哺乳動物。為了本發(fā)明的目的，術(shù)語“哺乳動物”清楚地表示包括人。在優(yōu)選的實施方案中，對需要免疫刺激的脊椎動物施用所述致免疫物或致免疫物結(jié)合物。在根據(jù)本發(fā)明的該方面的方法中，致免疫物的給藥可以通過任何合適的途徑，包括，但不限于胃腸外(parenteral)、口服、舌下、經(jīng)皮、局部、鼻內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)(intrperitonal)、皮下、皮內(nèi)、氣溶膠(aerosol)、眼內(nèi)、氣道內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道、通過基因槍、皮膚貼片或滴眼劑或漱口水形式。致免疫物的治療組合物的給藥可以使用已知的方法以有效減輕疾病的癥狀或替換性標(biāo)記的劑量和時間進行。當(dāng)系統(tǒng)地給藥時，所述治療組合物優(yōu)選以足夠劑量給藥以使致免疫物的血濃度(bloodlevel)達到大約0.0001微摩爾至大約10微摩爾。對于局部給藥，遠遠低于此的濃度可為有效的，而高得多的濃度是可以耐受的。優(yōu)選地，致免疫物的總劑量范圍為每位病人每天大約0.001毫克到每公斤體重每天約200毫克。需要同時或順序地將有效量的本發(fā)明的一種或多種治療組合物給予個人作為單個治療階段。在一些優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的致免疫物與疫苗、抗體、細(xì)胞毒素劑、變應(yīng)原、抗生素、反義寡核苷酸、肽、蛋白質(zhì)、基因治療載體、DNA疫苗和/或佐劑聯(lián)合給藥以增強免疫應(yīng)答的特異性或幅度。在這些實施方案中，本發(fā)明的致免疫物可不同地作為佐劑和/或產(chǎn)生直接的免疫刺激作用。致免疫物或疫苗，或兩者，可選地與免疫原性蛋白質(zhì)，如鑰孔血蘭蛋白(keyholelimpethemocyanin)(KLH)、霍亂毒素(choleratoxin)B亞基，或任何其它免疫原的載體蛋白質(zhì)或非免疫原的載體蛋白質(zhì)連接?？墒褂萌魏芜m宜佐劑，其包括，但不限于，弗氏完全佐劑(Freund’scompleteadjuvant)、弗氏不完全佐劑(Freund’sincompleteadjuvant)、KLH、單磷酰脂質(zhì)A(monophosphoryllipidA)(MPL)、明礬(alum)和皂苷(saponins)，其包括QS-21、咪喹莫特(imiquimod)、R848或其組合。Toll-樣受體(TLRs)作為感染的傳感器起作用并誘導(dǎo)固有的和獲得的免疫應(yīng)答的激活。TLRs識別多種被稱為與病原體相關(guān)的分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns)(PAMPs)的配體。一旦識別保守的與病原體有關(guān)的分子產(chǎn)物，TLRs通過它們細(xì)胞內(nèi)的信號域(signallingdomain)，Toll/白介素-1受體(TIR)域，和下游銜接蛋白質(zhì)(adaptorprotein)MyD88來激活宿主防御應(yīng)答(defenseresponse)。樹突細(xì)胞(Dendriticcell)和巨噬細(xì)胞(macrophage)正常地響應(yīng)Toll-樣受體(TLR)配體和細(xì)胞因子(例如，白介素-1；IL-6和腫瘤壞死因子(tumournecrosisfactor)，TNF)，它們也產(chǎn)生這些物質(zhì)；天然殺傷細(xì)胞(naturalkiller(NK)cell)和T細(xì)胞也參與促炎癥回路(pro-inflammatorycircuit)。在通過細(xì)菌化合物的TLR刺激之后，先天免疫細(xì)胞(innateimmunecell)釋放許多(arangeof)細(xì)胞因子。TLR配體的一些實例包括，但不限于，脂蛋白；肽聚糖(peptidoglycan)、酵母聚糖(zymosan)(TLR2)、雙鏈RNA、polyI:polyC(TLR3)、脂多糖(lipopolysaccharide)、熱休克蛋白質(zhì)(heatshockprotein)、紫杉酚(taxol)(TLR4)、鞭毛蛋白質(zhì)(flagellin)(TLR5)和咪唑并喹啉(imidazoquinoline)-R848、瑞喹莫德(resiquimod)、咪喹莫特(imiquimod)；ssRNA(TLR7/8)。為了本發(fā)明的此方面的目的，術(shù)語“與...聯(lián)用”是指在治療相同患者的相同疾病的過程中，并包括以任何順序施用致免疫物和/或疫苗和/或佐劑，所述順序包括同時給藥，以及相隔多至幾天的時間間隔順序。所述聯(lián)用治療也可包括以多于單次的方式給藥致免疫物，和/或獨立地給藥疫苗，和/或獨立地給藥佐劑。致免疫物和/或疫苗和/或佐劑的給藥可通過相同或不同的途徑。根據(jù)本發(fā)明的此方面的方法用于免疫系統(tǒng)的模型研究。所述方法也用于人或動物疾病的預(yù)防或治療處理。例如，所述方法用于兒科和獸醫(yī)疫苗應(yīng)用。在第五個方面，本發(fā)明提供了用于治療患有疾病或病癥的患者的方法，所述方法包括對所述患者施用根據(jù)本發(fā)明的致免疫物或致免疫物結(jié)合物。在不同的實施方案中，待治療的疾病或病癥是癌癥，自身免疫性疾病，氣道炎癥(airwayinflammation)，炎性疾病、過敏、哮喘或由病原體引起的疾病。病原體包括細(xì)菌、寄生蟲、真菌、病毒、類病毒(viroid)和蛋白質(zhì)感染素(prions)。如本發(fā)明的第四方面所述進行給藥。為了本發(fā)明的目的術(shù)語“過敏”包括，但不限于，食物過敏、特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis)、變應(yīng)性鼻炎(allergicrhinitis)(也稱為枯草熱(hayfever))、變應(yīng)性結(jié)膜炎(allergicconjunctivitis)、蕁麻疹(urticaria)(也稱作蕁麻疹(hives))、呼吸過敏和對于其它物質(zhì)如膠乳(latex)、藥物和昆蟲叮咬的過敏性反應(yīng)，或通常由過敏性鼻炎-鼻竇炎(allergicrhinitis-sinusitis)和中耳炎(otitismedia)引起的問題。術(shù)語“氣道炎癥”包括，但不限于哮喘。哮喘的具體實例包括，但不限于，變應(yīng)性哮喘、非變應(yīng)性哮喘、運動誘發(fā)的哮喘(exercised-inducedasthma)、職業(yè)性哮喘(occupationalasthma)和夜發(fā)性哮喘(nocturnalasthma)。變應(yīng)性哮喘的特征在于與過敏反應(yīng)相關(guān)并通過稱為變應(yīng)原的物質(zhì)觸發(fā)的氣道阻塞(airwayobstruction)。變應(yīng)性哮喘的觸發(fā)物(trigger)包括，但不限于，空氣傳播的花粉(airbornepollen)、霉菌(mold)、動物皮屑(animaldander)、屋塵螨(housedustmite)和蟑螂糞(cockroachdropping)。非變應(yīng)性哮喘由病毒感染、某些藥物或空氣中存在的刺激物引起，其使鼻子和氣道惡化(aggravate)。非變應(yīng)性哮喘的觸發(fā)物包括，但不限于，空氣傳播的粒子(例如，煤、粉筆灰)，空氣污染物(例如，煙草煙霧、木頭煙霧)，強烈的氣味或噴霧(例如，香水(perfume)、家庭清潔劑(householdcleaner)、烹飪煙氣(cookingfume)、油漆或清漆(varnish))，病毒感染(例如，感冒、病毒性肺炎(viralpneumonia)、鼻竇炎(sinusitis)、鼻息肉(nasalpolyps))，阿斯匹林敏感性(aspirin-sensitivity)，和胃食管返流疾病(gastroesophagealrefluxdisease)(GERD)。運動誘發(fā)的哮喘(EIA)通過激烈的身體活動觸發(fā)。EIA的癥狀不同程度地發(fā)生在大多數(shù)哮喘患者中，并可能作為運動時呼吸寒冷、干燥的空氣的結(jié)果而被觸發(fā)。EIA的觸發(fā)物包括，但不限于，運動時呼吸空氣傳播的花粉，運動時呼吸空氣污染物，患病毒性呼吸道感染時運動，和在寒冷、干燥的空氣中運動。職業(yè)性哮喘直接與吸入工作場所中存在的刺激物和其它可能有害的物質(zhì)相關(guān)。職業(yè)性哮喘的觸發(fā)物包括，但不限于，煙、化學(xué)品、氣體、樹脂、金屬、塵、蒸汽和殺蟲劑。如在本文中使用的，術(shù)語“自身免疫性疾病”指“自身”蛋白質(zhì)經(jīng)受免疫系統(tǒng)攻擊的疾病。該術(shù)語包括自身免疫性哮喘。不期望受限于任何具體的理論，暴露于細(xì)菌的減少可部分地造成變應(yīng)性疾病，如哮喘、特應(yīng)性皮炎和鼻炎在發(fā)達國家的發(fā)病率、嚴(yán)重性和死亡率增加。此假設(shè)得到細(xì)菌感染或產(chǎn)物能抑制變應(yīng)性疾病在實驗動物模型中的發(fā)展的證據(jù)和臨床研究的支持。在一些序列(CpGDNA)中含有未甲基化的CpG二核苷酸的細(xì)菌DNA或合成的寡脫氧核苷酸有力地刺激先天的免疫應(yīng)答并由此獲得免疫性。對于CpGDNA的免疫應(yīng)答包括先天免疫細(xì)胞的激活、B細(xì)胞的增殖，Th1細(xì)胞因子分泌的誘導(dǎo)，和免疫球蛋白質(zhì)(Ig)的產(chǎn)生。免疫細(xì)胞被CpGDNA激活通過Toll-樣受體9(TLR9)發(fā)生，所述Toll-樣受體9是分子模式識別受體(molecularpatternrecognitionreceptor)。