專利名稱：利用愈傷組織誘導(dǎo)培育轉(zhuǎn)基因辣椒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育轉(zhuǎn)基因辣椒植物的方法，特別是一種利用愈傷組織誘導(dǎo)來大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因辣椒植物的方法，該方法的特征在于以下步驟預(yù)培養(yǎng)辣椒外植體；將該預(yù)培養(yǎng)的辣椒外植體與引入了靶基因的土壤桿菌(Agrobacterium)共同培養(yǎng)；選擇愈傷組織；以及形成幼芽。
背景技術(shù)：
辣椒是世界上的主要農(nóng)作物之一，廣泛的用作食品或調(diào)味品。同時，辣椒還用在工業(yè)染料中，特別是用作化妝品唇膏的一種主要原料。在韓國，辣椒產(chǎn)品的年總銷售額大約在兩萬億韓元并形成了韓國最大的種子市場。辣椒是在利用生物技術(shù)能夠創(chuàng)造高附加值方面最適合的農(nóng)作物。
在生物技術(shù)方面利用辣椒的第一種方式是進行轉(zhuǎn)化。然而，眾所周知，辣椒作為一種農(nóng)作物由于以下兩個原因很難被轉(zhuǎn)化。第一，轉(zhuǎn)基因辣椒植物再生成功的可能性根據(jù)種系不同而有很大差異(Christopher，Tet al.，Plant Cell Tiss.Org.Cult.，46245，1996；Kim，JY et al.，J.PlantBiotechnol.，4129，2002)。由于高轉(zhuǎn)化率只能通過具有高再生率的種系獲得，因而低再生率的種系很難進行轉(zhuǎn)化。第二，土壤桿菌的感染率根據(jù)農(nóng)作物的不同而不同。據(jù)推斷，對于難以進行轉(zhuǎn)化的農(nóng)作物來說，土壤桿菌的菌毛不能透過外植體的組織細胞或不能充分地接種到組織細胞上。
世界上成功進行辣椒轉(zhuǎn)化的例子仍然很少。利用土壤桿菌轉(zhuǎn)化辣椒植物的方法首先在美國被報道(美國專利No.5,262,316)，韓國的Sung-Han Son等人也有所研究(韓國專利注冊號No.344573)。然而，這些方法的缺點在于，它們的轉(zhuǎn)化率非常低，不可再生而且很難大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因辣椒植物。
發(fā)明公開內(nèi)容在我們對大規(guī)模高效率生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因辣椒植物的廣泛研究過程中，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)辣椒外植體通過在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，然后與土壤桿菌共同培養(yǎng)而進行再生時，可以很容易獲得轉(zhuǎn)基因辣椒，從而完成本發(fā)明。
因此，本發(fā)明的主要目標(biāo)是提供一種大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因辣椒植物的方法，該方法的特征在于在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)辣椒外植體，接著與土壤桿菌共同培養(yǎng)。
為了完成上述目標(biāo)，本發(fā)明提供了一種大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因辣椒植物的方法，該方法包括步驟(a)在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)辣椒外植體；(b)將所述預(yù)培養(yǎng)的外植體與引入了靶基因的土壤桿菌共同培養(yǎng)；(c)在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述共同培養(yǎng)的外植體以便形成愈傷組織并選擇所形成的愈傷組織；以及(d)切取所述愈傷組織并在幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所切取的愈傷組織以形成幼芽。
這里所用到的術(shù)語“外植體”指的是從植物上切下的組織片斷，包括子葉或胚軸。
在下文中，將詳細描述本發(fā)明。
本發(fā)明中的方法包括以下步驟(a)辣椒外植體的預(yù)培養(yǎng)；(b)轉(zhuǎn)化(與引入了靶基因的土壤桿菌共同培養(yǎng))，(c)愈傷組織選擇；以及(d)形成幼芽。同時，本發(fā)明的方法還可以另外包括形成根系和適應(yīng)土壤的步驟。特別地，本發(fā)明的方法的特征在于所述辣椒外植體在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化從而人工形成愈傷組織，并且由所形成的愈傷組織誘導(dǎo)植物的再生?，F(xiàn)在將詳細地描述本發(fā)明方法的每一個步驟。
(a)用于愈傷組織誘導(dǎo)的外植體的預(yù)培養(yǎng)在本發(fā)明方法中，辣椒的外植體首先在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)。此時，優(yōu)選損傷該外植體以便促進愈傷組織誘導(dǎo)。此外，子葉或胚軸可以作為辣椒外植體用在本發(fā)明中。優(yōu)選使用通過滅菌和洗滌辣椒種子并使洗滌的種子在MS培養(yǎng)基中發(fā)芽從而獲得的子葉。
本發(fā)明方法的預(yù)培養(yǎng)步驟中所用的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基指的是一種含有能夠誘導(dǎo)愈傷組織的植物激素的植物培養(yǎng)基(例如，MS培養(yǎng)基和1/2的MS培養(yǎng)基)?？捎糜谟鷤M織誘導(dǎo)的植物激素可以從玉米素、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、吲哚-3-乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)和芐氨基嘌呤(BA)構(gòu)成的組中選擇一種。
