專利名稱：增強(qiáng)植物抗旱性的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)科學(xué)領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及增強(qiáng)植物抗旱性的方法。

背景技術(shù)：
水是生命賴以生存的最基本物質(zhì)，當(dāng)今地球水資源狀況每況愈下。所以在人們的生活中極力提倡節(jié)水。在農(nóng)業(yè)科學(xué)研究中，加大了對(duì)抗旱品種的研究。
氣孔是在高等植物葉表皮分布的由兩個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞環(huán)繞形成的、二氧化碳和水分進(jìn)出植物體的必須經(jīng)過(guò)的通道。氣孔的開放和關(guān)閉程度直接決定植物水分蒸騰的速率和光合作用的效率。氣孔的開放受很多環(huán)境信號(hào)的控制，其中光是最重要的環(huán)境信號(hào)。藍(lán)光被證明是調(diào)控氣孔開放最為有效的光質(zhì)。而藍(lán)光要發(fā)揮其信號(hào)的調(diào)控作用，必須通過(guò)經(jīng)由藍(lán)光受體介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。雙子葉模式植物擬南芥菜目前有4個(gè)藍(lán)光受體PHOT1、PHOT2、CRY1、CRY2。PHOT1主要參與植物向光性的調(diào)節(jié)，PHOT2主要參與葉綠體的運(yùn)動(dòng)。PHOT1和PHOT2還共同參與氣孔的開放，因?yàn)閜hot1 phot2雙突變體的氣孔不能開放，但目前尚未對(duì)該突變體的抗旱性進(jìn)行研究。CRY1、CRY2在植物光形態(tài)建成、開花時(shí)間、花色素苷合成和生物節(jié)律性等重要生理過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但CRY1和CRY2在氣孔開放的調(diào)節(jié)中是否發(fā)揮作用目前尚無(wú)報(bào)道。


發(fā)明內(nèi)容
實(shí)驗(yàn)研究表明氣孔的開放和關(guān)閉程度直接決定植物水分蒸騰的速率和光合作用的效率。氣孔的開放受很多環(huán)境信號(hào)的控制，其中光是最重要的環(huán)境信號(hào)。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，植物的藍(lán)光受體隱花色素CRY1和CRY2基因的雙突變，即cry1 cry2雙突變體的氣孔開度比野生型的小，具有極強(qiáng)的保水能力。因此可以通過(guò)構(gòu)建植物cry1 cry2雙突變體來(lái)增強(qiáng)植物的抗旱性。由于cry1 cry2雙突變體開花時(shí)間的延遲，導(dǎo)致生育期延長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)體特別發(fā)達(dá)，所以本發(fā)明特別適用于培育抗旱節(jié)水的供觀賞和綠化的園林植物和以營(yíng)養(yǎng)器官為收獲指標(biāo)的農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)植物。
因此，本發(fā)明一方面涉及一種增強(qiáng)植物抗旱性的方法，該方法包括使該植物的CRY1和CRY2基因功能喪失或降低。
本發(fā)明另一方面涉及一種獲得抗旱性增強(qiáng)的植物的方法，該方法包括使該植物的CRY1和CRY2基因功能喪失或降低。
本發(fā)明再一方面涉及一種減少植物氣孔開度的方法，該方法包括，使該植物的CRY1和CRY2基因功能喪失或降低。
本發(fā)明還涉及其CRY1和CRY2基因功能喪失或降低的植物。
本發(fā)明還涉及CRY1和CRY2基因在增強(qiáng)植物抗旱性和減少氣孔開度中的用途。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)剔除所述CRY1和CRY2基因而實(shí)現(xiàn)所述失活。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)過(guò)量表達(dá)所述CRY1、CRY2的N端功能區(qū)而使其活性下降。
在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明特別適用于培育抗旱節(jié)水的供觀賞和綠化的園林植物和以營(yíng)養(yǎng)器官為收獲指標(biāo)的農(nóng)作物和經(jīng)濟(jì)植物。這些植物包括十字花科蕓苔屬、茄科番茄屬、茄科煙草屬、蝶形花科、禾本科稻屬、禾本科大麥屬的各種植物。
本發(fā)明可采用各種方法來(lái)使CRY1和CRY2基因功能喪失或降低。這些方法包括采用物理(快中子、γ射線)、化學(xué)誘變劑(EMS，甲基磺酸乙酯)、T-DNA或轉(zhuǎn)座子插入的方法。