CpGDNAs誘導(dǎo)強的Th1-優(yōu)勢型(dominant)免疫應(yīng)答，其特征在于IL-12和IFN-γ的分泌。致免疫物(IMOs)單獨或作為變應(yīng)原結(jié)合物減少IL-4、IL-5和IgE的產(chǎn)生，并減少變應(yīng)性哮喘的小鼠模型中嗜酸粒細(xì)胞增多。IMO化合物也通過將Th2應(yīng)答轉(zhuǎn)換為Th1應(yīng)答來有效地逆轉(zhuǎn)(reverse)確定的特應(yīng)性嗜酸性粒細(xì)胞的氣道疾病。含明礬的OVA通常用于在各種小鼠和大鼠模型中建立Th2-優(yōu)勢型免疫應(yīng)答。所述Th2免疫應(yīng)答包括增加的IL-4、IL-5和IL-13產(chǎn)生，總的和抗原特異性的IgE，IgG1的血清水平提高，和較低的IgG2a水平。IMO化合物防止并逆轉(zhuǎn)小鼠中確定的Th2-優(yōu)勢型免疫應(yīng)答。IMO化合物及OVA/明礬對于小鼠的聯(lián)合-給藥減少了IL-4、IL-5和IL-13的產(chǎn)生并誘導(dǎo)在經(jīng)過抗原再刺激(antigenre-stimulation)的脾細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生IFN-γ。此外，IMO化合物抑制抗原特異性的以及總的IgE并增加這些小鼠中的IgG2a產(chǎn)生。注射OVA/明礬和IMO化合物在小鼠中誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞抗原-回憶應(yīng)答(antigen-recallresponse)(Th1-型)，所述小鼠的特征在于低水平的與Th2有關(guān)的細(xì)胞因子，IgE和IgG1和高水平的與Th1有關(guān)的細(xì)胞因子和IgG2a。IMO化合物與其它種類抗原，諸如S.masoni卵(egg)和母雞卵溶菌酶的共同給藥(co-administration)在體外和在體內(nèi)研究中也導(dǎo)致將Th2-響應(yīng)逆轉(zhuǎn)為Th1-優(yōu)勢型應(yīng)答。如本文所述，IMO化合物有效地防止了Th2免疫應(yīng)答的發(fā)展并允許強的Th1應(yīng)答。當(dāng)Th2細(xì)胞因子觸發(fā)Ig同種型轉(zhuǎn)換為產(chǎn)生IgE和IgG1時，Th1細(xì)胞因子IFN-γ誘導(dǎo)B-淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IgG2a。用OVA/明礬和IMO化合物注射的小鼠比單獨用OVA/明礬注射的小鼠，產(chǎn)生較低水平的IL-4、IL-5和IL-13和較高水平的IFN-γ，伴有較低的IgE和IgG1和較高的IgG2a水平。這說明在接受抗原和IMO化合物的小鼠中，Th1-細(xì)胞因子誘導(dǎo)和免疫球蛋白質(zhì)同種型轉(zhuǎn)換(isotypeswitch)之間存在緊密的聯(lián)系(closelink)。接受OVA/明礬和IMO化合物的小鼠中的血清抗原-特異性的以及總的IgE水平顯著低于單獨接受OVA/明礬的小鼠中的情況。相比之下，OVA-特異性的IgG1水平與單獨用OVA/明礬注射的小鼠(數(shù)據(jù)未顯示)相比無顯著地變化，而且總IgG1水平與單獨用OVA/明礬注射的小鼠(數(shù)據(jù)未顯示)相比只是輕微地減少。不同的應(yīng)答可由不同參與控制IgE和IgG1類型轉(zhuǎn)換的機制產(chǎn)生，但兩種同種型均受IL-4和IL-13的影響。例如，IL-6在IL-4的存在下促進了B淋巴細(xì)胞合成IgG1。在任何根據(jù)本發(fā)明的方法中，可將致免疫物或致免疫物結(jié)合物與任何其它用于治療疾病或病癥的試劑聯(lián)用給藥，所述的疾病或病癥不減少致免疫物的免疫刺激作用。為了本發(fā)明的此方面的目的，術(shù)語“與...聯(lián)用”是指在治療相同患者的相同疾病的過程中，并包括以任何順序施用致免疫物和試劑，所述順序包括同時給藥，以及任何時間間隔順序，例如從一個緊接著另一個連續(xù)給藥至相隔多達幾天給藥。所述聯(lián)用治療也可包括以多于單次的方式給藥致免疫物，和給藥單獨的試劑。致免疫物和試劑的給藥可通過相同或不同的途徑。在任何根據(jù)本發(fā)明的方法中，用于治療疾病或病癥的試劑包括，但不限于，抗原、變應(yīng)原或共-刺激分子，諸如細(xì)胞因子、趨化因子、蛋白質(zhì)配體、反式作用因子(trans-activatingfactor)、肽和包含經(jīng)修飾的氨基酸的肽。此外，所述試劑可包括編碼抗原或變應(yīng)原的DNA載體。本發(fā)明提供了包含免疫刺激性寡核苷酸和/或致免疫物的試劑盒，所述致免疫物包含連接在一起的至少兩個寡核苷酸，這樣所述致免疫物具有一個以上可接近的5’末端，其中至少一個寡核苷酸是免疫刺激性寡核苷酸。在另一個方面，所述試劑盒包含本發(fā)明的免疫刺激性寡核苷酸和/或免疫刺激性寡核苷酸結(jié)合物和/或致免疫物或致免疫物結(jié)合物及生理上可接受的載體。所述試劑盒也將通常包括一套使用說明。下面的實施例旨在進一步說明本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案，而不意味著限制本發(fā)明大范圍。實施例實施例1合成含有免疫調(diào)節(jié)部分的寡核苷酸使用自動化DNA合成儀(Expedite8909；PerSeptiveBiosystems，F(xiàn)ramingham，MA)，按照圖5和6概述的線性合成或平行合成步驟，以1μmol規(guī)模合成寡核苷酸。由AppliedBiosystems(FosterCity，CA)得到脫氧核糖核苷亞磷酰胺。由GlenResearch(Sterling，VA)得到1’，2’-雙脫氧核糖亞磷酰胺、丙基-1-亞磷酰胺、2脫氧尿苷亞磷酰胺、1，3-雙-[5-(4，4’-二甲氧三苯甲基)戊基酰胺基]-2-丙醇亞磷酰胺和甲基亞磷酰胺。由ChemGenes(Ashland，MA)得到β-L-2’-脫氧核糖核苷亞磷酰胺、α-2’-脫氧核糖核苷亞磷酰胺、單-DMT-甘油亞磷酰胺和二-DMT-甘油亞磷酰胺。由Clontech(PaloAlto，CA)得到(4-氨基丁基)-1，3-丙二醇亞磷酰胺。由ReliablePharmaceutical(St.Louis，MO)得到阿糖胞苷亞磷酰胺、阿糖鳥苷、阿糖胸苷和阿糖尿苷。在Hybridon，Inc.(Cambridge，MA)合成阿糖鳥苷亞磷酰胺、阿糖胸苷亞磷酰胺和阿糖尿苷亞磷酰胺(Noronha等(2000)Biochem.，397050-7062)。通過31P和1HNMR光譜表征所有核苷亞磷酰胺。使用正常的偶聯(lián)循環(huán)在具體的位點摻入經(jīng)修飾的核苷。合成之后，使用濃縮的氫氧化銨使寡核苷酸脫保護并通過反相HPLC純化，然后是透析。使用之前將鈉鹽形式的純化的寡核苷酸凍干(lyophilize)。通過CGE和MALDI-TOFMS檢測純度。實施例2分析脾細(xì)胞增殖使用如前所述的標(biāo)準(zhǔn)步驟進行脾細(xì)胞增殖的體外分析(參見，例如，Zhao等，BiochemPharma51173-182(1996))。結(jié)果顯示在圖8A中。這些結(jié)果說明在較高的濃度，與不具有可接近的5’末端的致免疫物5或具有單一可接近的5’末端的寡核苷酸4相比，具有兩個可接近的5’末端的致免疫物6導(dǎo)致更多的脾細(xì)胞增殖。致免疫物6也產(chǎn)生比LPS陽性對照更多的脾細(xì)胞增殖。實施例3體內(nèi)脾腫大(Splenomegaly)試驗為了測試體外結(jié)果到體內(nèi)模型的可用性，將選擇的寡核苷酸給藥小鼠并測定脾腫大的程度作為免疫刺激活性水平的指標(biāo)。將5mg/kg的單劑量腹膜內(nèi)給藥于BALB/c小鼠(雌性，4-6周齡，HarlanSpragueDawleyInc，Baltic，CT)。寡核苷酸給藥后72小時處死小鼠，收獲脾臟并稱重。結(jié)果顯示于圖8B中。這些結(jié)果說明，具有兩個可接近的5’末端的致免疫物6的免疫刺激作用比寡核苷酸4或致免疫物5大得多。實施例4細(xì)胞因子分析通過夾心ELISA測定IL-12和IL-6在脊椎動物細(xì)胞，優(yōu)選BALB/c小鼠脾細(xì)胞或人PBMC中的分泌。由PharMingen，SanDiego，CA購實所需的試劑，其包括細(xì)胞因子抗體和細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)物。用PBSN緩沖液(PBS/0.05％疊氮化鈉(sodiumazide)，pH9.6)中5μg/mL的適當(dāng)抗體在4℃過夜溫育ELISA平板(Costar)，然后用PBS/1％BSA在37℃封閉30分鐘。用PBS/10％FBS適當(dāng)稀釋細(xì)胞培養(yǎng)物上清和細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)，一式三份加入平板中，并在25℃溫育2小時。用1μg/mL適當(dāng)?shù)纳锼仵；?biotinylated)抗體涂覆平板并在25℃溫育1.5小時。然后用PBS-T緩沖液(PBS/0.05％Tween20)洗滌平板并在加入抗生蛋白質(zhì)鏈菌素結(jié)合的過氧化物酶(streptavidinconjugatedperoxidase)(Sigma，St.Louis，MO)之后進一步在25℃溫育1.5小時。將該平板用SureBlueTM(Kirkegaard和Perry)顯色試劑顯色并通過加入終止溶液(StopSolution)(Kirkegaard和Perry)來終止反應(yīng)。