每種植物激素可以按下列濃度添加0.01-5mg/l的2，4-D，0.01-5mg/l的IAA，0.01-5mg/l的玉米素，0.01-5mg/l的NAA和0.01-5mg/l的BA。最優(yōu)選地，可使用1mg/l的2，4-D或1mg/l的IAA。也可以使用上述激素的混合物。優(yōu)選地，可以使用0.01-2mg/l的玉米素與選自0.1-5mg/l的2，4-D、0.1-5mg/l的IAA、和0.01-2mg/l的NAA的組中之一的混合物。預(yù)培養(yǎng)步驟優(yōu)選在22-28℃下進行20-60小時。在預(yù)培養(yǎng)步驟過程中，愈傷組織通過激素的影響而在外植體的損傷部分被誘導(dǎo)。
(b)轉(zhuǎn)化(與引入了靶基因的土壤桿菌共同培養(yǎng))為了轉(zhuǎn)化在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)后的所述外植體，將該預(yù)培養(yǎng)的外植體與土壤桿菌共同培養(yǎng)。在共同培養(yǎng)之前，需要將要被引入辣椒植物的靶基因引入土壤桿菌中。士壤桿菌的轉(zhuǎn)化可以通過本領(lǐng)域所知的任何方法進行。例如可以使用凍融法(Glevin et al.，Plant molecularbiology.Kluwer Academic Publishers A3/7，1988)。之后，將引入了靶基因的土壤桿菌接種到預(yù)培養(yǎng)的辣椒外植體中10-20分鐘，然后進行共同培養(yǎng)。這時，優(yōu)選使用如步驟(a)中所使用的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基一樣的培養(yǎng)基作為共同培養(yǎng)基。此外，共同培養(yǎng)步驟優(yōu)選在22-28℃下進行40-80小時。
(c)愈傷組織選擇將與土壤桿菌共同培養(yǎng)后的辣椒外植體在選擇培養(yǎng)基下培養(yǎng)以選擇轉(zhuǎn)基因的愈傷組織。所述選擇培養(yǎng)基優(yōu)選不僅包含用于選擇轉(zhuǎn)基因愈傷組織的抗生素，還包含用于誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)育的玉米素和IAA。作為IAA的替換物，也可以使用NAA。而且，用于選擇愈傷組織的抗生素優(yōu)選是一種與引入土壤桿菌的重組載體中所存在的抗生素抗性基因相對應(yīng)的抗生素。同樣，玉米素優(yōu)選使用濃度為0.1-5mg/l，IAA和NAA分別優(yōu)選使用濃度為0.01-1mg/l。更為優(yōu)選地，可使用2mg/l的玉米素和0.3mg/l的IAA的混合物。在與土壤桿菌共同培養(yǎng)的外植體被轉(zhuǎn)移至所述選擇性培養(yǎng)基4-5周后，愈傷組織開始生長。然后，優(yōu)選將該愈傷組織再培養(yǎng)5-8周。
(d)形成幼芽將步驟(c)中獲得的轉(zhuǎn)化愈傷組織切成小片。將該切片的愈傷組織片轉(zhuǎn)移到幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中以誘導(dǎo)幼芽形成。所述幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選包括單獨的玉米素或玉米素與IAA和NAA之一的混合物。玉米素優(yōu)選的使用濃度為0.5-10mg/l，IAA和NAA分別優(yōu)選的使用濃度為0.01-0.2mg/l。更為優(yōu)選地，可使用2mg/l的玉米素和0.01mg/l的IAA的混合物。在愈傷組織轉(zhuǎn)移至幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基一個月之后，形成了幼芽。然后，優(yōu)選將該幼芽在相同的培養(yǎng)基中再培養(yǎng)大約兩個月，以使幼芽伸長。
(e)根系形成和土壤適應(yīng)將伸長的幼芽轉(zhuǎn)移到根系誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。所述根系誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選不包含植物激素。優(yōu)選地，可用含有少量抗生素的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為根系誘導(dǎo)培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)移到根系誘導(dǎo)培養(yǎng)基大約4-5周后，形成了根系。當(dāng)根系長到大約4-10cm時，徹底去除培養(yǎng)基并將根系種植在盆中。
本發(fā)明用于轉(zhuǎn)化辣椒植物的方法具有以下優(yōu)點。
第一，根據(jù)現(xiàn)有土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，從辣椒外植體直接誘導(dǎo)幼芽很少或不能進行轉(zhuǎn)化，而本發(fā)明的方法表現(xiàn)出非常高的轉(zhuǎn)化率。
第二，本發(fā)明方法不限于辣椒植物的特定種系(種系非特異性)。因而，本發(fā)明的方法能夠穩(wěn)定地轉(zhuǎn)化各種辣椒植物種系第三，與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比，本發(fā)明的方法能夠在較短時間內(nèi)大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，因為在預(yù)培養(yǎng)外植體步驟中添加了愈傷組織誘導(dǎo)激素以便縮短愈傷組織誘導(dǎo)時間。
因此，各種有用的基因，例如與植物防御機制相關(guān)的基因或與有用的代謝物的生物合成相關(guān)的基因，都可以通過本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法引入到辣椒植物中，從而能夠高效率大規(guī)模地生產(chǎn)各種功能性轉(zhuǎn)基因辣椒植物。
