專利名稱：苜蓿青貯的復(fù)合菌添加劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種生物技術(shù)領(lǐng)域的添加劑，具體是一種苜蓿青貯的復(fù)合菌添加劑。
背景技術(shù)：
紫花苜蓿(Medicago sativa L.，以下簡(jiǎn)稱苜蓿)是一種多年生豆科牧草，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，是草食動(dòng)物優(yōu)質(zhì)的飼草，有“牧草之王”的美譽(yù)。長(zhǎng)期以來(lái)，紫花苜蓿的保存主要以曬制干草為主，這種方法的最大缺點(diǎn)是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失嚴(yán)重。近幾年，加拿大、日本等國(guó)家開(kāi)始利用青貯的方法保存苜蓿，解決了苜蓿保存過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失嚴(yán)重的問(wèn)題。由于苜蓿可溶性糖含量低，緩沖能高，屬于難青貯的豆科牧草，直接青貯效果不好，需要在青貯發(fā)酵過(guò)程中使用添加劑。國(guó)外目前使用比較普遍的添加劑種類有甲酸、乳酸菌制劑、酶制劑、以及乳酸菌和酶制劑的混合物等。我國(guó)在苜蓿青貯方面的研究尚處于起步階段，對(duì)苜蓿青貯添加劑的研究尚屬空白，但我國(guó)苜蓿青貯市場(chǎng)潛力巨大，青貯添加劑的市場(chǎng)前景很好。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Mitsuaki Ohshima等(1997)在AnimalFeed Science Technology雜志第66期(129-137頁(yè))首次提出綠汁發(fā)酵液(Previously Fermented Juice，簡(jiǎn)寫(xiě)為PFJ)的制作方法及其在苜蓿青貯中的效果。該方法的主要制作過(guò)程如下新鮮苜蓿→切碎→加水→浸漬→粉碎(打漿)→過(guò)濾→濾液中加葡萄糖→發(fā)酵→制成PFJ。由于綠汁發(fā)酵液含有多種來(lái)源于苜蓿的乳酸菌菌種，在苜蓿青貯中有明顯降低青貯料pH值的作用，并且，綠汁發(fā)酵液制作簡(jiǎn)單，取材方便，家畜食用青貯料后無(wú)副作用，青貯制作過(guò)程中對(duì)人體無(wú)害，因此，逐漸開(kāi)始在生產(chǎn)中得到應(yīng)用。作為乳酸發(fā)酵的啟動(dòng)因子，綠汁發(fā)酵液能夠在青貯過(guò)程中促進(jìn)乳酸菌種群擴(kuò)大，抑制其它有害菌的生長(zhǎng)，改善苜蓿青貯品質(zhì)。許多的研究證明用綠汁發(fā)酵液青貯苜蓿，其作用比接種單一乳酸菌更有效，可顯著降低青貯苜蓿的pH值。然而，綠汁發(fā)酵液中除含有多種乳酸菌外，還含有多種有害的菌種，這些菌種同樣也具有啟動(dòng)因子的作用，在苜蓿青貯過(guò)程中誘導(dǎo)有害菌種群擴(kuò)大，因而降低或減緩了綠汁發(fā)酵液更好地促進(jìn)乳酸菌擴(kuò)大繁殖的作用，使得青貯苜蓿在預(yù)備發(fā)酵期和酸化前期不能在短期內(nèi)急劇降低青貯料的pH值，這是綠汁發(fā)酵液作為青貯添加劑在苜蓿青貯中存在的最大缺陷，影響到青貯苜蓿高質(zhì)量發(fā)酵和形成高質(zhì)量的青貯料。在進(jìn)一步的檢索中，尚未見(jiàn)將綠汁發(fā)酵液與乳酸鏈球菌和糞鏈球菌混合作為苜蓿青貯添加劑的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)中PFJ青貯的不足和缺陷對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)，提供一種苜蓿青貯的復(fù)合菌添加劑，使其在綠汁發(fā)酵液中加入該乳酸鏈球菌和糞鏈球菌強(qiáng)化了綠汁發(fā)酵液促進(jìn)青貯苜蓿發(fā)酵、快速降低pH值的作用。