在本發(fā)明方法中，可采用上述方法包括 (1)獲得CRY1基因突變和CRY2突變的突變體植株； (2)然后將其雜交，可選擇得到cry1 cry2雙突變體植株。
也可以利用CRY1、CRY2基因的cDNA序列，構(gòu)建RNAi或表達(dá)具有負(fù)顯性(dominant negative)效應(yīng)的N端功能區(qū)的植物表達(dá)載體，導(dǎo)入植物獲得轉(zhuǎn)基因植株。分別篩選在藍(lán)光條件下下胚軸明顯伸長(zhǎng)和在土壤中成熟植株開花時(shí)間明顯推遲的轉(zhuǎn)基因植株，即可以獲得CRY1和CRY2功能喪失或降低的植株。



圖1AWT(野生型)、cry1、cry2和cry1 cry2突變體植株在正常的有水情況下生長(zhǎng)約21天，然后斷水觀測(cè)其抗旱性。該圖顯示的為斷水后14天各基因型32株植株中代表性的2株。
圖1B離體葉片中最保水和最易失水的植物基因型分別為cry1 cry2雙突變及CRY1-ovx(過(guò)表達(dá)CRY1)植株。失水率為散失的水分與起始鮮重的百分比。圖示的值為三次測(cè)量的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，每一次的樣品大小為5-8片離體葉片。進(jìn)一步的分析表明WT和cry1 cry2雙突變體差異顯著(P≤0.01，t檢驗(yàn))。
圖2A共聚焦氣孔顯微照片，從左至右分別為WT、cry1、cry2、cry1 cry2、CRY1-ovx和CRY2-ovx。葉表皮在光強(qiáng)為50μmol.m-2.s-1紅光的背景下用5μmol.m-2.s-1藍(lán)光處理3小時(shí)。圖中的標(biāo)尺為10μm。
圖2BWT、cry1、cry2、cry1 cry2、CRY1-ovx和CRY2-ovx植株(過(guò)量表達(dá)CRY2的轉(zhuǎn)基因植株)氣孔在黑暗(Dark)、紅光(Red)和藍(lán)光(Blue)條件下的氣孔開度統(tǒng)計(jì)值。氣孔開度表達(dá)為40個(gè)氣孔的平均值加上標(biāo)準(zhǔn)誤差。cry1 cry2雙突變體的氣孔在藍(lán)光加紅光(Blue+Red)的條件下開度顯著低于野生性的(**P≤0.01，t檢驗(yàn))。
圖2Ccry1 cry2雙突變體、WT和CRY1-ovx植株的氣孔對(duì)不同強(qiáng)度藍(lán)光的反應(yīng)。CRY1-ovx植株的氣孔呈現(xiàn)超敏感的藍(lán)光反應(yīng)，而cry1 cry2雙突變體植株的氣孔呈現(xiàn)減弱的藍(lán)光反應(yīng)。

具體實(shí)施例方式 本申請(qǐng)以擬南芥菜為例，其CRY1基因的登陸號(hào)為S66907，cDNA序列如SEQ ID NO1所示。擬南芥菜CRY2基因的登陸號(hào)為U43397，cDNA序列如SEQID NO2所示。
所有的高等植物中都應(yīng)該存在CRY基因。通過(guò)敲除CRY1、CRY2構(gòu)建抗旱的cry1 cry2雙突變體適用于所有的雙子葉植物和單子葉植物。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有CRY基因的植物包括雙子葉植物中的擬南芥菜(十字花科蕓苔屬)、番茄(茄科番茄屬)、煙草(茄科煙草屬)、豌豆(蝶形花科)等等，單子葉植物中的水稻(禾本科稻屬)、大麥(禾本科大麥屬)等等，以及蕨類、苔蘚類和藻類中的一些物種。
可采用本領(lǐng)域已知的各種方法來(lái)使CRY基因功能喪失或降低。這些方法包括，例如可以用物理(快中子、γ射線)、化學(xué)誘變劑(EMS，甲基磺酸乙酯)、T-DNA或轉(zhuǎn)座子插入的方法獲得突變體庫(kù)。將突變種子在藍(lán)光下發(fā)芽，篩選下胚軸明顯變長(zhǎng)的植株。在后代通過(guò)分析在藍(lán)光、紅光和遠(yuǎn)紅光條件下分析表型，獲得只能在藍(lán)光下下胚軸變長(zhǎng)的突變體，通過(guò)PCR(或Western blot)來(lái)分析CRY1基因序列(或蛋白質(zhì)表達(dá))，即可以獲得CRY1功能喪失或降低的突變體；將突變種子在弱藍(lán)光下發(fā)芽，篩選下胚軸明顯變長(zhǎng)的植株，然后移栽到土壤中，篩選在長(zhǎng)日照條件下(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)開花時(shí)間明顯延遲的植株，通過(guò)PCR(或Western blot)來(lái)分析CRY2基因序列或蛋白質(zhì)表達(dá)，即可以獲得CRY2功能喪失或降低的突變體。
