專利名稱：一種建立中華結(jié)縷草成熟胚再生體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種建立中華結(jié)縷草成熟胚再生體系的方法。屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
九十年代以來(lái)，隨著我國(guó)城市建設(shè)的發(fā)展和人民生活水平的提高，我國(guó)北方許多城市大力鋪植草坪，取得了很好的景觀效果，如北京已種植草坪3000公頃，每年都有近300公頃草坪?jiǎn)柺?；大連市后來(lái)居上，每年新增240多公頃(王清奎等，我國(guó)草坪業(yè)發(fā)展回顧及對(duì)策，草原與草地，2002，97(7)22-24)。但以冷季型草居多，雖綠期長(zhǎng)、色澤優(yōu)美，但耗水量大、生長(zhǎng)迅速需經(jīng)常修剪，夏季易生病蟲害，養(yǎng)護(hù)費(fèi)用高。我國(guó)是發(fā)展中國(guó)家，經(jīng)濟(jì)實(shí)力有限，且淡水資源缺乏，西北地區(qū)尤甚，所以無(wú)論是城市綠化還是水土保持工程，都應(yīng)把開發(fā)抗旱、抗病、管理粗放、綠色期長(zhǎng)的草坪與地被植物作為重點(diǎn)。而結(jié)縷草正好可彌補(bǔ)冷季型草坪草的不足，它具有諸多優(yōu)良的特性1)耐旱、耐熱性極強(qiáng)；2)耐鹽堿性強(qiáng)；3)耐磨、耐踐踏、彈性好；4)耐修剪；5)具有較好的抗病蟲性；6)耐土壤貧瘠；7)耐低水平養(yǎng)護(hù)。在與草地早熟禾比較中，結(jié)縷草的耗水量比草地早熟禾少30％至40％，而草坪彈力是草地早熟禾的30至40倍，建植和管理費(fèi)用比草地早熟禾低80％(胡叔良，發(fā)展草坪綠地關(guān)鍵問(wèn)題的探討，中國(guó)草地，1997(2)67-70)。因此，結(jié)縷草已成為運(yùn)動(dòng)場(chǎng)、開放綠地、邊坡綠化以及水土保持的首選草種，是適合我國(guó)國(guó)情的草坪草種。
中華結(jié)縷草(Zoysia sinica Hance)是國(guó)產(chǎn)珍貴的優(yōu)良草坪植物，除具一般結(jié)縷草所具備的優(yōu)良特性外，其葉片質(zhì)地較細(xì)，色澤美，擴(kuò)展快，其適宜生境土壤的pH值在7.2-9.3，為耐鹽堿植物，可作為鹽堿地及沿海城市建植草坪的優(yōu)良植物，開發(fā)潛力很大。有專家預(yù)測(cè)，結(jié)縷草，特別是中華結(jié)縷草必將成為我國(guó)未來(lái)草坪業(yè)的支柱之一。
但在實(shí)際應(yīng)用中華結(jié)縷草還存在一些問(wèn)題，如抗寒性差，枯黃期過(guò)長(zhǎng)等。中華結(jié)縷草對(duì)低溫極為敏感，當(dāng)環(huán)境溫度低于10℃時(shí)即進(jìn)入休眠，在北方地區(qū)每年的綠期平均只有6個(gè)月左右，如在大連地區(qū)4月中下旬返青，10月中下旬枯黃，綠色期160天左右，而早熟禾為280天(劉建秀等，暖季型草坪草種資源的研究與改良，國(guó)外畜牧學(xué)—草原與牧草，1996(3)12-21)。這一缺點(diǎn)嚴(yán)重限制了其在北方地區(qū)的推廣。因而對(duì)結(jié)縷草進(jìn)行遺傳改良，延緩葉片衰老，選育綠色期延長(zhǎng)，且草坪質(zhì)地優(yōu)良的新品種(系)，具有重要的理論和實(shí)踐意義。
直接誘導(dǎo)體細(xì)胞變異，或采用基因工程技術(shù)，將抗逆功能基因有目的、有針對(duì)性地導(dǎo)入特定品種的愈傷組織或原生質(zhì)體，獲得改良的轉(zhuǎn)基因植物，提高草坪草的抗逆性，成為草坪學(xué)領(lǐng)域的研究前沿。組織培養(yǎng)(原生質(zhì)體培養(yǎng))是現(xiàn)代生物技術(shù)不可或缺的組成部分，無(wú)論是轉(zhuǎn)基因受體的提供，還是轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選和再生，都需要組織培養(yǎng)技術(shù)作支撐，因而建立一套高效的再生體系是轉(zhuǎn)基因技術(shù)的必須條件。
草坪草再生體系的建立難度較大，許多草坪草研究?jī)H是獲得了再生植株，無(wú)法滿足遺傳轉(zhuǎn)化的需要。而暖季型草坪草比冷季型草坪草更難誘導(dǎo)胚性愈傷組織和再生植株。結(jié)縷草屬植物屬于暖季型草坪草，其組織培養(yǎng)研究已經(jīng)有十多年。一些日本和韓國(guó)學(xué)者在這方面的研究較為深入，探討了結(jié)縷草再生過(guò)程中2，4-D、NAA和6-BA的作用和配比(Yoo Y K等，Effects of plant growthregulators on callus formation and organogenesis from the shoot cultures of fiveturf-grass species，Journal of the Korean Society for HorticulturalSci.，1991，32(2)237-246；Noh，HeeYoung，Choi，JoonSoo，Ahn，ByungJoon.Plantregeneration through somatic embryogenesis in zoysiagrasses，Journal of the KoreanSociety for Horticultural Science，1995，36(4)582-587；李瑞芬等，結(jié)縷草愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生，園藝學(xué)報(bào)，2003，30(3)355-357；等)。
