專利名稱：雪蓮組培苗瓶外生根方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種雪蓮組培苗瓶外生根方法背景技術雪蓮(Saussurea involucrata.et kir)是名貴的中草藥之一，新疆是主要的產地之一。目前市場上的雪蓮主要來自于野生，這就極大的破壞了脆弱的生態(tài)環(huán)境；新疆許多地區(qū)適宜雪蓮的生長，因此近年來雪蓮的人工栽培開展的規(guī)模較大，其中組織培養(yǎng)技術在雪蓮大規(guī)模人工種植中的作用越來越被重視。
據有關文獻關于新疆雪蓮的組織培養(yǎng)，目前有以下幾個報道瓦·古巴諾娃等以新疆幼嫩的新疆雪蓮植株不同部位作外植體，接種于含有不同激素水平的MS培養(yǎng)上，經15天培養(yǎng)即形成愈傷組織；將愈傷組織轉移到附加KT，BA的MS培養(yǎng)基上，2-3周后芽開始分化；以1/2MS+IAA(0.1～1.0mg/L)+活性炭(5g/L)為生根培養(yǎng)基誘導生根；將形成的苗在瓊脂糖培養(yǎng)基上進行數天的鍛煉，再從試管中移栽到花盆內，用塑料薄膜保持空氣溫度。并在低溫下處理若干天，這樣移栽的成活率在50％左右。
王子霞等用子葉作為外植體，在培養(yǎng)基MS+6-BA(2mg/L)+NAA(0.5mg/L)上，10天左右開始萌動出現愈傷組織；將愈傷組織轉到芽分化培養(yǎng)基MS+6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.5mg/L)上很快長出叢生芽，將3-4厘米長的叢生芽切成單芽后轉栽到生根培養(yǎng)基1/2MS+IAA(0.5mg/L)+活性炭(0.1％)上，30天左右大部分的叢生芽能長出2-5條根，形成完整植株，移栽時打開瓶口煉苗3天，洗凈后種植于花盆中，保持一定的濕度，成活率可達50％左右。
宋惠鋒等以新疆雪蓮莖尖生長點作為外植體，得到試管苗；在生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA(0.5mg/L)上，20天左右有5～6條根形成，移栽時打開瓶蓋煉苗3天，洗凈后移栽到森林土的營養(yǎng)袋中，用薄膜覆蓋，溫度保持在20℃左右，成活率可達80％左右。
樸日子等將新疆雪蓮無菌葉片作為外植體，得到的試管苗在1/2MS+IAA(0.2mg/L)+活性炭(0.5％)的生根培養(yǎng)基上誘導生根，根長約1厘米左右時，向過渡移栽基質(腐殖土∶河沙＝2∶1)上移栽，保持濕度，成活率為72％。
從以上傳統的組織培養(yǎng)生根方法可以看出，傳統方法通常利用光混合培養(yǎng)，用膠化劑如瓊脂糖、乙酰吉蘭糖膠(Gelrite)作為支持物質，加入糖如蔗糖、葡萄糖等作為碳源，將植物置于光下培養(yǎng)。該方法存在以下問題1、由于多糖的存在造成培養(yǎng)基、容器及內部環(huán)境的污染，需要經過高壓滅菌及其他方法的滅菌，植物組織的移植或繼代培養(yǎng)過程應該非常小心地清潔工作臺和諸如此類的無菌操作，然后才能盡可能地避免污染，這樣的過程耗費大量的勞動力，并且需要較長的時間，所以該方法具有較多的問題。
2、在大多數的情況下，在凝膠中水分較多，誘導的根移栽到土中苗易失水，生長緩慢，根生長延遲，并且因為培養(yǎng)基(凝膠)為非氣體相，得到的根是水生根，一般不能向土中移栽，需經煉苗，移栽成活率較低；3、因為大多數生長所需碳源培養(yǎng)基中的多糖，而其對光合作用的依賴性比較低，所以葉子的生長較少，移栽到土中后需要較長時間的適應，所得的再生植株需要長時間的、耗費勞動力的馴化步驟是必不可少的，直至植物能夠光自養(yǎng)生長；另外不能適應這樣的馴化的植物極易死亡。
為了改良這些問題，已經有人提出了一些方法，例如用殺菌劑的方法作為克服問題1的方法已有人報道(日本公開專利(kokai)4-311326，9-235208，7-255305，7-255306，3-297331，10-313717)。