在Ceres900HDISpectrophotometer(Bio-TekInstruments)上測定顏色變化。結(jié)果顯示于下面的表5A中。從健康志愿者的外周血中通過Ficoll-Paque密度梯度離心(Histopaque-1077，Sigma，St.Louis，MO)分離人外周血單核細(xì)胞(Humanperipheralbloodmononuclearcells)(PBMCs)。簡言之，將肝素化血(heparinizedblood)鋪在圓錐離心機中的Histopaque-1077(等體積)上并在400xg在室溫離心30分鐘。小心除去含有單核細(xì)胞的血沉棕黃層(buffycoat)并用等滲的(isotonic)磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)通過在250xg離心10分鐘來洗滌兩遍。然后將得到的細(xì)胞沉淀在含有L-谷氨酰胺(MediaTech，Inc.，Herndon，VA)的RPMI1640培養(yǎng)基中重懸并補加10％熱失活的FCS和青霉素-鏈霉素(100U/ml)。在24孔板中以1×106細(xì)胞/ml/孔，在存在或不存在寡核苷酸的條件將細(xì)胞培養(yǎng)不同的時間。在培育期的末尾，收獲上清液并在-70℃冷凍保存，直到通過夾心ELISA測定不同的細(xì)胞因子，其包括IL-6(BDPharmingen，SanDiego，CA)、IL-10(BDPharmingen)、lL-12(BioSourceInternational，Camarillo，CA)、IFN-α(BioSourceInternational)和-γ(BDPharmingen)和TNF-α(BDPharmingen)。此結(jié)果顯示于下面的表5和5A中。在所有實例中，細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中IL-12和IL-6的水平由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線分別在IL-12和IL-6的相同實驗條件下構(gòu)建。IL-10、IFN-gamma和TNF-α在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的水平由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線分別在IL-10、IFN-gamma和TNF-α的相同實驗條件下構(gòu)建。表5.人PBMC培養(yǎng)物中的致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性D1和D2是供體1和2。表5A.BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中的致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性正體代表硫代磷酸酯連接；斜體代表磷酸二酯連接。此外，圖7A-C所示的結(jié)果說明，濃度低于分別具有一個或零個可接近的5’末端的寡核苷酸1或3時，具有兩個可接近的5’末端的寡核苷酸2使IL-12和IL-6升高，但不使IL-10升高。實施例5鏈長對于致免疫物的免疫刺激活性的影響為了研究寡核苷酸鏈的長度的影響，合成了在每條鏈中含有18、14、11和8個核苷酸的致免疫物并檢測了免疫刺激活性，如通過它們誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL-12和IL-6在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中分泌的能力(表6-8)所測定的。在此和所有后續(xù)的實施例中，如實施例4所述在BALB/c脾細(xì)胞培養(yǎng)物中進行細(xì)胞因子試驗。表6.致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性表7.致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性表8.致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性該結(jié)果顯示，當(dāng)寡核苷酸鏈的長度從18-mers減少到7mers時，致免疫物的免疫刺激活性增加。具有短如6-mers或5mers的寡核苷酸鏈長的致免疫物顯示可與具有單5’末端的18-mer寡核苷酸相當(dāng)?shù)拿庖叽碳せ钚浴Ｈ欢?dāng)接頭的長度為大約2埃至大約200埃時，具有短如6-mers或5mers的寡核苷酸鏈長的致免疫物具有增加的免疫刺激活性。實施例6含有非天然嘧啶或非天然嘌呤核苷的致免疫物的免疫活性如表9-11所示，對于在免疫刺激性二核苷酸基序中具有非天然嘧啶核苷或非天然嘌呤核苷的不同長度的致免疫物而言，免疫刺激活性得以保持。表9.致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性表10.致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性表11.致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性實施例7接頭對于免疫刺激活性的影響為了檢測連接兩個寡核苷酸的接頭的長度的影響，合成了含有同樣寡核苷酸但含有不同接頭的致免疫物并檢測了免疫刺激活性。表12所示的結(jié)果說明，接頭長度在致免疫物的免疫刺激活性中起重要作用。用C3-至C6-烷基接頭或具有散布的磷酸鹽/酯電荷(interspersedphosphatecharge)的無堿基接頭獲得最佳的免疫刺激作用。表12.致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性實施例8寡核苷酸骨架對于免疫刺激活性的影響通常，含有天然磷酸二酯骨架的免疫刺激性寡核苷酸的免疫刺激性比具有硫代磷酸酯骨架的同樣長度的寡核苷酸低。此較低程度的免疫刺激活性可部分歸因于磷酸二酯寡核苷酸在實驗條件下的快速降解。寡核苷酸的降解主要是3′-外切核酸酶(3′-exonuclease)的結(jié)果，所述酶從3’末端消化寡核苷酸。此實施例的致免疫物不包含自由的3’末端。因此，具有磷酸二酯骨架的致免疫物在實驗條件下應(yīng)具有比對應(yīng)的單體寡核苷酸更長的半衰期(halflife)，并由此應(yīng)顯示改進的免疫刺激活性。表13中顯示的結(jié)果說明了此影響，其中通過BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞因子誘導(dǎo)測定，致免疫物84和85顯示免疫刺激活性。表13.致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性L＝C3-接頭實施例9致免疫物73-92的合成使用自動化DNA合成儀(Expedite8909；PerSeptiveBiosystems，F(xiàn)ramingham，MA)，以1μmol規(guī)模合成寡核苷酸。由AppliedBiosystems(FosterCity，CA)得到脫氧核苷亞磷酰胺。由GlenResearch(Sterling，Virginia)得到7-脫氮-2’-脫氧鳥苷亞磷酰胺。由ChemGenes(Ashland，MA)得到1，3-雙-DMT-甘油-CPG。使用正常的偶聯(lián)循環(huán)在具體的位點摻入修飾的核苷。合成之后，使用濃縮的氫氧化銨使寡核苷酸脫保護并通過反相HPLC純化，然后是透析。使用之前將鈉鹽形式的純化的寡核苷酸凍干。通過CGE和MALDI-TOFMS(BrukerPronexIIIMALDI-TOF質(zhì)譜儀)檢測寡核苷酸的純度。實施例10致免疫物穩(wěn)定性將寡核苷酸在含有10％牛血清的PBS中在37℃溫育4、24或48hours。通過毛細(xì)管凝膠電泳測定完整的寡核苷酸。結(jié)果在表14中顯示。表14.10％牛血清PBS溶液中消化寡核苷酸X＝C3-接頭，U，C＝2’-OMe-核糖核苷實施例11可接近的5’末端對于免疫刺激活性的影響在RPMI完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)BALB/c小鼠(4-8周)脾細(xì)胞。在補加10％(v/v)FCS和抗生素(100IU/mL的氨芐青霉素G/鏈霉素)的達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養(yǎng)基(Dulbecco’smoddiedEagle’smedium)中培養(yǎng)鼠科巨噬細(xì)胞-樣細(xì)胞J774(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTypeCultureCollection)，Rockville，MD)。所有其它培養(yǎng)試劑購自Mediatech(Gaithersburg，MD)。對于IL-12和IL-6進行ELISA。在24-孔盤中將BALB/c小鼠脾或J774細(xì)胞分別以5×106或1×106細(xì)胞/mL的密度鋪板。將溶于TE緩沖液(10mMTris-HCl，pH7.5，1mMEDTA)的IMO化合物以0.03、0.1、0.3、1.0、3.0或10.0μg/mL的終濃度加入小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物，并以1.0、3.0或10.0μg/mL的終濃度加入J774細(xì)胞培養(yǎng)物。然后將細(xì)胞在37℃溫育24hr并收集上清液用于ELISA試驗。對于每種濃度一式三份的每種IMO化合物進行兩次或三次實驗。通過夾心ELISA測定IL-12和IL-6的分泌。