專利名稱：殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用天然可再生資源殼聚糖的金屬鋅絡(luò)合物制備新型抗菌劑的方法，屬再生資源化學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甲殼素是從蝦、蟹等甲殼類動物的甲殼以及真菌的細胞壁中提取出來的一種天然多糖，也是自然界僅次于纖維素的第二大生物質(zhì)資源。殼聚糖是甲殼素的脫乙?；苌?，具有良好的生物相容性、生物可降解性、天然無毒性和多種生物活性，尤其是光譜抗菌性，并且由于其分子鏈上有很多氨基、羥基等活性基團，具有很高的反應(yīng)活性，極易與過渡金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)。近年來，殼聚糖作為一種天然抗菌劑受到了人們的廣泛關(guān)注，但是，與傳統(tǒng)的抗菌劑相比殼聚糖的抗菌活性較低，還不足以在食品、醫(yī)藥、紡織工業(yè)中廣泛應(yīng)用。因此，通過改性、共混等方法提高殼聚糖的抗菌活性，對于殼聚糖作為抗菌劑的應(yīng)用至關(guān)重要。目前提高殼聚糖的抗菌活性途徑主要是集中在對殼聚糖的衍生化等改性方面，包括殼聚糖的羧甲基化、硫酸酯化、季銨鹽化等。通過對殼聚糖的衍生化處理雖然能夠在一定程度上提高殼聚糖的抗菌活性，但是效果并不明顯，仍然無法滿足其應(yīng)用需求，而且殼聚糖的衍生化過程復(fù)雜，反應(yīng)條件苛刻不利于大規(guī)模生產(chǎn)。金屬離子是一種傳統(tǒng)抗菌劑，具有較強的抗菌活性，但是其生物毒性不能滿足當(dāng)前發(fā)展綠色無毒抗菌劑的要求。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供一種制備殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑的方法，該方法采用將原料殼聚糖與過渡金屬離子鋅配位反應(yīng)制得新型高效廣譜抗菌劑。用這種方法制得新型殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌都有顯著增強的抗菌活性。
本發(fā)明提供的技術(shù)方案為按如下步驟制備殼聚糖/金屬復(fù)合抗菌劑(1)將適量殼聚糖溶解于濃度為0.005-0.03g/ml的稀醋酸溶液配成濃度為0.005-0.02g/ml的殼聚糖稀醋酸溶液，磁力攪拌下加入與殼聚糖的氨基摩爾比為4∶1-0.25∶1的二價鋅離子，用濃度為0.05-1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到4.5-6.0，持續(xù)攪拌3-4小時，得到殼聚糖鋅絡(luò)合物溶液。
(2)將得到的殼聚糖鋅絡(luò)合物溶液加入到足量的丙酮和乙醇的混合溶劑中，得到白色沉淀，通過減壓抽濾分離沉淀和溶液體系，將獲得的殼聚糖鋅絡(luò)合物沉淀用足量無水乙醇洗滌，再次減壓抽濾去除洗滌劑，按照上述方法洗滌2-3次后，將獲得的殼聚糖鋅絡(luò)合物沉淀真空干燥，研碎即得到殼聚糖/鋅復(fù)合物粉末。
(3)將殼聚糖/鋅復(fù)合物粉末溶解于0.05-2mol/l稀鹽酸，配成濃度為1000μg/ml-31.3μg/ml的溶液，用濃度為0.05-1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到4.5-6.0，然后在高壓滅菌鍋中121-135℃下滅菌20-40分鐘，即得到殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑。
其中，所用原料殼聚糖最好為經(jīng)過普通純化處理的殼聚糖，且殼聚糖的分子量范圍在2.6萬-78.8萬、脫乙酰度范圍在85％-99％；所用的丙酮和乙醇的混合溶劑中丙酮∶乙醇的體積比為3∶1～1∶3。；二價鋅離子來自于水合硫酸鋅、醋酸鋅、氯化鋅、硝酸鋅。
由于殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑是殼聚糖和具有抗菌活性的金屬鋅離子配位反應(yīng)生成的產(chǎn)物，它綜合了殼聚糖和金屬鋅的抗菌性，表現(xiàn)出比殼聚糖強的多的抗菌活性，同時大大降低了金屬抗菌劑的毒性，而且原料來源豐富，制備方法簡單，容易大規(guī)模生產(chǎn)，所以可以作為新型抗菌殺菌劑、添加劑、抗菌藥物等在食品、醫(yī)藥、紡織工業(yè)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。
具體實施例方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明提供的制備殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑的方法作詳細說明。
實施例1稱取1g殼聚糖，加入100ml濃度為0.005g/ml稀醋酸溶液中，攪拌1-2h至溶解，磁力攪拌下加入3.12g ZnSO4·7H2O粉末，用濃度為0.05mol/l的氫氧化鈉溶液pH值為4.5，持續(xù)攪拌3-4h至配位平衡。停止攪拌，向溶液中加入200ml體積比為1∶1的丙酮∶乙醇混合溶液，得到白色團狀沉淀。減壓抽濾將沉淀物分離出來，用100ml無水乙醇洗滌沉淀，再次減壓抽濾除去洗滌劑和洗脫下來的未反應(yīng)的離子。重復(fù)用100ml去離子水洗滌兩次，將沉淀過濾、真空干燥，得到殼聚糖/鋅復(fù)合物。稱取0.05g殼聚糖/鋅復(fù)合物溶解于10ml濃度為0.05mol/l稀鹽酸溶液中，用濃度為0.05mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到4.5，將該溶液放置在高壓滅菌鍋中，121℃下滅菌20min即得到殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑，可以直接用于抑菌實驗。