結(jié)縷草愈傷組織的誘導(dǎo)多用成熟種子為外植體(Al-Khayri，等.In vitro plant regeneration of zoysiagrass，Arkansas Farm Research，1989，38(2)11；Chai等，Application of biotechnology in turfgrass genetic improvement，Crop Science，1998，381320-1338；Rim等，Callus induction and plant regeneration from seeds of Zoysia japonica Steud，Journal of the Korean Society of Grassland Science，2001，21(2)49-52；等)，在添加不同濃度的2，4-D、NAA和BA的MS培養(yǎng)基(見(jiàn)附表1)或LS培養(yǎng)基(見(jiàn)附表2)上誘導(dǎo)愈傷組織并再生植株。在已有的研究中，結(jié)縷草種子愈傷組織誘導(dǎo)率僅為30-50％，其中胚性愈傷組織率通常低于3％。以幼穗和幼果為外植體，也誘導(dǎo)出愈傷組織并獲得了再生植株。Inokuma等(Transgenic Japanese lawngrass(Zoysia japonica Steud.)plants regenerated from pro-toplasts，Plant Cell Reports，1998，17(5)334-338)開創(chuàng)了結(jié)縷草原生質(zhì)體培養(yǎng)的先例。
以上各再生體系建立研究均以日本結(jié)縷草(Z.japonica)為材料，且愈傷組織誘導(dǎo)率及再生率仍較低，而有關(guān)中華結(jié)縷草(Zoysia sinica Hance)組織培養(yǎng)再生體系的建立研究尚未見(jiàn)報(bào)道，相關(guān)研究均處理探索階段。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明以中華結(jié)縷草成熟種子胚為材料，誘導(dǎo)成熟胚高頻率產(chǎn)生愈傷組織，切取愈傷組織，放入繼代培養(yǎng)基及植株再生培養(yǎng)基中獲得高、頻穩(wěn)定的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率和植株再生率。為遺傳轉(zhuǎn)化提供良好受體材料。
本發(fā)明通過(guò)離體培養(yǎng)中華結(jié)縷草成熟胚建立了再生體系，外植體取材容易且方便貯存，所獲得的再生植株性狀均一、穩(wěn)定，易于遺傳工程操作。本發(fā)明的培養(yǎng)方法包括四個(gè)培養(yǎng)階段(1)以成熟胚為外植體，離體培養(yǎng)直接誘導(dǎo)愈傷組織，(2)愈傷組織的繼代培養(yǎng)，(3)愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，(4)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)再生植株，其中(1)(2)為黑暗培養(yǎng)，(3)為200～500勒克斯的弱光培養(yǎng)，(4)為1500～3000勒克斯的光培養(yǎng)，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程，培養(yǎng)溫度為25±3℃，第(1)階段培養(yǎng)40天轉(zhuǎn)接，第(2)(3)(4)每培養(yǎng)20天換新鮮培養(yǎng)基。
優(yōu)選為第(1)、(4)階段的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，第(2)、(3)階段的基本培養(yǎng)基是HMS培養(yǎng)基，在第(1)階段的培養(yǎng)基中所用激素為2.5～6mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～1.0萘乙酸NAA，0.1～1.0mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA，還添加了核黃素VB2 0.5～2.0mg/L和水解酪蛋白200～500mg/L，在第(2)階段的培養(yǎng)基中所用激素為0.1～5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～3mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA。在第(3)階段的培養(yǎng)基中所用激素為0.05～5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.01～2mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA，在第(4)階段的培養(yǎng)基中含有激動(dòng)素KT0～0.3mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.0～3.5mg/L，6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.1mg/L。
