專利名稱：一種楝樹雜交組織培養(yǎng)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物的雜交組培技術(shù)，是一種楝樹雜交組織培養(yǎng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
印楝樹(Neem)屬楝科，常綠喬木，廣泛種植于熱帶、亞熱帶地區(qū)，印楝樹綜合利用價值很高，在現(xiàn)已開發(fā)的20余種用途中，最有價值的還是利用楝素做殺蟲劑，是目前世界上公認(rèn)的最優(yōu)秀的高效、無毒、無公害殺蟲劑。
印楝樹中的有效活性成分——楝素主要集中在果實中，而本地苦楝樹和川楝樹的楝素主要集中在皮、葉和根部，且印楝中的楝素含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于苦楝和川楝。但是印楝樹的生存對緯度要求及其嚴(yán)格，長期無法使其跨越北緯30度生存。
要使印楝樹北移達(dá)到跨越北緯30度以上的地區(qū)種植，并仍能保持原有的優(yōu)良性狀，是傳統(tǒng)扦插、嫁接技術(shù)或種子栽培技術(shù)無法做到的。而且傳統(tǒng)扦插、嫁接技術(shù)雖然可縮短楝樹的生長周期，保持楝樹母體本身的優(yōu)良性狀，但是由于長期的無性繁殖會使病毒積累，危害加重。種子栽培技術(shù)雖然可避免上述缺點，卻極易發(fā)生性狀分離，而且延長了楝樹的育苗周期。目前，尚未發(fā)現(xiàn)采用印楝樹和當(dāng)?shù)乜嚅瑯?、川楝樹的原生質(zhì)體融合培育出保持印楝樹原有的性狀又適應(yīng)當(dāng)?shù)刈匀画h(huán)境生長的新品種楝樹。
CN1296239給出了一種印楝樹組織培養(yǎng)的快速繁殖方法，通過外植體幼嫩枝條、葉片為外植體，通過愈傷組織的培養(yǎng)、不定芽分化和植株再生，但愈傷組織的生長誘導(dǎo)方法有不足之處。同時也未能從根本上解決品系改良的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種使印楝樹北移達(dá)到北緯30度以上地區(qū)，仍能保持原有印楝樹優(yōu)良性狀的新品雜交楝樹，本發(fā)明提供一種楝樹雜交組織培養(yǎng)技術(shù)。
本發(fā)明目的是這樣實現(xiàn)的楝樹雜交組織培養(yǎng)技術(shù)是指在人工操縱下，將印楝樹和苦楝樹或川楝樹或三者離體的器官(如根尖、莖尖、葉、未成熟的果實等)、組織(如形成層、胚乳、皮層等)、細(xì)胞(如體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等)、胚胎(如成熟和未成熟的胚)、原生質(zhì)體(如脫壁后仍有生活力的原生質(zhì)體)融合，在無菌和適宜的人工培養(yǎng)基及光照、溫度等條件下，人工誘導(dǎo)，實現(xiàn)楝樹雜交原生質(zhì)體的融合，產(chǎn)生雜交楝樹的細(xì)胞壁并分裂成細(xì)胞因，再轉(zhuǎn)入傳代培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，誘導(dǎo)生長繁殖雜交楝樹。更簡單的說就是，切取印楝樹與苦楝樹或川楝樹具有制造、莖、葉能力的生長點，使其器官、組織、細(xì)胞、胚胎和原生質(zhì)體進(jìn)行融合，然后將其置于人工調(diào)配好的培養(yǎng)基中，借著植物激素的操作促進(jìn)完整植株的形成。
本發(fā)明的改進(jìn)是雜交楝樹的組織培養(yǎng)技術(shù)是利用楝樹莖尖、葉或其他組織經(jīng)過嚴(yán)格消毒、滅菌處理，然后接種在適宜的人工培養(yǎng)基上，在適宜溫度(一般20-50度，下同)、濕度、光照條件下誘導(dǎo)生長繁殖，最后獲得根、莖、葉齊全的完整小植株苗。