當(dāng)然，也可以利用CRY1、CRY2基因的cDNA序列，構(gòu)建RNAi或表達(dá)具有負(fù)顯性效應(yīng)的N端功能區(qū)的植物表達(dá)載體，導(dǎo)入植物獲得轉(zhuǎn)基因植株。由于CRY1最容易識(shí)別的功能包括在中等或強(qiáng)藍(lán)光下(10-30μmol.m-2.s-1)抑制下胚軸的伸長(zhǎng)、促進(jìn)花色素苷(anthocyanin)的積累[Ahmad，M.，Cashmore，A.R.(1993).HY4 gene of A.thaliana encodes aprotein with characteristics of ablue-light photoreceptor.Nature 366162-166；Ahmad，M.，Lin，C.，Cashmore，A.R.(1995).Mutations throughout an Arabidopsis blue-light photoreceptorimpair blue-light-responsive anthocyanin accumulation and inhibition ofhypocotyl elongation.Plant J.8653-658]；而CRY2最容易識(shí)別的功能包括在弱藍(lán)光下(1-5μmol.m-2.s-1)抑制下胚軸的伸長(zhǎng)[Lin，C.，Yang，H.，Guo，H.，Mockler，T.，Chen，J.，Cashmore，A.R.(1998).Enhancement of blue-lightsensitivity of Arabidopsis seedlings by a blue light receptor cryptochrome 2.PNAS 952686-2690]和促進(jìn)植株開花[Guo，H.，Yang，H.，Mockler，T.C.，Lin，C.(1998).Regulation of flowering time by Arabidopsis photoreceptors.Science 2791360-1363]。所以對(duì)獲得的表達(dá)CRY的RNAi或負(fù)顯性效應(yīng)的N端功能區(qū)載體的轉(zhuǎn)基因植株在中等或強(qiáng)藍(lán)光下條件下篩選得到的下胚軸明顯伸長(zhǎng)、花色素苷積累水平下降的植株即為CRY1功能喪失或降低的轉(zhuǎn)基因植株，而在弱藍(lán)光下篩選獲得的下胚軸明顯伸長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因植株、這些植株在土壤中長(zhǎng)成的成熟植株開花時(shí)間明顯推遲，這樣的植株即為CRY2功能喪失或降低的轉(zhuǎn)基因植株。
本發(fā)明使CRY基因功能喪失或降低的方法并不限于上述方法，任何能使所示CRY基因功能喪失或降低的方法都可以用于實(shí)施本發(fā)明的技術(shù)方案。
在本發(fā)明中，“CRY基因功能喪失或降低”指CRY基因的功能部分或全部喪失。在表型上，CRY1基因功能喪失或降低導(dǎo)致在中等或強(qiáng)藍(lán)光下(10-30μmol.m-2.s-1)下胚軸明顯伸長(zhǎng)、花色素苷(anthocyanin)積累下降；而CRY2基因功能喪失或降低導(dǎo)致在弱藍(lán)光下(1-5μmol.m-2.s-1)下胚軸明顯伸長(zhǎng)、成熟植株開花時(shí)間延遲。
在本發(fā)明中，氣孔是指高等植物葉片表皮特有的、由兩個(gè)腎形(雙子葉植物)或啞鈴形(禾本科植物)的保衛(wèi)細(xì)胞圍繞而成的小孔，該小孔的開放和關(guān)閉程度直接決定植物水分蒸騰的速率和光合作用的效率。氣孔開度可以用小孔的孔徑來(lái)表示，單位為微米(μm)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Molecular cloningA laboratorymanual，3rd ed.，Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)和植物分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Plant Molecular Biology-A Laboratory Mannual，Clark等，Springer-Verlag，1997)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1cry1 cry2雙突變體的構(gòu)建 用化學(xué)或物理誘變雙子葉植物種子，創(chuàng)制突變體庫(kù)。用M2代種子分別在弱藍(lán)光下和強(qiáng)藍(lán)光下選擇下胚軸高的小苗。在M3代分別在弱藍(lán)光、強(qiáng)藍(lán)光下和紅光下選擇，獲得僅僅在弱藍(lán)光、強(qiáng)藍(lán)光下表現(xiàn)高下胚軸的突變體。對(duì)在弱藍(lán)光下獲得的下胚軸變高的突變體移栽到土壤，選擇開花時(shí)間延遲的突變體。用PCR方法分別擴(kuò)增以上突變體的CRY1和CRY2位點(diǎn)，并通過(guò)測(cè)序確定突變位點(diǎn)。當(dāng)獲得確定的cry1、cry2單突變體后，通過(guò)雜交獲得F1代種子。在藍(lán)光下對(duì)F2種子進(jìn)行篩選，選擇下胚軸比cry1單突變體明顯高的小苗，經(jīng)過(guò)F3、F4代獲得cry1 cry2純合突變體。