其中，在第(1)階段的培養(yǎng)基中添加的碳源為蔗糖20～30g/L，葡萄糖15～25g/L，第(2)、(3)、(4)階段培養(yǎng)中添加的碳源為蔗糖30～60g/L。HMS培養(yǎng)基的成分為1/2MS大量元素，MS微量元素，MS鐵鹽，核黃素(VB2)1.0mg/L，鹽酸噻胺(VB1)1.0mg/L，煙酸0.5mg/L，鹽酸吡哆辛0.5mg/L，肌醇0.1g/L。
本發(fā)明建立中華結(jié)縷草再生體系的方法包括如下步驟(1)種子先用30％(w/v)的NaOH溶液處理40分鐘，打破休眠，(2)然后于室溫下自來(lái)水中浸泡12～20小時(shí)。用70％(v/v)酒精滅菌30秒，無(wú)菌蒸餾水清洗3次后，0.1％升汞浸泡10分鐘，再用無(wú)菌蒸餾水清洗8-10次，(3)將滅過(guò)菌的外植體接種于含2.5～6.0 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、0.1～1.0萘乙酸NAA，0.1～1.0mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA、0.5～2.0mg/L核黃素VB2、200～500mg/L水解酪蛋白CH以及20～30g/L蔗糖和15～25g/L葡萄糖的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，溫度為25±3℃。外植體去污染率達(dá)90％以上。10天后，在種子萌發(fā)的芽基部或芽體上產(chǎn)生的，或者是在種子的胚部位開始出現(xiàn)愈傷組織，第15-25天愈傷組織發(fā)生達(dá)高峰期，40天調(diào)查愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)70％以上。2，4-D與6-BA以及高濃度碳源在誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程有極為重要的作用。(4)無(wú)菌條件下，將愈傷組織轉(zhuǎn)入含1.0～4.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～0.5mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA的HMS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為不見(jiàn)光培養(yǎng)，溫度25±3℃。繼代培養(yǎng)60天后，愈傷組織體積明顯增大，相對(duì)生長(zhǎng)量為2～4倍，愈傷組織表型可以明顯地分成三類一類是外觀白色到淡黃色的愈傷組織，兼有軟、粘組織和硬粒組織；二類是生長(zhǎng)快，外觀舒松，內(nèi)部軟、水漬狀的愈傷組織；三類是生長(zhǎng)慢、色深、褐化的愈傷組織。(5)將組織塊分類轉(zhuǎn)接到胚性愈傷組織誘導(dǎo)及植株再生的培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)。第一類即白色到淡黃色、含有硬粒的愈傷組織，分化培養(yǎng)10-15天后即可見(jiàn)到少量芽原基，30-40天后可見(jiàn)到明顯的小芽叢，再生率可達(dá)30-65％。植株再生以器官發(fā)生方式為主，在苗叢形成的同時(shí)或隨后在基部發(fā)出須狀根。再生苗在室溫下煉苗3天后，移栽成活率95％以上。第二類即軟化愈傷組織，在分化培養(yǎng)初期繼續(xù)生長(zhǎng)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸褐化死亡。第三類即色深、褐化的愈傷組織，分化培養(yǎng)后多數(shù)死亡，只有個(gè)別組織塊可以形成綠色的愈傷，但很少再生植株。其中(2)(3)為黑暗培養(yǎng)，(4)為200～500勒克斯的弱光培養(yǎng)，(5)為1500～3000勒克斯的光培養(yǎng)，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程，培養(yǎng)溫度為25±3℃，除第(2)階段外，每培養(yǎng)20天換一次新鮮培養(yǎng)基。
本發(fā)明中，愈傷組織是在種子萌發(fā)的芽基部或芽體上產(chǎn)生的，或者是在種子的胚部位直接發(fā)出，因而可以認(rèn)為愈傷組織是由種子的成熟胚產(chǎn)生的。
所述的愈傷組織是指從中華結(jié)縷草成熟胚誘導(dǎo)產(chǎn)生的膨大的未組織化的分裂細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞團(tuán)。
