專利名稱：一種鮮切花百合的高效離體繁殖方法
專利說明一種鮮切花百合的高效離體繁殖方法 本發(fā)明涉及鮮切花百合鱗片、葉、短縮莖離體快速繁殖優(yōu)良種苗的方法。百合(Lilium spp.)是多年生球根花卉，花朵碩大，色彩豐富，花姿優(yōu)美，既能作切花、盆花，又能在園林綠地中應(yīng)用。隨著百合在國內(nèi)外鮮切花市場(chǎng)中的走俏，百合花生產(chǎn)和消費(fèi)逐年增加，百合切花在荷蘭的排名已上升為第五位，取得球根花卉之王的稱號(hào)(陸美蓮，許新萍，生物技術(shù)在百合上的應(yīng)用，仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，15(4)69～76，2002)。百合花不僅具有觀賞價(jià)值還具有祛咳生津、補(bǔ)脾益氣、清心安神的藥用價(jià)值，民間常用于做“百合稀粥”、“百合蓮子羹”，其味鮮美可口(阮少寧，楊華，梁一池，劉榮忠，香水百合組織培養(yǎng)的試驗(yàn)研究，福建林學(xué)院學(xué)報(bào)2001，21(2)142～145)。中國是百合屬植物的自然分布中心，全世界百合屬植物約有94個(gè)種，起源于我國的有47個(gè)種、18個(gè)變種，占世界百合屬植物的一半，其中36個(gè)種、15個(gè)變種為我國特有種。我國百合不僅種類多，而且生態(tài)習(xí)性各異，分布廣泛。但目前我國的百合育種工作十分落后，現(xiàn)有的百合種質(zhì)資源不僅沒有得到充分利用，而且破壞、流失現(xiàn)象十分嚴(yán)重，與百合故鄉(xiāng)的地位很不相稱(張?jiān)疲帕?，劉青林，百合的品種改良與生物技術(shù)研究進(jìn)展，北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，23(6)56-59，2001)。由于觀賞百合商品種球繁殖率低，病毒侵染退化，造成種球生產(chǎn)難于滿足切花生產(chǎn)需要。近幾年，我國百合切花生產(chǎn)的種球主要靠進(jìn)口，價(jià)格昂貴。
自Robb離體培養(yǎng)百合鱗莖成功以來，生物技術(shù)在百合上的應(yīng)用已取得顯著的進(jìn)展(趙祥云，王樹棟，陳新露，等.百合[M].北京中國農(nóng)業(yè)出版社，1999)。國內(nèi)外許多科學(xué)家以百合不同品種的鱗片、葉、莖、花藥、花絲、花被、花托等器官為外植體進(jìn)行了擴(kuò)繁研究，眾多研究結(jié)果表明百合鱗片是最佳的擴(kuò)繁外植體(Takayama and Misawa，1980；Takayama and Misawa，1983；Niimi，1986；Gerrits and De Klerk，1992；Priyadarshi and Sen，1992；Wickremesinhe et al.，1994 and Tanimoto and Matsubara，1995；Watad A.A.etal.，1998；Long et al.，2004；Zhang et al.，2004)。目前主要采用鱗莖組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行百合脫毒和擴(kuò)繁，促進(jìn)了百合商品種球的生產(chǎn)。(謝航，白偉，劉云，劉巍，百合組織培養(yǎng)及快繁技術(shù)，農(nóng)業(yè)與技術(shù)，18(5)33-34，1998)。
但百合組織培養(yǎng)中也存在以下問題(1)商業(yè)化生產(chǎn)中的不利因素。迄今為止，百合的生產(chǎn)種植仍以傳統(tǒng)的種球繁殖方式或以分植小鱗莖法繁殖，這樣不僅繁殖系數(shù)低，而且病害侵染嚴(yán)重，因此有人采用鱗片葉直接種植的方式進(jìn)行繁殖，這樣雖然理論上能提高繁殖系數(shù)，但實(shí)際上單鱗片在土中很容易滋生病蟲害并引起腐爛而亡。傳統(tǒng)雜交育種方法常存在受精前后障礙，影響育種效率，利用柱頭切割技術(shù)和胚胎拯救技術(shù)可克服百合受精前后障礙，但由于其技術(shù)難度過大、育種年限長而無法大規(guī)模推廣應(yīng)用。因此，需要通過組織培養(yǎng)進(jìn)行無性系的快速繁殖。(2)污染嚴(yán)重。由于百合鱗莖裸露無皮，直接從田間采回的百合鱗莖，經(jīng)消毒后污染率高達(dá)85％以上，因此大多數(shù)的百合快繁均以失敗告終。污染問題成了百合快繁中的一大障礙。(3)繁殖系數(shù)低。國內(nèi)百合的組織培養(yǎng)快速繁殖研究雖然早已受到重視，例如早有黃敏玲、井忠平、馬惠等關(guān)于百合組織培養(yǎng)的報(bào)道(黃敏玲，陳楊春.