專利名稱：苜蓿青貯的微生物添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的添加劑，具體是一種苜蓿青貯的微生物添加劑。
背景技術(shù)：
紫花苜蓿(Medicago sativa L.以下簡稱苜蓿)是一種多年生豆科牧草，營養(yǎng)價值豐富，是草食動物優(yōu)質(zhì)的飼草，有“牧草之王”的美譽。長期以來，紫花苜蓿的保存主要以曬制干草為主，這種方法的最大缺點是營養(yǎng)物質(zhì)損失嚴重。近幾年，加拿大、日本等國家開始利用青貯的方法保存苜蓿，解決了苜蓿保存過程中營養(yǎng)物質(zhì)損失嚴重的問題。由于苜?？扇苄蕴呛康?，緩沖能高，屬于難青貯的豆科牧草，直接青貯效果不好，需要在青貯發(fā)酵過程中使用添加劑。國外目前使用比較普遍的添加劑種類有甲酸、乳酸菌制劑、酶制劑、以及乳酸菌和酶制劑的混合物等。
經(jīng)對現(xiàn)有技術(shù)的文獻檢索發(fā)現(xiàn)，Mitsuaki Ohshima等(1997)在Animal FeedScience Technology雜志第66期(129-137頁)首次提出綠汁發(fā)酵液(PreviouslyFermented Juice，簡寫為PFJ)的制作方法及其在苜蓿青貯中的效果。該方法的主要制作過程如下新鮮苜?！兴椤铀n→粉碎(打漿)→過濾→濾液中加葡萄糖→發(fā)酵→制成PFJ。由于綠汁發(fā)酵液含有多種來源于苜蓿的乳酸菌菌種，在苜蓿青貯中有明顯降低青貯料pH值的作用，并且，綠汁發(fā)酵液制作簡單，取材方便，家畜食用青貯料后無副作用，青貯制作過程中對人體無害，因此，逐漸開始在生產(chǎn)中得到應用。作為乳酸發(fā)酵的啟動因子，綠汁發(fā)酵液能夠在青貯過程中促進乳酸菌種群擴大，抑制其它有害菌的生長，改善苜蓿青貯品質(zhì)。許多的研究證明用綠汁發(fā)酵液青貯苜蓿，其作用比接種單一乳酸菌更有效，可顯著降低青貯苜蓿的pH值。然而，綠汁發(fā)酵液中除含有多種乳酸菌外，還含有多種有害的菌種，這些菌種同樣也具有啟動因子的作用，在苜蓿青貯過程中誘導有害菌種群擴大，因而降低或減緩了綠汁發(fā)酵液更好地促進乳酸菌擴大繁殖的作用，使得青貯苜蓿在預備發(fā)酵期和酸化前期不能在短期內(nèi)急劇降低青貯料的pH值，這是綠汁發(fā)酵液作為青貯添加劑在苜蓿青貯中存在的最大缺陷，影響到青貯苜蓿高質(zhì)量發(fā)酵和形成高質(zhì)量的青貯料。在進一步的檢索中，至今還未見有關(guān)從苜蓿中分離乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)作為青貯添加劑的報道，也未見將綠汁發(fā)酵液和乳酸鏈球菌混合作為苜蓿青貯添加劑的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對背景技術(shù)中綠汁發(fā)酵液青貯的不足和缺陷，提供一種苜蓿青貯的微生物添加劑，使其具有明顯降低青貯預備發(fā)酵期和酸化前期苜蓿pH值，提高青貯質(zhì)量的效果。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，本發(fā)明所述的苜蓿青貯的微生物添加劑由綠汁發(fā)酵液(PFJ)和保存有乳酸鏈球菌組成，具體是由綠汁發(fā)酵液(PFJ)和保存有乳酸鏈球菌的MRS液體培養(yǎng)基按50-70％∶30-50％的重量百分比組成，其中每ml MRS液體培養(yǎng)基中至少含有乳酸鏈球菌2×107cfu。每10ml該添加劑含PFJ5-7ml，乳酸鏈球菌107～108cuf，青貯時每公斤苜蓿加入10-15ml添加劑。
綠汁發(fā)酵液和乳酸鏈球菌是以被青貯的苜蓿為原料，經(jīng)制作和分離而來。由苜蓿中分離的乳酸鏈球菌比從其它植物中分離的乳酸鏈球菌能夠更好地適應苜蓿青貯發(fā)酵的環(huán)境，產(chǎn)生更多的乳酸。在綠汁發(fā)酵液中加入該乳酸鏈球菌強化了綠汁發(fā)酵液促進青貯苜蓿發(fā)酵，快速降低pH值的作用。
