專利名稱：一種新型真菌殺蟲劑的生產(chǎn)和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種真菌殺蟲劑，尤其涉及一種昆蟲病原真菌萊氏野村菌的生產(chǎn)和用途。
背景技術(shù)：
當(dāng)前，農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全已成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)，引起了我國各級(jí)政府的重視。推廣應(yīng)用生物農(nóng)藥，取代化學(xué)農(nóng)藥尤其是高毒高殘留化學(xué)殺蟲劑，不僅可以降低農(nóng)藥殘留、提高農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)，而且更是保護(hù)環(huán)境、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的有效途徑。
全球應(yīng)用的生物源農(nóng)藥品種約30種，其中細(xì)菌性殺蟲劑蘇云金桿菌(Bt)是研究最多、產(chǎn)量最大、應(yīng)用范圍最廣、最具代表性的生物殺蟲劑。目前以Bt為代表的生物農(nóng)藥在生產(chǎn)實(shí)踐中仍存在四個(gè)問題需要研究解決①Bt菌株對(duì)防治害蟲的選擇性難以滿足實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)多種害蟲并發(fā)危害一藥多治的需要，暴露出生物農(nóng)藥殺蟲譜窄、特別是對(duì)夜蛾科害蟲難以控制的弱點(diǎn)。②對(duì)害蟲的作用方式主要是胃毒作用，致病機(jī)理單一是Bt生物農(nóng)藥的防治效果差、作用速度慢的主要原因。③Bt類生物農(nóng)藥持效期短和對(duì)爆發(fā)性害蟲控制作用弱，在害蟲種群中不能形成疾病自然流行，難以發(fā)揮自然控制作用。④缺乏對(duì)生物農(nóng)藥使用技術(shù)系統(tǒng)的研究和合理科學(xué)使用，尚未建立生物農(nóng)藥田間高效應(yīng)用技術(shù)體系，制約了生物農(nóng)藥的推廣。
病原真菌是又一類重要微生物農(nóng)藥資源，大約有100個(gè)屬的真菌對(duì)鞘翅目、鱗翅目、雙翅目等昆蟲有致病性，具有胃毒、觸殺及疾病流行等多種作用途徑，近10年來歐美國家在真菌殺蟲劑研制方面發(fā)展迅猛，國外已有20多個(gè)產(chǎn)品注冊(cè)登記。萊氏野村菌(Nomuraea rileyi)是1903年自甘藍(lán)野螟幼蟲中分離獲得的重要昆蟲病原真菌，能寄生30多種鱗翅目、雙翅目害蟲，對(duì)夜蛾科害蟲的致病力更強(qiáng)，特別是能引起疾病流行(Mohamed，1977)，因而受到各國重視。美國應(yīng)用該菌作為微生物殺蟲劑，誘發(fā)流行病及生態(tài)系統(tǒng)調(diào)節(jié)等途徑，防治大豆夜蛾類害蟲效果顯著(Ignoffo，1981；Boucias，1982)。日本學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，該菌廣泛分布于水田，適合防治雜食性的斜紋夜蛾等害蟲(淺山，1980)，也有報(bào)道對(duì)蚊幼蟲有較好防效。我國對(duì)真菌制劑的研究、開發(fā)已有20多年的歷史，其中以白僵菌、綠僵菌為主，應(yīng)用白僵菌防治松毛蟲和玉米螟等害蟲的面積達(dá)667萬ha以上。但我國迄今尚無真菌殺蟲劑正式登記投產(chǎn)。蟲生真菌研究應(yīng)用的滯后主要存在以下幾方面原因第一，在基礎(chǔ)研究方面長期忽視昆蟲病理學(xué)和流行學(xué)的基礎(chǔ)研究和工廠化生產(chǎn)發(fā)酵工藝的研究。第二，在應(yīng)用方面未能研究生物學(xué)穩(wěn)定的劑型及其相應(yīng)的配套應(yīng)用技術(shù)，生產(chǎn)條件簡陋，使用效果不穩(wěn)定。第三，在菌種的選擇上比較單一，長期在立項(xiàng)上將大量投入集中在Bt、白僵菌上，其它優(yōu)勢(shì)菌種未受到應(yīng)有的重視。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了從源頭上解決農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)的問題，實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品的優(yōu)質(zhì)、安全生產(chǎn)，保障人民身體健康和農(nóng)產(chǎn)品出口創(chuàng)匯，開展真菌、病毒等新型生物源農(nóng)藥的研究和開發(fā)，建立廣譜、高效、昆蟲疾病流行的生物防治平臺(tái)，以攻克微生物農(nóng)藥殺蟲譜窄、作用速度慢、防效不穩(wěn)定的弱點(diǎn)和微生物農(nóng)藥高效施用技術(shù)研究滯后等重大關(guān)鍵問題為重點(diǎn)任務(wù)，提供一種新型真菌殺蟲劑的生產(chǎn)和用途。
