專利名稱：蘭屬植物種子無菌萌發(fā)與植株培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物培植技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是蘭屬植物種子無菌萌發(fā)與植株培育方法。
背景技術(shù)：
沉香虎頭蘭(Cmbidium tracyanum L castle)、碧玉蘭(C.Lowianum)及黃蟬蘭(C.iridioides)是蘭科蘭屬植物，花大枝長，觀賞價值高，是優(yōu)異的蘭花資源。三種蘭花多產(chǎn)于云南、貴州和西藏東南部，是很好的雜交親本和切花材料。
蘭花種子很小，內(nèi)含一些發(fā)育不完全的球形胚，無胚乳，自然狀態(tài)下很難萌發(fā)，需與蘭菌共生或無菌條件培養(yǎng)才能獲得成功。蘭屬(Cmbidium)植物種子的萌發(fā)，已有人作過研究，但以上三種蘭屬植物的無菌萌發(fā)未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種蘭屬植物種子無菌萌發(fā)與植株培育方法。
本發(fā)明對沉香虎頭蘭(Cmbidium tracyanum L castle)、碧玉蘭(C.Lowianum)及黃蟬蘭(C.iridioides)三種蘭花種子進(jìn)行了無菌萌發(fā)和快速繁殖技術(shù)體系研究，成功地培育出大量組培苗，形成雜交育種和規(guī)?；a(chǎn)栽培不可缺少的關(guān)鍵技術(shù)。
本發(fā)明的具體方法是1)材料來源采得沉香虎頭蘭蘭株、黃蟬蘭蘭株、碧玉蘭蘭株在資源圃內(nèi)培育至蘭花果實到九成熟，果皮略顯黃色時摘??；2)培養(yǎng)方法①外植體處理將上述90％成熟度果實用75％酒精消毒40秒，轉(zhuǎn)入1％升汞表面消毒8～12分鐘，無菌水沖洗3～4次，無菌室取出種子并用紗布包好種子后，以少量無菌水潤洗5次，然后用0.1mol/L KOH溶液預(yù)處理8分鐘，用無菌水沖洗3次，在飽和漂白粉上清液中消毒10～20分鐘，無菌水沖洗5次后，接種到固體培養(yǎng)基；②培養(yǎng)基用改良的MS固體培養(yǎng)基(即1/2MS培養(yǎng)基)加入細(xì)胞分裂素，和生長素，即1/2MS+6-BA1.0～2.0mg.L-1+NAA0.5～1.0mg.L-1培養(yǎng)基，將種子接種在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)；③培養(yǎng)條件在整個培養(yǎng)過程中，種子無菌萌發(fā)采用暗箱培養(yǎng)，圓球莖成苗的培養(yǎng)、增殖和生根培養(yǎng)均采用光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照1800～2500勒克斯(lx)，每天光照12～15小時，培養(yǎng)基pH5.4，瓊脂7g/L，待種子萌發(fā)后長出芽和長出帶根毛的幼根時，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)；④轉(zhuǎn)接對圓球莖進(jìn)行轉(zhuǎn)接，即從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)到另一個培養(yǎng)瓶的；⑤快速增殖當(dāng)圓球莖長到1cm左右，再轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基1/2MS+6-BA1.5～2.5mg.L-1+NAA0.2～0.5mg.L-1+香蕉泥70～80g/L培養(yǎng)中進(jìn)行增殖培養(yǎng)；⑥生根培養(yǎng)將增殖培養(yǎng)后的苗培養(yǎng)到5～8cm高，從基部切下，轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基1/2MS+10-6Y2或10-6Y1中，一個月后即長出新根。
本發(fā)明從實驗研究中得出如下結(jié)論1、種子無菌萌發(fā)培養(yǎng)1/2MS培養(yǎng)基外加6-BA1.0～2.0mg.L-1+NAA0.5～1.0mg.L-1有利于種子萌發(fā)。
2、圓球莖培養(yǎng)改良的培養(yǎng)基培養(yǎng)圓球莖生長的效果最佳。
3、不同激素、培養(yǎng)基對增殖的影響根據(jù)不同培養(yǎng)時期加入不同的生長素、細(xì)胞分裂素及其他附加物質(zhì)(香蕉泥)增殖培養(yǎng)效果最好。