實施例2稱取1g殼聚糖樣品，加入100ml濃度為0.01g/ml稀醋酸溶液中，攪拌1-2h至溶解，磁力攪拌下加入1.56g ZnSO4·7H2O粉末，用濃度為0.25mol/l的氫氧化鈉溶液pH值為5.0，持續(xù)攪拌3-4h至配位平衡。停止攪拌，向溶液中加入200ml體積比為1∶1的丙酮∶乙醇混合溶液，得到白色團狀沉淀。減壓抽濾將沉淀物分離出來，用100ml無水乙醇洗滌沉淀，再次減壓抽濾除去洗滌劑和洗脫下來的未反應(yīng)的離子。重復(fù)用100ml去離子水洗滌兩次，將沉淀過濾、真空干燥，得到殼聚糖/鋅復(fù)合物。稱取0.5g殼聚糖/鋅復(fù)合物溶解于10ml濃度為0.5mol/l稀鹽酸溶液中，用濃度為0.5mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到5.0，將該溶液放置在高壓滅菌鍋中，125℃下滅菌24min即得到殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑，可以直接用于抑菌實驗。
實施例3稱取1g殼聚糖樣品，加入濃度為0.015-g/ml稀醋酸溶液中，攪拌1-2h至溶解，劇烈攪拌下加入0.78g ZnSO4·7H2O粉末，用濃度為0.5mol/l的氫氧化鈉溶液pH值為5.5，持續(xù)攪拌3-4h至配位平衡。停止攪拌，向溶液中加入200ml體積比為1∶1的丙酮∶乙醇混合溶液，得到白色團狀沉淀。減壓抽濾將沉淀物分離出來，用100ml無水乙醇洗滌沉淀，再次減壓抽濾除去洗滌劑和洗脫下來的未反應(yīng)的離子。重復(fù)用100ml去離子水洗滌兩次，將沉淀過濾、真空干燥，得到殼聚糖/鋅復(fù)合物。稱取1g殼聚糖/鋅復(fù)合物溶解于10ml濃度為1mol/l稀鹽酸溶液中，用濃度為0.6mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到5.5，將該溶液放置在高壓滅菌鍋中，130℃下滅菌30min即得到殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑，可以直接用于抑菌實驗。
實施例4稱取1g純化后的殼聚糖樣品，加入100ml濃度為0.02g/ml稀醋酸溶液中，攪拌1-2h至溶解，劇烈攪拌下加入0.39g ZnSO4·7H2O粉末，用濃度為0.7mol/l的氫氧化鈉溶液pH值為6.0，持續(xù)攪拌3-4h至配位平衡。停止攪拌，向溶液中加入200ml體積比為1∶1的丙酮∶乙醇混合溶液，得到白色團狀沉淀。減壓抽濾將沉淀物分離出來，用100ml無水乙醇洗滌沉淀，再次減壓抽濾除去洗滌劑和洗脫下來的未反應(yīng)的離子。重復(fù)用100ml去離子水洗滌兩次，將沉淀過濾、真空干燥，得到殼聚糖/鋅復(fù)合物。稱取2g殼聚糖/鋅復(fù)合物溶解于10ml濃度為1.5mol/l稀鹽酸溶液中，用濃度為1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到6.0.將該溶液放置在高壓滅菌鍋中，135℃下滅菌40min即得到殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑，可以直接用于抑菌實驗。
實施例5稱取1g純化后的殼聚糖樣品，加入100ml濃度為0.03g/ml稀醋酸溶液中，攪拌1-2h至溶解，劇烈攪拌下加入0.20g ZnSO4·7H2O粉末，用濃度為1mol/l的氫氧化鈉溶液pH值為6.0，持續(xù)攪拌3-4h至配位平衡。停止攪拌，向溶液中加入200ml體積比為1∶1的丙酮∶乙醇混合溶液，得到白色團狀沉淀。減壓抽濾將沉淀物分離出來，用100ml無水乙醇洗滌沉淀，再次減壓抽濾除去洗滌劑和洗脫下來的未反應(yīng)的離子。重復(fù)用100ml去離子水洗滌兩次，將沉淀過濾、真空干燥，得到殼聚糖/鋅復(fù)合物。稱取3g殼聚糖/鋅復(fù)合物溶解于10ml濃度為2mol/l稀鹽酸溶液中，用濃度為1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到6.0，將該溶液放置在高壓滅菌鍋中，135℃下滅菌40min即得到殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑，可以直接用于抑菌實驗。
下表是實施例1、2、3、4、5制得的殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑的成分分析，括號內(nèi)是計算含量，括號外為實測含量。