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明所述的苜蓿青貯的復(fù)合菌添加劑由乳酸鏈球菌(Streptococcus lactis)、糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)和綠汁發(fā)酵液(PFJ)組成，具體是由綠汁發(fā)酵液與保存有乳酸鏈球菌和糞鏈球菌的MRS液體培養(yǎng)基按50-60％∶20-25％∶20-25％的重量百分比混合，形成苜蓿青貯微生物添加劑，其中每ml MRS液體培養(yǎng)基中至少含有乳酸鏈球菌或糞鏈球菌5×106cfu，每10ml該添加劑含PFJ 5-6ml，乳酸鏈球菌和糞鏈球菌各106～107cuf，青貯時(shí)每公斤苜蓿加入10-15ml添加劑。綠汁發(fā)酵液和乳酸鏈球菌是以被青貯的苜蓿為原料，經(jīng)制作和分離而來(lái)，糞鏈球菌從玉米中分離而來(lái)。由苜蓿中分離的乳酸鏈球菌比從其它植物中分離的乳酸鏈球菌能夠更好地適應(yīng)苜蓿青貯發(fā)酵的環(huán)境，產(chǎn)生更多乳酸。
所述的MRS液體培養(yǎng)基(％)配方為蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，檸檬酸二銨0.2g，乙酸鈉0.5g，葡萄糖2g，土溫800.1％，MgSO4.7H2O 0.058g，MnSO4.4H2O 0.025g，pH＝6.2，121℃滅菌15min。
本發(fā)明所述的添加劑通過(guò)以下步驟制得(1)制作綠汁發(fā)酵液；(2)從綠汁發(fā)酵液中分離乳酸鏈球菌；(3)乳酸鏈球菌和糞鏈球菌活化；(4)把綠汁發(fā)酵液與活化的乳酸鏈球菌和糞鏈球菌按比例混合，形成苜蓿青貯的復(fù)合菌添加劑。
本發(fā)明的特點(diǎn)在于(1)乳酸鏈球菌由苜蓿中分離；(2)將該乳酸鏈球菌、糞鏈球菌與綠汁發(fā)酵液三種功能互補(bǔ)的添加劑按比例混合，形成本添加劑，它不同于國(guó)外單獨(dú)使用乳酸鏈球菌或PFJ作為苜蓿青貯添加劑的方法。綠汁發(fā)酵液是乳酸發(fā)酵的啟動(dòng)因子；乳酸鏈球菌是預(yù)備發(fā)酵期起主要作用的乳酸菌菌種，是預(yù)備發(fā)酵期繁殖最快的乳酸菌菌種；糞鏈球菌是青貯酸化期起主要作用的乳酸菌菌種，是酸化期繁殖最快的乳酸菌菌種，三種添加劑的綜合和互補(bǔ)，強(qiáng)化了綠汁發(fā)酵液促進(jìn)青貯苜蓿發(fā)酵的作用，使本添加劑比綠汁發(fā)酵液和乳酸鏈球菌兩種添加劑單獨(dú)使用有更好的降低pH和提高青貯質(zhì)量的效果。用本添加劑處理的苜蓿，經(jīng)30天青貯，青貯料pH值比用綠汁發(fā)酵液處理降低13.3～13.8％。
具體實(shí)施例方式
結(jié)合本發(fā)明方法步驟提供以下實(shí)施例實(shí)施例一1、綠汁發(fā)酵液制作(1)取新鮮的苜蓿植株，去掉基部和頂部各約10cm，同時(shí)去掉主枝和比較粗的枝條，將剩余的幼枝和葉保留，切碎成3-5cm，(2)按苜蓿(g)和水(ml)1∶2.5的比例加入蒸餾水，充分混合，用高速組織粉碎機(jī)搗碎，靜置1小時(shí)，雙層紗布過(guò)濾，按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在濾液中加入葡萄糖或相當(dāng)葡萄糖量的糖漿，充分?jǐn)嚢瑁糜?0℃的環(huán)境中發(fā)酵48小時(shí)，制成綠汁發(fā)酵液；2、乳酸鏈球菌分離、純化將綠汁發(fā)酵液稀釋100倍，置于分離固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基pH＝5.8，35℃下培養(yǎng)48h，挑選溶鈣圈大、培養(yǎng)基變黃的菌落，放置在MRS固體培養(yǎng)基純化，得到乳酸鏈球菌(ST)，純化后的乳酸鏈球菌用裝有MRS固體培養(yǎng)基的試管保存。
所述的分離固體培養(yǎng)基(％)配方為牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏1g，葡萄糖1g，番茄汁20％，土溫800.05％，碳酸鈣2g，溴甲酚綠0.01％，瓊脂1.5g，pH＝5.8。
所述的MRS固體培養(yǎng)基(％)配方為蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，檸檬酸二銨0.2g，乙酸鈉0.5g，葡萄糖2g，土溫80 0.1％，MgSO4.7H2O 0.058g，MnSO4.4H2O 0.025g，瓊脂1.5g，pH＝6.2，121℃滅菌15min。
3、乳酸鏈球菌和糞鏈球菌活化分別將乳酸鏈球菌和糞鏈球菌放在MRS液體培養(yǎng)基中活化，活化溫度35℃，活化時(shí)間36小時(shí)，活化完成時(shí)，每ml液體培養(yǎng)基中至少含有乳酸鏈球菌或糞鏈球菌5×106cfu。