另外有報道已經公開問題2的方法，據報道中國公開專利(CN1284261A)公開了利用蛭石、纖維素等物質作為培養(yǎng)支持物質，加入含有一定量殺菌劑的營養(yǎng)液，但是上述方法中，由于在培養(yǎng)過程中是用了殺菌劑，對植物有明顯的損傷作用，延緩了植物的生長，這一問題也極大的限制了這些方法的應用。而本發(fā)明對新疆雪蓮組織培養(yǎng)中的關鍵步驟——生根作了細致的研究，并得到了一種新方法。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便、成本低廉、效果非常好的雪蓮組培苗的瓶外生根方法。該方法無需傳統的無菌操作步驟，使得雪蓮組培苗生根變得簡單易行，實用性很強。另外，該方法將生根和煉苗結合為一步，得到的雪蓮根生長狀況良好，無需鍛煉和馴化，縮短了時間，節(jié)約大量的成本，用溫度控制污染，使組培得到的無根雪蓮苗在開放的環(huán)境中的培養(yǎng)基上生根。
本發(fā)明所述的雪蓮組培苗瓶外生根方法，按下列步驟進行a、在普通的環(huán)境下將MS或B5或White或Nitsh或N6加入植物激素培養(yǎng)基配好，無需滅菌，與支撐介質蛭石或纖維素或木屑或椰糠按5∶4比例混合后，分裝于培養(yǎng)的容器中，培養(yǎng)溫度10-25℃，控制菌的生長，使得在開放無糖培養(yǎng)基上的組培苗生根，并同時進行煉苗；b、然后將從瓊脂上取出的無根雪蓮組培苗用自來水沖洗，將雪蓮苗上粘附的含糖培養(yǎng)基成分清洗干凈，將苗移栽到含有支撐介質培養(yǎng)基的容器中，半開放，將培養(yǎng)瓶上方的封口膜覆蓋一半培養(yǎng)；c、培養(yǎng)環(huán)境條件為光照為1000-5000lex；CO2濃度維持在正常的大氣中或更高一些，如300-2000μmol/mol；溫度為20-24℃；濕度為40-80％，培養(yǎng)時間為10-25天，雪蓮苗即可生根。
本發(fā)明所述的雪蓮組培苗瓶外生根方法的特點為用蛭石代替了瓊脂，由于蛭石可以重復利用，因此可以使成本大為下降；無需進行對環(huán)境和培養(yǎng)基、容器、植物等進行滅菌和無菌操作，大量節(jié)省勞動力，提高工作效率；而且苗的長勢明顯優(yōu)于傳統的封閉式瓊脂培養(yǎng)基上的生根，根生長較快，形成的根系發(fā)達，苗可以不經馴化進入土中，成活率高；同時又可以避免上述提到的使用殺菌劑控制苗的生長的現象。
本發(fā)明所述的雪蓮組培苗瓶外生根方法，該方法利用合適的培養(yǎng)溫度(10-25℃)控制菌的生長，使得在開放培養(yǎng)基(無糖)上的組培苗生根，并同時進行煉苗，所得的再生植株，根系發(fā)達，生長量較大，由于在開放環(huán)境下生根，沒有提供糖作為碳源，植株為自養(yǎng)，因此在移栽到土中時成活率大為提高。
容器用各種開放式的容器都可以比如各種玻璃瓶、塑料瓶、容積較大的盒及盆(材料不限，但是要保持上部能夠透光)等等；培養(yǎng)基支持物不是用傳統的瓊脂等膠化物，改用蛭石、纖維素、木屑、椰糠等支撐介質的物質；其中蛭石的性能更適合本發(fā)明使用，因為蛭石較輕，吸水、保水能力強，空隙大，利于植物產生氣生根，而不是水生根，這對苗的移栽成活至關重要。
培養(yǎng)基根據具體實驗選擇，所有的液體培養(yǎng)基(去除糖成分)都可以使用，如MS、B5、White、Nitsh、N6(上述培養(yǎng)基都去除糖成分)等等。
培養(yǎng)條件光照控制在1000-5000lex，根據培養(yǎng)物情況可以適當調節(jié)。
CO2濃度維持在正常的大氣中CO2濃度即可，或CO2濃度高一些，如300-2000μmol/mol，培養(yǎng)物生長狀況會更好。
溫度由于環(huán)境溫度較高時，加快了培養(yǎng)基的污染，不利于操作，將培養(yǎng)環(huán)境的溫度控制在10-25℃之間；在此溫度范圍內，植物長勢良好，而且在植物生長期間(10-25天)，微生物繁殖速度較慢，培養(yǎng)基很少有污染的情況發(fā)生。