可用于本發(fā)明的與植物防御機制相關(guān)的基因的例子優(yōu)選為，編碼選自以下組的蛋白質(zhì)的基因核糖體失活蛋白(RIP)，茉莉酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶，海藻糖合成酶，植物防御素1.2，硫堇合成酶，葡聚糖酶，幾丁質(zhì)酶，苯丙氨酸解氨酶，查爾酮合酶，谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶，鄰氨基苯甲酸合成酶，儲存蛋白，鈣調(diào)蛋白，色氨酸合成酶，蛋白酶抑制素II，氮氧化物合成酶，半胱胺(cystemine)，脂肪酸過氧化酶，丙二烯氧化合酶，辣椒-PMMV相互作用1轉(zhuǎn)錄因子(PPI1)，WRKY域轉(zhuǎn)錄因子，病原體響應(yīng)蛋白和病毒外殼蛋白，但不僅限于此。編碼病毒外殼蛋白的基因?qū)嵗═MV-CP，CMV-CP和PepMoV-CP基因。
此外，與有用代謝物的生物合成相關(guān)的基因優(yōu)選選自與生物合成以下物質(zhì)相關(guān)的基因的群組丹寧酸，芥子酸膽堿，皂苷，蒜素，酸棗黃酮碳甙，肉桂酸，類黃酮，萜類，兒茶素，維生素，青霉素，吲哚，胰島素，前列腺素，紫杉醇，澤瀉醇，蓖麻毒蛋白，類胡蘿卜素和蕃椒，但不僅限于此。
本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法可以應(yīng)用于所有的番椒(Capsicum)屬辣椒，而且優(yōu)選甜椒(Capsicum annuum L)。甜椒(Capsicum annuum L)的例子包括紅辣椒(Capsicum annuum L.var.acuminatum)、甜椒或燈籠椒(Capsicum annuum L.var.grossum)，尖椒(Capsicum annuum L.var.conoides)，櫻桃辣椒(Capsicum annuum L.var.cerasiforme)，朝天椒(Capsicum annuum L.var.fasciculatum)，長辣椒(Capsicum annuum L.var.longum)等等。
在本發(fā)明的一個實施例中，將辣椒的外植體在含有玉米素和NAA的混合物或玉米素和IAA的混合物的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，然后用引入了TMV-CP基因或PPI1基因的土壤桿菌(Agrobacterium)進行轉(zhuǎn)化。之后，與辣椒再生過程中幼芽直接從轉(zhuǎn)化外植體的損傷部分形成(直接形成幼芽)的通常情況不同，可以觀察到在損傷部分中已經(jīng)誘導(dǎo)出愈傷組織，然后幼芽在此處形成(間接形成幼芽；愈傷組織介導(dǎo)的幼芽形成)(見


圖1和圖2)。
測定上述兩種情況的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果顯示，在直接形成幼芽的情況下，直接幼芽形成的幾率很高，但是從幼芽形成根系的幾率很低而且沒有一個幼芽進行了轉(zhuǎn)化(見表1和表3)。另一方面，在通過愈傷組織介導(dǎo)間接形成幼芽的情況下，盡管從外植體的損傷部分誘導(dǎo)出愈傷組織的幾率非常低，但是從誘導(dǎo)的愈傷組織形成幼芽和從幼芽形成根系的幾率都很高(見表2)。此外，檢測了從愈傷組織形成幼芽的轉(zhuǎn)化率，結(jié)果顯示，P915種系的辣椒轉(zhuǎn)化率為0.19％，P409種系辣椒的為0.03％(3/37，500)(見表4)。通過這些結(jié)果，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)，在從轉(zhuǎn)化愈傷組織誘導(dǎo)形成幼芽的情況下，可獲得辣椒的高轉(zhuǎn)化效率。這是本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)的。
因此，本發(fā)明提供了由編碼PPI1蛋白的基因轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因辣椒植物，以及由編碼TMV-CP的基因轉(zhuǎn)化的TMV-抗性辣椒植物。
在本發(fā)明的另一個實施例中，為了更為有效地從辣椒外植體中誘導(dǎo)愈傷組織，將該辣椒外植體在含有一種或多種不同植物激素的培養(yǎng)基中進行預(yù)培養(yǎng)，然后與引入了GFP基因的土壤桿菌共同培養(yǎng)。這里，用2，4-D、IAA或者玉米素和2，4-D的混合物作為植物激素。之后，將轉(zhuǎn)化外植體在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)以選擇轉(zhuǎn)基因愈傷組織(見圖3和圖4)。將愈傷組織切成小片，之后轉(zhuǎn)移到幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中以形成幼芽(見圖5)。之后，從幼芽中誘導(dǎo)根系然后通過適當(dāng)?shù)牟襟E再生成為完整的植物(見圖6)。
當(dāng)辣椒外植體在含有2，4-D和玉米素混合物，2，4-D或IAA的培養(yǎng)基中進行預(yù)培養(yǎng)時，測定愈傷組織的誘導(dǎo)率。結(jié)果表明，盡管愈傷組織誘導(dǎo)率在辣椒種系之間會有微小的差異，但通常愈傷組織誘導(dǎo)率約為13％(見表6)。該愈傷組織誘導(dǎo)率比外植體在含有玉米素和NAA(或IAA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)情況下的約高10倍。而且，根據(jù)用于轉(zhuǎn)化的外植體總數(shù)，從愈傷組織形成幼芽的轉(zhuǎn)化率大約為1％(見圖7)。這個值比外植體在含有玉米素和NAA(或IAA)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)情況下愈傷組織介導(dǎo)的幼芽轉(zhuǎn)化率(0.19％)的約高5倍。而且，當(dāng)外植體在含有2，4-D和玉米素，2，4-D或IAA的混合物的培養(yǎng)基中進行預(yù)培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)測試的所有8個種系的辣椒都穩(wěn)定地進行了轉(zhuǎn)化(見表6和圖7到圖9)。上面所描述的本發(fā)明的方法通過在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)辣椒外植體，可以使轉(zhuǎn)化時間比現(xiàn)有技術(shù)方法有所縮短。
