專利名稱：枯草芽孢桿菌抗菌肽的用途及制劑的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌抗菌肽抑制黃曲霉生長的用途及制劑。
背景技術：
玉米、稻谷、棉子等在儲存期由于本身的含水量高、儲存環(huán)境問題容易發(fā)生霉變。霉菌會產生多種毒素，人或動物因食入霉菌毒素污染的糧食或飼料，就會引起肝中毒、癌癥等，嚴重威脅人類的健康和生命，畜牧業(yè)發(fā)展也將受到影響。據知全世界每年有25％的糧食作物受到霉菌毒素的污染，直接損失可達數千億美元。因此，霉菌毒素已成為糧食工業(yè)、飼料工業(yè)、畜牧業(yè)中不可忽視的問題。黃曲霉是一種能產黃曲霉毒素的霉菌。黃曲霉毒素毒性極強，被它污染的糧食等食品食入人體內主要損害肝臟，并有強烈的致癌作用。用霉變玉米棒飼料飼喂畜禽、黃曲霉會在動物體組織中積蓄，通過食物鏈帶給人類，而霉變的花生會污染花生油及花生醬等制品。
枯草芽孢桿菌是一種能分泌對多種農作物有害病原真菌和細菌的具有抑制殺傷作用的抗菌肽的土壤微生物，同時它又是自然界廣泛存在的非致病細菌，對人畜無害，不污染環(huán)境。代謝產物抗菌肽通常以多種結構類似物的形式共同存在于枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液中，有環(huán)狀結構和脂類側鏈，具有熱穩(wěn)定性高，耐受蛋白酶水解的能力，而且微生物不易對其產生耐藥性。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種枯草芽孢桿菌抗菌肽制劑及用途，使用枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中的有效抗菌成分抗菌肽和乳酸混合制成混合制劑，能夠抑制多種植物病原真菌和細菌生長，尤其是對黃曲霉有強烈的抑制作用；試驗表明該制劑是一種較好的能應用于糧食儲存的防霉制劑。
本發(fā)明的技術方案為
枯草芽孢桿菌抗菌肽的用途，其特征在于用于抑制黃曲霉等有害病菌。
所述的用途，其特征在于用于抑制玉米、稻谷、棉子或動物飼料上的黃曲霉等有害霉菌。
所述的用途，其特征在于抗菌肽是枯草芽孢桿菌發(fā)酵產物的粗提取物或精提物。
抑制黃曲霉的制劑，其特征在于是枯草芽孢桿菌抗菌肽與有機酸的混合物。
所述的有機酸為乳酸，抗菌肽與乳酸的重量配比為5~10∶1。
所述的抗菌肽采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵產物的粗提取物或精提物，其中抗菌肽的含量＞100μg/mL。
從枯草芽孢桿菌發(fā)酵液中提純抗菌肽，分離提純工藝包括1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的粗提液的制備是利用超過濾的裝置對發(fā)酵液進行濃縮和純化，截留分子量在1000D以上的物質，為抗菌肽的粗提物。
更確切的說是將枯草芽孢桿菌的發(fā)酵液經Millipore公司的切向流超濾系統(tǒng)超濾濃縮后(截留分子量為1000D)6000r/min離心取上清液得到。
2、DEAE-Sepharose FF柱層析將粗提液用A緩沖液(20mmol/L pH6.8磷酸鹽緩沖液)充分透析，8000r/min離心收集上清液，過A緩沖液平衡的DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱，用B緩沖液(含1.0mol/L(NH4)2SO4的A緩沖液)與A緩沖液在線混合進行線性梯度洗脫，收集對黑曲霉、小麥赤霉和水稻紋枯病菌均有抑菌作用的活性峰，并將收集的活性洗脫液經Millipore公司的Stirred Cells 8050超濾杯濃縮(截留分子量為3000D)。
3、SOURCE 15 PHE柱層析將陰離子柱收集的活性組份上B緩沖液預平衡的SOURCE 15 PHE柱，B緩沖液淋洗至基線，再用A緩沖液進行淋洗，最后用蒸餾水洗脫得到活性峰，收集合并后濃縮冷凍干燥即得到抗菌肽的精提物。
所述的枯草芽孢桿菌株發(fā)酵液的制備方法，其特征是所述的混合制劑的用途，是用于糧食儲存中黃曲霉病菌的抑制。
本發(fā)明的產生菌的發(fā)酵工藝穩(wěn)定簡單，對環(huán)境無污染。
本發(fā)明的抗菌肽抗菌活性、物質熱穩(wěn)定性好，對酸堿和蛋白酶有一定的耐受性，在生物防治領域有很好的應用前景。