所述的胚性愈傷組織是指無(wú)組織化的分裂細(xì)胞團(tuán)經(jīng)進(jìn)一步培養(yǎng)后，細(xì)胞團(tuán)表面或內(nèi)部部分細(xì)胞內(nèi)含物增加，并出現(xiàn)極性，進(jìn)一步發(fā)育經(jīng)歷球形胚、魚雷胚及子葉形胚后即形成體細(xì)胞胚，在適宜條件下可直接分化成完整植株。其發(fā)育過(guò)程類似受精后的子房發(fā)育過(guò)程。
本發(fā)明以中華結(jié)縷草成熟胚為外植體，建立的遺傳轉(zhuǎn)化受體體系克服了結(jié)縷草屬植物普遍存在的愈傷組織誘導(dǎo)率低及植株再生率低的缺點(diǎn)，其特點(diǎn)在于(1)愈傷組織誘導(dǎo)顯著增高，最高達(dá)70％以上；(2)再生植株誘導(dǎo)率高，且穩(wěn)定。(3)取材不受季節(jié)限制。


圖1胚性愈傷組織圖2開始形成胚性愈傷組織圖3非胚性愈傷組織圖4胚性愈傷組織分化成芽點(diǎn)圖5體細(xì)胞胚萌發(fā)圖6從胚性愈傷組織誘導(dǎo)不定芽再生圖7中華結(jié)縷草成熟誘導(dǎo)再生植株
具體實(shí)施例方式在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)材料中華結(jié)縷草成熟種子。
試驗(yàn)設(shè)計(jì)及培養(yǎng)基按照L9(4×3)正交表設(shè)計(jì)。所用的培養(yǎng)基為HMS培養(yǎng)基，蔗糖30g/L，瓊脂6.0g/L，pH 5.8。
培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為25±1℃，無(wú)光照。
試驗(yàn)步驟種子用30％(w/v)的NaOH溶液處理40min，可打破休眠，7天發(fā)芽率達(dá)89.9％。然后于室溫下自來(lái)水中浸泡20小時(shí)。用70％(v/v)酒精滅菌30秒，無(wú)菌蒸餾水清洗3次后，0.1％升汞浸泡10分鐘，再用無(wú)菌蒸餾水清洗8次然后接種于含2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 2.5mg/L、萘乙酸NAA 0.5mg/L、6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.25mg/L、VB11.0mg/L和蔗糖30g/L、葡萄糖20g/L的MS培養(yǎng)基中，不見(jiàn)光培養(yǎng)，溫度為25±1℃。10天后，在種子萌發(fā)的芽基部或芽體上產(chǎn)生的，或者是在種子的胚部位開始出現(xiàn)愈傷組織，第21天愈傷組織發(fā)生達(dá)高峰期。40天調(diào)查愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)70％以上。2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、6-芐基氨基腺嘌呤6-BA及碳源在誘導(dǎo)愈傷組織過(guò)程起極為重要的作用。
實(shí)施例2愈傷組織繼代培養(yǎng)愈傷組織誘導(dǎo)同實(shí)施例1。將愈傷組織接種到含6-芐基氨基腺嘌呤6-BA為0.1mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D為1.6mg/L的HMS培養(yǎng)基上，愈傷組織多呈白色，有的組織塊中帶有少量淡黃色愈傷，愈傷組織幾乎不發(fā)生褐化。繼代培養(yǎng)60天后，愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量為3.2倍，但沒(méi)有明顯的芽原基分化。當(dāng)6-BA濃度為0.25mg/L時(shí)，組織塊逐漸變硬，形成白色到淡黃色的小芽，組織塊褐化率為10.3％。當(dāng)6-BA濃度為0.5mg./L，褐化率達(dá)25％。說(shuō)明在愈傷組織的繼代培養(yǎng)中6-芐基氨基腺嘌呤6-BA濃度應(yīng)≤0.1mg/L。當(dāng)6-BA濃度高時(shí)容易引發(fā)器官分化，不利于愈傷組織生長(zhǎng)。
繼代培養(yǎng)基中2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D濃度在2.5mg/L、6-芐基氨基腺嘌呤6-BA濃度為0.1mg/L時(shí)，愈傷組織繼代培養(yǎng)60天后，愈傷組織相對(duì)生長(zhǎng)量為3.6倍，各2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D濃度處理間愈傷組織的相對(duì)生長(zhǎng)量差異均不顯著(P＝0.05)。根據(jù)愈傷組織表型可以明顯地分成二類(見(jiàn)

)一類是外觀白色到淡黃色的愈傷組織，兼有軟、粘組織和硬粒組織；二類是生長(zhǎng)快，內(nèi)部軟、水漬狀的愈傷組織；其中以第一類為主。說(shuō)明2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D濃度為2.5mg/L利用愈傷組織生長(zhǎng)質(zhì)量的保持。
實(shí)施例3再生植株誘導(dǎo)試驗(yàn)材料繼代培養(yǎng)60天的愈傷組織，獲得方法同實(shí)施例1、2。