本發(fā)明技術(shù)還包括對產(chǎn)生小植株苗連續(xù)自交。產(chǎn)生出后代的多樣性和向純型合子方向發(fā)展。對產(chǎn)生的小植株苗選擇。選擇出符合要求的純型合子。對上述小植株苗的組織培育在外植體類型的選擇上，優(yōu)先選用芽生芽的方式，而盡量避免經(jīng)愈傷組織再生的方式，以減少培養(yǎng)過程中發(fā)生的變異，確保繁殖后代遺傳性狀的穩(wěn)定性、一致性；培養(yǎng)基配方的選擇上以協(xié)調(diào)增殖速度與芽苗素質(zhì)間的關(guān)系，在達(dá)到一定的增殖速度的前提下，重視芽苗素質(zhì)和成活率的提高；培養(yǎng)條件的選擇則盡量趨于自然，以減少人為調(diào)節(jié)的投入，降低育苗成本。
本發(fā)明的特點是本發(fā)明是在經(jīng)過長期、大量的實驗，成功培育出了印楝樹和苦楝樹、川楝樹的雜交品種，利用雜交組織培養(yǎng)技術(shù)，采用楝素含量高的印楝樹和本地區(qū)的苦楝樹、川楝樹為親本，綜合各自的優(yōu)良性狀，經(jīng)多年的的雜交實驗，在雜交后代眾多類型中不斷篩選，終于成功培育出需要的高楝素含量又可在北緯30度以上地區(qū)生長的楝樹新品種。此方法在國內(nèi)尚屬首創(chuàng)，并填補(bǔ)了植物楝屬楝科雜交品種的空白。原生質(zhì)體分離培養(yǎng)的意義在于1、除去了細(xì)胞壁為植物細(xì)胞之間的融合掃平了障礙，同時也為制造新品種開辟了道路。2、原生質(zhì)體可攝入外源DNA，細(xì)胞器、細(xì)菌或病毒顆粒，這些特性與植物全能性相結(jié)合為高等植物的遺傳飾變打下基礎(chǔ)。3、獲得細(xì)胞無性系和選育突變體的優(yōu)良起始材料。
通過植物組織培養(yǎng)，可以從植物體的一部分體細(xì)胞快速培育出大量和母體植物相同的植株。本發(fā)明是一項綜合性高新生物技術(shù)。它的技術(shù)原理涉及植物育種的遺傳變異原理和雜種優(yōu)勢原理、植物細(xì)胞的全能性原理，通過體細(xì)胞雜交完全不經(jīng)過有性過程，只通過體細(xì)胞融合制造雜種。通過本技術(shù)的運(yùn)用，雜交楝樹可以一年四季均可育苗，具有無菌、優(yōu)質(zhì)、繁殖率高，批量生產(chǎn)，周年供應(yīng)，便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點。利用二種或三種原生質(zhì)體融合，使正在融合的原生質(zhì)體再生出細(xì)胞壁，從而生成雜種楝的細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞分裂或愈傷組織后產(chǎn)生雜種植株。
具體實施例方式原生質(zhì)體融合1、雜交楝樹的原生質(zhì)體的分離制備將印楝樹和苦楝樹、川楝樹三種葉片或印楝樹和苦楝樹、印楝樹和川楝樹二種葉片的表面消毒→破碎并除去表皮→將破碎的葉片浸入含雞蛋清溶菌酶的溶液中PH7-8(或纖維素酶溶液、離析酶溶液)和滲透壓穩(wěn)定劑(如異丙醇等)的溶液中進(jìn)行植物細(xì)胞的溶解破壁→過濾除酶→清洗→離心，將原生質(zhì)體放入基質(zhì)中→加入少量PEG，使原生質(zhì)體的外膜不穩(wěn)定，放置10min→每隔5min加入原生質(zhì)體培養(yǎng)基稀釋PEG以促進(jìn)原生質(zhì)體融合，每次稀釋后輕微搖動，原生質(zhì)體就會重懸浮→混和物在100g下離心10min，離心后在不含PEG的培養(yǎng)基中清洗→再離心，在相同的培養(yǎng)基上重懸浮備用。