專(zhuān)利名稱(chēng)：一種牡丹組培苗增殖及褐化和玻璃化防止方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物種苗繁殖技術(shù)，具體地說(shuō)涉及一種牡丹組培苗增殖及褐化和玻璃化防止方法。
背景技術(shù)：
牡丹是我國(guó)特產(chǎn)的傳統(tǒng)名花，我國(guó)人民歷來(lái)視牡丹為中華民族繁榮昌盛、興旺發(fā)達(dá)、和平幸福的象征。近年來(lái)，牡丹在美化環(huán)境、商品生產(chǎn)、社會(huì)文化方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，這需要以大量的牡丹苗木為基礎(chǔ)，而牡丹只有單瓣品種結(jié)實(shí)多，半重瓣品種次之，重瓣品種一般不結(jié)實(shí)，且實(shí)生苗變異大，不易保持母株優(yōu)良性狀。另外，嫁接、分株等傳統(tǒng)繁殖方式以及近幾年出現(xiàn)的雙平法繁殖，也都需要大量的砧木、接穗、植株等原始繁殖材料，因此繁殖速度也不快，無(wú)法滿(mǎn)足社會(huì)的需要。
組織培養(yǎng)是植物快速繁殖的最有效手段之一，可以在短期內(nèi)提供大量的優(yōu)良無(wú)性系苗木和繁殖材料。近二十年來(lái)，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者都致力于牡丹組織培養(yǎng)的研究。以芽為外植體的牡丹組培報(bào)道中，普遍認(rèn)為早春時(shí)期即將萌動(dòng)的休眠芽是最好的材料；MS或改良的MS基本培養(yǎng)基是適宜的培養(yǎng)基；激素BAP與GA3配合使用可以生長(zhǎng)良好且獲得較高的增殖率；鈣離子濃度加倍對(duì)防止外植體玻璃化，提高有效增殖率有益。由于牡丹的品種眾多品種間的差異較大，組培時(shí)不同的品種需要分別對(duì)待，更加劇了組培的難度?？傊谀档そM培中，各種品種普遍表現(xiàn)出繁殖系數(shù)低，褐化、玻璃化嚴(yán)重等問(wèn)題。據(jù)報(bào)道，牡丹組培中各種品種的增殖率普遍較低，一般在3.0左右，也就是說(shuō)增殖率還有待進(jìn)一步提高；同時(shí)，組培苗的玻璃化，導(dǎo)致組培苗的畸形、病態(tài)，降低了苗的質(zhì)量和增殖率；而褐化的發(fā)生，對(duì)組培苗產(chǎn)生毒害，導(dǎo)致死亡，也降低了組培苗的增殖率。因此，圍繞提高增殖率以及如何防止玻璃化和褐化的問(wèn)題一直是牡丹組培技術(shù)發(fā)展的瓶頸。只有解決好它們，才能攻破牡丹組織培養(yǎng)這一技術(shù)難題。

發(fā)明內(nèi)容
(一)、要解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的在于提供一種牡丹組培苗增殖及褐化和玻璃化防止方法。
(二)、技術(shù)方案本發(fā)明為一種牡丹組培苗增殖、褐化和玻璃化防止方法，所用的培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基+BAP 0.5-1.0mg/L+GA30.2-1.0mg/L。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，其中用于增殖時(shí)所述的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、Ca2+加倍。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，用于防止褐化時(shí)所述的基本培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，其中用于防止褐化時(shí)所述的改良MS培養(yǎng)基為1/2～1/3微量元素、Ca2+加倍，CaCl2與Ca(NO3)2的摩爾比為1∶1。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，其中用于防止玻璃化時(shí)所述的基本培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基。
本發(fā)明所述的培養(yǎng)基，其中防止玻璃化時(shí)所述的改良MS培養(yǎng)基為1/2大量元素、Ca2+加倍，CaCl2與Ca(NO3)2的摩爾比為1∶1。
(三)、有益效果試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)激素濃度的篩選，得到了適合不同品種增殖的最佳激素濃度，普遍提高了這些品種的增殖率，尤其是對(duì)于純黃色、香氣怡人的品種‘正午’，已將它的增殖率提高到8.00，在牡丹組培技術(shù)上又邁進(jìn)了一步。