實(shí)施例2過(guò)量表達(dá)CRY1、CRY2轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建 通過(guò)PCR方法分別獲得CRY1、CRY2 cDNA全長(zhǎng)，分別插入pKYL71載體或pHB中的35S啟動(dòng)子后面獲得過(guò)量表達(dá)CRY1和CRY2的植物表達(dá)載體。再將這些載體分別轉(zhuǎn)化植物，獲得轉(zhuǎn)基因植株。分別在中等強(qiáng)度藍(lán)光(20μmol.m-2.s-1)和弱藍(lán)光條件下(1-5μmol.m-2.s-1)篩選下胚軸明顯變短的小苗，獲得的轉(zhuǎn)基因植株分別為過(guò)量表達(dá)CRY1和CRY2的轉(zhuǎn)基因植株。
實(shí)施例3抗旱性研究 抗旱性和水損失研究 如Pei，Z.M.，Ghassemian，M.，Kwak，C.M.，McCourt，P.& Schroeder，J.I.(1998)Science 282，287-290所述，給植物灌溉3周，然后停止灌溉，使其斷水。去培養(yǎng)了21天的植株的葉子，測(cè)量其水分損失，以最初新鮮葉子的重量百分比表示，如Leung，J.，Merlot，S.& Giraudat，J.(1997)Plant Cell 9，759-771所述。在所有的抗旱性和水損失研究中，將植株或取下的葉子放在24℃、連續(xù)的160μmol·m-2·s-1的白熾熒光燈的條件下。相對(duì)濕度維持為45％。
氣孔開度測(cè)量 在測(cè)量氣孔開度以前，先把待測(cè)植株(3至4周齡)在黑暗下處理72小時(shí)以使所有氣孔關(guān)閉。在微弱的紅光下撕取葉片表皮，置于2毫升反應(yīng)液(5mMMES，pH 6.5，50mM KCl，and 0.1mM CaCl2)中，然后在相應(yīng)的光照條件下處理3小時(shí)。接著用顯微鏡(Nikon ECLIPSE TS100)觀察，并用軟件(ImageJ)測(cè)量氣孔的開度。氣孔的照片是用激光共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss LSM-510 META)拍攝的。所有的測(cè)量工作在9:00到15:00之間完成。
光源 測(cè)量氣孔時(shí)所用的光源是E-30 LED生長(zhǎng)培養(yǎng)箱，藍(lán)光的波長(zhǎng)為469納米，紅光的波長(zhǎng)為680納米，遠(yuǎn)紅光的波長(zhǎng)為730納米，在連續(xù)光照條件下的溫度是24℃。在藍(lán)光處理時(shí)，加入紅光(50μmol.m-2.s-1)作為背景。光譜測(cè)定用的儀器是美國(guó)ASD公司的便攜式光譜儀，光強(qiáng)測(cè)定用的儀器是美國(guó)Li-Cor公司的Li250光量子測(cè)定儀。
結(jié)果 (1)擬南芥cry1 cry2雙突變植株具有抗旱性 實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，同時(shí)斷水一周，野生型植株已經(jīng)萎蔫，而cry1 cry2雙突變體仍然存活。于是我們加入了兩個(gè)單突變體后在冷熒光白熾燈下對(duì)抗旱性進(jìn)行了進(jìn)一步研究。研究發(fā)現(xiàn)cry1 cry2雙突變植株比WT，cry1，cry2單突變體都要抗旱。cry1單突變體比野生型稍微抗旱，而cry2單突變體跟野生型幾乎沒(méi)有差別(圖1A)。
為了進(jìn)一步研究CRY1的抗旱功能，我們構(gòu)建了CRY1全長(zhǎng)的克隆，并且將其在野生型中表達(dá)。轉(zhuǎn)基因植株中CRY1蛋白的表達(dá)通過(guò)CCT1的抗體，用蛋白雜交加以鑒定。然后我們通過(guò)用不同基因型的植株的離體葉片進(jìn)行失水研究。研究表明最容易失水和最不容易失水的植株分別為CRY1過(guò)表達(dá)植株及cry1cry2雙突變植株。cry1，cry2單突變植株比野生型失水要少，而cry1單突變植株比cry2單突變植株失水要稍微少一點(diǎn)(圖1B)。這些結(jié)果表明CRY1和CRY2都參與cry1 cry2雙突變體的抗旱反應(yīng)。
(2)cry1 cry2突變體植株中觀察到的抗旱性與減少的藍(lán)光誘導(dǎo)的氣孔開放相關(guān) 為了檢驗(yàn)cry1 cry2雙突變植株所表現(xiàn)出的抗旱性是否與氣孔開放有關(guān)，我們測(cè)量了野生型、cry1單突變、cry2單突變、cry1 cry2雙突變和CRY1過(guò)表達(dá)植株的氣孔開度。如圖2A和2B所示，在藍(lán)光下，CRY1過(guò)表達(dá)植株的氣孔要比野生型植株開度更大，野生型又比cry1和cry2單突變的開度大，而這些單突變植株又比cry1 cry2雙突變的氣孔開度大。為了進(jìn)一步證實(shí)CRY2在這個(gè)過(guò)程中的作用，我們?cè)赾ry1單突變背景中過(guò)量表達(dá)含有Myc標(biāo)記的CRY2(Myc-CRY2)蛋白，并用Western Blot檢測(cè)Myc-CRY2蛋白的表達(dá)情況。在藍(lán)光下，這些Myc-CRY2過(guò)量表達(dá)的植株中，盡管氣孔的開度沒(méi)有CRY1過(guò)表達(dá)植株那么大，但還是明顯超過(guò)了cry1單突變和野生型的水平。而在黑暗中和紅光下，所有這些基因型植株的氣孔開度沒(méi)有差別，說(shuō)明CRY1和CRY2介導(dǎo)的氣孔開放是依賴于藍(lán)光的。