再將優(yōu)良的原生質(zhì)體移入同體積的MS和含瓊脂糖的培養(yǎng)基溶液里培養(yǎng)→原生質(zhì)體重新產(chǎn)生雜種細(xì)胞壁并分裂成細(xì)胞團(tuán)后于瓊脂糖培養(yǎng)基質(zhì)中傳代培養(yǎng)→調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中滲透壓，誘導(dǎo)雜種細(xì)胞團(tuán)分化成植物的根、莖→轉(zhuǎn)入傳代培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，誘導(dǎo)生長繁殖。或采用其它常用的生物促進(jìn)融合方法，如病毒法。
典型的培養(yǎng)基采用MS+NAAI-3.0ppm+BA 0.5-1ppm+3％蔗糖+9％甘露醇。
注意①原生質(zhì)體分離后，非常脆弱，需要滲透壓保護(hù)劑的保護(hù)直到細(xì)胞壁形成。②針對不同的研究對象，上述培養(yǎng)基中生長素和細(xì)胞分裂素的水平要做適當(dāng)調(diào)整。
印楝樹和苦楝樹或川楝二種葉片原生質(zhì)體融合得到的細(xì)胞無顯著區(qū)別。
培養(yǎng)方法液體基質(zhì)培養(yǎng)法，半液體基質(zhì)培養(yǎng)法，固體基質(zhì)培養(yǎng)法，看護(hù)培養(yǎng)。
固體培養(yǎng)的步驟原生質(zhì)體移入培養(yǎng)基→1體積含原生質(zhì)體的培養(yǎng)基與1體積含瓊脂糖的培養(yǎng)基混和→倒轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿在25℃下培養(yǎng)→原生質(zhì)體重新產(chǎn)生細(xì)胞壁并分裂成細(xì)胞團(tuán)→細(xì)胞團(tuán)于瓊脂糖基質(zhì)中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)基中應(yīng)減少滲壓劑以利于愈傷組織的形成→誘導(dǎo)分化成植物的根，莖。
雜交楝樹組培育苗方法如下優(yōu)良健壯母株選擇→外植體的采集和表面滅菌→接種、外植體培養(yǎng)→叢芽誘導(dǎo)→繼代培養(yǎng)(微枝扦插和叢芽增殖相結(jié)合)→叢芽增殖→頂芽生根→移栽煉苗。
實施例組織培養(yǎng)方法1、外植體的采集和表面滅菌在外植體類型的選擇上，優(yōu)先選用芽生芽的方式，而盡量避免經(jīng)愈傷組織再生的方式，以減少培養(yǎng)過程中發(fā)生的變異，確保繁殖后代遺傳性狀的穩(wěn)定性、一致性；2、接種培養(yǎng)基配方的選擇上以協(xié)調(diào)增殖速度與芽苗素質(zhì)間的關(guān)系，在達(dá)到一定的增殖速度的前提下，重視芽苗素質(zhì)和成活率的提高；3、繼代培養(yǎng)用微枝扦插和叢芽增殖相結(jié)合方法繼代培養(yǎng)4-7次4、頂芽生根，移栽煉苗。培養(yǎng)條件的選擇則盡量趨于自然，以減少人為調(diào)節(jié)的投入，降低育苗成本。
組培實施例在外植體類型的選擇上，優(yōu)先選用芽生芽的方式(經(jīng)愈傷組織再生的方式易產(chǎn)生變異)，確保繁殖后代遺傳性狀的穩(wěn)定性、一致性；培養(yǎng)基配方的選擇上以協(xié)調(diào)增殖速度與芽苗素質(zhì)間的關(guān)系，在達(dá)到一定的增殖速度的前提下，重視芽苗素質(zhì)和成活率的提高；培養(yǎng)條件的選擇則盡量趨于自然，以減少人為調(diào)節(jié)的投入，降低育苗成本。
