專利名稱：：在基因轉(zhuǎn)變活躍的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)遺傳多樣化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及通過利用抗體生產(chǎn)細(xì)胞以及能產(chǎn)生所說遺傳多樣性的細(xì)胞和細(xì)胞系中免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)變(geneconversion)和超變(hypermutation)之間的關(guān)系對靶核酸序列或基因產(chǎn)物進(jìn)行定向和選擇性遺傳多樣化的方法，以及能夠進(jìn)行所述遺傳多樣化的細(xì)胞和細(xì)胞系。許多使基因產(chǎn)物產(chǎn)生多樣性的方法依賴于產(chǎn)生非常大數(shù)目的突變體，然后用有力的選擇技術(shù)對其進(jìn)行選擇。不過，這些體系有許多弊病。如果誘變是在體外對基因構(gòu)建體進(jìn)行的、并且隨后將其用于體外表達(dá)或作為轉(zhuǎn)基因在細(xì)胞或動物內(nèi)表達(dá)，則所說的基因表達(dá)在生理學(xué)環(huán)境中是困難的且突變體庫在時(shí)間上是確定的。另一方面，如果誘變是在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的，則將突變定向于預(yù)期的目標(biāo)核酸就較困難。因此，通過重復(fù)循環(huán)進(jìn)行足夠有效的突變和選擇來分離具有改良活性的分子的效率是有限的。而且，體內(nèi)隨機(jī)誘變是有害的，并且可能誘發(fā)高水平的有害次級突變。實(shí)際上，選定核酸序列的定向多樣化發(fā)生在免疫球蛋白(Ig)基因座位的重排V(D)J區(qū)段中。抗體特異性的主要部分是通過包括連接免疫球蛋白V、D和J基因區(qū)段在內(nèi)的DNA重排過程產(chǎn)生的。遇到抗原后，在那些表面免疫球蛋白可以較低的或中等的親和力與抗原結(jié)合的B細(xì)胞中重排的V(D)J區(qū)段通過超變發(fā)生第二次多樣化。這種所謂的體細(xì)胞超變產(chǎn)生了二級庫，從中選擇結(jié)合特異性增加的類型，從而使體液免疫反應(yīng)發(fā)生親和力成熟(Milstein和Rada，1995)。小鼠和人的免疫球蛋白基因座包含大集合的V、D和J基因區(qū)段，它們可參與V(D)J重排，從而在此階段通過隨機(jī)組合產(chǎn)生顯著的多樣性。諸如雞、兔、牛、綿羊和豬等其它物種則采取不同的策略來發(fā)展它們的初級免疫球蛋白總組分(Butler，1998)。在一種功能性V和J區(qū)段重排后，通過在特殊的淋巴器官-法氏囊內(nèi)的基因轉(zhuǎn)變產(chǎn)生雞輕鏈基因的進(jìn)一步多樣化(Reynaud等，1987；Arakawa和Buerstedde，印刷中)。在此過程中，來自非功能性假V基因的序列段被轉(zhuǎn)移入重排的V基因中。25種假V基因位于功能性V基因的上游并且與V基因享有序列同源性。與在人和小鼠中的情形相似，遇到抗原后的親和力成熟通過超變在雞的脾生發(fā)中心發(fā)生(Arakawa等，1996)。形成免疫球蛋白全部組分的所有三種B細(xì)胞特異性活性—基因轉(zhuǎn)變(Arakawa等，2002)、超變和同種型轉(zhuǎn)換重組(Muramatsu等，2000；Revy等，2000)都需要活化誘導(dǎo)型脫氨酶(ActivationInducedDeaminase，AID)基因的表達(dá)。盡管AID起初被認(rèn)為是DNA編輯酶(Muramatsu等，1999)，但近來的更多研究表明AID通過將胞嘧啶脫氨基形成尿嘧啶而直接修飾DNA(DiNoia和Neuberger，2002)。不過，胞嘧啶脫氨基活性必須被進(jìn)一步調(diào)控，因?yàn)橹挥蠥ID誘導(dǎo)的DNA修飾的類型、位置和過程有差異才能解釋在不同物種和B細(xì)胞環(huán)境中重組或超變的選擇性發(fā)生。根據(jù)某些AID突變影響轉(zhuǎn)換重組但不影響體細(xì)胞超變這一發(fā)現(xiàn)，研究者認(rèn)為AID需要結(jié)合輔因子來起始轉(zhuǎn)換重組(Ta等，2003；Barreto等，2003)。對DT40敲除型突變體進(jìn)行的分析表明，RAD54基因(Bezzubova等，1997)和RAD52重組修復(fù)途徑的其它成員是有效的免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)變所必需的(Sale等，2001)。RAD51類似物和平行進(jìn)化同源物的破壞減少了免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)變并誘發(fā)了重排的輕鏈基因內(nèi)的超變(Sale等，2001)，表明通過同源重組進(jìn)行DNA修復(fù)中的突變可將免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)變成超變。最近，已開發(fā)出第一種細(xì)胞體系，其中利用免疫球蛋白基因座內(nèi)體細(xì)胞超變的現(xiàn)象以組成型和定向的方式產(chǎn)生靶基因的突變體。這些細(xì)胞體系使得我們可以通過突變產(chǎn)生和選擇的循環(huán)步驟制備具有預(yù)期活性的基因產(chǎn)物。