附圖簡述
圖1是表示直接形成幼芽的再生過程各步驟圖。虛線表示切下用于后續(xù)步驟中培養(yǎng)的部分(A直接形成幼芽；B多個幼芽形成；C多個幼芽伸長；D一個幼芽從多個幼芽中伸長；以及E根系形成)。
圖2是表示通過愈傷組織介導(dǎo)間接形成幼芽的再生過程各步驟圖。虛線表示切下用于后續(xù)步驟中培養(yǎng)的部分(A愈傷組織形成；B愈傷組織發(fā)育；C幼芽形成；D單個幼芽伸長；E根系形成)。
圖3是表示根據(jù)本發(fā)明在選擇性培養(yǎng)基中生長兩周的愈傷組織(箭頭所表示)的圖片。
圖4表示了通過本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的愈傷組織在其生長過程中連續(xù)表達GFP的狀態(tài)。
圖5表示了通過本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化的愈傷組織形成幼芽的過程。
圖6表示了根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因辣椒植物外觀，其在根系形成后種植于盆中一個月。
圖7表示了從表達GFP(泳道1-9)的愈傷組織和不表達GFP(泳道10-15)的愈傷組織中提取的基因組DNA的PCR擴增的結(jié)果，(+GFP克??；M分子量標(biāo)記)。
圖8表示了從表達GFP的愈傷組織再生的幼苗植物葉片中提取的基因組DNA的PCR擴增結(jié)果(+GFP克隆；M分子量標(biāo)記；泳道1-9P410種系；泳道10-15P915種系；泳道16-21P318種系；泳道22-28P319種系；以及-非轉(zhuǎn)基因植物)。
圖9表示了本發(fā)明方法制備的轉(zhuǎn)基因辣椒植物中所獲得的基因組DNA的Southern印跡分析結(jié)果(泳道1-2P915種系；泳道3-6P318種系；泳道7-14P319種系；泳道15非轉(zhuǎn)基因植物)。
發(fā)明詳述下面將通過實施例對本發(fā)明進行進一步詳細的描述。然而對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說顯然本發(fā)明并不限于或受限于這些實施例。
實施例1培育TMV-CP基因或PPI1基因轉(zhuǎn)化的辣椒植物1-1外植體的制備和預(yù)培養(yǎng)實驗中使用四種近交系(P915，P409，P410和P101)的紅辣椒種子(Nongwoo Bio Co.，Korea)。種子表面用95％的酒精消毒30秒，然后用50％的漂白劑處理10分鐘。之后，用無菌水清洗種子3次。將該消毒后的種子轉(zhuǎn)移到1/2MS培養(yǎng)基中(1/2MS，1.5％蔗糖，0.8％瓊脂，pH5.8)，并在25℃的光照條件下生長。將子葉和胚軸從8-10天的植物上切下用作外植體。用刀損傷大約190,000株外植體，之后將其轉(zhuǎn)移到預(yù)培養(yǎng)基中(含有2mg/l的玉米素和0.05mg/l的NAA或0.1mg/l的IAA的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，并在22-28℃的光照條件下培養(yǎng)2-36小時。
1-2與土壤桿菌共同培養(yǎng)將編碼TMV-CP基因(GenBank accession NoL35074；Park et al.，1997)或PPI1基因(GenBank accession NoAF430372；Lee et al.，2002)的DNA片段插入pCAMBIA2300載體(CAMBIA，Australia)中。將得到的重組載體引入到土壤桿菌LBA4404株系或EHA105株系中。將轉(zhuǎn)化的土壤桿菌株系在含有50mg/l的卡那霉素，50mg/l的利福平和100μM乙酰丁香酮的YEP培養(yǎng)基中培養(yǎng)。離心培養(yǎng)液并在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中稀釋到OD6000.3-0.5。將培養(yǎng)懸液與含有100μM乙酰丁香酮的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合，并將混合物接種到上述實施例1-1中預(yù)培養(yǎng)的外植體中10-20分鐘。之后，將該外植體與土壤桿菌株系在與上述實施例1-1中所使用預(yù)培養(yǎng)基具有相同成分的培養(yǎng)基中、在黑暗條件下共同培養(yǎng)38-96小時。用含有500-800mg/l氨噻肟頭孢菌素或lilacilline的1/2MS液體培養(yǎng)基洗滌所述與土壤桿菌株系共同培養(yǎng)后的外植體3次。
1-3幼芽形成為了選擇轉(zhuǎn)基因植物，將上述實施例1-2中與土壤桿菌株系共同培養(yǎng)的外植體在含有2mg/l玉米素，0.05mg/l的NAA(或0.1mg/l的IAA)，80-100mg/l卡那霉素，300mg/l頭孢噻肟(或0.1mg/l lilacilline)的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(選擇性培養(yǎng)基)中培養(yǎng)6-8周。在培養(yǎng)的4-5周后，可以觀察到類似于愈傷組織的組織在一些外植體的損傷部分周圍形成。之后，為了誘導(dǎo)幼芽，將外植體轉(zhuǎn)移到含有2mg/l玉米素，0.01mg/l NAA(或0.01mg/l IAA)，60-100mg/l卡那霉素和300mg/l頭孢噻肟的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(伸長培養(yǎng)基)中培養(yǎng)7-10周。
1-4根系形成和土壤適應(yīng)將伸長的幼芽轉(zhuǎn)移到含有20-30mg/l卡那霉素和200mg/l頭孢噻肟的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(根系誘導(dǎo)培養(yǎng)基)中培養(yǎng)6-8周。將再生的植物轉(zhuǎn)移進輕便的盆中，在16hr光照的條件下以25℃培養(yǎng)2周。