具體如下采用一年生根蘗苗萌生的帶芽莖段為外植體，去葉后剪成長1.0cm的帶芽莖段，每莖段含1個腋芽，經(jīng)過常規(guī)消毒處理后(用70％的酒精溶液浸泡數(shù)秒)，取出后及時用10％的次氯酸納浸泡6-15分鐘→用無菌水沖洗3次→將莖段切成1-1.5cm的帶有一對側(cè)芽的小段，無菌環(huán)境下接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接4-10個→封口→置于25℃左右的培養(yǎng)室內(nèi)，在一定光照條件下培養(yǎng)→將長芽分切成帶12個芽的莖段，轉(zhuǎn)入增殖繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，使其分化出叢生芽；基部叢生芽直接轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。繼代周期為25-30天。增殖到一定數(shù)量后，使部分培養(yǎng)物分流。將增殖培養(yǎng)得到的2-3cm頂芽切下接入生根培養(yǎng)基中，可得到生根整齊，大小均勻，生長健壯的完整苗。進(jìn)入壯苗和生根，出瓶，在生根培養(yǎng)實驗中，IBA和IAA能直接導(dǎo)發(fā)根，小苗基部不產(chǎn)生愈傷，但I(xiàn)BA比IAA更有利于根誘導(dǎo)，當(dāng)IBA濃度在0.5-1之間，發(fā)根快，生根率高達(dá)100％苗高可達(dá)4-7cm，葉片大，苗粗壯；若IBA與NAA配合使用，則能達(dá)好的發(fā)根效果，發(fā)根初始時間為6d，12-15d后形成主根粗壯、須根發(fā)達(dá)。苗高5-8cm，葉大而濃綠粗壯小苗。但單獨(dú)使用NAA，雖根系發(fā)達(dá)，但生根慢，生根率低。生根苗移栽前打開瓶塞放在陽光充足，溫度接近自然溫度的地方鍛煉1-5天即可移栽。
權(quán)利要求
1.雜交楝樹的培養(yǎng)技術(shù)，其特征是楝樹雜交組織培養(yǎng)技術(shù)是指在人工操縱下，將印楝樹和苦楝樹或川楝樹或三者離體的根尖、莖尖、葉、未成熟的果實等器官、形成層、胚乳、皮層等組織、體細(xì)胞、生殖細(xì)胞等細(xì)胞、成熟和未成熟的胚等胚胎、原生質(zhì)體、包括脫壁后仍有生活力的原生質(zhì)體融合，在無菌和人工培養(yǎng)基及光照、20-50度溫度條件下，進(jìn)行人工誘導(dǎo)，實現(xiàn)楝樹雜交原生質(zhì)體的融合，產(chǎn)生雜交楝樹的細(xì)胞壁并分裂成細(xì)胞因，再轉(zhuǎn)入傳代培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，誘導(dǎo)生長繁殖雜交楝樹。
2.由權(quán)利要求1所述的雜交楝樹的培養(yǎng)技術(shù)，其特征是通過切取印楝樹與苦楝樹或川楝樹具有制造、莖、葉能力的生長點，使其器官、組織、細(xì)胞、胚胎和原生質(zhì)體進(jìn)行融合，然后將其置于人工調(diào)配好的培養(yǎng)基中，借著植物激素的操作促進(jìn)完整植株的形成。
3.由權(quán)利要求1所述的雜交楝樹的培養(yǎng)技術(shù)，其特征是對產(chǎn)生雜交植株苗連續(xù)自交，產(chǎn)生出后代的多樣性和向純型合子方向發(fā)展。對產(chǎn)生的小植株苗選擇。選擇出符合要求的純型合子。
4.由權(quán)利要求1所述的雜交楝樹的培養(yǎng)技術(shù)，其特征是對上述小植株苗的組織培育在外植體類型的選擇上，優(yōu)先選用芽生芽的方式
