專利名稱：一種野牛草成熟種子的滅菌方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種野牛草成熟種子的滅菌方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物材料的滅菌是植物組織培養(yǎng)工作中的重要環(huán)節(jié)，是取得植物組織培養(yǎng)成功的最基本的重要前提和根本保證。它既要求將外植體表面的微生物徹底殺死，又要求盡可能少傷害外植體組織和表層細胞。而不同的植物材料所帶的菌種類及帶菌量存在很大的區(qū)別，因此對不同的外植體均需通過大量試驗探索其合適的滅菌方式。
目前常用的植物材料的殺菌劑有如下幾種(1)乙醇。由于乙醇具有脫水作用和一定的溶脂性，所以它能使蛋白質(zhì)脫水、變性、沉淀及質(zhì)膜破損、透性增加，使微生物致死，是一種常用的外植體表面殺菌劑。70％(w/v)的乙醇對細胞具有很強的穿透性和殺傷力，故用乙醇作殺菌劑，滅菌時間較短，約30s即可殺死外植體表面的絕大部分微生物。因植物材料不同，一般控制在5～60s之間，種子的滅菌可適當(dāng)延長。延長滅菌時間會增加外植體損傷的程度。
(2)升汞。升汞(二氯化汞，HgCl2)是重金屬鹽殺菌劑，其殺菌原理是Hg2+可與帶負電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使菌體蛋白變性，酶失活。HgCl2具有極強的殺菌能力，10-6HgCl2溶液在37℃下，2小時可完全殺死50億個農(nóng)桿菌/毫升。在室溫下，通過用0.1％HgCl2滅菌10min左右可有效地殺死附著在外植體表面的細菌及芽抱，是一種極有效的殺菌劑，具有廣譜性。
(3)新潔爾滅。新潔爾滅是一種廣譜表面活性滅菌劑。它對絕大多數(shù)植物外植體傷害很小，效果很好。通常使用1∶200的稀釋液，刷洗、浸泡外植體30min，甚至可更長些時間。
(4)次氯酸鹽。次氯酸鹽是一種強氧化劑，具有殺菌作用。常用的次氯酸鹽有鈉鹽和鈣鹽。次氯酸鈉通常為微黃色或無色的澄清液體，含有效氯約5％，應(yīng)用廣泛。次氯酸鹽在水中形成次亞氯酸(HClO)，次亞氯酸分解后形成鹽酸和新生態(tài)氧(O-)，具有極強的氧化性，故具有殺菌作用。組培中使用的次氯酸鹽濃度以有效氯計算，通常在0.5～2.5％之間，滅菌時間在5-15min。次氯酸鈉最后分解成氯和氧氣排入大氣中，滅菌處理后易于除去，不留殘毒，在組培培養(yǎng)工作中應(yīng)用為較為廣泛。
(5)抗生素類殺菌劑?？股厥巧锎x的產(chǎn)物，一般是通過阻斷微生物的正常代謝途徑使微生物致死。常用的有鏈霉素、青霉素、慶大霉素、金霉素、四環(huán)素和殺真菌劑(fungicide)、多菌靈等生化類物質(zhì)。但由于抗生素殺菌劑對外植體的生長也有明顯的的抑制作用，在植物組織培養(yǎng)中的應(yīng)用不多見。
不同的外植體類型，其滅菌方法存在很大的區(qū)別(1)莖尖、莖段及葉片等的滅菌。滅菌時先用75％酒精浸泡10～30S，以無菌水沖洗2～3次后，按材料的老、嫩和枝條的堅硬程度，分別采用有效氯為0.2％～1％的NaClO溶液或0.1％HgCl2浸泡10～15min；若材料表面再用無菌水沖洗3～4次即可。
(2)果實和種子的滅菌。視果實和種子的潔凈程度，用自來水充分沖洗后，再用70％酒精迅速漂洗一次。果實滅菌一般用有效率為0.2％NaClO溶液浸10min，后用無菌蒸餾水沖洗2～3次后，就可取出果實內(nèi)的種子或組織進行培養(yǎng)。種子則先要用2％NaClO溶液浸泡20～30min，對難以滅菌的還可以用0.1％升汞或1％～2％溴水滅菌5min。