庫克點(diǎn)百合的組織培養(yǎng)[J].植物生理學(xué)通訊，1988(5)49；井忠平，李惠芝，潘景麗.麝香百合葉片培養(yǎng)[J].植物雜志，1989(5)8；馬惠，郭扶興.百合葉片愈傷組織的誘導(dǎo)和植株再生[J].植物生理學(xué)通訊，1992，28(4)284.)，但這些研究都未涉及到提高百合繁殖系數(shù)的問題。此后雖有人研究該問題，但系數(shù)都很低。例如黃惠英研究東方百合的離體培養(yǎng)，繁殖系數(shù)為4.95；王鳳蘭等以鱗莖為外植體研究亞洲百合的快繁技術(shù)，繁殖系數(shù)僅為4.4；張君等研究麝香百合的離體培養(yǎng)，繁殖系數(shù)僅為2.0；阮少寧等研究香水百合的繁殖系數(shù)為6.8；杭玲等研究龍牙百合的離體快速繁殖，用鱗片連續(xù)培養(yǎng)8-10次時(shí)，繁殖系數(shù)才達(dá)到512-1000。(4)繁殖時(shí)間過長。Han et al.認(rèn)為東方雜交百合和麝香百合從鱗莖到新植株開花需18個(gè)月以上(Han BH，Yae BW，Yu H J and Peak KY.Improvement of in vitro micropropagation of Lilium oriental hybrid‘Casablanca’by theformation of shoots with abnormally swollen basal plates.Scientia Horticulture，30 January2005，Volume 103，Issue 3，351-359；Han BH，Yu HJ，Yae BW and Peak KY.In vitromicropropagation of Lilium longiflorum‘Georgia’by shoot formation as influenced by additionof liquid medium.Scientia Horticulture，2004，Volume 103，Issue 1，39-49)。這期間主要是成熟苗在移栽前的低溫處理時(shí)間過長，并且由于低溫處理，很容易導(dǎo)致采后葉片枯黃變褐、花蕾敗育、少花且開花期縮短等一系列不良現(xiàn)象。為了解決這一問題，國外的Ranwala A.P和Miller W.B采用在低溫處理的培養(yǎng)基中加GA4+7和BA的措施，(Ranwala A.P and Miller W.B，2005.Effects of cold storage onpostharvest leaf and flower quality of potted Oriental-Asiatia-and LA-hybrid Lily cultivars.Scientia Horticulture.)雖然能緩解以上癥狀，但對(duì)整個(gè)生長期的縮短沒有多大的影響。國內(nèi)阮少寧等采用在香水百合小鱗莖復(fù)壯培養(yǎng)基中添加一定量的BA和GA，可打破休眠，使開花期提前，但沒有具體生長期的統(tǒng)計(jì)資料。(5)組培苗的移栽成活率低。組培苗移栽是營養(yǎng)由異養(yǎng)型向自養(yǎng)型的轉(zhuǎn)變，因此對(duì)外界環(huán)境條件非常敏感。國內(nèi)眾多的科研工作者以沙砂、蛭石、泥炭、園土、椰糠等材料為基質(zhì)進(jìn)行不同的配比來對(duì)組培苗進(jìn)行馴化栽培，但成活率還是不夠理想。
綜上所述，百合快繁盡管在國內(nèi)外做了許多工作，但都不系統(tǒng)，而且還存在許多技術(shù)難題亟待解決。因此系統(tǒng)地研究鮮切花百合組培快繁既可保持優(yōu)良品種(花色、花形美麗，花香濃郁，株型別致，抗逆性強(qiáng)，瓶插壽命長)的遺傳穩(wěn)定性，為其種質(zhì)的保存提供了一條有效途徑，也方便了國際間種質(zhì)交流；同時(shí)以麝香百合和東方百合的鱗片為初始外植體，尋找其最適宜的培養(yǎng)基配方，探索提高繁殖系數(shù)的方法，為麝香百合和東方百合組培苗進(jìn)入工廠化生產(chǎn)提供依據(jù)，這對(duì)鮮切花百合的商業(yè)化生產(chǎn)具有重要的推動(dòng)作用，具有重要的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的實(shí)際且迫切需要解決的問題，本發(fā)明的目的是提供一種兩步外植體法直接快速擴(kuò)繁優(yōu)質(zhì)鮮切花百合的組織培養(yǎng)方法。