在上述的實驗中，可以確定外植體中形成了兩種形式的幼芽。一種是普通形式，幼芽(或多個幼芽)直接從外植體的損傷部分形成(直接形成幼芽)，另一種形式是愈傷組織在外植體的損傷部分周圍形成，之后，幼芽從愈傷組織處形成(間接形成幼芽；愈傷組織介導(dǎo)的幼芽形成)。
大多數(shù)情況下觀察到的是直接形成幼芽的再生過程。如
圖1所示，再生過程包括5個步驟幼芽形成，多幼芽形成，多幼芽伸長，單幼芽伸長和根系形成。另一方面，通過愈傷組織介導(dǎo)的間接形成幼芽的再生過程則很少觀察到，據(jù)信這是由于愈傷組織不容易從子葉損傷部位自然誘導(dǎo)形成的原因。如圖2所示，通過間接幼芽形成的再生過程包括5個步驟愈傷組織形成，愈傷組織發(fā)育，幼芽形成，單個幼芽伸長和根系形成。
實施例2幼芽形成幾率的檢測2-1直接形成幼芽的幾率從四個株系的辣椒外植體中獲得了總共151,700個外植體，將其通過與實施例1中相同的方式轉(zhuǎn)化，之后檢測從外植體損傷部分直接形成幼芽的幾率。在幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上直接形成幼芽的幾率是5.3％(8,089/151,700)(見表1)。然而，在根系誘導(dǎo)培養(yǎng)基上存活的幼芽的比率為17.4％(1,407/8,089)。表1和2中列出的每種植物株系的數(shù)值表示了使用各種激素的全部結(jié)果。
表1直接形成幼芽的幾率

2-2通過愈傷組織介導(dǎo)的間接形成幼芽的幾率從四個株系的辣椒植物中獲得的外植體總共為37,500株，將其通過與上述實施例1中相同的方式轉(zhuǎn)化，之后檢測愈傷組織介導(dǎo)的幼芽形成幾率。從外植體形成愈傷組織的幾率處于非常低的水平，為1.2％(459/37,500)(見表2)。然而，從愈傷組織發(fā)育成幼芽的幾率是11.6％(53/459)，并且從幼芽形成根系的幾率為52.8％(28/53)。這些值大大高于通過直接形成幼芽在再生過程中形成幼芽和根系的比率。
表2愈傷組織發(fā)育和從愈傷組織形成幼芽的幾率

上述結(jié)果表明，一旦在辣椒外植體的再生過程中形成愈傷組織，就能高效地形成幼芽和根系。
實施例3轉(zhuǎn)化率測定從實施例1中的外植體損傷部分直接形成了總共1,407個幼芽，以及從愈傷組織間接形成了總共28個幼芽，將其通過PCR試驗測定其轉(zhuǎn)化率。
首先，根據(jù)Lee et al.，Plant Mol.Biol.，46661，2001中所描述的方法分離辣椒植物的基因組DNA。為了檢測TMV-CP基因的插入，用SEQID NO1和SEQ ID NO2表示的引物進行PCR。此外，為了檢測PPI1基因的插入，用SEQ ID NO3和SEQ ID NO4表示的引物進行PCR。PCR重復(fù)進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括在94℃下1分鐘、在55℃下1分鐘和在72℃下1分鐘。
PCR試驗結(jié)果表明，從外植體損傷部分直接形成的1,407個幼芽中沒有插入TMV-CP基因或PPI1基因(見表3)。下表3和4中列出的轉(zhuǎn)化率是PCR試驗中呈陽性的幼芽數(shù)量除以使用的外植體數(shù)量所獲得的值。
表3從外植體損傷組織直接形成幼芽的轉(zhuǎn)化率

另一方面，愈傷組織間接形成幼芽的轉(zhuǎn)化率的檢測結(jié)果顯示，P915系植物為0.19％(15/37,500)，P409系植物為0.03％(3/37,500)(見表4)。在PCR試驗中呈陽性的幼芽數(shù)量與從愈傷組織形成的幼芽的數(shù)量的比例為34％(18/53)。
表4 從愈傷組織間接形成的幼芽的轉(zhuǎn)化率

上述結(jié)果表明，如果幼芽從轉(zhuǎn)化后的愈傷組織處形成，則辣椒植物的轉(zhuǎn)化可能性大大提高。
實施例4轉(zhuǎn)基因辣椒植物的TMV抗性測定為了檢測上述實施例1中通過愈傷組織介導(dǎo)的間接形成幼芽過程引入了TMP-CP基因的轉(zhuǎn)基因辣椒植物是否對TMV具有抗性，進行以下實驗。將T0植物進行自交獲得T1植物。兩次(間隔兩周)將408株單個的T1植物葉片接種上TMV。第二次接種后兩周，用TMV-CP抗體(Shin，R.et al.，Mol.Plant Microbe.Interact.，15983，2002)進行ELISA.。結(jié)果表明408株T1植物個體中有28株個體能抵抗TMV感染(見表5)。易感植物的葉片中觀察到了花葉病斑點，但抗性植物中沒有觀察到。
另外，將從植物葉片中分離的基因組DNA模版按照與實施例3中相同的方式進行PCR。PCR試驗結(jié)果表明TMV-CP基因插入所有的28個抗性植物個體中(數(shù)據(jù)未示出)。
表5TMV抗性測定

實施例5制備GFP轉(zhuǎn)化的辣椒植物5-1外植體的制備和預(yù)培養(yǎng)為了確定從辣椒外植體高水平地誘導(dǎo)愈傷組織的最佳條件，將該外植體在含有一種或多種各種植物激素的培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)。
首先，實驗中使用了八種近交系(P915，P318，P319，P409，P410，P784，P2377和PMAL)的紅辣椒種子(Nongwoo Bio Co.，Korea)。種子表面用95％的酒精消毒30秒，然后用50％的漂白劑(Yuhanrocks。YuhanCorp.，Korea)處理10分鐘。然后，用無菌水清洗種子3次。將該消毒后的種子轉(zhuǎn)移到1/2MS培養(yǎng)基中(1/2MS+1.5％蔗糖+0.8％瓊脂，pH5.8)，然后在25℃的光照條件下生長。接著，將子葉從8-10天的植物上切下。用刀損傷該子葉，之后將其轉(zhuǎn)移到含有一種或多種各種植物激素的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中(含有1mg/l的2，4-D，1mg/l IAA或1mg/l的2，4-D和0.2mg/l的玉米素的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基)并進行預(yù)培養(yǎng)。預(yù)培養(yǎng)在光照條件下的溫控培育箱(22-28℃)中進行20-60小時。