(3)cry1 cry2突變體植株的氣孔顯示出減少的藍(lán)光應(yīng)答 在1μmol.m-2.s-1藍(lán)光下，過(guò)表達(dá)CRY1的植株的氣孔有很強(qiáng)的應(yīng)答，而野生型和cry1 cry2雙突變體植株卻無(wú)應(yīng)答。當(dāng)光強(qiáng)增強(qiáng)到5μmol.m-2.s-1，所有基因型的氣孔都有應(yīng)答，其中CRY1過(guò)量表達(dá)的最敏感，野生型的其次，而cry1 cry2雙突變體最不敏感。當(dāng)光強(qiáng)進(jìn)一步增強(qiáng)到10μmol.m-2.s-1，野生型和cry1 cry2雙突變體仍然有應(yīng)答，但那些CRY1過(guò)表達(dá)植株卻更敏感。根據(jù)數(shù)據(jù)，我們計(jì)算cry1 cry2雙突變體要獲得約2.2μm的氣孔開度，需要大約是野生型10倍的光強(qiáng)。而要達(dá)到約3.0μm的氣孔開度，CRY1過(guò)表達(dá)的植株只需要少于野生型6倍的光強(qiáng)(圖2C)。所以，這些數(shù)據(jù)表明cry1 cry2突變體植株的氣孔顯示出減少的藍(lán)光應(yīng)答，而過(guò)量表達(dá)CRY1的植株的氣孔則顯示出增強(qiáng)的藍(lán)光應(yīng)答。
實(shí)施例4用RNAi的方法構(gòu)建CRY1和CRY2功能缺失的雙突變體的構(gòu)建 將反向CRY1全長(zhǎng)cDNA插入pKYL71載體[Schardl，C.L.，Byrd，A.D.，Benzion，G.，Altschuler，M.A.，Hildebrand，D.F.，和Hunt，A.G.(1987).“Design and construction of a versatile system for the expression of foreigngenes in plants”.Gene 61，1-11]中的35S啟動(dòng)子后面獲得反義表達(dá)的植物表達(dá)載體。也可以用雙鏈RNA干擾手段，即將兩段長(zhǎng)度大約為500bp的CRY1 cDNA片段(可以在任何位置)反向串聯(lián)后插入pKYL71載體中的35S啟動(dòng)子后面獲得干擾CRY1的RNAi的載體。通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將該載體導(dǎo)入植物，在F1代抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因種子在強(qiáng)藍(lán)光下發(fā)芽后，篩選下胚軸明顯伸長(zhǎng)的小苗，經(jīng)過(guò)自交獲得CRY1基因被敲除的、純合的轉(zhuǎn)基因植株；將兩段長(zhǎng)度大約為500bp的CRY2 cDNA片段(可以在任何位置)反向串聯(lián)后插入pHB載體[Mao，J.，Zhang，Y.C.，Sang，Y.，和Yang，H.Q.(2005).“A role for Arabidopsis cryptochromesand COP1 in the regulation of stomatal opening”，PNAS，in press，我們即將發(fā)表在PNAS的工作，構(gòu)建步驟為通過(guò)PCR擴(kuò)增潮霉素抗性基因-NPTII序列，并克隆至pCambia3301(CAMBIA，Canberra，Australia)的NcoI和BstEII位點(diǎn)，取代GUS片段。然后將含兩個(gè)串聯(lián)的35S啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)序列(MCS)和RBCS基因poly A序列的片段克隆到上述中間載體的EcoRI和HindIII位點(diǎn)，獲得pHB載體。該載體在轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)賦予植物同時(shí)對(duì)潮霉素和除草劑的抗性]中的35S啟動(dòng)子后面獲得干擾CRY2的RNAi的載體。用攜帶該載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化CRY1基因被敲除的純合的轉(zhuǎn)基因植株，利用潮霉素篩選得到在弱藍(lán)光下篩選下胚軸更高的小苗，當(dāng)移栽到土壤后用除草劑噴灑，選擇開花時(shí)間延遲的抗性植株即為CRY1和CRY2功能缺失的雙突變體。當(dāng)然也可以用上述方法先干擾敲掉CRY2，再干擾敲掉CRY1。
采用與實(shí)施例3相同的方式研究所獲得的CRY1和CRY2功能缺失的雙突變體植株進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)此實(shí)施例獲得的cry1 cry2雙突變體植物同樣具有抗旱性，且所觀察到的抗旱性與減少的藍(lán)光誘導(dǎo)的氣孔開放相關(guān)，其氣孔顯示出減少的藍(lán)光應(yīng)答。