(3)根及地下部器官的滅菌。一般用0.1％～0.2％升汞浸5～10min或2％NaClO溶液浸泡10～15min，然后以無菌水沖洗3次，即可達到滅菌效果。
對污染嚴重的外植體，尤其由內(nèi)源細菌引起的污染，無論用何種表面滅菌方法都不能徹底消除，可以在培養(yǎng)基中加入殺菌劑。但通常對植物材料的生長產(chǎn)生明顯的抑制作用。
野牛草原產(chǎn)北美中部溫帶和亞熱帶半干旱地區(qū)。是一種生長緩慢，耐寒、耐熱、抗旱性強的暖季型多年生低矮草坪草。能在低等護養(yǎng)水平下保持優(yōu)良品質(zhì)。極具抗旱性是其最突出的特征之一，它能在極端干旱時進入休眠狀態(tài)，一旦條件適宜又迅速恢復(fù)生長。野牛草匍匐莖發(fā)達，有時也有根莖發(fā)生。其匍匐莖的侵占性、生長習(xí)性及草皮的致密特性使其具有較強的水土保持能力。
長期以來，培育綠期長的新品種是人們的育種重點之一，但遺憾的是，到目前為止，綠期明顯延長的野牛草新品種仍未培育成功。究其原因，可能是由于傳統(tǒng)育種方法對這一性狀的改良存在局限性。因此，尋找新的育種技術(shù)對這一性狀進行改良勢在必行?，F(xiàn)代生物技術(shù)，如細胞工程、基因工程等在水稻等農(nóng)作物育種中的成功應(yīng)用為利用現(xiàn)代生物技術(shù)對野牛草進行品種改良提供重要借鑒。而利用現(xiàn)代生物技術(shù)進行品種改良的前提是建立其高頻、穩(wěn)定的再生體系。
野牛草離體培養(yǎng)及植株再生的研究已有個別報道，外植體均為幼穗或葉片基部，且再生率較低，難以滿足遺傳轉(zhuǎn)化的需要。野牛草種子相比幼穗等類型外植體，易收集、耐貯藏，目前為止，以其為外植體獲得再生植株未見成功報道。其中一個重要影響因素之一是，野牛草成熟種子伴有內(nèi)生菌，且?guī)Ь看?，采用上述滅菌方法難以建立理想的無菌體系，一些學(xué)者對其滅菌方式進一步進行了探索，如采用70％的乙醇與0.1％升汞組合滅菌，當(dāng)70％的乙醇處理時間至60s，0.1％升汞處理10～20min時，去污染率平均約為33％，種子萌芽率為83％；當(dāng)70％的乙醇處理時間延長至90s，0.1％升汞處理延長至30min時，去污染率平均約為61％，仍未達到理想效果，而種子受到嚴重損傷，種子萌芽率僅為60％。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有技術(shù)研究進展及其存在的不足，本發(fā)明以野牛草成熟種子為試驗材料，對種子進行滅菌預(yù)處理后將然后在無菌條件下，用70～75％酒精及高濃度NaClO溶液滅菌20～30min，無菌水沖洗5～10次后，去菌率達95％以上，有效地建立了以野牛草成熟種子為外植體的無菌體系。且方法簡單易行，便于推廣應(yīng)用。
本發(fā)明公開了一種野牛草成熟種子的滅菌方法。為以其為外植體建立無菌體系提供了技術(shù)保障。
本發(fā)明中所述的野牛草成熟種子包括野牛草屬的所有品種。
本發(fā)明中野牛草成熟種子含大量真菌及其它種類菌，對種子化學(xué)解除休眠處理后，仍帶有大量菌。采用常規(guī)滅菌方法很難達到理想滅菌效果。
本發(fā)明是所述的常規(guī)滅菌方法是指多年來在植物組織培養(yǎng)中經(jīng)常采用的外植體滅菌方式，主要包括(1)70％的乙醇與0.1％升汞組合滅菌，(2)70％的乙醇與有效氯為0.2～2％NaClO溶液組合滅菌，(3)稀釋的新潔爾滅滅菌，(4)培養(yǎng)基中添加抗生素及殺菌劑。(5)高低溫處理等物理方法滅菌。