5-2與土壤桿菌共同培養(yǎng)將GFP基因(GenBank accession NoAY508125；Haseloff et al.，PNAS，942122，1997)引入pCAMBIA2300載體中。將得到的重組載體引入到土壤桿菌LBA4404株系中。將轉(zhuǎn)化的土壤桿菌株系在含有50mg/l的卡那霉素，50mg/l的利福平和100μM乙酰丁香酮的YEP培養(yǎng)基中培養(yǎng)。離心培養(yǎng)液并在MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中稀釋到OD6000.3-0.6。將培養(yǎng)懸液與含有100μM乙酰丁香酮的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基混合，并將混合物接種到上述實施例5-1中預(yù)培養(yǎng)的子葉中20分鐘。之后，將該子葉與土壤桿菌株系在與實施例5-1中所使用預(yù)培養(yǎng)基具有相同成分的培養(yǎng)基中、在黑暗條件下共同培養(yǎng)48-70小時。用含有500-800mg/l氨噻肟頭孢菌素的1/2MS液體培養(yǎng)基洗滌所述與土壤桿菌株系共同培養(yǎng)后的子葉3次。
5-3愈傷組織選擇為了選擇轉(zhuǎn)基因愈傷組織，將上述實施例5-2中與土壤桿菌株系共同培養(yǎng)的子葉轉(zhuǎn)移到含有2mg/l玉米素，0.3mg/l的IAA，80mg/l卡那霉素，100mg/l頭孢噻肟和300mg/l lilacilline)的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(選擇性培養(yǎng)基)中，并在16-hr光照/6-hr黑暗周期條件的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4-5周。在該培養(yǎng)過程中，愈傷組織開始生長。圖3是表示在轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基后生長了兩周的愈傷組織圖片。在UV顯微鏡下可以觀察到按照培養(yǎng)時間不同的轉(zhuǎn)基因愈傷組織生長形態(tài)，結(jié)果如圖4中所示。如圖4所示，可以肯定表達GFP的轉(zhuǎn)基因愈傷組織在其生長過程中表現(xiàn)出連續(xù)的GFP表達，從而表明其在基因上是穩(wěn)定的。
5-4根系形成和土壤適應(yīng)將成熟愈傷組織切成小片，然后轉(zhuǎn)移到含有2mg/l玉米素，0.01mg/lIAA，30-60mg/l卡那霉素和300mg/l頭孢噻肟的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基(幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基)中并培養(yǎng)大約一個月。之后，將形成的幼芽再培養(yǎng)大約兩個月以使所形成的幼芽伸長。從轉(zhuǎn)化愈傷組織形成幼芽的過程如圖5中所示。
5-5根系形成和土壤適應(yīng)為了從幼芽中誘導(dǎo)根系，將幼芽在含有20-30mg/l卡那霉素和200mg/l頭孢噻肟的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。大約4-5周之后，從幼芽處形成了根系。當(dāng)根系長到大約10cm時，徹底去除培養(yǎng)基并將剩余的根系種植到進輕便的盆中。將其在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天，然后在溫室中培養(yǎng)。將根系種植于輕便盆中之后一個月得到的轉(zhuǎn)基因辣椒植物的外觀如圖6中所示。
實施例6通過PCR試驗證實轉(zhuǎn)基因植物從上述實施例5中獲得的轉(zhuǎn)基因植物當(dāng)中，在UV下分別從表達GPF的愈傷組織和不表達GPV的愈傷組織提取基因組DNA。為了檢測GFP基因的插入情況，用SEQ ID NO5和SEQ ID NO6表示的引物對所提取的DNA模板分別進行PCR。PCR重復(fù)進行35個循環(huán)，每個循環(huán)包括在60℃下1分鐘、在94℃下1分鐘和在72℃下1分鐘。如圖7中所示，PCR試驗結(jié)果表明，對應(yīng)于GFP基因的大約720bp大小條帶只在表達GFP的愈傷組織中檢測到。
另外，從表達GFP的愈傷組織中再生成的一些幼芽株系的葉片中提取了基因組DNA，然后按照上面所述的相同方式進行PCR。如圖8中所示，PCR試驗結(jié)果表明GFP基因被穩(wěn)定地引入了所有P410、P915、P318和P319品系。這表明根據(jù)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化方法是非品系特異性的。
實施例7測定引入轉(zhuǎn)基因植物中GFP基因的復(fù)制數(shù)量從上面實施例5中獲得的轉(zhuǎn)基因辣椒植物(T0)的14個個體中提取基因組DNA，然后進行Southern印記分析，從而測定插入轉(zhuǎn)基因植物中的GFP基因復(fù)制數(shù)量。
用BamHI和XbaI酶切各個基因組DNA30μg，然后在0.8％的瓊脂糖凝膠中20V下電泳20小時。接著，將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并與32P-dCTP標(biāo)記的GFP基因混合，在65℃下雜交16小時。如圖9所示，分析結(jié)果表明，14個個體當(dāng)中有4個個體的基因組中存在兩個GFP基因，剩余個體中存在一個。而且，轉(zhuǎn)基因植物的條帶位置彼此不同，從而表明轉(zhuǎn)基因植物的愈傷組織來源彼此不同。
實施例8轉(zhuǎn)化率測定8-1檢測愈傷組織誘導(dǎo)率嘗試以與實施例5中相同的方式對8個品系的辣椒植物中的愈傷組織進行誘導(dǎo)。結(jié)果表明愈傷組織在所有品系中的平均誘導(dǎo)率為13％，不過辣椒植物品系之間的愈傷組織誘導(dǎo)率不同。特別是，用2，4-D或IAA單獨處理的情況下表現(xiàn)出比用2，4-D和玉米素的混合物處理的情況更高的愈傷組織誘導(dǎo)率。此外，實施例5的愈傷組織誘導(dǎo)率比實施例1的約高10倍(1.2％；見表2)。