本發(fā)明技術(shù)方案一種鮮切花百合的高效離體繁殖方法，包括兩步外植體法，外植體的預(yù)處理、消毒、培養(yǎng)、組培苗的馴化及移栽等步驟兩步外植體法以優(yōu)質(zhì)的鱗莖為初始外植體，以從優(yōu)質(zhì)鱗莖上長出的芽為次級(jí)外植體。
外植體的預(yù)處理取優(yōu)質(zhì)的百合鱗莖于4℃暗藏40-60天使其脫春化；消毒流線型自來水沖洗12小時(shí)，然后在75％酒精中浸泡30秒，0.1％升汞中不斷攪動(dòng)處理15分鐘。
培養(yǎng)培養(yǎng)階段包括初始外植體誘導(dǎo)出芽、次級(jí)外植體增殖及壯苗培養(yǎng)、催根培養(yǎng)、試管苗馴化及移栽等步驟。
初始外植體誘芽培養(yǎng)將初始外植體即鱗片葉切割成1cm見方的小塊，每片視其大小切割成3-5小塊，接種于MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH＝5.8，22-26℃，每日光照培養(yǎng)16小時(shí)，強(qiáng)度為1500lx，連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間30-50天，產(chǎn)生從生芽；次級(jí)外植體增殖及壯苗培養(yǎng)從初始外植體上誘導(dǎo)的從生芽為次級(jí)外植體，將其葉、小鱗莖和短縮莖分別切割成2mm(寬)×10mm(長)、4-5mm(寬)×7-8mm(長)和8-10mm(直徑)×2mm(高)的小段，每個(gè)芽可以切割成15-18小片。然后接種于MS+BM.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH＝5.8，22-26℃，每日光照培養(yǎng)16小時(shí)，強(qiáng)度為1500lx，連續(xù)培養(yǎng)40天產(chǎn)生從生芽。
催根培養(yǎng)經(jīng)壯苗培養(yǎng)后，繁殖芽接種于1/2MS+IBA0.25mg/L+GA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH＝5.8，22-24℃，每日光照培養(yǎng)12小時(shí)，強(qiáng)度為1500lx。連續(xù)培養(yǎng)30天則誘導(dǎo)出較高質(zhì)量的根系，成為生根苗。
試管苗馴化及移栽生根苗經(jīng)2-3天的自然光煉苗后，移栽于滅菌的基質(zhì)(砂∶園土∶椰糠＝1∶1∶1)中，20-22℃，每日光照培養(yǎng)12小時(shí)，強(qiáng)度為1500lx，20天后，移栽入大田。
結(jié)果分析1、外植體消毒的成功率經(jīng)過預(yù)處理的外植體，用流線型自來水沖洗12小時(shí)，然后在75％酒精中浸泡30秒，0.1％升汞中不斷攪動(dòng)處理15分鐘，其成功率達(dá)50％以上，這說明這種消毒處理對(duì)百合鱗莖表面泥砂、細(xì)菌及其真菌孢子去除均有一定的作用，采用這一消毒技術(shù)獲得的良好效果是已見報(bào)道的技術(shù)方法所不能達(dá)到的。
2、高繁殖系數(shù)采用兩步外植體法是提高繁殖系數(shù)的最好方法。一個(gè)中等大小(重50mg)的百合鱗莖有10-15片鱗片葉，每片鱗片可以切成3-5個(gè)1cm見方的小塊，每小塊可以誘導(dǎo)30個(gè)不定芽，以此芽為次級(jí)外植體，每個(gè)芽可以分割成15-18個(gè)小片，平均每小片又能誘發(fā)4個(gè)生長健壯的不定芽，考慮到消毒處理時(shí)50％的成功率，因此一個(gè)中等大小的鱗莖通過兩步外植體法1代就可以擴(kuò)增出27,000個(gè)獨(dú)立完整的帶小鱗莖的新植株，這一結(jié)果是國內(nèi)外已見報(bào)導(dǎo)的技術(shù)方法所不能達(dá)到的(表1、2)。
3、高繁殖速度以經(jīng)過預(yù)處理的百合鱗莖為初始外植體，在50天甚至更早就可以誘導(dǎo)出次級(jí)外植體，次級(jí)外植體在同樣的培養(yǎng)基上40天就可以誘導(dǎo)出叢生芽。將芽切下置于生根培養(yǎng)基中只需30天即可誘導(dǎo)生根，生根苗不需經(jīng)過低溫處理直接移栽于滅菌的基質(zhì)中，20天后移入大田正規(guī)生長，4個(gè)月后即可開花，因此從鱗莖到新植株開花只需8個(gè)月左右，這么快的繁殖速度是國內(nèi)外都未見報(bào)導(dǎo)的。
4、高移栽成活率正?；L的小苗在移入大田前進(jìn)行20天左右的馴化培養(yǎng)是必需的。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室對(duì)不同培養(yǎng)基質(zhì)的配比試驗(yàn)，又考慮到大規(guī)模生產(chǎn)的成本，發(fā)現(xiàn)在砂∶園土∶椰糠＝1∶1∶1的基質(zhì)中生長的小苗成活率高達(dá)99％，這也是國內(nèi)外現(xiàn)有技術(shù)所不能達(dá)到的。