培養(yǎng)基所用的培養(yǎng)基為不加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS基本培養(yǎng)基，蔗糖30g/L，瓊脂6.0g/L，pH 6.0。
培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為25±3℃，光照強(qiáng)度為2000勒克斯，光照時(shí)間為12小時(shí)/天。
選取其中結(jié)構(gòu)較致密的白色或淡黃色愈傷組織，接種到含1.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.05mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA的培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)15天后即可見(jiàn)到少量芽原基，30天后可見(jiàn)到明顯的小芽叢，再生率可達(dá)70％。植株再生以器官發(fā)生方式為主，在苗叢形成的同時(shí)或隨后在基部發(fā)出須狀根。再生苗在室溫下煉苗3天后，移栽成活率95％以上。
附表1MS基本培養(yǎng)基(Murashige & Skoog，1962)成分

附表1MS基本培養(yǎng)基(Murashige & Skoog，1962)成分

權(quán)利要求
1.一種建立中華結(jié)縷草再生體系的方法，其特征在于以中華結(jié)縷草成熟胚為外植體，進(jìn)行離體培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述方法包括四個(gè)培養(yǎng)階段(1)以成熟胚為外植體，離體培養(yǎng)直接誘導(dǎo)愈傷組織，(2)愈傷組織的繼代培養(yǎng)，(3)愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，(4)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)再生植株，其中(1)(2)為黑暗培養(yǎng)，(3)為200～500勒克斯的弱光培養(yǎng)，(4)為1500～3000勒克斯的光培養(yǎng)，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程，培養(yǎng)溫度為25±3℃，第(1)階段培養(yǎng)40天轉(zhuǎn)接，第(2)(3)(4)每培養(yǎng)20天換新鮮培養(yǎng)基。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，第(1)、(4)階段的基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，第(2)、(3)階段的基本培養(yǎng)基是HMS培養(yǎng)基，所用植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為從生長(zhǎng)素類物質(zhì)2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、萘乙酸NAA和細(xì)胞分裂素類物質(zhì)6-芐基氨基腺嘌呤6-BA、激動(dòng)素KT和玉米素ZT的組合中選擇出的任何一種、兩種或三種，在第(1)培養(yǎng)基中還添加了核黃素VB2，蔗糖和葡萄糖。第(1)培養(yǎng)階段添加了水解酪蛋白CH或乳蛋白LH。整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程所用的培養(yǎng)基pH值為5.5～6.2。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，HMS培養(yǎng)基的成分為1/2MS大量元素，MS微量元素，MS鐵鹽，核黃素VB21.0mg/L，鹽酸噻胺(VB1)1.0mg/L，煙酸0.5mg/L，鹽酸吡哆辛0.5mg/L，肌醇0.1g/L。
5.按照權(quán)利要求3所述的方法，涉及的MS為基本培養(yǎng)基，其成分見(jiàn)附表1。
6.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在第(1)階段的培養(yǎng)基中所用激素為2.5～6mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～1.0萘乙酸NAA，0.1～1.0mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA，還添加了核黃素VB20.5～2.0mg/L和酶水解酪蛋白200～500mg/L，在第(2)階段的培養(yǎng)基中所用激素為0.1～5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～3mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA。在第(3)階段的培養(yǎng)基中所用激素為0.05～5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.01～2mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA，在第(4)階段的培養(yǎng)基中含有激動(dòng)素KT 0.1～0.3mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D1.0～3.5mg/L，6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.1mg/L。