本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，新型真菌殺蟲劑的生產(chǎn)，是利用野外分離、實(shí)驗(yàn)室純化的萊氏野村菌(菌株Nr04-3)，采用液固雙相發(fā)酵技術(shù)在含氮培養(yǎng)基上，控制溫度為25-34℃，PH值為5-8，連續(xù)黑暗的條件下液體培養(yǎng)60-80小時(shí)，固體培養(yǎng)7-10天，生產(chǎn)其有效成分為萊氏野村菌孢子，含量為2×1010孢子/克(2×1010spore/g)的固態(tài)可濕性粉劑。
所述的控制溫度最佳為30℃。PH值最佳為6。液體培養(yǎng)最佳時(shí)間為72小時(shí)。所述的含氮培養(yǎng)基為豆餅瓊脂培養(yǎng)基，在豆餅瓊脂培養(yǎng)基上，菌絲有隔，直徑1.8-2.1μm，菌落呈致密的短絨毛狀，初白色，3-4天后淡黃綠色，分生孢子梗長出成輪的小梗，大小為5.5-8×2.5-4.0μm，短橢圓形，偶爾基部膨大，頸部很短或缺乏，小梗上著生瓶狀體，在瓶狀體上產(chǎn)生成串分生孢子，分生孢子廣擬橢圓形，有時(shí)呈圓筒形，光滑、淡綠色，大小為3.5-4.5×2.0-3.0μm，顏色暗綠。
新型真菌殺蟲劑的用途，是使用新型真菌殺蟲劑防治、毒殺鱗翅目害蟲和蚊幼蟲孑孓時(shí)，先用水將新型真菌殺蟲劑稀釋后，再噴灑到鱗翅目害蟲侵害的植物上和蚊幼蟲孑孓的棲生處。所述的鱗翅目害蟲包括斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、茶尺蠖、二化螟。新型真菌殺蟲劑用水稀釋配成的濃度為0.1～2％。
本發(fā)明通過分離野外的萊氏野村菌，采用固液雙相發(fā)酵技術(shù)，生產(chǎn)出先進(jìn)水平的新型昆蟲病害流行真菌生物農(nóng)藥，提高生物農(nóng)藥對(duì)夜蛾科等頑固害蟲的效果，有效克制重大病蟲害的爆發(fā)危害，克服制約微生物殺蟲劑應(yīng)用的瓶頸，加快微生物農(nóng)藥的實(shí)用化進(jìn)程，降低化學(xué)農(nóng)藥在優(yōu)質(zhì)農(nóng)產(chǎn)品中的殘留量和對(duì)農(nóng)田生態(tài)環(huán)境的污染，實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物重大病蟲害可持續(xù)控制。該殺蟲劑對(duì)斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、茶尺蠖、二化螟等鱗翅目害蟲具有較好的防治效果，同時(shí)對(duì)蚊幼蟲孑孓也具有毒殺作用，可以廣泛應(yīng)用于糧食、蔬菜、茶葉、森林及衛(wèi)生等多種害蟲防治。
具體實(shí)施例方式
新型真菌殺蟲劑的生產(chǎn)，通過分離揚(yáng)州野外的萊氏野村菌(菌株Nr04-3)，經(jīng)實(shí)驗(yàn)室純化，采用液固雙相發(fā)酵技術(shù)在豆餅瓊脂培養(yǎng)基上，控制溫度為30℃，PH值為6，連續(xù)黑暗的條件下液體培養(yǎng)72小時(shí)，固體培養(yǎng)7-10天。在豆餅瓊脂培養(yǎng)基上，菌絲有隔，直徑1.8-2.1μm，菌落呈致密的短絨毛狀，初白色，3-4天后淡黃綠色，分生孢子梗長出成輪的小梗，大小為5.5-8×2.5-4.0μm，短橢圓形，偶爾基部膨大，頸部很短或缺乏，小梗上著生瓶狀體，在瓶狀體上產(chǎn)生成串分生孢子，分生孢子廣擬橢圓形，有時(shí)呈圓筒形，光滑、淡綠色，大小為3.5-4.5×2.0-3.0μm，顏色暗綠。生產(chǎn)其有效成分為萊氏野村菌孢子，含量為2×1010孢子/克(2×1010spore/g)的固態(tài)可濕性粉劑。
新型真菌殺蟲劑用于新型真菌殺蟲劑防治、毒殺斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、茶尺蠖、二化螟等鱗翅目害蟲和蚊幼蟲孑孓。使用時(shí)，先用水將新型真菌殺蟲劑稀釋配成的濃度為0.1～2％，再噴灑到鱗翅目害蟲侵害的植物上和蚊幼蟲孑孓的棲身處。
實(shí)施例1萊氏野村菌菌株培養(yǎng)特性1、溫度對(duì)菌株生長的影響萊氏野村菌各個(gè)菌株在14～34℃之間均能生長，26～30℃之間生長最快，接菌后2天，可見分生孢子。最適溫度為30℃；14℃以下，34℃以上生長明顯趨緩。該菌產(chǎn)孢量也以30℃最高(見表1)。6種菌株生長速度和產(chǎn)孢量不一致，接種后培養(yǎng)10天，Nr04-3的產(chǎn)孢量顯著高于其他菌株。
表1溫度對(duì)菌株產(chǎn)孢量的影響