濕度控制在40-80％，避免培養(yǎng)環(huán)境的濕度過大或過小。
在本發(fā)明中，將通過正常組織培養(yǎng)方法得到的無菌雪蓮苗(無根)，選擇其中比較健壯的無根苗(苗高度4cm以上，有4-5片葉以上)進行生根。將雪蓮苗從瓊脂培養(yǎng)基中取出(在普通環(huán)境中，無需無菌條件)，用自來水沖洗，注意將雪蓮苗上粘附的含糖培養(yǎng)基成分清洗干凈，而后將苗移栽到含有上述培養(yǎng)基支持成分的容器中，開口培養(yǎng)，在上述的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，一般10-25天左右，就能生出理想的根(一般根長3cm以上，根數達10以上)，而且植物生長狀況良好，移栽成活率優(yōu)于傳統的瓊脂生根方法。
效果由于本發(fā)明無需傳統的無菌操作，使得雪蓮組培苗生根變得簡單易行，實用性很強，利于大規(guī)模推廣應用。
具體實施例方式
各選取100株雪蓮組培苗(無根)，進行本發(fā)明的瓶外生根方法及傳統的瓶內生根方法的比較。
實施例1(本發(fā)明的實驗操作)選取100株雪蓮組培苗(無根)，在普通的環(huán)境(無需無菌)下將MS培養(yǎng)基(無糖)配好，無需滅菌，與支撐介質蛭石按5∶4比例混合，使混合好的培養(yǎng)基與蛭石不能過于干燥或濕潤后，分裝于培養(yǎng)的容器中，培養(yǎng)溫度10℃，控制菌的生長，使得在開放無糖培養(yǎng)基上的組培苗生根，并同時進行煉苗；然后將從瓊脂上取出的無根雪蓮組培苗用自來水沖洗，將雪蓮苗上粘附的含糖培養(yǎng)基成分清洗干凈，將苗移栽到含有支撐介質蛭石培養(yǎng)基支持成分的容器中，半開放，將培養(yǎng)瓶上方的封口膜覆蓋一半培養(yǎng)；
培養(yǎng)環(huán)境條件為光照1000lex；CO2濃度維持在300μmol/mol；溫度為20℃；濕度為40％，培養(yǎng)時間為10天，雪蓮苗即可生根。
實施例2(本發(fā)明的實驗操作)選取100株雪蓮組培苗(無根)，在普通的環(huán)境(無需無菌)下將B5加入植物激素(無糖)培養(yǎng)基，無需滅菌，與支撐介質纖維素按5∶4比例混合后，分裝于培養(yǎng)的容器中，培養(yǎng)溫度15℃，控制菌的生長，使得在開放無糖培養(yǎng)基上的組培苗生根，并同時進行煉苗；然后將從瓊脂上取出的無根雪蓮組培苗用自來水沖洗，將雪蓮苗上粘附的含糖培養(yǎng)基成分清洗干凈，將苗移栽到含有支撐介質纖維素培養(yǎng)基的容器中，半開放，將培養(yǎng)瓶上方的封口膜覆蓋一半培養(yǎng)；培養(yǎng)環(huán)境條件為光照為2000lex；CO2濃度維持1000mol/mol；溫度為22℃；濕度為60％，培養(yǎng)時間為15天，雪蓮苗即可生根。
實施例3(本發(fā)明試驗操作)在普通的環(huán)境下(無需無菌)將White加入植物激素(無糖)培養(yǎng)基，無需滅菌，與支撐介質木屑按5∶4比例混合后，分裝于培養(yǎng)的容器中，培養(yǎng)溫度20℃，控制菌的生長，使得在開放培養(yǎng)基無糖上的組培苗生根，并同時進行煉苗；然后將從瓊脂上取出的無根雪蓮組培苗用自來水沖洗，將雪蓮苗上粘附的含糖培養(yǎng)基成分清洗干凈，將苗移栽到含有支撐介質木屑培養(yǎng)基的容器中，半開放，將培養(yǎng)瓶上方的封口膜覆蓋一半培養(yǎng)；培養(yǎng)環(huán)境條件為光照為4000lex；CO2濃度維持在1500mol/mol；溫度為24℃；濕度為70％，培養(yǎng)時間為20天，雪蓮苗即可生根。