實(shí)施例5CRY1和CRY2功能缺失雙突變體的構(gòu)建 由于CRY1是通過(guò)N端功能區(qū)(簡(jiǎn)稱CNT1)介導(dǎo)的二聚體形式發(fā)揮作用的，當(dāng)將CNT1導(dǎo)入野生型植株中，由于CNT1與內(nèi)源CRY1形成CNT1-CRY1二聚體，該二聚體沒(méi)有天然的CRY1-CRY1二聚體的功能，所以由于這種CNT1的負(fù)顯性(dominant negative)效應(yīng)導(dǎo)致表達(dá)CNT1植株呈現(xiàn)cry1突變體的表現(xiàn)型[Sang，Y.，Li，Q.H.，Rubio，V.，Zhang，Y.C.，Mao，J.，Deng，X.W.，和Yang，H.Q.(2005).N-Terminal domain-mediated homodimerization is required forphotoreceptor activity of Arabidopsis CRYPTOCHROME 1.The Plant Cell 17，1569-1584]。通過(guò)PCR獲得CNT1片段，將該片段插入pKYL71載體中的35S啟動(dòng)子后面獲得能導(dǎo)致負(fù)顯性效應(yīng)的植物表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)入植物，篩選獲得具有cry1突變體表型的轉(zhuǎn)基因植株；利用該轉(zhuǎn)基因植株，通過(guò)RNAi敲除CRY2，在藍(lán)光下選擇下胚軸明顯伸長(zhǎng)、同時(shí)移栽至土壤中后開花明顯延遲的植株，這樣的植株即為功能上的cry1 cry2雙突變體。
采用與實(shí)施例3相同的方式研究所獲得的CRY1和CRY2功能缺失的雙突變體植株進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)此實(shí)施例獲得的cry1 cry2雙突變體植物同樣具有抗旱性，且所觀察到的抗旱性與減少的藍(lán)光誘導(dǎo)的氣孔開放相關(guān)，其氣孔顯示出減少的藍(lán)光應(yīng)答。
序列表
<110>中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院
<120>增強(qiáng)植物抗旱性的方法
<130>054995
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>2046
<212>DNA
<213>擬南芥(Arabidopsis)
<400>1
atgtctggtt ctgtatctgg ttgtggttct ggtggttgta gtattgtatg gtttagaaga60
gatcttaggg ttgaagataa tccagcttta gcagcagcag taagagctgg tccagtgatt 120
gctctgtttg tttgggcacc agaagaagaa ggacactatc atccaggtag ggtttctagg 180
tggtggctca agaacagttt ggctcagctt gattcttctc ttagaagtct tggtacttgt 240
cttatcacca agagatctac tgatagtgtt gcttctcttc ttgatgttgt taaatccact 300
ggtgcttctc agatcttctt caaccatttg tatgatccat tgtctttggt gcgtgatcac 360
cgagctaaag atgttttgac ggcgcaaggc atagcggttc gatcattcaa cgcagacttg 420
ctttatgagc catgggaagt gactgatgaa ttaggccgtc ctttctctat gtttgctgcg 480
ttttgggaga gatgtcttag tatgccttat gaccctgagt ctcctcttct tccacctaag 540
aagatcattt caggggatgt gtctaaatgt gttgcggatc cattggtgtt tgaggatgac 600
tctgagaaag gaagcaatgc acttctggct cgtgcttggt ctcctggatg gagtaatggt 660
gataaagctc tcacaacgtt tataaacggt ccattgcttg aatactctaa gaaccgcaga 720
aaagccgata gtgctacaac ctcgtttctt tctccacact tgcattttgg ggaagtgagt 780
gtgagaaaag tttttcatct tgttcggatc aaacaggtcg cgtgggcaaa cgaaggaaac 840
gaggccgggg aagaaagcgt gaatcttttc ctgaaatcta ttggtctcag ggagtattct 900
aggtacataa gttttaacca tccatattcc catgaaagac cacttcttgg ccatctaaag 960