所需的試劑，包括細(xì)胞因子抗體和標(biāo)準(zhǔn)物購自PharMingen。用5μg/mL在PBSN緩沖液(PBS/0.05％疊氮化鈉，pH9.6)中適當(dāng)?shù)目贵w在4℃過夜溫育ELISA板(Costar)，然后用PBS/1％BSA在37℃封閉30分鐘。用PBS/1％BSA適當(dāng)?shù)叵♂尲?xì)胞培養(yǎng)物上清液和細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)物，一式三份加入平板，并在25℃溫育2hr。洗滌平板并用1μg/mL適當(dāng)?shù)纳锼仵；目贵w溫育并25℃溫育1.5hr。用PBS/0.05％Tween20徹底洗滌平板，在加入抗生蛋白質(zhì)鏈菌素(streptavidine)-結(jié)合的過氧化物酶(Sigma)之后進一步在25℃溫育1.5hr。用SureBlueTM(Kirkegaard和Perry)顯色試劑將平板顯色，并通過加入StopSolution(Kirkegaard和Perry)來終止反應(yīng)。在Ceres900HDI分光光度計(Bio-TekInstruments)上在450nm測定顏色變化。由標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IL-12和IL-6在細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中的水平，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是在相同實驗條件下分別對于IL-12和IL-6構(gòu)建的。結(jié)果顯示于表15中。表15本研究中使用的硫代磷酸酯CpGDNA序列和修飾aa參見圖示I的化學(xué)結(jié)構(gòu)b-l；5’-CG-3’二核苷酸顯示為加下劃線圖示1表16.通過CpGDNA-結(jié)合物在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)IL-12和IL-6分泌a參見表1的序列?？傊壳暗慕Y(jié)果顯示，CpGDNA的可接近的5’-端是最佳的免疫刺激活性所需的，而且較小的基團如硫代磷酸酯、單核苷酸或二核苷酸不有效地封閉CpGDNA的5’-端對于涉及免疫刺激途徑的受體或因子的可接近性。然而，和熒光素一樣大或更大的分子在CpGDNA的5’-端的結(jié)合可去消免疫刺激活性。這些結(jié)果對于CpGDNA-抗原/疫苗/單克隆抗體(mAb)結(jié)合物的免疫刺激活性的研究具有直接影響。大分子如疫苗或mAbs在CpGDNA的5’-端的結(jié)合可導(dǎo)致CpGDNA的亞最佳(suboptimal)免疫刺激活性。功能配體在CpGDNA的3’-端的結(jié)合不僅有助于增加核酸酶穩(wěn)定性，而且有助于在體內(nèi)增加CpGDNA的免疫刺激效力(potency)。實施例12接頭對于細(xì)胞因子分泌的影響為此研究合成了如下的寡核苷酸。能將這些修飾的寡核苷酸中的每個摻入致免疫物。表17-顯示取代位置的CpGDNA的序列a參見圖14取代1-9的化學(xué)結(jié)構(gòu)。所有CpGDNAs為硫代磷酸酯骨架修飾的。為了評價用于增強免疫刺激活性的最佳接頭大小，測定了BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中由修飾的CpGDNAs誘導(dǎo)的IL-12和IL-6分泌。所有CpGDNAs誘導(dǎo)濃度依賴性IL-12和IL-6分泌。圖15顯示利用1μg/mL濃度的所選CpGDNAs，116，119，126，130，和134得到的數(shù)據(jù)，所述的CpGDNA與親代CpGDNA相比在CpG二核苷酸的5’-側(cè)翼序列中第5個核苷酸位置具有接頭。所述CpGDNAs，其含有C2-(1)，C3-(2)，和C4-接頭(3)，誘導(dǎo)與親代CpGDNA4類似的產(chǎn)生IL-12的分泌。在CpG二核苷酸的5’-側(cè)翼序列中第5個核苷酸位置含有C6和C9-接頭(4和5)的CpGDNA，誘導(dǎo)比親代CpG更低水平的IL-12分泌(圖15)，這說明取代長于C4-接頭的接頭導(dǎo)致較低水平的IL-12的誘導(dǎo)。所有五種具有接頭的CpGDNAs誘導(dǎo)的IL-6分泌比親代CpGDNA高兩到三倍。這些CpGDNAs中接頭的存在相對于不具有接頭的CpGDNAs顯示對于誘導(dǎo)IL-6的顯著作用。然而，我們未觀察到對于IL-6分泌的長度-依賴性的接頭作用。為了研究含有乙二醇-接頭的CpGDNA對于免疫刺激活性的影響，我們合成了CpGDNAs137和138，其中分別將三甘醇(triethyleneglycol)-接頭(6)摻入CpG二核苷酸的5’-側(cè)翼序列中第5個核苷酸位置和CpG二核苷酸的3’-側(cè)翼序列中第4個核苷酸位置。類似地，CpGDNAs139和140分別包含摻入CpG二核苷酸的5’-或3’-側(cè)翼序列的六乙烯乙二醇-接頭(hexaethyleneglycol-linker)(7)(137-140)與親代CpGDNA4相比，在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中測試。所有四種修飾的CpGDNAs對細(xì)胞因子(IL-12、IL-6和IL-10)的誘導(dǎo)。所有CpGDNAs在檢測的濃度范圍(0.03-10.0μg/mL)誘導(dǎo)濃度-依賴性細(xì)胞因子產(chǎn)生(數(shù)據(jù)未顯示)。濃度為0.3μg/mL的CpGDNAs137-140所誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的水平顯示于表18。在5’-側(cè)翼序列中具有乙二醇-接頭的CpGDNAs137和139，比親代CpGDNA4誘導(dǎo)更高水平的IL-12(2106±143和2066±153pg/mL)和IL-6(2362±166和2507±66pg/mL)分泌(表18)。在相同濃度，137和139比親代CpGDNA誘導(dǎo)稍低水平的IL-10分泌(表18)。在3’-側(cè)翼序列中具有較短乙二醇-接頭(6)的CpGDNA138，誘導(dǎo)與親代CpGDNA類似的IL-12分泌，但其誘導(dǎo)的IL-6和IL-10的水平顯著較低(表18)。具有較長乙二醇-接頭(7)的CpGDNA140與親代CpGDNA相比，誘導(dǎo)顯著較低水平的全部三種受試細(xì)胞因子(表18)。雖然三甘醇-接頭(6)具有類似于C9-接頭(5)的鏈長，但含有三甘醇-接頭的CpGDNA比含有C9-接頭的CpGDNA具有更好的免疫刺激活性，如通過在脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌所測定的那樣。這些結(jié)果表明以含有較長烷基-接頭(4和5)的CpGDNA觀察到的較低的免疫刺激活性可與它們的長度增加無關(guān)，但與它們的疏水特性有關(guān)。此觀察促使我們研究含有親水官能團的分支的烷基-接頭的取代對于免疫刺激活性的影響。表18.由BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中含有乙二醇-接頭的CpGDNAs誘導(dǎo)的細(xì)胞因子分泌。為了測試含有分支的烷基-接頭的CpGDNA對于免疫刺激活性的影響，、將包含羥基(8)或胺(9)官能團的兩種分支的烷基接頭摻入親代CpGDNA4中并測定所得經(jīng)修飾的CpGDNAs對于免疫刺激活性的影響(150-154-表19)。用在不同核苷酸位置含有氨基-接頭9的CpGDNAs150-154在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物(增殖)和體內(nèi)(脾大(splenomegaly))得到的數(shù)據(jù)顯示于表19中。表19.含有氨基丁酰(aminobutyryl)丙二醇-接頭的CpGDNA誘導(dǎo)BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中的脾細(xì)胞增殖和BALB/c小鼠中的脾大。親代CpGDNA4在0.1μg/mL的濃度顯示3.7±0.8的增殖指數(shù)(proliferationindex)。在相同濃度，在不同位置含有氨基-接頭9的修飾的CpGDNAs151-154與親代CpGDNA相比引起更高的脾細(xì)胞增殖(表19)。如用其它接頭所觀察的，當(dāng)取代發(fā)生在CpG二核苷酸(150)附近時，與親代CpGDNA相比顯示了較低的增殖指數(shù)(表19)，這進一步證實了將接頭取代放置于CpG二核苷酸附近對于免疫刺激活性具有有害影響(detrimentaleffect)。通常，5’-側(cè)翼序列(151和152)中用2’-脫氧核糖核苷的氨基-接頭的取代比3’-側(cè)翼序列(153和154)中的所述取代產(chǎn)生更高的脾細(xì)胞增殖。在脾大試驗中觀察到類似的結(jié)果(表19)，這證實了在脾細(xì)胞培養(yǎng)物中觀察到的結(jié)果。含有甘油-接頭(8)的經(jīng)修飾CpGDNA顯示的免疫刺激活性類似于或稍高于對于含有氨基-接頭(9)的經(jīng)修飾CpGDNA所觀察到的活性(數(shù)據(jù)未顯示)。為了比較含有接頭8和9的CpGDNA的免疫刺激作用，我們選擇了在5’-側(cè)翼序列具有取代的CpGDNA145和152，并測定了它們在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)細(xì)胞因子IL-12和IL-6分泌的能力。CpGDNAs145和152兩者都誘導(dǎo)濃度-依賴的細(xì)胞因子分泌。