所述的苜蓿青貯的微生物添加劑通過以下步驟制備(1)選擇新鮮的苜蓿材料；(2)綠汁發(fā)酵液的制作；(3)乳酸鏈球菌分離、純化過程；(4)乳酸鏈球菌活化；(5)把綠汁發(fā)酵液與活化的乳酸鏈球菌按比例混合，形成苜蓿青貯微生物添加劑。
本發(fā)明的特點在于(1)乳酸鏈球菌由苜蓿中分離；(2)將該乳酸鏈球菌與PFJ兩個功能互補的添加劑按比例混合，形成本添加劑，它不同于國外單獨使用乳酸鏈球菌(由非苜蓿材料中獲得)或PFJ作為苜蓿青貯添加劑的方法。綠汁發(fā)酵液是乳酸發(fā)酵的啟動因子，而乳酸鏈球菌是預備發(fā)酵期起主要作用的乳酸菌菌種，是預備發(fā)酵期繁殖最快的乳酸菌菌種，兩種添加劑的綜合和互補，強化了綠汁發(fā)酵液促進青貯苜蓿發(fā)酵的作用，使本添加劑比綠汁發(fā)酵液和乳酸鏈球菌這兩種添加劑單獨使用有更好的降低pH和提高青貯質(zhì)量的效果。用本添加劑處理的苜蓿，經(jīng)30天青貯，青貯料pH值比用綠汁發(fā)酵液處理降低10.4～12.7％。本發(fā)明所得苜蓿青貯微生物添加劑，有明顯降低青貯預備發(fā)酵期和酸化前期苜蓿pH值，提高青貯質(zhì)量的效果。
具體實施例方式
結(jié)合本發(fā)明方法步驟提供以下實施例實施例一苜蓿青貯微生物添加劑中，綠汁發(fā)酵液∶MRS液體培養(yǎng)基中的活乳酸鏈球菌為50％∶50％，每10ml該添加劑含PFJ 5ml，乳酸鏈球菌108cuf，青貯時每公斤苜蓿加入10ml添加劑。
1、選擇新鮮苜蓿材料取新鮮的苜蓿植株，去掉基部和頂部各約10cm，同時去掉主枝和比較粗的枝條，將剩余的幼枝和葉保留，作為綠汁發(fā)酵液的制作材料；2、綠汁發(fā)酵液制作將新鮮的苜蓿材料切碎成3-5cm，按苜蓿(g)和水(ml)1∶2.5的比例加入蒸餾水，充分混合，用高速組織粉碎機搗碎，靜置1小時，雙層紗布過濾，按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在濾液中加入葡萄糖或相當葡萄糖量的糖漿，充分攪拌，置于30℃發(fā)酵48小時，制成綠汁發(fā)酵液；3、乳酸鏈球菌分離、純化將綠汁發(fā)酵液稀釋100倍，置于分離固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基pH＝5.8，35℃下培養(yǎng)48h，挑選溶鈣圈大、培養(yǎng)基變黃的菌落，放置在MRS固體培養(yǎng)基純化，得到乳酸鏈球菌(ST)，純化后的乳酸鏈球菌用裝有MRS固體培養(yǎng)基的試管保存。
所述的分離固體培養(yǎng)基(％)配方為牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏1g，葡萄糖1g，番茄汁20％，土溫800.05％，碳酸鈣2g，溴甲酚綠0.01％，瓊脂1.5g，pH＝5.8。
所述的MRS固體培養(yǎng)基(％)配方為蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，檸檬酸二銨0.2g，乙酸鈉0.5g，葡萄糖2g，土溫800.1％，MgSO4.7H2O 0.058g，MnSO4.4H2O 0.025g，瓊脂1.5g，pH＝6.2，121℃滅菌15min。
4、乳酸鏈球菌活化將分離好的乳酸鏈球菌放在MRS液體培養(yǎng)基中活化，活化溫度35℃，活化時間24小時，活化完成時，每ml液體培養(yǎng)基中至少含有乳酸鏈球菌2×107cfu。
所述的MRS液體培養(yǎng)基(％)配方為蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，檸檬酸二銨0.2g，乙酸鈉0.5g，葡萄糖2g，土溫800.1％，MgSO4.7H2O0.058g，MnSO4.4H2O 0.025g，pH＝6.2，121℃滅菌15min。