注表中同列中具有相同字母者表示在0.05水平上差異不顯著。
2、pH對(duì)菌株生長的影響萊氏野村菌在pH值2～9范圍內(nèi)，菌株均能生長，低于3或高于8時(shí)生長緩慢，最適為pH＝5～7，pH＝6時(shí)生長最好，產(chǎn)孢量也以pH＝6時(shí)最高。各菌株的產(chǎn)孢量差異顯著，Nr04-3產(chǎn)孢量最多(表2)。
表2pH對(duì)菌株產(chǎn)孢量的影響

注表中同列中具有相同字母者表示在0.05水平上差異不顯著。
3、光照對(duì)菌株生長的影響萊氏野村菌菌株在黑暗、日光燈、黑暗與散光交替及自然光照下均可生長。但在連續(xù)黑暗條件下生長最快，自然光照下生長最差。菌株產(chǎn)孢量也以黑暗條件下產(chǎn)孢最多，自然光照條件下產(chǎn)孢最少。(見表3)。
表3光照對(duì)菌株產(chǎn)孢量的影響

注表中同列中具有相同字母者表示在0.05水平上差異不顯著。
實(shí)施例2培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)1、不同培養(yǎng)基對(duì)菌株產(chǎn)孢性狀的影響同一種菌株在PDA、有機(jī)氮和SDAY三種培養(yǎng)基上形態(tài)變化不大。而用有機(jī)氮培養(yǎng)基和SDAY培養(yǎng)基更易獲得大量的分生孢子。有機(jī)氮培養(yǎng)基和SDAY上萊氏野村菌出現(xiàn)孢子，比用PDA培養(yǎng)的一般提前1天產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量比PDA平板上大，與PDA的比值，有機(jī)氮培養(yǎng)基為1.17～8.75，SDAY的比值為1.09～10。菌株固體培養(yǎng)生產(chǎn)孢子的收獲適期為7～10天。
表5不同菌株在固體培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢性狀

2、液體培養(yǎng)基對(duì)菌株產(chǎn)孢的影響用Nr04-3菌株進(jìn)行液體培養(yǎng)產(chǎn)孢考察，在培養(yǎng)到48小時(shí)時(shí)，培養(yǎng)基C上的孢子濃度達(dá)109個(gè)/ml，顯著高于其他培養(yǎng)基產(chǎn)孢量；在培養(yǎng)72小時(shí)時(shí)，培養(yǎng)基A、B的產(chǎn)孢量也達(dá)109個(gè)/ml。84小時(shí)后，產(chǎn)孢量逐漸減少?？紤]到能源等成本因素，一般推薦培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)。
表6液體培養(yǎng)不同時(shí)間的產(chǎn)孢量

實(shí)施例3害蟲防治試驗(yàn)1、昆蟲感病癥狀表現(xiàn)斜紋夜蛾、甜菜夜蛾幼蟲受萊氏野村菌感染后，一般3天左右食欲減退，行動(dòng)開始遲緩，4～5天后開始死亡，死亡高峰期在處理后的第6～8天，死亡時(shí)蟲體顏色不發(fā)生明顯變化。死蟲26℃保濕培養(yǎng)1天后蟲體長出少量白色菌絲，2～3天后菌絲由疏松逐漸變密覆蓋蟲體，蟲體僵硬。隨后蟲體被綠色孢子粉覆蓋，4天后形成密集的淡綠色小堆。
2、侵染途徑以相同濃度孢子懸浮液感染甜菜夜蛾，無論體表接觸還是經(jīng)口感染，對(duì)甜菜夜蛾幼蟲均有較高活性。接種后3天，體表接觸處理的幼蟲死亡率為36.8％，死亡高峰為4～6天，最終死亡率為100％。經(jīng)口感染的幼蟲對(duì)菌株的反應(yīng)慢，死亡高峰為5～7天，最終死亡率為92％。
表7不同侵染途徑對(duì)甜菜夜蛾的效果