4、生根培養(yǎng)把無根蘭苗轉(zhuǎn)接到不同活性物質(zhì)的生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)三個月時的不同活性物質(zhì)的促根效果不同，在基本培養(yǎng)基加入10-6Y2(生防菌)時，根長、根數(shù)、莖粗效果都較其它三組好，且根數(shù)較對照高33％；不加激素的對照也長出三條根，說明對外源激素的依賴程度不高，同時NAA為2.0mg/L時對根的生長有抑制作用；加入10-6Y1(生防菌)時，根長、根粗、株高、莖粗都較對照好。說明生根培養(yǎng)以10-6Y2(生防菌)為宜。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)比較具有的優(yōu)點1、傳統(tǒng)的蘭花繁育主要以分株繁殖為主，而分株繁殖系數(shù)底，每年老苗與新新生苗的比例只為1∶1～3左右，很難進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)。組織培養(yǎng)應(yīng)用于蘭花的培養(yǎng)報道較少，這種現(xiàn)代生物技術(shù)可用一個芽在一年中繁殖出數(shù)十萬株蘭花，從而滿足蘭花產(chǎn)業(yè)化需求；還可進(jìn)行脫毒技術(shù)操作，生產(chǎn)出無病毒種苗，從而可降低蘭花生產(chǎn)的成本和提高產(chǎn)品質(zhì)量，這都是傳統(tǒng)分株技術(shù)無法做到的。因此，該技術(shù)克服了蘭花傳統(tǒng)繁殖方法帶來的種種弊端，有利于擴(kuò)大蘭花的繁殖系數(shù)，能在短期內(nèi)生產(chǎn)出數(shù)量巨大的試管種苗和脫毒苗，有效滿足蘭花產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的巨大需求。
具體實施例方式
實施例1材料來源自云南山區(qū)采得沉香虎頭蘭蘭株，在資源圃內(nèi)培育至蘭花果實到九成熟，果皮略顯黃色時摘取。
培養(yǎng)方法1、外植體處理將上述90％成熟度果實用75％酒精消毒40秒，轉(zhuǎn)入1％升汞表面消毒8～12分鐘，無菌水沖洗3～4次，無菌室取出種子并用紗布包好種子后，以少量無菌水潤洗5次，然后用0.1mol/L KOH(氫氧化鉀)溶液預(yù)處理8分鐘，用無菌水沖洗3次，在飽和漂白粉上清液中消毒10～20分鐘，無菌水沖洗5次后，接種到固體培養(yǎng)基；2、培養(yǎng)基用1/2MS+6-BA1.0mg.L-1+NAA1.0mg.L-1培養(yǎng)基，將種子接種在此改良的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)(6-BA即6-芐基腺嘌呤，為細(xì)胞分裂素，NAA即奈乙酸，為生長素)；3、培養(yǎng)條件在整個培養(yǎng)過程中，除了種子無菌萌發(fā)采用暗箱培養(yǎng)外，圓球莖成苗的培養(yǎng)，增殖和生根培養(yǎng)均采用光照培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照1800～2500勒克斯(lx)，每天光照12～15小時，培養(yǎng)基pH5.4，瓊脂7g/L。接種3個月后發(fā)芽率達(dá)90％以上。種子萌發(fā)后先長出芽，隨后長出帶根毛的幼根，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)3個月后逐漸成苗；4、轉(zhuǎn)接的具體過程轉(zhuǎn)接方法由于蘭花種子非常細(xì)小，播種時有些種子聚集在一起，致使長出的圓莖球較擁擠，因此對圓球莖進(jìn)行轉(zhuǎn)接，即從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)到另一個培養(yǎng)瓶的過程；5、快速增殖過程當(dāng)圓球莖長到1cm左右，再轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基1/2MS+6-BA2.5mg.L-1+NAA0.2mgL-1+香蕉泥70g/L培養(yǎng)(香蕉泥是附加物)；6、生根培養(yǎng)將增殖培養(yǎng)后的苗培養(yǎng)到5～8cm高，從基部切下，轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基1/2MS+10-6Y2或10-6Y1中(Y1、Y2為生防菌，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)提供)，一個月后即長出新根。
實施例2材料來源自云南山區(qū)采得碧玉蘭(C.Lowianum)蘭株，在資源圃內(nèi)培育至蘭花果實到九成熟，果皮略顯黃色時摘取。
培養(yǎng)方法1、外植體處理按實施例1的方法進(jìn)行。