此外，根據(jù)轉(zhuǎn)化中使用的總外植體數(shù)在UV下表達GFP的愈傷組織比率為4.7％，而根據(jù)從外植體誘發(fā)的總愈傷組織數(shù)來說則為36.1％(233/645)(見表6)。這再次表明一旦愈傷組織從外植體中誘發(fā)，則轉(zhuǎn)化率大大提高。表中列出的每種品系的數(shù)值表示預(yù)培養(yǎng)中使用的各種激素的全部結(jié)果。
表6根據(jù)愈傷組織誘導(dǎo)率和GFP表達的轉(zhuǎn)化率

8-2檢測來自愈傷組織的幼芽形成率和轉(zhuǎn)化率在同土壤桿菌共同培養(yǎng)大約5個月之后，測定從外植體誘導(dǎo)的愈傷組織形成幼芽的幾率，結(jié)果表明幼芽形成幾率大約為37.7％(見表7)。在愈傷組織形成的幼芽上進行PCR試驗以測定GFP基因的誘導(dǎo)率。PCR測定結(jié)果表明，在有愈傷組織形成的幼芽當(dāng)中具有GFP基因插入的幼芽比率為45％(表7)。在轉(zhuǎn)化所用的外植體總數(shù)基礎(chǔ)上測得具有GFP基因的幼芽轉(zhuǎn)化率為大約1％(27/2792)。這個值比實施例1中的約高(0.19％)5倍(見表4)。
表7來自愈傷組織的幼芽形成率和轉(zhuǎn)化率

工業(yè)實用性如上所述，本發(fā)明中，辣椒外植體在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)，然后進行轉(zhuǎn)化以人工形成愈傷組織，并從該愈傷組織誘導(dǎo)再生植物體。本發(fā)明的方法表現(xiàn)出非常高的轉(zhuǎn)化率，并且可以以非品系特異性的方式轉(zhuǎn)化辣椒植物。而且，本發(fā)明的方法可以高效率地大規(guī)模生產(chǎn)各種轉(zhuǎn)基因辣椒植物，因為用于制備轉(zhuǎn)基因辣椒植物的時間比現(xiàn)有技術(shù)方法得以縮短。
序列表FP06KR158.ST25SEQUENCE LISTING<110>株式會社農(nóng)友生物(NONGWOOBIO)<120>利用愈傷組織誘導(dǎo)培育轉(zhuǎn)基因辣椒的方法(METHOD FOR PREPARINGTRANSGENIC PEPPER USING CALLUS INDUCTION)<130>FP06KR158<150>KR 10-2004-0016722<151>2004-03-12<150>PCT/KR2004/001686<151>2004-07-09<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>forward primer for PCR<400>1atgacgcaca atcccactat 20<210>2<211>18<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>reverse primer for PCR<400>2cgaacccctg aaaataat18<210>3<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>forward primer for PCR<400>3atgacgcaca atcccactat 20
FP06KR158.ST25<210>4<211>17<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>reverse primer for PCR<400>4gtaccacttg aagaagc 17<210>5<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>forward primer for PCR<400>5atgacgcaca atcccactat20<210>6<211>23<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>reverse primer for PCR<400>6catgtggtct ctcttttcgt tgg2權(quán)利要求
1.一種制備轉(zhuǎn)基因辣椒植物的方法，該方法包括步驟(a)在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)辣椒外植體；(b)將所述預(yù)培養(yǎng)的外植體與引入了靶基因的土壤桿菌共同培養(yǎng)；(c)在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述共同培養(yǎng)的外植體以便形成愈傷組織并選擇所形成的愈傷組織；以及(d)切取所述愈傷組織并在幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)所切取的愈傷組織以形成幼芽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于使步驟(a)的外植體損傷以促進愈傷組織誘導(dǎo)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(a)的外植體為子葉或胚軸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(a)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括一種或多種選自玉米素、2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、吲哚-3-乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)和芐氨基嘌呤(BA)所構(gòu)成的組。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于步驟(a)的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括一種或多種選自0.01-5mg/l的2，4-D，0.01-5mg/l的IAA，0.01-5mg/l的NAA和0.01-5mg/l的BA所構(gòu)成的組。