ttcttccctt gggctgtgga tgagaactat ttcaaggcat ggaggcaagg ccggactgga 1020
tatccgttgg tcgatgccgg gatgagagag ttatgggcta ctggttggtt gcatgatcgc 1080
ataagagtag ttgtttcaag cttctttgtt aaagtgcttc aattaccatg gagatggggg 1140
atgaagtatt tctgggacac acttcttgat gcggatttag aaagcgatgc tcttggttgg 1200
caatacatta ccggtactct cccggatagc cgggagtttg atcgcataga taaccctcag 1260
tttgaagggt acaagtttga tccaaatggt gaatacgtaa ggcgatggct tcctgaactc 1320
tctagactcc cgacagactg gatacatcat ccgtggaacg cacctgagtc cgttcttcaa 1380
gctgctggta tcgagcttgg atcaaactat cctctaccaa ttgttggatt agacgaagca 1440
aaagcacggc ttcatgaagc gctttcacag atgtggcaac tagaagctgc ttcaagagct 1500
gcaatagaga acggatccga agaaggactt ggagattctg ctgaggtaga ggaagctcct 1560
atagagttcc caagggacat tacaatggaa gagactgaac caaccagact caacccaaac 1620
aggagatatg aggatcagat ggttccaagc attacttctt ctttgatcag acctgaagaa 1680
gacgaagagt cgtctcttaa tttgagaaat tcagtaggag atagcagagc agaggttcca 1740
aggaacatgg ttaacaccaa ccaagctcag cagcggagag cagaaccggc ttcaaaccaa 1800
gtcactgcta tgattccaga atttaatatc agaattgttg cagagagcac tgaagactca 1860
acagcggaat cttccagcag cggaaggaga gaaagaagcg gaggcatagt ccccgagtgg 1920
tctccagggt actcagagca gttccctagt gaagaaaatc gtattggagg aggaagtaca 1980
acgtctagct acttgcagaa tcaccatgaa atactgaact ggagacggct ttcacaaacc 2040
gggtaa 2046
<210>2
<211>1839
<212>DNA
<213>擬南芥(Arabidopsis)
<400>2
atgaagatgg acaaaaagac tatagtttgg tttagaagag acctaaggat tgaggataat60
cctgcattag cagcagctgc tcacgaagga tctgtttttc ctgtcttcat ttggtgtcct 120
gaagaagaag gacagtttta tcctggaaga gcttcaagat ggtggatgaa acaatcactt 180
gctcacttat ctcaatcctt gaaggctctt ggatctgacc tcactttaat caaaacccac 240
aacacgattt cagcgatctt ggattgtatc cgcgttaccg gtgctacaaa agtcgtcttt 300
aaccacctct atgatcctgt ttcgttagtt cgggaccata ccgtaaagga gaagctggtg 360
gaacgtggga tctctgtgca aagctacaat ggagatctat tgtatgaacc gtgggagata 420
tactgcgaaa agggcaaacc ttttacgagt ttcaattctt actggaagaa atgcttagat 480
atgtcgattg aatccgttat gcttcctcct ccttggcggt tgatgccaat aactgcagcg 540
gctgaagcga tttgggcgtg ttcgattgaa gaactagggc tggagaatga ggccgagaaa 600
ccgagcaatg cgttgttaac tagagcttgg tctccaggat ggagcaatgc tgataagtta 660
ctaaatgagt tcatcgagaa gcagttgata gattatgcaa agaacagcaa gaaagttgtt 720
gggaattcta cttcactact ttctccgtat ctccatttcg gggaaataag cgtcagacac 780