所述的MRS液體培養(yǎng)基(％)配方為蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，檸檬酸二銨0.2g，乙酸鈉0.5g，葡萄糖2g，土溫800.1％，MgSO4.7H2O 0.058g，MnSO4.4H2O 0.025g，pH＝6.2，121℃滅菌15min。
4、苜蓿青貯的復(fù)合菌添加劑的制作把綠汁發(fā)酵液與保存有乳酸鏈球菌和糞鏈球菌的MRS液體培養(yǎng)基按50％∶25％∶25％的比例混合，形成苜蓿青貯微生物添加劑，其中每10ml該添加劑含PFJ 5ml，乳酸鏈球菌和糞鏈球菌各1.25×107cuf，青貯時(shí)每公斤苜蓿加入10ml添加劑。
表2 實(shí)施例一的苜蓿青貯效果

從表2看出，用本發(fā)酵液處理的苜蓿，經(jīng)30天青貯，青貯料感觀評(píng)價(jià)達(dá)到優(yōu)良，而PFJ的感觀評(píng)價(jià)為中等；pH值和蛋白質(zhì)含量分別比PFJ處理低13.3％和提高14.5％，差異均達(dá)到顯著水平。
實(shí)施例二1、綠汁發(fā)酵液制作(1)取新鮮的苜蓿植株，去掉基部和頂部各約10cm，同時(shí)去掉主枝和比較粗的枝條，將剩余的幼枝和葉保留，切碎成3-5cm，(2)按苜蓿(g)和水(ml)1∶2.5的比例加入蒸餾水，充分混合，用高速組織粉碎機(jī)搗碎，靜置1小時(shí)，雙層紗布過(guò)濾，按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在濾液中加入葡萄糖或相當(dāng)葡萄糖量的糖漿，充分?jǐn)嚢?，置?0℃的環(huán)境中發(fā)酵48小時(shí)，制成綠汁發(fā)酵液；2、乳酸鏈球菌分離、純化將綠汁發(fā)酵液稀釋80倍，置于分離固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基pH＝6.1，37℃下培養(yǎng)48h，挑選溶鈣圈大、培養(yǎng)基變黃的菌落，放置在MRS固體培養(yǎng)基純化，得到乳酸鏈球菌(ST)，純化后的乳酸鏈球菌用裝有MRS固體培養(yǎng)基的試管保存；所述的分離固體培養(yǎng)基(％)配方為牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏1g，葡萄糖1g，番茄汁20％，土溫800.05％，碳酸鈣2g，溴甲酚綠0.01％，瓊脂1.5g，pH＝6.1。
所述的MRS固體培養(yǎng)基(％)配方與實(shí)施例一相同。
3、乳酸鏈球菌和糞鏈球菌活化分別將乳酸鏈球菌和糞鏈球菌放在MRS液體培養(yǎng)基中活化，活化溫度35℃，活化時(shí)間30小時(shí)，活化完成時(shí)，每ml液體培養(yǎng)基中至少含有乳酸鏈球菌或糞鏈球菌5×106cfu。
所述的MRS液體培養(yǎng)基(％)配方與實(shí)施例一相同。
4、苜蓿青貯的復(fù)合菌添加劑的制作把綠汁發(fā)酵液與保存有乳酸鏈球菌和糞鏈球菌的MRS液體培養(yǎng)基按55％∶20％∶25％的比例混合，形成苜蓿青貯微生物添加劑，其中每10ml該添加劑含PFJ 5ml，乳酸鏈球菌107cuf、糞鏈球菌1.25×107cuf，青貯時(shí)每公斤苜蓿加入12ml添加劑。
表3 實(shí)施例一的苜蓿青貯效果

從表3看出，用本發(fā)酵液處理的苜蓿，經(jīng)30天青貯，青貯料感觀評(píng)價(jià)達(dá)到優(yōu)良，而PFJ的感觀評(píng)價(jià)為中等；pH值和蛋白質(zhì)含量分別比PFJ處理低13.8％和提高15.7％，差異均達(dá)到顯著水平。
實(shí)施例三1、綠汁發(fā)酵液制作(1)取新鮮的苜蓿植株，去掉基部和頂部各約10cm，同時(shí)去掉主枝和比較粗的枝條，將剩余的幼枝和葉保留，切碎成3-5cm，(2)按苜蓿(g)和水(ml)1∶2.5的比例加入蒸餾水，充分混合，用高速組織粉碎機(jī)搗碎，靜置1小時(shí)，雙層紗布過(guò)濾，按苜蓿原料∶葡萄糖＝10g∶1g的比例在濾液中加入葡萄糖或相當(dāng)葡萄糖量的糖漿，充分?jǐn)嚢?，置?0℃的環(huán)境中發(fā)酵48小時(shí)，制成綠汁發(fā)酵液；2、乳酸鏈球菌分離、純化將綠汁發(fā)酵液稀釋60倍，置于固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基pH＝6.4，40℃下培養(yǎng)48h，挑選溶鈣圈大、培養(yǎng)基變黃的菌落，放置在MRS固體培養(yǎng)基純化，得到乳酸鏈球菌(ST)，純化后的乳酸鏈球菌用裝有MRS固體培養(yǎng)基的試管保存；所述的固體培養(yǎng)基(％)配方為牛肉膏1g，蛋白胨1g，酵母膏1g，葡萄糖1g，番茄汁20％，土溫800.05％，碳酸鈣2g，溴甲酚綠0.01％，瓊脂1.5g，pH＝6.4。