5、苜蓿青貯微生物添加劑的制備把綠汁發(fā)酵液與在MRS液體培養(yǎng)基中的活乳酸鏈球菌按50％∶50％的比例混合，形成苜蓿青貯微生物添加劑，其中每10ml該添加劑含PFJ 5ml，乳酸鏈球菌108cuf，青貯時每公斤苜蓿加入10ml添加劑。
表2實施例一的苜蓿青貯效果

從表2看出，用本添加劑處理的苜蓿，經(jīng)30天青貯，青貯料感觀評價達到優(yōu)良，而PFJ的感觀評價為中等；pH值和蛋白質(zhì)含量分別比PFJ處理低12.7％和提高8.7％，差異均達到顯著水平。
實施例二苜蓿青貯微生物添加劑中，綠汁發(fā)酵液∶MRS液體培養(yǎng)基中的活乳酸鏈球菌為60％∶40％的比例混合，形成苜蓿青貯微生物添加劑，其中每10ml該添加劑含PFJ 6ml，乳酸鏈球菌8×107cuf，青貯時每公斤苜蓿加入12ml添加劑。
1、選擇新鮮苜蓿材料取新鮮的苜蓿植株，去掉基部和頂部各約10cm，同時去掉主枝和比較粗的枝條，將剩余的幼枝和葉保留，作為綠汁發(fā)酵液的制作材料；2、綠汁發(fā)酵液制作將新鮮的苜蓿材料切碎成3-5cm，按苜蓿(g)和水(ml)1∶2.5的比例加入蒸餾水，充分混合，用高速組織粉碎機搗碎，靜置1小時，雙層紗布過濾，按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在濾液中加入葡萄糖或相當葡萄糖量的糖漿，充分攪拌，置于30℃發(fā)酵48小時，制成綠汁發(fā)酵液；3、乳酸鏈球菌分離、純化將綠汁發(fā)酵液稀釋80倍，置于分離固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基pH＝6.1，37℃下培養(yǎng)48h，挑選溶鈣圈大、培養(yǎng)基變黃的菌落，放置在MRS固體培養(yǎng)基純化，得到乳酸鏈球菌(ST)，純化后的乳酸鏈球菌用裝有MRS固體培養(yǎng)基的試管保存；所述的分離固體培養(yǎng)基(％)配方為牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏1g，葡萄糖1g，番茄汁20％，土溫800.05％，碳酸鈣2g，溴甲酚綠0.01％，瓊脂1.5g，pH＝6.1。
所述的MRS固體培養(yǎng)基(％)配方與實施例一相同。
4、乳酸鏈球菌活化將分離的乳酸鏈球菌放在MRS液體培養(yǎng)基中活化，活化溫度37℃，活化時間30小時，活化完成時，每ml液體培養(yǎng)基中至少含有乳酸鏈球菌2×107cfu。
所述的MRS液體培養(yǎng)基(％)配方與實施例一相同。
5、苜蓿青貯微生物添加劑的制備把綠汁發(fā)酵液與在MRS液體培養(yǎng)基中的活乳酸鏈球菌按60％∶40％的比例混合，形成苜蓿青貯微生物添加劑，其中每10ml該添加劑含PFJ 6ml，乳酸鏈球菌8×107cuf，青貯時每公斤苜蓿加入12ml添加劑。
表3 實施例二的苜蓿青貯效果

從表3看出，用本添加劑處理的苜蓿，經(jīng)30天青貯，青貯料感觀評價達到優(yōu)良，而PFJ的感觀評價為中等；pH值和蛋白質(zhì)含量分別比PFJ處理低11.9％和提高9.2％，差異均達到顯著水平。
實施例三苜蓿青貯微生物添加劑中，綠汁發(fā)酵液MRS液體培養(yǎng)基中的活乳酸鏈球菌為70％30％的比例混合，形成苜蓿青貯微生物添加劑，其中每10ml該添加劑含PFJ 7ml，乳酸鏈球菌6×107cuf，青貯時每公斤苜蓿加入15ml添加劑。