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于其中所述培養(yǎng)基包括1mg/l的2，4-D或1mg/l的IAA。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于其中所述培養(yǎng)基包括0.01-2mg/l的玉米素與選自0.1-5mg/l的2，4-D、0.1-5mg/l的IAA、和0.01-2mg/l的NAA的組中之一的混合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(b)中的共同培養(yǎng)在與步驟(a)中使用的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基相同的培養(yǎng)基中進行。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(c)中的選擇培養(yǎng)基包括0.1-5mg/l的玉米素和0.01-1mg/l的IAA的混合物或.0.1-5mg/l的玉米素和0.01-1mg/l的NAA的混合物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(d)中的幼芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括選自以下組的構(gòu)成之一(i)0.5-10mg/l的玉米素；(ii)0.5-10mg/l玉米素和0.01-0.2mg/l IAA的混合物；以及(iii)0.5-10mg/l玉米素和0.01-0.2mg/l NAA的混合物。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(d)之后進一步包括以下步驟(e)(e)將所述幼芽轉(zhuǎn)移到根系形成培養(yǎng)基中，然后培養(yǎng)所轉(zhuǎn)移的幼芽以形成根系。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中所述靶基因是植物防御機制相關(guān)的基因或與有用代謝物的生物合成相關(guān)的基因。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于其中與植物防御機制相關(guān)的基因是編碼選自以下組的蛋白質(zhì)的基因核糖體失活蛋白(RIP)，茉莉酸羧甲基轉(zhuǎn)移酶，海藻糖合成酶，植物防御素1.2，硫堇合成酶，葡聚糖酶，幾丁質(zhì)酶，苯丙氨酸解氨酶，查爾酮合酶，谷胱苷肽巰基轉(zhuǎn)移酶，鄰氨基苯甲酸合成酶，儲存蛋白，鈣調(diào)蛋白，色氨酸合成酶，蛋白酶抑制素II，氮氧化物合成酶，半胱胺(cystemine)，脂肪酸過氧化酶，丙二烯氧化合酶，辣椒-PMMV相互作用1轉(zhuǎn)錄因子(PPI1)，WRKY域轉(zhuǎn)錄因子，病原體響應(yīng)蛋白和病毒外殼蛋白。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于其中編碼病毒外殼蛋白的基因選自TMV-CP，CMV-CP和PepMoV-CP基因所構(gòu)成的組。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于其中與有用代謝物的生物合成相關(guān)的基因選自與生物合成以下物質(zhì)相關(guān)的基因的群組丹寧酸，芥子酸膽堿，皂苷，蒜素，酸棗黃酮碳甙，肉桂酸，類黃酮，萜類，兒茶素，維生素，青霉素，吲哚，胰島素，前列腺素，紫杉醇，澤瀉醇，蓖麻毒蛋白，類胡蘿卜素和蕃椒油。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于其中所述辣椒為番椒(Capsicum)屬辣椒。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于其中所述番椒(Capsicum)屬辣椒為甜椒(Capsicum annuum L)。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于其中所述甜椒(Capsicum annuum L)選自以下組紅辣椒(Capsicum annuum L.var.acuminatum)、甜椒或燈籠椒(Capsicum annuum L.var.grossum)，尖椒(Capsicum annuum L.var.conoides)，櫻桃辣椒(Capsicum annuum L.var.cerasiforme)，朝天椒(Capsicum annuum L.var.fasciculatum)，長辣椒(Capsicum annuum L.var.longum)
19.一種編碼PPI1蛋白的基因轉(zhuǎn)化的辣椒，其特征在于其通過權(quán)利要求13的方法制備而成。
20.一種編碼TMV-CP的基因轉(zhuǎn)化的TMV抗性辣椒，其特征在于其通過權(quán)利要求14的方法制備而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種制備轉(zhuǎn)基因辣椒植物的方法，特別是一種利用愈傷組織誘導(dǎo)來大規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因辣椒植物的方法。本發(fā)明的方法表現(xiàn)出了高轉(zhuǎn)化率，并且可以以非品系特異性的方式生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因辣椒植物。而且，因為用于制備轉(zhuǎn)基因辣椒植物的時間比現(xiàn)有技術(shù)方法得以縮短，本發(fā)明的方法可以高效率地大規(guī)模生產(chǎn)各種品系的轉(zhuǎn)基因辣椒植物。
文檔編號A01H4/00GK1925740SQ200480042428
公開日2007年3月7日 申請日期2004年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月12日
發(fā)明者韓智學(xué), 李允姬, 金主淵, 金孝淳, 鄭珉, 崔淳浩, 梁承均 申請人:株式會社農(nóng)友生物