本發(fā)明中所述的滅菌預(yù)處理是指將野牛草成熟種子從其果穎中取出后，用稀釋的洗滌劑對其洗滌后，流動的自來水充分沖洗并浸泡6～48小時。
本發(fā)明中所采用的70～75％乙醇溶液滅菌方式是將經(jīng)滅菌預(yù)處理的種子轉(zhuǎn)入無菌容器內(nèi)，倒入70～75％乙醇溶液至沒過種子，滅菌過程不斷振蕩，計時從倒入容器開始，將容器內(nèi)乙醇溶液倒出后計時結(jié)束，時間為30～60s。
本發(fā)明中采用的高濃度NaClO溶液是指有效氯在5％～10％以上，是常規(guī)用量的2倍以上，滅菌時間為20～30min，是常規(guī)滅菌時間的2～3倍。滅菌方式是將用70～75％乙醇溶液滅菌處理過的種子轉(zhuǎn)入無菌容器，向容器內(nèi)倒入有效氯為5～10％的NaClO溶液充分振蕩滅菌，20～30min時，倒出NaClO溶液，并迅速用無菌水沖洗滅菌過的種子5～10次。
本發(fā)明所述方法的具體步驟為(1)將野牛草成熟種子用一定濃度的洗滌劑溶液洗滌后，用流動的自來水充分沖洗6～48小時，完成滅菌預(yù)處理，(2)將滅菌預(yù)處理后的種子在無菌條件下轉(zhuǎn)入滅菌過的容器，向容器內(nèi)倒入70～75％的乙醇溶液，不斷振蕩滅菌，30～60s后，將該容器內(nèi)的乙醇溶液倒出，在原容器內(nèi)或?qū)⒎N子再轉(zhuǎn)移到無菌新容器內(nèi)，(3)倒入有效氯在5％以上的NaClO溶液，不斷振蕩，保證材料滅菌充分，20～30min后，將容器內(nèi)的NaClO溶液倒出，(4)然后，迅速向該容器內(nèi)倒入滅菌過的無菌水，振蕩洗滌1～3分鐘，倒出，如此重復(fù)5～10次后，即可接種到培養(yǎng)基或作其它處理，從而建立野牛草成熟種子的無菌體系。
具體實施例方式在下面的實施例中進一步說明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。
實施例1將野牛草成熟種子用一定濃度的洗滌劑溶液洗滌后，用流動的自來水充分沖洗24小時，種子充分吸脹，將滅菌預(yù)處理后的種子在無菌條件下轉(zhuǎn)入滅菌過的容器，向容器內(nèi)倒入70～75％的乙醇溶液，不斷振蕩滅菌，60s后，將該容器內(nèi)的乙醇溶液倒出，在原容器內(nèi)倒入有效氯為5％的NaClO溶液，不斷振蕩，保證材料滅菌充分，20min后，將容器內(nèi)的NaClO溶液倒出，然后，迅速向該容器內(nèi)倒入滅菌過的無菌水，振蕩洗滌1～3分鐘，倒出，如此重復(fù)5～10次后，接種到培養(yǎng)基，培養(yǎng)1周后，調(diào)查污染情況種子生活力，結(jié)果為種子去污染率為96.34％，種子萌芽率達87.75％。
實施例2野牛草成熟種子的滅菌預(yù)處理及滅菌過程均按實施例1進行，不同之處在于，預(yù)處理過程流動自來水的沖洗時間為12小時，有效氯為5％的NaClO溶液對種子滅菌的時間為25min，調(diào)查結(jié)果為種子的去污染率為98.79％，種子萌芽率達85.48％。
實施例3野牛草成熟種子的滅菌預(yù)處理及滅菌過程均按實施例1進行，不同之處在于，預(yù)處理過程流動自來水的沖洗時間為36小時，有效氯為5％的NaClO溶液對種子滅菌的時間為30min，調(diào)查結(jié)果為種子的去污染率為99.41％，種子萌芽率達88.78％。