3、對(duì)不同昆蟲的毒力3-2感染濃度與死亡率的關(guān)系不同濃度孢子懸浮液感染各種幼蟲后，幼蟲死亡率與感染濃度關(guān)系的毒力回歸方程見表9。在一定濃度范圍內(nèi)， 死亡率與感染濃度呈正比。參試?yán)ハx中二化螟、淡色庫蚊的致死中濃度最低，為1.10×106～7.0×106個(gè)孢子/ml，說明該菌株對(duì)這兩種昆蟲具有較高的生物活性。其次為甜菜夜蛾、斜紋夜蛾，致死中濃度為1.02×107～2.0×107個(gè)孢子/ml。茶尺蠖的致死中濃度較高，說明萊氏野村菌對(duì)茶尺蠖活性低。高濃度孢子懸浮液(5.40×109)對(duì)黃楊絹野螟有一定的活性，防效為55％，對(duì)小菜蛾無防效。
表9Nr04-3菌株對(duì)昆蟲幼蟲的致死中濃度(LC50)

權(quán)利要求
1.一種新型真菌殺蟲劑的生產(chǎn)，其特征是利用野外分離、實(shí)驗(yàn)室純化的萊氏野村菌，采用液固雙相發(fā)酵技術(shù)在含氮培養(yǎng)基上，控制溫度為25-34℃，PH值為5-8，連續(xù)黑暗的條件下液體培養(yǎng)60-80小時(shí)，固體培養(yǎng)7-10天，生產(chǎn)其有效成分為萊氏野村菌孢子，含量為2×1010孢子/克的固態(tài)可濕性粉劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型真菌殺蟲劑的生產(chǎn)，其特征是所述的控制溫度最佳為30℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型真菌殺蟲劑的生產(chǎn)，其特征是所述的PH值最佳為6。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型真菌殺蟲劑的生產(chǎn)，其特征是所述的液體培養(yǎng)最佳時(shí)間為72小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型真菌殺蟲劑的生產(chǎn)，其特征是所述的含氮培養(yǎng)基為豆餅瓊脂培養(yǎng)基，在豆餅瓊脂培養(yǎng)基上，菌絲有隔，直徑1.8-2.1μm，菌落呈致密的短絨毛狀，初白色，3-4天后淡黃綠色，分生孢子梗長出成輪的小梗，大小為5.5-8×2.5-4.0μm，短橢圓形，偶爾基部膨大，頸部很短或缺乏，小梗上著生瓶狀體，在瓶狀體上產(chǎn)生成串分生孢子，分生孢子廣擬橢圓形，有時(shí)呈圓筒形，光滑、淡綠色，大小為3.5-4.5×2.0-3.0μm，顏色暗綠。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的新型真菌殺蟲劑的生產(chǎn)，其特征是所述的萊氏野村菌為菌株NrO4-3。
7.一種新型真菌殺蟲劑的用途，其特征是使用新型真菌殺蟲劑防治、毒殺鱗翅目害蟲和蚊幼蟲孑孓時(shí)，先用水將新型真菌殺蟲劑稀釋后，再噴灑到鱗翅目害蟲侵害的植物上和蚊幼蟲孑孓的棲生處。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的新型真菌殺蟲劑的用途，其特征是所述的鱗翅目害蟲包括斜紋夜蛾、甜菜夜蛾、二化螟和衛(wèi)生害蟲孑孓。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的新型真菌殺蟲劑的用途，其特征是所述的新型真菌殺蟲劑用水稀釋配成的濃度為0.1-2％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種通過工業(yè)發(fā)酵技術(shù)繁殖生產(chǎn)萊氏野村菌(Nomuraea rileyi)加工生產(chǎn)孢子粉的殺蟲劑。生產(chǎn)用真菌菌種為野外分離、實(shí)驗(yàn)室純化的萊氏野村菌(菌株Nr04－3)，在專用培養(yǎng)基上，通過液固雙相發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)孢子粉殺蟲劑，殺蟲劑含量和劑型為2×10
文檔編號(hào)A01N63/04GK1718004SQ200510040999
公開日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2005年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月13日
發(fā)明者徐健, 劉琴, 殷向東 申請(qǐng)人:江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所