本研究已對(duì)麝香百合和東方雜交百合的鱗莖預(yù)處理、消毒、初始外植體的誘芽培養(yǎng)、次級(jí)外植體的誘芽培養(yǎng)，催根及馴化移栽等環(huán)節(jié)作了系統(tǒng)的研究，找到了一條適合鮮切花百合快繁的可行途徑，若投入一定的人力、物力，以此技術(shù)體系為依托進(jìn)行鮮切花種苗的商業(yè)化生產(chǎn)是可行的，此項(xiàng)技術(shù)的突破大大改進(jìn)了國內(nèi)在鮮切花百合快繁技術(shù)上的不足；通過本技術(shù)體系目前已獲得了麝香百合、東方雜交百合兩個(gè)無性系，并已移栽至大田進(jìn)行示范種植，示范面積為1畝。下面結(jié)合實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明1、材料來源以從云南引進(jìn)的優(yōu)質(zhì)東方雜交百合鱗莖和中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝所提供的麝香百合鱗莖作為初始外植體。
2、方法(1)材料預(yù)處理及消毒處理①取優(yōu)質(zhì)的百合鱗莖于4℃暗藏40天使其脫春化；②外植體經(jīng)預(yù)處理后用流線型自來水沖洗12小時(shí)，然后在75％酒精中浸泡30秒，0.1％升汞中不斷攪動(dòng)處理15分鐘。
(2)初始外植體誘芽培養(yǎng)將初始外植體即鱗片葉切割成1cm見方的小塊，每片視其大小切割成4小塊，接種于MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH＝5.8，24℃，每日光照培養(yǎng)16小時(shí)，強(qiáng)度為1500lx，連續(xù)培養(yǎng)時(shí)間50天，產(chǎn)生從生芽；(3)次級(jí)外植體增殖及壯苗培養(yǎng)從初始外植體上誘導(dǎo)的從生芽為次級(jí)外植體，將其葉、小鱗莖和短縮莖分別切割成2mm(寬)×10mm(長)、4mm(寬)×7mm(長)和8mm(直徑)×2mm(高)的小段，每個(gè)芽可以切割成15小片。然后接種于MS+BM.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH＝5.8，24℃，每日光照培養(yǎng)16小時(shí)，強(qiáng)度為1500lx，連續(xù)培養(yǎng)40天產(chǎn)生從生芽。
(4)催根培養(yǎng)經(jīng)壯苗培養(yǎng)后，繁殖芽接種于1/2MS+IBA0.25mg/L+GA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH＝5.8，22℃，每日光照培養(yǎng)12小時(shí)，強(qiáng)度為1500lx。連續(xù)培養(yǎng)30天則誘導(dǎo)出較高質(zhì)量的根系，成為生根苗。
(5)試管苗馴化及移栽生根苗經(jīng)2天的自然光煉苗后，移栽于滅菌的基質(zhì)(砂∶園土∶椰糠＝1∶1∶1)中，20℃，每日光照培養(yǎng)12小時(shí)，強(qiáng)度為1500lx，20天后，移栽入大田正規(guī)生長，4個(gè)月后開花。
表1.培養(yǎng)50天后不同的BA濃度對(duì)百合鱗片誘芽的影響
表2不同的次級(jí)外植體類型在MS加1.0mg/L BA和0.1mg/L NAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)40天后不同的出芽效果
權(quán)利要求
1.一種鮮切花百合的高效離體繁殖方法，即兩步外植體法，包括外植體的預(yù)處理、消毒、培養(yǎng)等步驟，其特征在于外植體的預(yù)處理取優(yōu)質(zhì)的百合鱗莖于4℃暗藏使其脫春化；消毒用流線型自來水沖洗過夜，先后用70％酒精、0.15％升汞消毒；培養(yǎng)培養(yǎng)階段包括初始外植體誘導(dǎo)出芽、次級(jí)外植體增殖及壯苗培養(yǎng)、催根培養(yǎng)、試管苗馴化及移栽等步驟。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鮮切花百合的高效離體繁殖方法，其特征在于在預(yù)處理時(shí)4℃暗藏天數(shù)為40-60天。