5.由權(quán)利要求1所述的雜交楝樹的培養(yǎng)技術(shù)，其特征是蘗苗萌生的帶芽莖段為外植體，去葉后剪成長1.0cm的帶芽莖段，每莖段含1個腋芽，經(jīng)過常規(guī)消毒處理后，將莖段切成1-1.5cm的帶有一對側(cè)芽的小段，無菌環(huán)境下接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每瓶接4-10個→封口→置于25℃左右的培養(yǎng)室內(nèi)，光照時間12小時，光照強(qiáng)度3000lux，將增殖后長芽分切成帶1-2個芽的莖段，轉(zhuǎn)入增殖繼代培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，使其分化出叢生芽；基部叢生芽直接轉(zhuǎn)入增殖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。繼代周期為25-30天。增殖到一定數(shù)量后，使部分培養(yǎng)物分流。
6.由權(quán)利要求1所述的雜交楝樹的培養(yǎng)技術(shù)，其特征是繼代培養(yǎng)用微枝扦插和叢芽增殖相結(jié)合方法繼代培養(yǎng)。
7.由權(quán)利要求1或2所述的雜交楝樹的培養(yǎng)技術(shù)，其特征從雜交楝樹的原生質(zhì)體的分離制備融合將印楝樹和苦楝樹、川楝樹三種葉片或莖芽表面消毒→破碎并除去表皮→將破碎的葉片浸入含雞蛋清溶菌酶的溶液或纖維素酶溶液、離析酶溶液中，PH值7-8和滲透壓穩(wěn)定劑的溶液中進(jìn)行植物細(xì)胞的溶解破壁、過濾除酶、清洗、離心，將原生質(zhì)體放入基質(zhì)中，用PEG誘導(dǎo)，離心后在不含PEG的培養(yǎng)基中清洗、再離心，再將優(yōu)良的原生質(zhì)體移入同體積的MS和含瓊脂糖的培養(yǎng)基溶液里培養(yǎng)，原生質(zhì)體重新產(chǎn)生雜種細(xì)胞壁并分裂成細(xì)胞團(tuán)后于瓊脂糖培養(yǎng)基質(zhì)中傳代培養(yǎng)，誘導(dǎo)雜種細(xì)胞團(tuán)分化成植物的根、莖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種楝樹雜交組織培養(yǎng)技術(shù)。楝樹雜交組織培養(yǎng)技術(shù)是指在人工操縱下，將印楝樹和苦楝樹或川楝樹或三者離體的器官、組織、細(xì)胞、胚胎、原生質(zhì)體融合，在無菌和適宜的人工培養(yǎng)基及光照、溫度等條件下，人工誘導(dǎo)，實現(xiàn)楝樹雜交原生質(zhì)體的融合，產(chǎn)生雜交楝樹的細(xì)胞壁并分裂成細(xì)胞因，再轉(zhuǎn)入傳代培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，誘導(dǎo)生長繁殖雜交楝樹。通過本技術(shù)的運(yùn)用，其雜交種既可以保持印楝樹楝素含量高優(yōu)良性狀，又可適宜江蘇及華東、華中、華北地區(qū)的氣候、土壤特點，使雜交楝樹成功的跨越了北緯30度，并成功的應(yīng)用到工廠化育苗中。雜交楝樹可以一年四季均可育苗，具有無菌、優(yōu)質(zhì)、繁殖率高，批量生產(chǎn)，周年供應(yīng)，便于運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點。
文檔編號A01H4/00GK1723770SQ20051004109
公開日2006年1月25日 申請日期2005年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月19日
發(fā)明者史吉平, 張慧玲, 周衛(wèi)兵 申請人:南京九康科技發(fā)展有限公司