研究表明，調(diào)整了MS基本培養(yǎng)基中一些元素的用量，發(fā)現(xiàn)對(duì)減輕牡丹組培苗的玻璃化和褐化現(xiàn)象有明顯的作用，在含有1/2大量元素的改良MS基本培養(yǎng)基上，‘烏龍捧盛’和‘明星’兩品種的玻璃化苗比率都最低，尤其是后者，完全沒(méi)有玻璃化苗的出現(xiàn)，大大提高了牡丹組培苗的質(zhì)量和實(shí)際增殖率，為盡快克服牡丹組培難題提供了保證。
一般認(rèn)為微量元素參與酶活性的變化從而影響植物組織的褐化，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)與微量元素相比，大量元素對(duì)褐化的影響作用更大；大量元素減少，褐化加重，推測(cè)是因?yàn)橐种屏私M培苗的生長(zhǎng)，從而影響了植物內(nèi)部的生理機(jī)能。在改良MS培養(yǎng)基上，‘烏龍捧盛’的褐化情況，93％表現(xiàn)為1級(jí)，‘明星’83％表現(xiàn)為1～2級(jí)，均較輕，可以認(rèn)為沒(méi)有發(fā)生褐化。微量元素的含量也影響褐化，‘烏龍捧盛’和‘明星’分別在含1/2和1/3微量元素的培養(yǎng)基上褐化最輕。褐化的減輕，減少了有毒物質(zhì)對(duì)組培苗的傷害，為組培苗正常、健康的生長(zhǎng)提供了有力的保證。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 增殖培養(yǎng)基以MS(Ca2+加倍)為基本培養(yǎng)基，蔗糖40g/L，瓊脂6g/L，PH值5.8，附加激素是‘正午’BAP1.0mg/L，GA30.2mg/L；‘烏龍捧盛’BAP0.5mg/L，GA30.5mg/L；‘明星’BAP0.5mg/L，GA31.0mg/L；‘珊瑚臺(tái)’BAP1.0mg/L，GA30.5mg/L；‘紫二喬’BAP1.0mg/L，GA30.5mg/L。
用早春即將萌動(dòng)的休眠芽為外植體，消毒滅菌后剝?nèi)パ亏[，切掉芽?jī)?nèi)小葉片，將剩余部分接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每7天觀察統(tǒng)計(jì)一次，記錄各種品種在不同培養(yǎng)基上的增殖率及生長(zhǎng)狀況。培養(yǎng)5周后進(jìn)行繼代，方法是自組培苗葉柄基部切去葉片，再沿莖的中軸縱切，在有新芽發(fā)生的部位的下方0.5厘米處橫切，將得到的部分接種在新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)(以后的繼代過(guò)程相同)，共進(jìn)行3次繼代培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計(jì)方法同初代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為室溫25℃，光照時(shí)數(shù)14h/d，光強(qiáng)2000Lx。
表1 牡丹組培苗生長(zhǎng)情況

*表中所列的莖高是3次繼代過(guò)程的平均值。
**表中所列的增殖率為第II次繼代培養(yǎng)的平均值，增殖率為一定培養(yǎng)時(shí)期內(nèi)，外植體上分化的總芽數(shù)與接種外植體總數(shù)的比值。
實(shí)施例2 防止玻璃化保持MS基本培養(yǎng)基其它元素的含量不變(Ca2+加倍)，1/2倍大量元素(CaCl2與Ca(NO3)2的摩爾比為1∶1)，蔗糖40g/L，瓊脂6g/L，PH5.8，各品種的激素濃度采用實(shí)施例1中的濃度。
用早春即將萌動(dòng)的休眠芽為外植體，消毒滅菌后剝?nèi)パ亏[，切掉芽?jī)?nèi)小葉片，將剩余部分接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)。培養(yǎng)5周后進(jìn)行繼代，方法是自組培苗葉柄基部切去葉片，再沿莖的中軸縱切，在有新芽發(fā)生的部位的下方0.5厘米處橫切，將得到的部分接種在新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)(以后的繼代過(guò)程相同)，共進(jìn)行2次繼代培養(yǎng)。觀察記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。培養(yǎng)條件為室溫25℃，光照時(shí)數(shù)14h/d，光強(qiáng)1800Lx。
表2培養(yǎng)基對(duì)‘烏龍捧盛’和‘明星’玻璃化苗比率影響的顯著性比較

*表中所列的玻璃化苗比率為2次繼代過(guò)程的平均值。