實施例4(本發(fā)明試驗操作)選取100株雪蓮組培苗(無根)，在普通的環(huán)境下(無需無菌)將Nitsh加入植物激素(無糖)培養(yǎng)基，無需滅菌，與支撐介質椰糠按5∶4比例混合后，分裝于培養(yǎng)的容器中，培養(yǎng)溫度25℃，控制菌的生長，使得在開放無糖培養(yǎng)基上的組培苗生根，并同時進行煉苗；然后將從瓊脂上取出的無根雪蓮組培苗用自來水沖洗，將雪蓮苗上粘附的含糖培養(yǎng)基成分清洗干凈，將苗移栽到含有支撐介質椰糠培養(yǎng)基的容器中，半開放，將培養(yǎng)瓶上方的封口膜覆蓋一半培養(yǎng)；培養(yǎng)環(huán)境條件為光照為5000lex；CO2濃度維持在2000mol/mol；溫度為24℃；濕度為80％，培養(yǎng)時間為25天，雪蓮苗即可生根。
實施例5(傳統方法操作)將100棵雪蓮苗的生根，消毒環(huán)境、配制培養(yǎng)基并進行高壓滅菌，在超凈工作臺上操作，整個操作需要3個小時，培養(yǎng)環(huán)境為光照3000lex，溫度控制在20℃之間；苗在瓊脂培養(yǎng)基上生長30天左右，苗可以生出根；將此苗移栽到蛭石與森林土混合基質上進行鍛煉，大約10天左右即可向土壤中進行移栽。
實施例6(傳統方法操作)將100棵雪蓮苗的生根，消毒環(huán)境、配制培養(yǎng)基并進行高壓滅菌，在超凈工作臺上操作，整個操作需要4個小時。培養(yǎng)環(huán)境為光照3000lex，溫度控制在24℃之間；苗在瓊脂培養(yǎng)基上生長40天左右，苗可以生出根；將此苗移栽到蛭石與森林土混合基質上進行鍛煉，大約10天左右即可向土壤中進行移栽。
本發(fā)明與傳統方法比較見表
從對比實驗中看出，本發(fā)明的雪蓮組培苗瓶外生根方法可以消除耗費勞動力的滅菌過程，無需在無菌環(huán)境中操作。另外，雪蓮根生長狀況良好，得到的苗不用鍛煉和馴化，縮短了時間，節(jié)約大量的成本，實用性極強。發(fā)明的實驗操作中，無須對培養(yǎng)環(huán)境和操作使用的器械進行消毒，整個操作簡單、快捷，只需要1個小時左右，在上述的培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)10～15天左右，雪蓮苗即可生出理想的根。
權利要求
1.一種雪蓮組培苗瓶外生根方法，其特征在于按下列步驟進行a、在普通的環(huán)境下將MS或B5或White或Nitsh或N6加入植物激素培養(yǎng)基，無需滅菌，與支撐介質蛭石或纖維素或木屑或椰糠按5∶4比例混合后，分裝于培養(yǎng)的容器中，培養(yǎng)溫度10-25℃，控制菌的生長，使得在開放無糖培養(yǎng)基上的組培苗生根，并同時進行煉苗；b、然后將從瓊脂上取出的無根雪蓮組培苗用自來水沖洗，將雪蓮苗上粘附的含糖培養(yǎng)基成分清洗干凈，將苗移栽到含有支撐介質培養(yǎng)基的容器中，半開放，將培養(yǎng)瓶上方的封口膜覆蓋一半培養(yǎng)；c、培養(yǎng)環(huán)境條件為光照為1000～5000lex；CO2濃度維持在正常的大氣中或更高一些，如300-2000μmol/mol；溫度為20-24℃；濕度為40-80％，培養(yǎng)時間為10-25天，雪蓮苗即可生根。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新疆雪蓮組培苗瓶外生根的方法，該方法在普通的環(huán)境下將MS或B5或White或Nitsh或N6培養(yǎng)基配好，無需滅菌，與支撐介質蛭石或纖維素或木屑或椰糠混合，分裝于培養(yǎng)的容器，而后將從瓊脂上取出的無根雪蓮組培苗用自來水沖洗干凈，將苗移栽到含有支撐介質蛭石或纖維素或木屑或椰糠培養(yǎng)基的容器中，半開放培養(yǎng)10～15天左右，雪蓮苗即可生出非常好的根。本發(fā)明將生根和煉苗結合為一步，得到的雪蓮根生長狀況良好，無需鍛煉和馴化，縮短了時間，節(jié)約大量的成本，利于在大規(guī)模生產中進行推廣。
文檔編號A01H4/00GK1669409SQ200510072449
公開日2005年9月21日 申請日期2005年5月10日 優(yōu)先權日2005年5月10日
發(fā)明者王曉軍, 韋彥余, 趙民安, 劉敏, 趙海清, 許耀祖, 李璐, 林侃 申請人:中國科學院新疆理化技術研究所