1、選擇新鮮苜蓿材料取新鮮的苜蓿植株，去掉基部和頂部各約10cm，同時去掉主枝和比較粗的枝條，將剩余的幼枝和葉保留，作為綠汁發(fā)酵液的制作材料；2、綠汁發(fā)酵液制作將新鮮的苜蓿材料切碎成3-5cm，按苜蓿(g)和水(ml)1∶2.5的比例加入蒸餾水，充分混合，用高速組織粉碎機搗碎，靜置1小時，雙層紗布過濾，按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在濾液中加入葡萄糖或相當葡萄糖量的糖漿，充分攪拌，置于30℃發(fā)酵48小時，制成綠汁發(fā)酵液；3、乳酸鏈球菌分離、純化將綠汁發(fā)酵液稀釋60倍，置于固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基pH＝6.4，40℃下培養(yǎng)48h，挑選溶鈣圈大、培養(yǎng)基變黃的菌落，放置在MRS固體培養(yǎng)基純化，得到乳酸鏈球菌(ST)，純化后的乳酸鏈球菌用裝有MRS固體培養(yǎng)基的試管保存；所述的固體培養(yǎng)基(％)配方為牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏1g，葡萄糖1g，番茄汁20％，土溫800.05％，碳酸鈣2g，溴甲酚綠0.01％，瓊脂1.5g，pH＝6.4。
所述的MRS固體培養(yǎng)基(％)配方與實施例一相同。
4、乳酸鏈球菌活化將分離好的乳酸鏈球菌放在MRS液體培養(yǎng)基中活化，活化溫度37℃，活化時間36小時，活化完成時，每ml液體培養(yǎng)基中至少含有乳酸鏈球菌2×107cfu。
所述的MRS液體培養(yǎng)基(％)配方與實施例一相同。
5、苜蓿青貯微生物添加劑的制備把綠汁發(fā)酵液與在MRS液體培養(yǎng)基中的活乳酸鏈球菌按70％∶30％的比例混合，形成苜蓿青貯微生物添加劑，其中每10ml該添加劑含PFJ 7ml，乳酸鏈球菌6×107cuf，青貯時每公斤苜蓿加入15ml添加劑。
表4 實施例三的苜蓿青貯效果

從表4看出，用本添加劑處理的苜蓿，經(jīng)30天青貯，青貯料感觀評價達到優(yōu)良，而PFJ的感觀評價為中等；pH值和蛋白質(zhì)含量分別比PFJ處理低10.4％和提高8.4％，差異均達到顯著水平。
權(quán)利要求
1.一種苜蓿青貯的微生物添加劑，其特征在于，由綠汁發(fā)酵液和保存有乳酸鏈球菌的MRS液體培養(yǎng)基按50-70％∶30-50％的重量百分比混合組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苜蓿青貯微生物添加劑，其特征是，活化的乳酸鏈球菌保存在MRS液體培養(yǎng)基中，每m1MRS液體培養(yǎng)基中至少含有乳酸鏈球菌2×107cfu。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的苜蓿青貯的微生物添加劑，其特征是，所述的MRS液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，檸檬酸二銨0.2g，乙酸鈉0.5g，葡萄糖2g，土溫800.1％，MgSO4.7H2O 0.058g，MnSO4.4H2O 0.025g，pH＝6.2，121℃滅菌15min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苜蓿青貯微生物添加劑，其特征是，每10ml該添加劑含PFJ 5-7ml，乳酸鏈球菌3-5ml，含乳酸鏈球菌107～108cuf。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或者4所述的苜蓿青貯微生物添加劑，其特征是，青貯時每公斤苜蓿加入10-15ml添加劑。
全文摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域的苜蓿青貯的微生物添加劑，由綠汁發(fā)酵液和保存有乳酸鏈球菌的MRS液體培養(yǎng)基按50－70％∶30－50％的比例組成，其中，每ml MRS液體培養(yǎng)基中至少含有乳酸鏈球菌2×10
文檔編號A23K3/00GK1757711SQ200510028689
公開日2006年4月12日 申請日期2005年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月11日
發(fā)明者安淵, 田瑞霞, 王光文 申請人:上海交通大學