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鮮切花百合的高效離體繁殖方法，其特征在于，初始外植體經(jīng)預(yù)處理后用流線型自來水沖洗12小時(shí)，然后在75％酒精中浸泡30秒，0.1％升汞中不斷攪動(dòng)處理15分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鮮切花百合的高效離體繁殖方法，其特征在于將初始外植體即鱗片葉切割成1cm見方的小塊，每片視其大小切割成3-5小塊。接種步驟為接種于MS+BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+30g/L蔗糖+7g/L瓊脂，pH＝5.8，22-26℃，每日光照培養(yǎng)16小時(shí)，強(qiáng)度為1500lx。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鮮切花百合的高效離體繁殖方法，其特征在于以從初始外植體上誘導(dǎo)的芽為次級(jí)外植體，將其葉、小鱗莖和短縮莖分別切割成2mm(寬)×10mm(長)、4-5mm(寬)×7-8mm(長)和8-10mm(直徑)×2mm(高)的小段，每個(gè)長4cm的芽可以切割成15-18小片。然后接種于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH＝5.8，22-26℃，每日光照培養(yǎng)16小時(shí)，強(qiáng)度為2000lx。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的鮮切花百合的高效離體繁殖方法，其特征在于所述的壯苗培養(yǎng)步驟為次級(jí)外植體經(jīng)繼代培養(yǎng)后，接種于MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH＝5.8，22-26℃，每日光照培養(yǎng)16小時(shí)，強(qiáng)度為2000lx。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的鮮切花百合的高效離體繁殖方法，其特征在于所述的催根培養(yǎng)步驟為繁殖芽經(jīng)壯苗培養(yǎng)后，接種于1/2MS+IBA0.25mg/L+GA0.2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L，pH＝5.8，22-24℃，每日光照培養(yǎng)12小時(shí)，強(qiáng)度為1500lx。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的鮮切花百合的高效離體繁殖方法，其特征在于所述的試管苗馴化及移栽步驟為生根苗經(jīng)2-3天的自然光煉苗后，移栽于滅菌的基質(zhì)(砂∶園土∶椰糠＝1∶1∶1)中，20-22℃，每日光照培養(yǎng)12小時(shí)，強(qiáng)度為1500lx，20天后，移栽入大田。
全文摘要
本發(fā)明涉及鮮切花百合的高效離體繁殖方法——兩步外植體法，將優(yōu)質(zhì)的東方雜交百合和麝香百合，于4℃暗藏使其脫春化，選擇中等大小(50克)的鱗莖為初始外植體，通過直接分化的途徑擴(kuò)繁出芽。以該芽叢為次級(jí)外植體，進(jìn)行增殖及壯苗培養(yǎng)、催根培養(yǎng)、試管苗馴化及移栽等步驟。不僅解決了以鱗莖直接作為種球存在的繁殖系數(shù)低且易發(fā)生種球退化問題，而且解決了以鱗莖為唯一外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)存在的污染率高、增殖率低、繁殖速度慢和移栽成活率低的關(guān)鍵問題，為鮮切花百合的生產(chǎn)提供培育優(yōu)質(zhì)種苗的技術(shù)途徑，同時(shí)亦為鮮切花百合的大規(guī)模生產(chǎn)開發(fā)起到積極的推動(dòng)作用，這具有十分重要的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)A01H3/02GK1771797SQ200510101440
公開日2006年5月17日 申請(qǐng)日期2005年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月15日
發(fā)明者劉菊華, 徐碧玉, 金志強(qiáng), 譚光蘭 申請(qǐng)人:中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所, 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室