圖4顯示與親代CpGDNA4相比，在小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中通過145和152以0.3μg/mL濃度誘導(dǎo)的IL-12和IL-6的水平。兩種CpGDNAs比親代CpGDNA4誘導(dǎo)更高水平的IL-12和IL-6。含有甘油-接頭(8)的CpGDNA比含有氨基-接頭(9)的CpGDNA誘導(dǎo)稍高水平的細(xì)胞因子(尤其是IL-12)(圖16)。這些結(jié)果進一步證實含有親水基團的接頭對于CpGDNA的免疫刺激活性更有利。我們研究了CpGDNA中多接頭取代的兩個不同方面。在一組實驗中，我們將核苷酸序列的長度保持為13-mer，并將一種在5’-端摻入五個C3-接頭(2)取代(120-124)。這些修飾的CpGDNAs允許我們研究接頭長度增加的影響，而不導(dǎo)致溶解度問題。在第二組實驗中，我們在CpG二核苷酸的5’-側(cè)翼序列中的相鄰位置摻入兩個相同的接頭取代(3、4或5)，以研究是否對于免疫刺激活性會有任何附加的效果。與親代CpGDNA4相比，研究修飾的CpGDNAs誘導(dǎo)BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中的細(xì)胞因子產(chǎn)生的能力。所有CpGDNAs誘導(dǎo)濃度-依賴的細(xì)胞因子產(chǎn)生。以1.0μg/mL濃度的CpGDNAs得到的數(shù)據(jù)顯示于表20。在此試驗中，親代CpGDNA4以1μg/mL的濃度誘導(dǎo)967±28pg/mL的IL-12、1593±94pg/mL的IL-6和14±6pg/mL的IL-10分泌。表20中提供的數(shù)據(jù)顯示，隨著接頭取代數(shù)目的減少IL-12誘導(dǎo)減少。然而，通過CpGDNAs123和124誘導(dǎo)較低水平的IL-12分泌可為長度較短的CpGDNAs的結(jié)果。我們對短于15-核苷酸的未修飾的CpGDNA的研究顯示不顯著的免疫刺激活性(數(shù)據(jù)未顯示)。長度或接頭取代數(shù)目都不對IL-6分泌具有更小的影響。雖然IL-10分泌隨接頭取代增加，但這些CpGDNAs的總IL-10分泌是最少的。對于在CpG二核苷酸的5’-側(cè)翼序列的第四個和第五個位置含有兩個接頭取代(接頭3-127；接頭-4-131；接頭-5-135)的CpGDNAs和相應(yīng)的5’-截斷變體(version)128，132和136，測定它們在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌的能力。以1.0μg/mL濃度分泌的IL-12和IL-6的水平顯示于圖17。圖17提供的結(jié)果顯示，免疫刺激活性取決于摻入的接頭的性質(zhì)。用C4-接頭3(CpGDNA127)取代第四個和第五個核苷與親代CpGDNA4相比對于細(xì)胞因子分泌具有不顯著的作用，這說明在這些位置的核堿基和糖環(huán)(sugarring)對于受體識別和/或結(jié)合不是必需的。接頭取代以外的核苷酸缺失(CpGDNA128)產(chǎn)生的IL-12和IL-6分泌比用CpGDNAs4和127得到的更高。正如所料，兩個C6-接頭(4)的取代導(dǎo)致IL-12分泌低于通過親代CpGDNA4誘導(dǎo)的水平，而IL-6分泌與通過親代CpGDNA4誘導(dǎo)的水平類似。5’-截短的CpGDNA132誘導(dǎo)比利用CpGDNA131時更高的細(xì)胞因子分泌。具有兩個C9-接頭(5)的CpGDNAs135和136誘導(dǎo)不顯著的細(xì)胞因子分泌，這證實了以含有與上述相同的接頭的單-取代CpGDNA獲得的結(jié)果。實施例13磷酸二酯連接對于細(xì)胞因子誘導(dǎo)的影響為了測定磷酸二酯連接對于致免疫物-誘導(dǎo)的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的影響，合成了如下分子。表21PO-致免疫物序列和分析數(shù)據(jù)a箭頭在每個DNA分子中表示CpG二核苷酸的5’-3’方向性，X和Y的結(jié)構(gòu)在方框中顯示。b分別代表硫代磷酸酯和磷酸二酯骨架。c如通過MALDI-TOF質(zhì)譜所測定的。以PO-CpGDNA155作為對照發(fā)現(xiàn)PS-CpGDNA4(表21)在小鼠中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答(數(shù)據(jù)未顯示)。PO-致免疫物156和157每個包含兩個相同的、截斷的親代CpGDNA155的拷貝，其通過它們的3’-端經(jīng)甘油基接頭X(表21)連接。雖然156和157每個包含相同的14個堿基的寡核苷酸區(qū)段，但157的5’-端通過加入兩個C3-接頭Y(表21)來修飾。所有寡核苷酸4、155-157包含已知可激活小鼠免疫系統(tǒng)的′GACGTT′六聚體基序(hexamericmotif)。PO-致免疫物抗核酸酶的穩(wěn)定性通過在含有10％胎牛血清(FBS)(非-熱-失活)的細(xì)胞培養(yǎng)基中在37℃將CpGDNAs4、155-157培養(yǎng)4、24和48小時來進行評估。然后通過CGE測定反應(yīng)混合物中殘留的完整CpGDNA。圖18A-D顯示在10％FBS保溫24hr的CpGDNAs4、155-157的核酸酶消化圖譜(digestionprofile)。在每個時間點殘留的全-長CpGDNA的量顯示于圖18E中。正如所料，親代PS-CpGDNA4對于血清核酸酶是最有抗性的。大約55％的18-mer4在48hr保溫后保持不降解。與此相反，在相同實驗條件下在4hr后只剩余大約5％的全-長PO-致免疫物155，這證實了含有磷酸二酯連接的DNA經(jīng)過了快速降解。正如所料，PO-致免疫物156和157對于血清核酸酶的抗性都高于155的所述抗性。4hr后，大約62％的156和73％的157是完整的，與此相比大約5％的155是完整的(圖18E)。甚至48hr之后，分別大約23％的156和37％的157保持不降解。也顯示3’-3’-連接的PO-致免疫物對于血清核酸酶更穩(wěn)定，這些研究表明在5’-端的化學(xué)修飾可進一步增加核酸酶穩(wěn)定性。在BALB/c和C3H/HeJ小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中，通過測定分泌的細(xì)胞因子IL-12和IL-6的水平來研究CpGDNAs的免疫刺激活性。所有CpGDNAs在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)濃度-依賴性的細(xì)胞因子分泌(圖19)。在3μg/mL時，PS-CpGDNA4分別誘導(dǎo)2656±256和12234±1180pg/mL的IL-12和IL-6。除了在10μg/mL的濃度，親代PO-CpGDNA155不將細(xì)胞因子水平提高到背景之上。此觀察與核酸酶穩(wěn)定性試驗的結(jié)果一致。與此相反，PO-致免疫物156和157在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)IL-12和IL-6兩者分泌。圖19中提供的結(jié)果顯示PS-和PO-CpGDNAs的細(xì)胞因子誘導(dǎo)譜中的清楚的區(qū)別。與PS-CpGDNA4相比，PO-致免疫物156和157在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)更高水平的IL-12(圖19A)。相比之下，在濃度高達3μg/mL時，它們產(chǎn)生可忽略量的IL-6(圖19B)。甚至在最高濃度(10μg/mL)，PO-致免疫物156誘導(dǎo)的IL-6顯著少于PS-CpGDNA4的情況。C3接頭在PO-致免疫物157的5’-末端的存在與156相比導(dǎo)致稍高水平的IL-6分泌。然而，重要地，由PO-致免疫物157產(chǎn)生的IL-6的水平比由PSCpGDNA4誘導(dǎo)的水平低得多。圖19A的插頁(inset)顯示以3μg/mL濃度分泌時IL-12對IL-6的比例。除了增加IL-12分泌，與PS-CpGDNA4相比，PO-致免疫物156和157在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)更高水平的IFN-γ(數(shù)據(jù)未顯示)。BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中由PO-和PS-CpGDNAs誘導(dǎo)的不同的細(xì)胞因子圖譜促使我們研究C3H/HeJ小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物(LPS較低-應(yīng)答株)中CpGDNAs的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的模式。在此試驗中測試的所有三種CpGDNAs誘導(dǎo)濃度-依賴性的細(xì)胞因子分泌(圖20A和B)。由于PO-CpGDNA155不能在BALB/c小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌，就沒有進一步在C3H/HeJ脾細(xì)胞培養(yǎng)物中測試它。PO-致免疫物156和157與PSCpGDNA4相比都誘導(dǎo)更高的IL-12生產(chǎn)(圖20A)。然而，在濃度高達3μg/mL時，它們都不誘導(dǎo)IL-6生產(chǎn)。在測試的最高濃度(10μg/mL)，它們誘導(dǎo)的IL-6都顯著少于PS-CpGDNA4的情況(圖20B)。計算分泌的IL-12對IL-6的比例以區(qū)分PS和POCpGDNAs的細(xì)胞因子分泌圖譜(圖20A插頁)。