實施例4野牛草成熟種子的滅菌預(yù)處理及滅菌過程均按實施例1進行，不同之處在于，預(yù)處理過程流動自來水的沖洗時間為24小時，有效氯為7％的NaClO溶液對種子滅菌的時間為20min，調(diào)查結(jié)果為種子的去污染率為98.42％，種子萌芽率達88.55％。
實施例5野牛草成熟種子的滅菌預(yù)處理及滅菌過程均按實施例1進行，不同之處在于，預(yù)處理過程流動自來水的沖洗時間為24小時，有效氯為7％的NaClO溶液對種子滅菌的時間為25min，調(diào)查結(jié)果為種子的去污染率為99.35％，種子萌芽率達80.69％。
實施例6野牛草成熟種子的滅菌預(yù)處理及滅菌過程均按實施例1進行，不同之處在于，預(yù)處理過程流動自來水的沖洗時間為24小時，有效氯為7％的NaClO溶液對種子滅菌的時間為30min，調(diào)查結(jié)果為種子的去污染率為99.55％，種子萌芽率達72.25％。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及一種野牛草成熟種子的滅菌方法，其方法可有效滅除野牛草成熟種子所帶的菌，去污染率達95％以上，其特征是用酒精與高濃度NaClO溶液組合對野牛草成熟種子滅菌。
2.按照權(quán)利要求1的方法，其進一步特征在于，野牛草成熟種子含大量真菌及其它種類菌，對種子化學(xué)解除休眠處理后，仍帶有大量菌。
3.按照權(quán)利要求2的方法所述，其特征在于，野牛草成熟種子所帶的菌采用常規(guī)滅菌方法很難達到理想滅菌效果。
4.按照權(quán)利要求3的方法所述，其特征在于，常規(guī)滅菌方法包括(1)70％的乙醇與0.1％升汞組合滅菌，(2)70％的乙醇與有效氯為0.2～2％NaClO溶液組合滅菌，(3)稀釋的新潔爾滅滅菌，(4)培養(yǎng)基中添加抗生素及殺菌劑。(5)高低溫處理等物理方法滅菌。
5.按照權(quán)利要求1的方法，滅菌時采用的高濃度NaClO溶液是指有效氯在5％～10％，是常規(guī)用量的2倍以上，滅菌時間為20～30min。
6.按照權(quán)利要求1的方法，其特征在于，種子在滅菌前按常規(guī)預(yù)處理，即將種子洗滌劑洗滌后，用流動的自來水充分沖洗6～48小時。
7.按照權(quán)利要求1的方法，具體步驟為(1)將野牛草成熟種子用一定濃度的洗滌劑溶液洗滌后，用自來水充分沖洗，(2)經(jīng)預(yù)處理后的種子在無菌條件下，70～75％的乙醇溶液滅菌30～60s，用有效氯在5％以上的NaClO溶液滅菌20～30min。(3)用滅過菌的無菌水充分沖洗種子5～10次后，即可用于接種或其它處理。
全文摘要
本發(fā)明公開一種野牛草成熟種子的滅菌方法，主要步驟包括將野牛草種子從果穎中取出，用稀釋的洗滌劑洗滌，并在流動的自來水中沖洗，進行常規(guī)滅菌預(yù)處理。在無菌條件下，70～75％乙醇溶液對種子滅菌30～60s后，用高濃度NaClO溶液對其振蕩滅菌20～30min，然后用無菌水沖洗5～10次，種子去污染率達95％以上。
文檔編號A01H4/00GK1714627SQ200510090119
公開日2006年1月4日 申請日期2005年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月10日
發(fā)明者孫振元, 錢永強, 韓蕾, 巨關(guān)升, 馮霞, 楊學(xué)軍 申請人:中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所