實(shí)施例3 防止褐化，各品種的激素濃度采用實(shí)施例1的濃度，蔗糖40g/L，瓊脂6g/L，PH5.8。
‘烏龍捧盛’改良MS培養(yǎng)基、1/2微量元素、Ca2+加倍，CaCl2與Ca(NO3)2的摩爾比為1∶1。
‘明星’改良MS培養(yǎng)基、1/3微量元素、Ca2+加倍，CaCl2與Ca(NO3)2的摩爾比為1∶1。
以早春時(shí)期即將萌動(dòng)的休眠芽為外植體，消毒滅菌后剝?nèi)パ亏[，切掉芽?jī)?nèi)小葉片，將剩余部分接種在培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每7天觀察記錄各種品種在不同培養(yǎng)基上的褐化級(jí)別。培養(yǎng)5周后進(jìn)行繼代，方法是自組培苗葉柄基部切去葉片，再沿莖的中軸縱切，在有新芽發(fā)生的部位的下方0.5厘米處橫切，將得到的部分接種在新的培養(yǎng)基上培養(yǎng)(以后的繼代過(guò)程相同)。共進(jìn)行3次繼代培養(yǎng)，觀察統(tǒng)計(jì)方法同初代培養(yǎng)。
培養(yǎng)條件為室溫25℃，光照時(shí)數(shù)14h/d，光強(qiáng)1600Lx。
結(jié)果(3次繼代過(guò)程的平均值)‘烏龍捧盛’50％為1～2級(jí)，38％為4～5級(jí)；‘明星’78％為1～2級(jí)，8.7％在4級(jí)以上。
說(shuō)明褐化級(jí)別的劃分1級(jí)，不褐化或基本不褐化；2級(jí)褐化顏色很淺，褐化范圍在外植體周?chē)?.3厘米以?xún)?nèi)；3級(jí)褐化顏色淺，褐化范圍在外植體周?chē)?.4厘米以?xún)?nèi)；4級(jí)褐化顏色居中，褐化范圍在外植體周?chē)?.5厘米以?xún)?nèi)；5級(jí)褐化顏色深，褐化范圍在外植體周?chē)?.5厘米左右；6級(jí)褐化顏色最深，褐化范圍在外植體周?chē)?.5厘米以上。
權(quán)利要求
1.一種牡丹組培苗增殖、褐化和玻璃化防止方法，其特征在于培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基+BAP 0.5-1.0mg/L+GA30.2-1.0mg/L。
2.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于用于增殖時(shí)所述的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基、Ca2+加倍。
3.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于用于防止褐化時(shí)所述的基本培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基。
4.如權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述的改良MS培養(yǎng)基為1/2～1/3微量元素、Ca2+加倍，CaCl2與Ca(NO3)2的摩爾比為1∶1。
5.如權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基，其特征在于用于防止玻璃化時(shí)所述的基本培養(yǎng)基為改良MS培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述的改良MS培養(yǎng)基為1/2大量元素、Ca2+加倍，CaCl2與Ca(NO3)2的摩爾比為1∶1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種牡丹組培苗增殖及褐化和玻璃化防止方法，用早春即將萌動(dòng)的休眠芽為外植體，消毒滅菌后剝?nèi)パ亏[，切掉芽?jī)?nèi)小葉片，將剩余部分接種在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)，然后定期進(jìn)行繼代培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)組培苗大量增殖并防止了褐化和玻璃化發(fā)生。本發(fā)明得到了適合不同品種增殖的適宜培養(yǎng)基與最佳激素濃度配比，普遍提高了牡丹組培苗的增殖率、減輕了玻璃化和褐化。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1742564SQ20051008659
公開(kāi)日2006年3月8日 申請(qǐng)日期2005年10月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月12日
發(fā)明者成仿云, 李萍 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)