此外，C3H/HeJ脾細(xì)胞培養(yǎng)物結(jié)果顯示，以CpGDNAs觀察到的應(yīng)答不是因為LPS污染(contamination)。已顯示PS-CpGDNAs在體內(nèi)誘導(dǎo)強抗癌活性。由于PO-CpGDNAs在體外試驗中顯示更高的核酸酶穩(wěn)定性并誘導(dǎo)更高水平的IL-12和IFN-γ分泌，我們想要查看PO-致免疫物的這些所需性質(zhì)是否改進體內(nèi)抗癌活性。我們對裸鼠以每隔一天0.5mg/kg的劑量皮下給藥PO-致免疫物157，所述裸鼠含有表達野生型p53的MCF-7乳腺癌(breastcancer)細(xì)胞，或表達突變p53的DU-145前列腺癌細(xì)胞的腫瘤異種移植物(tumorxenograft)。與鹽水對照(salinecontrol)相比，PO-致免疫物157在第15天導(dǎo)致MCF-7腫瘤的57％生長抑制(圖21A)。它也在第34天產(chǎn)生DU-145腫瘤的52％生長抑制(圖21B)。這些抗腫瘤研究顯示建議設(shè)計的PO-致免疫物在體內(nèi)顯示強抗腫瘤活性。實施例14短致免疫物為了測試短致免疫物對于細(xì)胞因子誘導(dǎo)的作用，使用了如下致免疫物。這些結(jié)果顯示短如每個區(qū)段5個核苷酸的致免疫物在誘導(dǎo)細(xì)胞因子產(chǎn)生中是有效的。表22.BABL/C小鼠脾細(xì)胞培養(yǎng)物中的致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性正體代表硫代磷酸酯連接。實施例15人B細(xì)胞和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞(plasmacytoiddendriticcell)(pDCs)的分離。將來自新鮮抽取的健康志愿者血液的PBMCs(CBRLaboratories，Boston，MA)通過Ficoll密度梯度離心方法(Histopaque-1077，Sigma)進行分離，并從PBMCs中通過陽性選擇，根據(jù)制造商的說明使用CD19細(xì)胞分離試劑盒(MiltenyiBiotec)來分離B細(xì)胞。實施例16B細(xì)胞增殖試驗用0.3、1.0、3.0或10.0μg/mL濃度的CpGDNAs刺激總共1×105B細(xì)胞/200μl64hr，然后用0.75μCi的[3H]-胸苷脈沖(pulse)并在8h以后收獲。使用液體閃爍計數(shù)器(liquidscintillationcounter)測定放射性的摻入。表23顯示在終濃度10.0μg/mL的6CpGDNAs的B細(xì)胞增殖平均值±SD。表23.人B-細(xì)胞增殖試驗中的致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性(72hs)正體代表硫代磷酸酯連接；下劃線代表2’-OMe核糖核苷酸；斜體代表磷酸二酯連接。實施例17人pDC培養(yǎng)物和IFN-αELISA。根據(jù)制造商的說明使用BDCA-4細(xì)胞分離試劑盒(MiltenyiBiotec)，從人PBMCs中分離pDCs。使用1×106細(xì)胞/mL，200μL/孔將pDC鋪于96-孔平板。將終濃度為0.3、1.0、3.0或10.0μg/mL的CpGDNAs加入細(xì)胞培養(yǎng)物并在37℃保溫24hr。然后收獲上清液并使用人IFN-aELISA試劑盒(PBL)分析IFN-α。表24A-24C顯示在1.0和10.0μg/mL的濃度條件下，6CpGDNAs的IFN-α平均值±SD。表24A.人樹突細(xì)胞試驗中的致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性(72hs)表24B.人樹突細(xì)胞試驗中的致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性(24hs)表24C.人樹突細(xì)胞試驗中的致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性(24hs)實施例18如上面在實施例4中討論的從健康志愿者的外周血中分離并制備人外周血單核細(xì)胞(Humanperipheralbloodmononuclearcell)(PBMCs)。表25A-25C顯示在10.0μg/mL的濃度條件下，5IMO化合物的IL-6、L-12和IL-γ的平均值±SD。表25A.人PBMC試驗中的致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性(72hs)表25B.人PBMC試驗中的致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性(24hs)表25C.人PBMC試驗中的致免疫物結(jié)構(gòu)和免疫刺激活性(24hs)單獨地對表23、24A-24C和25A-25C來說正體代表硫代磷酸酯連接；下劃線代表2’-OMe核糖核苷酸；斜體代表磷酸二酯連接，而且R、R1、X和X1定義如下實施例19脾細(xì)胞研究由Taconic農(nóng)場(Germantown，NY)得到5-6周齡的雌性BALB/c小鼠并保持無-OVA的飲食。將五只小鼠的組用于免疫研究。如上所述合成、純化和分析IMO化合物(圖22)。將每只小鼠通過在第0和14天皮下(s.c.)注射與等體積明礬溶液(Imject-Alum，Pierce，Rockford，IL)混合的100-μlPBS中的10-μg雞卵清蛋白質(zhì)(chickenovalbumin)(OVA；V級，Sigma，St.Louis，MO)來致敏，并用40-μlPBS中的20-μgOVA在第28、29和30天進行鼻內(nèi)(i.n.)攻擊(challenge)(圖2)。在第33、37、40和43天將溶于200μlPBS的IMOs1和2(30或60μg)皮下注射入小鼠。在第33天通過眶后穿刺(retro-orbitalpuncture)首次注射IMO化合物2h后收集來自麻醉中的小鼠的血樣，并收獲血清用于細(xì)胞因子試驗。在第44天用40-μlPBS中的10-μgOVA鼻內(nèi)攻擊每只小鼠。使小鼠出血并在最后的OVA攻擊24h后移除肺和脾。在冷的RPMI1640培養(yǎng)基(Sigma)中制備單個脾-細(xì)胞的懸浮液并對于每個實驗組以5×106細(xì)胞/ml收集到含有10％FCS(HyClone，Logan，UT)和100-μg/ml青霉素和100-U/ml鏈霉素(HyClone)的RPMI1640培養(yǎng)基中。將脾細(xì)胞(0.2ml/孔)在96-孔平底培養(yǎng)平板(Costar，Cambridge，MA)中在100-μg/mlOVA存在的條件下，在37℃在5％CO2氣氛中培養(yǎng)。72-h培養(yǎng)后，收獲培養(yǎng)上清液用于細(xì)胞因子試驗。通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)用來自BDBiosciences(SanDiego，CA)的小鼠抗體測定IL-5、IL-10、IL-12和IFN-γ的水平。根據(jù)制造商的說明，用小鼠DuoSetELISA試劑盒(R&amp;DSystem，Minneapolis，MN)評估IL-6和IL-13的水平。通過ELISA在小鼠血清中評價OVA-特異性的以及總的IgE和IgG2a的水平。對于OVA-特異性的Ig檢測，用PBS，pH9.6中的10-μg/mlOVA涂覆96-孔ELISA平板(Immulon2；Dynatech，Chantilly，VA)。對于總Ig檢測，用1-μg/ml抗-小鼠IgE(克隆R35-72)和1-μg/ml抗-小鼠IgG2a(克隆R11-89)涂覆平板。在4℃培養(yǎng)過夜之后，用1％BSA/PBS，pH7-4在室溫封閉平板1h。將連續(xù)稀釋的血清(對于IgE為1∶10，對于IgG2a為1∶100)加入平板，并在室溫培養(yǎng)2h。洗滌平板并將100μl/孔的生物素酰化的抗-小鼠IgE(克隆R35-116)以0.25μg/ml，或IgG2a(克隆R19-15)以0.25μg/ml加入平板，并在室溫保溫2h。所有抗體都從BDBiosciences獲得。洗滌平板并加入100μl/孔的0.25-μg/ml抗生蛋白質(zhì)鏈菌素-過氧化物酶(Sigma)在室溫保溫1-h。試驗在100μl/孔的TMBSubstrateSolution(KPL，Gaithersburg，MD)中顯色，然后加入100μl/孔的StopSolution(KPL)。使用繪圖酶標(biāo)儀(microplatereader)(Bio-TekInstruments，Inc.Winooski，VT)測定A450(與OD450一樣？)，并用KCJunior軟件(HighPoint，NC)分析數(shù)據(jù)(參見圖24)。實施例20肺組織學(xué)將在第45天移除的肺在中性福爾馬林中固定并送到MassHistologyService(Warwick，RI)用于加工以及蘇木精與伊紅(hematoxylin&amp;eosin)(HE)和過碘酸-希夫(periodicacidSchiff)(PAS)染色。在光顯微鏡下觀察肺組織切片并用數(shù)碼相機拍照。使用方差分析(ANOVA)進行統(tǒng)計學(xué)分析。使用Student氏t檢驗(Student’st-test)比較OVA-免疫的和IMO-處理的組。結(jié)果表示為平均數(shù)±SEM。所有比較是雙尾的(twotailed)而且統(tǒng)計顯著性(statisticalsignificance)顯示為*p＜0.05。實施例21預(yù)防模型的研究。檢測了IMO化合物在小鼠中防止OVA-誘導(dǎo)的變應(yīng)性炎癥的能力。