所述的MRS固體培養(yǎng)基(％)配方與實(shí)施例一相同。
3、乳酸鏈球菌和糞鏈球菌活化分別將乳酸鏈球菌和糞鏈球菌放在MRS液體培養(yǎng)基中活化，活化溫度37℃，活化時(shí)間24小時(shí)，活化完成時(shí)，每m1液體培養(yǎng)基中至少含有乳酸鏈球菌或糞鏈球菌5×106cfu。
所述的MRS液體培養(yǎng)基(％)配方與實(shí)施例一相同。
4、苜蓿青貯的復(fù)合菌添加劑的制作把綠汁發(fā)酵液與保存有乳酸鏈球菌和糞鏈球菌的MRS液體培養(yǎng)基按60％∶20％∶20％的比例混合，形成苜蓿青貯微生物添加劑，其中每10ml該添加劑含PFJ 6ml，乳酸鏈球菌和糞鏈球菌各107cuf，青貯時(shí)每公斤苜蓿加入15ml添加劑。
表4 實(shí)施例一的苜蓿青貯效果

從表4看出，用本發(fā)酵液處理的苜蓿，經(jīng)30天青貯，青貯料感觀評(píng)價(jià)達(dá)到優(yōu)良，而PFJ的感觀評(píng)價(jià)為中等；pH值和蛋白質(zhì)含量分別比PFJ處理低13.3％和提高13.9％，差異均達(dá)到顯著水平。
權(quán)利要求
1.一種苜蓿青貯的復(fù)合菌添加劑，其特征在于，由綠汁發(fā)酵液與保存有乳酸鏈球菌和糞鏈球菌的MRS液體培養(yǎng)基按50-60％∶20-25％20-25％的重量百分比混合組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苜蓿青貯的復(fù)合菌添加劑，其特征是，其中每mlMRS液體培養(yǎng)基中至少含有乳酸鏈球菌或糞鏈球菌5×106cfu。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的苜蓿青貯的復(fù)合菌添加劑，其特征是，所述的MRS液體培養(yǎng)基配方為蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，K2HPO40.2g，檸檬酸二銨0.2g，乙酸鈉0.5g，葡萄糖2g，土溫80 0.1％，MgSO4.7H2O 0.058g，MnSO4.4H2O 0.025g，pH＝6.2，121℃滅菌15min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的苜蓿青貯的復(fù)合菌添加劑，其特征是，每10ml該添加劑含綠汁發(fā)酵液5-6ml，乳酸鏈球菌和糞鏈球菌各106～107cuf。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或者4所述的苜蓿青貯的復(fù)合菌添加劑，其特征是，青貯時(shí)每公斤苜蓿加入10-15ml添加劑。
全文摘要
一種生物技術(shù)領(lǐng)域的苜蓿青貯的復(fù)合菌添加劑，由綠汁發(fā)酵液與保存有乳酸鏈球菌和糞鏈球菌的MRS液體培養(yǎng)基按50－60％∶20－25％∶20－25％的重量百分比混合組成，通過(guò)以下步驟制得(1)制作綠汁發(fā)酵液；(2)從綠汁發(fā)酵液中分離乳酸鏈球菌；(3)乳酸鏈球菌和糞鏈球菌活化；(4)把綠汁發(fā)酵液與活化的乳酸鏈球菌和糞鏈球菌按比例混合，形成苜蓿青貯的復(fù)合菌添加劑。本發(fā)明添加劑比綠汁發(fā)酵液和乳酸鏈球菌兩種添加劑單獨(dú)使用有更好的降低pH和提高青貯質(zhì)量的效果。用本添加劑處理的苜蓿，經(jīng)30天青貯，青貯料pH值比用綠汁發(fā)酵液處理降低13.3～13.8％。
文檔編號(hào)A23K3/00GK1757714SQ20051002869
公開(kāi)日2006年4月12日 申請(qǐng)日期2005年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月11日
發(fā)明者安淵, 田瑞霞, 王光文 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)