本發(fā)明的抗菌肽混合制劑應用廣泛，對糧食儲存、飼料加工中的黃曲霉抑制效果明顯，有良好的應用前景。
具體實施例方式
枯草芽孢桿菌株發(fā)酵液的制備。
是將本發(fā)明的高產菌枯草芽孢桿菌株(由中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心受理保存，保藏入冊編號為1107)進行發(fā)酵，發(fā)酵工藝包括對斜面保存的枯草芽孢桿菌的高產菌株斜面活化；種瓶培養(yǎng)；發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵液高速離心除菌體并進行熱處理。斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基魚蛋白胨2％，甘油1％，K2HPO40.15％，MgSO40.15％，pH7.2，最佳種齡時間為12小時，再按接種量1∶10接種于發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基葡萄糖1％，蛋白胨1％，酵母粉0.5％，K2HPO40.15％，MgSO40.15％，最適pH值6.7～7.5，最適發(fā)酵周期為40hr～48hr，最適溫度28℃～30℃，發(fā)酵罐轉速為333r/min，發(fā)酵罐轉速為333r/min；發(fā)酵液高速離心及熱處理離心轉速為8000r/min，熱處理溫度為108℃，10min，得到發(fā)酵液。
枯草芽孢桿菌抗菌肽的分離提純步驟如下1、枯草芽孢桿菌發(fā)酵液的粗提液的制備，是將枯草芽孢桿菌JA的發(fā)酵液經Millipore公司的切向流超濾系統(tǒng)超濾濃縮后(截留分子量為1000D)6000r/min離心取上清液得到抗菌肽的粗提物。
2、DEAE-Sepharose.FF柱層析將粗提液用A緩沖液(20mmol/L pH6.8磷酸鹽緩沖液)充分透析，8000r/min離心收集上清液，過A緩沖液平衡的DEAE-Sepharose FF陰離子交換柱，用B緩沖液(含1.0mol/L(NH4)2SO4的A緩沖液)與A緩沖液在線混合進行線性梯度洗脫，收集對黑曲霉、小麥赤霉和水稻紋枯病菌均有抑菌作用的活性峰，并將收集的活性洗脫液經Millipore公司的Stirred Cells 8050超濾杯濃縮(截留分子量為3000D)。
3、SOURCE 15 PHE柱層析將陰離子柱收集的活性組份上B緩沖液預平衡的SOURCE 15 PHE柱，B緩沖液淋洗至基線，再用A緩沖液進行淋洗，最后用蒸餾水洗脫得到活性峰，收集合并后濃縮得到抗菌肽的精提物。
抑制黃曲霉的制劑，是將精提物或粗提物(抗菌肽溶液)與乳酸以10∶1體積比混合，制成混合溶液。
制劑對黃曲霉有強烈的抑制作用，另外對其他多種病原菌有明顯的抑制作用，如小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜菌核、灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、油菜菌核病菌、番茄青枯病菌、煙草青枯病菌等。
權利要求
1.枯草芽孢桿菌抗菌肽的用途，其特征在于用于抑制黃曲霉。
2.根據權利要求1所述的用途，其特征在于用于抑制玉米、稻谷、棉子或動物飼料上的黃曲霉。
3.根據權利要求1所述的用途，其特征在于抗菌肽是枯草芽孢桿菌發(fā)酵產物的粗提取物或精提物。
4.抑制黃曲霉的制劑，其特征在于是枯草芽孢桿菌抗菌肽與有機酸的混合物。
5.根據權利要求4所述的制劑，其特征在于所述的有機酸為乳酸，抗菌肽與乳酸的重量配比為5~10∶1。
6.根據權利要求4或5所述的制劑，其特征在于所述的抗菌肽采用枯草芽孢桿菌發(fā)酵產物的粗提取物或精提物，其中抗菌肽的含量＞100μg/mL。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種枯草芽孢桿菌抗菌肽的用途及制劑，枯草芽孢桿菌的抗菌肽能有效抑制黃曲霉等有害病菌生長，抗菌肽溶液與有機酸如乳酸酸混合，抑制有害病菌生長時有協同作用。抗菌肽具有環(huán)狀結構，穩(wěn)定性好，在糧食儲藏安全和飼料加工方面有很好的應用前景。
文檔編號A01N63/02GK1695458SQ200510038629
公開日2005年11月16日 申請日期2005年3月28日 優(yōu)先權日2005年3月28日
發(fā)明者劉靜, 王軍, 王萍, 姚建銘, 余增亮 申請人:中國科學院等離子體物理研究所