將每只小鼠在第0、7和14天通過皮下(s.c.)注射與等體積明礬溶液(Imject-Alum，Pierce，Rockford，IL)混合的100-μlPBS中的20-μg雞卵清蛋白質(zhì)(OVA；V級，Sigma，St.Louis，MO)來致敏。初次接受試驗組(navegroup)的小鼠只接受明礬注射。將溶于OVA/明礬混合物的IMO化合物(10μg)在第0、7和14天給藥小鼠。最后免疫14之后，將以異氟烷(isoflurane)(AbbottLaboratories，NorthChicago，IL)麻醉的小鼠通過眶后穿刺放血，然后處死以移除脾。實施例22在抗原-特異性回憶免疫應(yīng)答中IMO化合物對于Th2細(xì)胞因子、IL-4、IL-5、IL-12和IL-13的抑制的影響。為了測定IMO化合物在用OVA/明礬注射的小鼠中改變Th2-優(yōu)勢免疫應(yīng)答的能力，在第0和14天注射IMO化合物連同OVA/明礬。在第28天從小鼠中分離脾細(xì)胞并與OVA保溫72hrs(抗原回憶)。來自用OVA/明礬注射的小鼠的脾細(xì)胞與首次接受實驗的小鼠相比，只產(chǎn)生更高水平的與Th2相關(guān)的細(xì)胞因子，諸如IL-4(～2-倍)、IL-5(130-倍)和IL-13(28-倍)(參見圖23A和23B)。來自接受CpGDNA或IMO化合物和OVA的小鼠的脾細(xì)胞分泌顯著較少的這些細(xì)胞因子，尤其是IL-5和IL-13；IL-5減少20％至97％而IL-13減少60％至95％。這些結(jié)果顯示IMO化合物對于與Th2有關(guān)的細(xì)胞因子分泌具有抑制作用。實施例23IMO化合物在抗原-特異性回憶免疫應(yīng)答中對于IFN-γ產(chǎn)生的影響。在同樣的抗原-回憶實驗中，來自用OVA/明礬和IMO化合物注射的小鼠的脾細(xì)胞與來自首次接受實驗的或OVA/明礬-注射的小鼠的細(xì)胞相比產(chǎn)生顯著較高水平的Th1細(xì)胞因子IFN-γ(參見圖23A和23B)。來自用OVA/明礬和常規(guī)CpGDNA1注射的小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ水平可與由初始脾細(xì)胞產(chǎn)生的所述水平相當(dāng)。這些結(jié)果說明，用IMO化合物處理OVA/明礬-注射的小鼠可將免疫應(yīng)答從Th2-優(yōu)勢的改變?yōu)橹饕獮門h1型，如通過由脾細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子所反映的。實施例24IMO化合物對于OVA-特異的和總的IgE產(chǎn)生的影響。為了評價IMO化合物對于IgE產(chǎn)生的影響，檢測了最后的OVA/明礬注射14天后OVA-特異的和總的IgE的血清水平。用OVA/明礬的致敏導(dǎo)致小鼠中OVA-特異性IgE的高水平產(chǎn)生；OVA-特異性的IgE水平的水平顯著低于(可與在首次接受實驗的小鼠中存在的水平相比較)接受IMO化合物連同OVA/明礬的小鼠中的水平(參見圖24A和24B)。在用OVA/明礬和IMO化合物注射的小鼠中總血清IgE水平也是低的。實施例25IMO化合物對于OVA-特異的和總的IgG1和IgG2a產(chǎn)生的影響為了評價IMO化合物對于IgG1和IgG2a產(chǎn)生的影響，檢測了OVA-特異的和總的IgG1和IgG2a的血清水平。接受OVA/明礬注射的動物產(chǎn)生高水平OVA-特異性的IgG1和不顯著水平的OVA-特異性的IgG2a(參見圖24A和24B)。與OVA/明礬-注射的小鼠中存在的水平相比，對小鼠注射IMO化合物不影響或降低OVA-特異性的IgG1水平。在接受IMO化合物的小鼠血清中，OVA-特異性的IgG2a抗體水平顯著高于在那些只接受OVA/明礬的小鼠中的水平。在用OVA/明礬加IMO化合物注射的小鼠中，這些IgG1和IgG2a水平被轉(zhuǎn)化為比只接受OVA/明礬的小鼠中更高的OVA-特異性的IgG2a/IgG1比例。類似的結(jié)果見于血清總Ig生產(chǎn)。來自用OVA/明礬和IMO化合物注射的小鼠的血清，比只接受OVA/明礬的小鼠的血清具有更低水平的總IgG1和更高水平的總IgG2a。實施例26治療模型的研究。在哮喘的小鼠模型中，測試了IMOs1和2的治療效力(therapeuticpotential)。用OVA致敏并和激發(fā)小鼠，并如前面規(guī)程所述用IMOs1和2處理。為了測定IMOs1和2處理對于局部免疫應(yīng)答的作用，在最后注射IMOs1和2之后48小時，對用或不用IMOs1和2處理的、首次接受實驗的和OVA/明礬-致敏-并-激發(fā)的小鼠的肺進行了組織學(xué)檢測。不用IMOs1和2處理的OVA-致敏并激發(fā)的小鼠與首次接受實驗的小鼠相比顯示嚴(yán)重的炎癥細(xì)胞浸潤(inflammatorycellinfiltration)和氣道上皮細(xì)胞增生(airwayepithelialhyperplasia)(數(shù)據(jù)未顯示)。正相反，IMOs1和2-處理的小鼠與未處理的小鼠相比具有較少的炎癥細(xì)胞浸潤和較少的氣道增生(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果說明IMOs1和2在用OVA致敏并激發(fā)的小鼠中逆轉(zhuǎn)OVA-誘導(dǎo)的肺炎癥的能力。實施例27IMOs1和2處理在抗原-特異的回憶免疫應(yīng)答對于Th2和Th1細(xì)胞因子的影響。為了測定IMOs1和2在用OVA致敏并激發(fā)的小鼠中逆轉(zhuǎn)Th2-優(yōu)勢型免疫應(yīng)答的能力，我們在第45天從小鼠中分離了脾細(xì)胞并與OVA一起培養(yǎng)72hr。在用OVA重-刺激脾細(xì)胞之后，我們在處理的組中觀察到Th2細(xì)胞因子(IL-5和IL-13)產(chǎn)生中的顯著差異。來自只用OVA注射的小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生高水平與Th2-有關(guān)的細(xì)胞因子(圖25)。用IMOs1和2處理的小鼠產(chǎn)生顯著較少的OVA-誘導(dǎo)的Th2細(xì)胞因子(圖25)。在抗原-回憶實驗中，在來自首次接受實驗的和OVA/明礬-致敏-并-激發(fā)的小鼠的脾細(xì)胞培養(yǎng)物中只誘導(dǎo)低水平的IL-12和IFN-γ。來自用IMOs1和2處理然后OVA激發(fā)的小鼠的脾細(xì)胞產(chǎn)生顯著較高水平的IFN-γ(圖25)。實施例28用IMOs1和2的處理在OVA-致敏并攻擊的小鼠中對于OVA-特異的和總的血清IgE生成的影響。為了評價IMOs1和2對于IgE產(chǎn)生的影響，我們檢測了OVA-特異的和總的IgE的血清水平。用OVA致敏并攻擊但不用IMOs1和2處理的小鼠在血清中具有高水平的OVA-特異性的IgE(圖26)，而用IMOs1和2處理的小鼠具有顯著較低水平的OVA-特異性IgE。總血清IgE水平在接受IMOs1和2處理的小鼠中也是低的(圖26)。實施例29IMOs1和2處理在OVA/明礬-致敏-并-攻擊的小鼠中對于OVA-特異的和總的IgG2a產(chǎn)生的影響。為了評價IMOs1和2處理對于IgG2a產(chǎn)生的影響，我們檢測了OVA-特異的和總的IgG2a的血清水平。不用IMOs1和2處理，用OVA致敏并激發(fā)的小鼠具有顯著水平的OVA-特異性IgG2a(圖26)。用IMOs1和2處理的OVA-致敏并-激發(fā)的小鼠具有增加的OVA-特異性IgG2a抗體水平(圖26)。類似的結(jié)果見于血清總Ig生產(chǎn)(圖26)用OVA致敏并激發(fā)而且用IMOs1和2處理的小鼠，比不用IMOs1和2處理的小鼠具有更高水平的總IgG2a。實施例30單次高劑量的IMO化合物相對于多次低劑量的IMO化合物在首次接受實驗的小鼠中對于局部和系統(tǒng)Th1細(xì)胞因子水平的影響為了測定劑量對于IMO處理的影響，用33μg的IMO1或3在第1、2和3天經(jīng)鼻內(nèi)處理小鼠或用單次鼻內(nèi)給藥100μug的IMO1或3處理小鼠。在最后處理后5小時將小鼠放血并移除肺。單次100μg劑量誘導(dǎo)較高水平系統(tǒng)的細(xì)胞因子應(yīng)答，然而，三次較小劑量(3×33μg)誘導(dǎo)較高的局部(BALF)細(xì)胞因子應(yīng)答(圖27)。為了測定低量多次給藥IMO化合物在首次接受實驗的小鼠中對于局部和系統(tǒng)細(xì)胞因子水平的劑量-依賴性影響，在第1、2和3天用2.5μg、10.0μg或40.0μg的IMO1經(jīng)鼻內(nèi)處理小鼠。在最后處理5小時后將小鼠放血并移除肺。當(dāng)以小劑量多次給藥時，IMO化合物在小鼠中增加局部(BALF)細(xì)胞因子水平而不是系統(tǒng)細(xì)胞因子水平(圖28)。此影響是劑量依賴性的(dosedependant)。實施例31比較IMO化合物和皮質(zhì)類固醇(corticosteriod)在體外的影響通過在第0和14天經(jīng)腹腔內(nèi)(intraperitonal)(i.p.)注射10mgOVA將小鼠致敏并在第28天用40-μPBS中的10μgOVA進行經(jīng)鼻內(nèi)激發(fā)。在第30天收集脾細(xì)胞并用100μg/mOVA，用或不用1μg/ml至10μg/mlIMO化合物或布地奈德(budesonide)保溫72小時。IMO1和布地奈德抑制OVA誘導(dǎo)的Th2細(xì)胞因子分泌(IL-5，ILB)(圖29)。然而，只有IMO1顯示強的Th1細(xì)胞因子誘導(dǎo)(IL-12，F(xiàn)N-8)。