7.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，在第(1)階段的培養(yǎng)基中添加的碳源為蔗糖20～30g/L，葡萄糖15～25g/L。第(2)(3)(4)階段的培養(yǎng)基中添加劑的碳源為蔗糖30～60g/L。
8.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在第(2)階段用于愈傷組織繼代培養(yǎng)及保持其生長(zhǎng)質(zhì)量的培養(yǎng)基中添加2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1.0～4.0mg/L，6-芐基氨基腺嘌呤6-BA 0.1～0.5mg/L。
9.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)外植體滅菌后接種于含2.5～6mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～1.0萘乙酸NAA，0.1～1.0mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA、核黃素VB20.5～2.0mg/L、酶水解酪蛋白200～500mg/L以及蔗糖20～30g/L和15～25g/L葡萄糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)40天；(2)誘導(dǎo)獲得的愈傷組織接種于添加0.1～5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1～3mg/L6-芐基氨基腺嘌呤6-BA的培養(yǎng)基中；(3)繼代的愈傷組織在含1.0～4.0mg/L 2，4-二苯氧乙酸2，4-D，0.1～0.5mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(4)繼代培養(yǎng)過(guò)的愈傷組織接種于含0.1～0.3mg/L激動(dòng)素KT、1.0～2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、0.1mg/L 6-芐基氨基腺嘌呤6-BA及30～60g/L蔗糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導(dǎo)胚性愈傷組織及體細(xì)胞胚；(5)誘導(dǎo)得到的體細(xì)胞胚接種于含激動(dòng)素KT0～0.3mg/L，2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D1.0～2.0mg/L，6-芐基氨基腺嘌呤6-BA0.1mg/L的培養(yǎng)基誘導(dǎo)再生植株，其中(1)(2)為黑暗培養(yǎng)，(3)為200～500勒克斯的弱光培養(yǎng)，(5)為1500～3000勒克斯的光培養(yǎng)，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程，培養(yǎng)溫度為25±3℃，第(1)階段培養(yǎng)40天轉(zhuǎn)接愈傷組織，第(2)(3)(4)階段，每培養(yǎng)20天換一次新鮮培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明公開一種建立中華結(jié)縷草成熟胚再生體系的方法，主要步驟包括以中華結(jié)縷草成熟種子為材料，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)獲得愈傷組織，經(jīng)繼代培養(yǎng)后，在胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基及再生培養(yǎng)基中高頻誘導(dǎo)體細(xì)胞胚及再生植株。在誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基通過(guò)添加一定配比的2，4－D和6－BA以及高濃度碳源有效地提高了愈傷組織的誘導(dǎo)率。在繼代培養(yǎng)到再生培養(yǎng)過(guò)程，通過(guò)不斷改變植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度配比及核黃素等含量，使植株再生率明顯提高，達(dá)60％以上。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1746294SQ20051008773
公開日2006年3月15日 申請(qǐng)日期2005年8月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月8日
發(fā)明者孫振元, 韋善君, 韓蕾, 錢永強(qiáng), 巨關(guān)升 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所