gttttccagt gtgcccggat gaaacaaatt atatgggcaa gagataagaa cagtgaagga 840
gaagaaagtg cagatctttt tcttagggga atcggtttaa gagagtattc tcggtatata 900
tgtttcaact tcccgtttac tcacgagcaa tcgttgttga gtcatcttcg gtttttccct 960
tgggatgctg atgttgataa gttcaaggcc tggagacaag gcaggaccgg ttatccgttg1020
gtggatgccg gaatgagaga gctttgggct accggatgga tgcataacag aataagagtg1080
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tctgggagta tccccgatgg ccacgagctt gatcgcttgg acaatcccgc gttacaaggc1260
gccaaatatg acccagaagg tgagtacata aggcaatggc ttcccgagct tgcgagattg1320
ccaactgaat ggatccatca tccatgggac gctcctttaa ccgtactcaa agcttctggt1380
gtggaactcg gaacaaacta tgcgaaaccc attgtagaca tcgacacagc tcgtgagcta1440
ctagctaaag ctatttcaag aacccgtgaa gcacagatca tgatcggagc agcacctgat1500
gagattgtag cagatagctt cgaggcctta ggggctaata ccattaaaga acctggtctt1560
tgcccatctg tgtcttctaa tgaccaacaa gtaccttcgg ctgttcgtta caacgggtca1620
aagagagtga aacctgagga agaagaagag agagacatga agaaatctag gggattcgat1680
gaaagggagt tgttttcgac tgctgaatct tcttcttctt cgagtgtgtt tttcgtttcg1740
cagtcttgct cgttggcatc agaagggaag aatctggaag gtattcaaga ttcatctgat1800
cagattacta caagtttggg aaaaaatggt tgcaaatga 1839
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)植物抗旱性的方法，其特征在于，該方法包括使該植物的CRY1和CRY2基因功能喪失或降低。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述植物選自十字花科蕓苔屬、茄科番茄屬、茄科煙草屬、蝶形花科、禾本科稻屬、禾本科大麥屬。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)剔除所述CRY1和CRY2基因而實(shí)現(xiàn)所述失活。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)過(guò)量表達(dá)所述CRY1、CRY2的N端功能區(qū)而使其活性下降。
5.一種獲得抗旱性增強(qiáng)的植物的方法，其特征在于，所述方法包括使該植物的CRY1和CRY2基因功能喪失或降低。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，通過(guò)剔除所述CRY1和CRY2基因而實(shí)現(xiàn)所述失活。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，通過(guò)過(guò)量表達(dá)所述CRY1、CRY2的N端功能區(qū)而使其活性下降。
8.CRY1和CRY2基因在增強(qiáng)植物抗旱性中的用途。
9.一種減少植物氣孔開度的方法，其特征在于，所述方法包括，使該植物的CRY1和CRY2基因功能喪失或降低。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述植物選自十字花科蕓苔屬、茄科番茄屬、茄科煙草屬、蝶形花科、禾本科稻屬、禾本科大麥屬。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種增強(qiáng)植物抗旱性的方法，該方法包括使植物的CRY1和CRY2基因雙突變，獲得的cry1 cry2雙突變體的氣孔開度比野生型的小，具有極強(qiáng)的保水能力。
文檔編號(hào)A01H1/00GK1907009SQ200510028529
公開日2007年2月7日 申請(qǐng)日期2005年8月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月5日
發(fā)明者楊洪全, 茅健 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院