等效物雖然為了清楚和理解的起見已經(jīng)詳細(xì)描述了上述本發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過閱讀本公開可以理解的是，在不背離本發(fā)明的真實范圍和所附的權(quán)利要求的情況下，可進行形式和細(xì)節(jié)上的各種改變。權(quán)利要求1.免疫刺激性寡核苷酸致免疫物，其包含SEQIDNO170的序列。2.免疫調(diào)節(jié)性組合物，其包含權(quán)利要求1的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸致免疫物；而且還包含共-刺激分子，所述共-刺激分子選自細(xì)胞因子、趨化因子、蛋白質(zhì)配體、反式-活化因子、肽和包含經(jīng)修飾的氨基酸的肽組成的組。3.權(quán)利要求2的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其中所述共-刺激分子與所述免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸致免疫物相結(jié)合。4.權(quán)利要求2的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其還包含佐劑。5.權(quán)利要求2的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其還包含可藥用的載體。6.免疫調(diào)節(jié)性組合物，其包含權(quán)利要求1的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸致免疫物；而且還包含抗原。7.權(quán)利要求6的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其中所述抗原選自肽、糖蛋白、脂蛋白，多糖和脂質(zhì)組成的組。8.權(quán)利要求6的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其中所述抗原是變應(yīng)原。9.權(quán)利要求6的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其還包含佐劑。10.權(quán)利要求6的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其還包含可藥用的載體。11.免疫刺激性寡核苷酸致免疫物，其包含SEQIDNO171的序列。12.免疫調(diào)節(jié)性組合物，其包含權(quán)利要求11的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸致免疫物；而且還包含共-刺激分子，所述共-刺激分子選自細(xì)胞因子、趨化因子、蛋白質(zhì)配體、反式-活化因子、肽和包含經(jīng)修飾的氨基酸的肽組成的組。13.權(quán)利要求12的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其中所述共-刺激分子與所述免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸致免疫物相結(jié)合。14.權(quán)利要求12的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其還包含佐劑。15.權(quán)利要求12的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其還包含可藥用的載體。16.免疫調(diào)節(jié)性組合物，其包含權(quán)利要求11的免疫調(diào)節(jié)性寡核苷酸致免疫物；而且還包含抗原。17.權(quán)利要求16的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其中所述抗原選自肽、糖蛋白、脂蛋白，多糖和脂質(zhì)組成的組。18.權(quán)利要求16的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其中所述抗原是變應(yīng)原。19.權(quán)利要求16的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其還包含佐劑。20.權(quán)利要求16的免疫調(diào)節(jié)性組合物，其還包含可藥用的載體。21.治療患有如下病癥的患者的方法氣道炎癥、炎性疾病、過敏癥或哮喘，所述方法包含對所述患者施用致免疫物。22.權(quán)利要求21的方法，其中所述致免疫物包含通過非核苷酸接頭連接并具有多于一個5’末端的至少兩個寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中至少一個是具有可接近的5’末端并包含免疫刺激性二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸。23.權(quán)利要求21的方法，其中所述免疫刺激性二核苷酸選自CpG、C*pG、CpG*和C*pG*組成的組，其中C是胞苷或2′-脫氧胞苷，C*是2′-脫氧胸苷、阿糖胞苷、1-(2’-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-脫氧-2’-取代的阿糖胞苷、2’-O-取代的阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷，或其非天然嘧啶核苷，G是鳥苷或2’-脫氧鳥苷，G*是2′脫氧-7-脫氮-鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷、2’-脫氧-2’取代的-阿糖鳥苷、2’-O-取代的-阿糖鳥苷，或其它非天然嘌呤核苷。24.權(quán)利要求21的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO170的序列。25.權(quán)利要求21的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO171的序列。26.權(quán)利要求21的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO172的序列。27.權(quán)利要求21的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO173的序列。28.權(quán)利要求21的方法，其還包含施用與所述疾病或病癥有關(guān)的抗原。29.權(quán)利要求21的方法，其中所述致免疫物和/或抗原連接于免疫原性蛋白質(zhì)或非免疫原性蛋白質(zhì)。30.權(quán)利要求21的方法，其還包含施用佐劑。31.調(diào)節(jié)患有氣道炎癥、炎性疾病、過敏癥或哮喘的患者中的免疫應(yīng)答的方法，所述方法包含對所述患者施用致免疫物。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述免疫應(yīng)答是Th1免疫應(yīng)答。33.權(quán)利要求31的方法，其中所述免疫應(yīng)答是Th2免疫應(yīng)答。34.權(quán)利要求31的方法，其中所述致免疫物包含通過非核苷酸接頭連接并具有多于一個5’末端的至少兩個寡核苷酸，其中所述寡核苷酸中至少一個是具有可接近的5’末端并包含免疫刺激性二核苷酸的免疫刺激性寡核苷酸。35.權(quán)利要求31的方法，其中所述免疫刺激性二核苷酸選自CpG、C*pG、CpG*和C*pG*組成的組，其中C是胞苷或2′-脫氧胞苷，C*是2′-脫氧胸苷、阿糖胞苷、1-(2’-脫氧-β-D-呋喃核糖基)-2-氧代-7-脫氮-8-甲基-嘌呤、2’-脫氧-2’-取代的阿糖胞苷、2’-O-取代的阿糖胞苷、2′-脫氧-5-羥基胞苷、2′-脫氧-N4-烷基-胞苷、2′-脫氧-4-硫代尿苷，或其非天然嘧啶核苷，G是鳥苷或2’-脫氧鳥苷，G*是2′脫氧-7-脫氮鳥苷、2′-脫氧-6-硫代鳥苷、阿糖鳥苷、2′-脫氧肌苷、2’-脫氧-2’取代的-阿糖鳥苷、2’-O-取代的-阿糖鳥苷。36.權(quán)利要求31的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO170的序列。37.權(quán)利要求31的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO171的序列。38.權(quán)利要求31的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO172的序列。39.權(quán)利要求31的方法，其中所述致免疫物包含SEQIDNO173的序列。40.權(quán)利要求31的方法，其還包含施用與所述疾病或病癥有關(guān)的抗原。41.權(quán)利要求31的方法，其中所述致免疫物和/或抗原連接于免疫原性蛋白質(zhì)或非免疫原性蛋白質(zhì)。42.權(quán)利要求31的方法，其還包含施用佐劑。全文摘要雖然為了清楚和理解的起見已經(jīng)詳細(xì)描述了上述本發(fā)明，但本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過閱讀本公開可以理解的是，在不背離本發(fā)明的真實范圍和所附的權(quán)利要求的情況下，可進行形式和細(xì)節(jié)上的各種改變。文檔編號A01N43/04GK101094594SQ200480041479公開日2007年12月26日申請日期2004年5月24日優(yōu)先權(quán)日2003年12月8日發(fā)明者蘇迪爾·阿格拉瓦爾,朱富剛,埃卡姆巴·R·坎迪馬拉申請人:海布里頓公司