2、培養(yǎng)基用1/2MS+6-BA2.0mg.L-1+NAA0.5mg.L-1培養(yǎng)基，將種子接種在此改良的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)；步驟3和4按實施例1的方法進(jìn)行。
5、快速增殖過程當(dāng)圓球莖長到1cm左右，再轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基1/2MS+6-BA1.5mg.L-1+NAA0.5mg.L-1+香蕉泥80g/L培養(yǎng)；6 步驟按實施例1的方法進(jìn)行。
實施例3材料來源自云南山區(qū)采得黃蟬蘭(C.iridioides)蘭株，在資源圃內(nèi)培育至蘭花果實到九成熟，果皮略顯黃色時摘取。
培養(yǎng)方法按實施例1或?qū)嵤├?的方法進(jìn)行。
權(quán)利要求
1.一種蘭屬植物種子無菌萌發(fā)與植株培育方法，其特征在于按以下步驟進(jìn)行1)材料來源采得沉香虎頭蘭蘭株、黃蟬蘭蘭株、碧玉蘭蘭株在資源圃內(nèi)培育至蘭花果實到九成熟，果皮略顯黃色時摘取；2)培養(yǎng)方法①外植體處理將上述90％成熟度果實用75％酒精消毒40秒，轉(zhuǎn)入1％升汞表面消毒8～12分鐘，無菌水沖洗3～4次，無菌室取出種子并用紗布包好種子后，以少量無菌水潤洗5次，然后用0.1mol/L KOH溶液預(yù)處理8分鐘，用無菌水沖洗3次，在飽和漂白粉上清液中消毒10～20分鐘，無菌水沖洗5次后，接種到固體培養(yǎng)基；②培養(yǎng)基用MS+6-BA1.0～2.0mg.L-1+NAA0.5～1.0mg.L-1培養(yǎng)基，將種子接種在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)；③培養(yǎng)條件在整個培養(yǎng)過程中，種子無菌萌發(fā)采用暗箱培養(yǎng)，圓球莖成苗的培養(yǎng)、增殖和生根培養(yǎng)均采用光照培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為溫度25±2℃，光照1800～2500勒克斯(lx)，每天光照12～15小時，培養(yǎng)基pH5.4，瓊脂7g/L，待種子萌發(fā)后長出芽和長出帶根毛的幼根時，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)；④轉(zhuǎn)接對圓球莖進(jìn)行轉(zhuǎn)接，即從一個培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)到另一個培養(yǎng)瓶的；⑤快速增殖當(dāng)圓球莖長到1cm左右，再轉(zhuǎn)到增殖培養(yǎng)基1/2MS+6-BA1.5～2.5mg.L-1+NAA0.2～0.5mg.L-1+香蕉泥70～80g/L培養(yǎng)中進(jìn)行增殖培養(yǎng)；⑥生根培養(yǎng)將增殖培養(yǎng)后的苗培養(yǎng)到5～8cm高，從基部切下，轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基1/2MS+10-6Y2或10-6Y1中，一個月后即長出新根。
全文摘要
本發(fā)明是一種蘭屬植物種子無菌萌發(fā)與植株培育方法。采得沉香虎頭蘭蘭株、黃蟬蘭蘭株、碧玉蘭蘭株在資源圃內(nèi)培育至蘭花果實到九成熟。培養(yǎng)方法經(jīng)外植體處理，改良的培養(yǎng)基對種子進(jìn)行培養(yǎng)，待種子萌發(fā)后長出芽和長出帶根毛的幼根時，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，快速增殖，生根培養(yǎng)，一個月后即長出新根。傳統(tǒng)的蘭花繁育主要以分株繁殖為主，而分株繁殖系數(shù)底，每年老苗與新生苗的比例只為1∶1～3左右，很難進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明用現(xiàn)代生物技術(shù)可用一個芽在一年中繁殖出數(shù)十萬株蘭花，從而滿足蘭花產(chǎn)業(yè)化需求；還可進(jìn)行脫毒技術(shù)操作，生產(chǎn)出無病毒種苗，從而可降低蘭花生產(chǎn)的成本和提高產(chǎn)品質(zhì)量，有效滿足蘭花產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的巨大需求。
文檔編號A01G7/00GK1729747SQ20051001076
公開日2006年2月8日 申請日期2005年4月22日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月22日
發(fā)明者李枝林, 余朝秀, 王卜瓊, 王玉英, 黃麗萍 申請人:云南農(nóng)業(yè)大學(xué)