抗菌劑C含量 H含量N含量 Zn含量實例1 9.98(10.08)3.65(1.54) 2.08(1.96)11.17(10.92)實例2 15.19(15.12) 4.38(2.31) 2.88(2.94)10.15(10.23)實例3 23.15(22.32) 5.18(3.41) 4.77(4.34)9.86(10.0)實例4 28.94(28.8)5.57(4.4)5.68(5.6) 4.38(4.42)實例5 37.86(36.0)6.93(5.5)6.73(7.0) 0.91(0.98)下表是將實例1、2、3、4、5制得的殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑的最小抑菌濃度(單位％)分別與殼聚糖進行對比測試的測試結(jié)果。
微生物對比例 實例1 實例2 實例3實例4 實例5大腸桿菌 0.0250.00313 0.00313 0.00313 0.0125 0.0125綠膿桿菌 0.0125 0.00625 0.00625 0.00625 0.0125 0.0125奇異變形桿菌 0.0250.00625 0.00625 0.0125 0.0125 0.0125
腸類沙門氏菌 0.050.00625 0.00625 0.01250.0125 0.025產(chǎn)氣腸桿菌0.050.00625 0.00625 0.01250.0250.025金黃色葡萄球菌0.050.00625 0.0125 0.01250.0250.05棒桿菌0.025 0.00313 0.00313 0.00625 0.00625 0.00625表皮葡萄球菌 0.025 0.00625 0.00625 0.01250.0250.025糞腸球菌 0.050.01250.0250.025 0.05 0.05白色念珠菌0.1 0.05 0.05 0.1 0.1 0.05近平滑假絲酵母菌 0.1 0.05 0.05 0.05 0.1 0.1下表是將實例3制得的殼聚糖、鋅復(fù)合抗菌劑的最小抑菌濃度(以鋅離子的濃度計算，單位μg/ml)分別與鋅鹽進行對比測試的測試結(jié)果。
實例3 鋅鹽金黃色葡萄球菌4.418表皮葡萄球菌 4.418大腸桿菌 2.218綠膿桿菌 4.436白色念珠菌18 18近平滑假絲酵母菌 18 ＞72通過測試結(jié)果可知殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和真菌的抗菌性都明顯優(yōu)于殼聚糖和金屬鋅鹽。
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑的制備方法，其特征在于制備步驟如下(1)將適量殼聚糖溶解于濃度為0.005-0.03g/ml的稀醋酸溶液配成濃度為0.005-0.02g/ml的殼聚糖稀醋酸溶液，磁力攪拌下加入與殼聚糖的氨基摩爾比為4∶1-0.25∶1的二價鋅離子，用濃度為0.05-1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到4.5-6.0，持續(xù)攪拌3-4小時，得到殼聚糖鋅絡(luò)合物溶液。(2)將得到的殼聚糖鋅絡(luò)合物溶液加入到足量的丙酮和乙醇的混合溶劑中，得到白色沉淀，通過減壓抽濾分離沉淀和溶液體系，將獲得的殼聚糖鋅絡(luò)合物沉淀用足量無水乙醇洗滌，再次減壓抽濾去除洗滌劑，按照上述方法洗滌2-3次后，將獲得的殼聚糖鋅絡(luò)合物沉淀真空干燥，研碎即得到殼聚糖/鋅復(fù)合物粉末。(3)將殼聚糖/鋅復(fù)合物粉末溶解于0.05-2mol/l稀鹽酸，配成濃度為1000μg/ml-31.3μg/ml的溶液，用濃度為0.05-1mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)整溶液pH值到4.5-6.0，然后在高壓滅菌鍋中121-135℃下滅菌20-40分鐘，即得到殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑的制備方法，其特征在于所用殼聚糖為用常規(guī)方法純化后的殼聚糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑的制備方法，其特征在于所用殼聚糖的分子量范圍在2.6萬-78.8萬。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑的制備方法，其特征在于所用殼聚糖的脫乙酰度范圍在85％-95％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑的制備方法，其特征在于所用的丙酮和乙醇的混合溶劑中丙酮∶乙醇的體積比為3∶1～1∶3。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑的制備方法，其特征在于二價鋅離子來自于水合硫酸鋅、醋酸鋅、氯化鋅、硝酸鋅。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑的方法，該方法將原料殼聚糖提純后與過渡金屬鋅離子配位，并用丙酮乙醇混合溶劑沉淀，洗滌干燥獲得殼聚糖/鋅復(fù)合抗菌劑。用這種方法制得的有機/無機復(fù)合抗菌劑擁有優(yōu)良的廣譜抗菌性，對多種致病菌的抑菌活性都有大幅提高，比單獨的殼聚糖和單獨的金屬鋅抗菌劑對細菌和真菌的抑菌活性明顯增強。這種新型高效抗菌劑可用于食品、紡織工業(yè)和日用品的抗菌，且該制備方法簡單易行，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號A01N59/16GK1685829SQ20051001864
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月30日
發(fā)明者杜予民, 王小慧 申請人:武漢大學(xué)