因而，WO00/22111和WO02/100998描述了能對某一特異核酸區(qū)域進(jìn)行定向組成型超變的人伯基特淋巴瘤細(xì)胞系(Ramos)。此突變區(qū)可以是內(nèi)源性重排的V區(qū)段或與指導(dǎo)超變的調(diào)控序列可操作性連接的外源基因。此細(xì)胞體系的主要缺點(diǎn)在于人細(xì)胞不能通過定向整合進(jìn)行有效的遺傳操作，因?yàn)楸晦D(zhuǎn)染的構(gòu)建體主要在隨機(jī)染色體位置處插入。WO02/100998還描述了用于在免疫球蛋白基因座中產(chǎn)生遺傳多樣性的另一細(xì)胞體系，它是以雞的B細(xì)胞系DT40為基礎(chǔ)的。在細(xì)胞培養(yǎng)期間，DT40繼續(xù)進(jìn)行重排輕鏈免疫球蛋白基因的基因轉(zhuǎn)變(Buerstedde等，1990)。重要的是，此細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染構(gòu)建體的定向與隨機(jī)整合之比較高，從而使得可以進(jìn)行有效的遺傳操作(Buerstedde和Takeda，1991)。依照WO02/100998，DT40中同源重組和DNA修復(fù)中所涉及的RAD51基因平行進(jìn)化同源物的缺失導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)變的減少并同時(shí)激活了重排V區(qū)段的超變。不過，此體系的主要缺點(diǎn)在于，突變細(xì)胞具有DNA修復(fù)缺陷，這可由X射線敏感性和染色體不穩(wěn)定性反映出來。所述突變體還具有低增殖速率和低基因打靶效率。因此此體系不太適合進(jìn)行有效的基因多樣化及選擇。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)體系的缺點(diǎn)，并且還具有更多的優(yōu)勢。發(fā)明簡述本發(fā)明的第一方面是提供了基因轉(zhuǎn)變完全或部分被超變所取代的遺傳修飾型淋巴細(xì)胞，其中所說的細(xì)胞在編碼重要的同源重組因子的RAD51基因平行進(jìn)化同源物和類似物的基因中沒有有害突變。明確的說，細(xì)胞中包含野生型同源重組因子。由于完整的同源重組機(jī)制，依照本發(fā)明的細(xì)胞是重組和修復(fù)全能的并且具有正常的增殖速率。本發(fā)明的細(xì)胞是表達(dá)免疫球蛋白的B淋巴細(xì)胞，其來源于利用基因轉(zhuǎn)變機(jī)制形成其免疫球蛋白全部組分的動物物種。這些物種舉例而言有雞、綿羊、牛、豬和兔。優(yōu)選地，所述細(xì)胞來源于雞法氏囊淋巴瘤。更優(yōu)選地，所說細(xì)胞來自DT40細(xì)胞系或與DT40細(xì)胞系相關(guān)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，依照本發(fā)明的細(xì)胞能通過超變或超變和基因轉(zhuǎn)變的聯(lián)合對靶核酸進(jìn)行定向和選擇性遺傳多樣化。所說靶核酸可編碼蛋白質(zhì)或具有調(diào)控活性。蛋白質(zhì)的例子有免疫球蛋白鏈、選擇性標(biāo)記、DNA結(jié)合蛋白、酶、受體蛋白或它們的部分。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，靶核酸是重排的人免疫球蛋白基因的V(D)J區(qū)段。調(diào)控核酸的例子是轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或RNAi序列。在某一實(shí)施方案中，其中通過超變和基因轉(zhuǎn)變的聯(lián)合使靶基因多樣化，依照本發(fā)明的細(xì)胞包含至少一種能用作靶核酸的基因轉(zhuǎn)變供體的序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，該靶核酸是與指導(dǎo)遺傳多樣化的調(diào)控核酸序列可操作性連接的外源核酸。在另一實(shí)施方案中，所述的靶核酸以便于選擇展示預(yù)期活性的細(xì)胞的方式在本發(fā)明的細(xì)胞中表達(dá)。所述的選擇可以是直接選擇細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞表面上或細(xì)胞外靶核酸的活性。或者。所述的選擇可以是間接選擇報(bào)導(dǎo)核酸的活性。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于調(diào)節(jié)本發(fā)明細(xì)胞內(nèi)靶核酸的遺傳多樣性的遺傳方式。所述的調(diào)節(jié)可以是修飾順式作用調(diào)控序列、改變基因轉(zhuǎn)變供體的數(shù)目或者修飾反式作用調(diào)控因子，諸如活化作用誘導(dǎo)性脫氨酶(AID)或者除了RAD51類似物或平行進(jìn)化同源物之外的DNA修復(fù)或重組因子。所述細(xì)胞優(yōu)選條件性地表達(dá)活化作用誘導(dǎo)的脫氨酶(AID)。第二方面，本發(fā)明提供了衍生自本發(fā)明細(xì)胞的細(xì)胞系。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該細(xì)胞系是DT40或其修飾形式。第三方面，本發(fā)明提供了含有其中基因轉(zhuǎn)變?nèi)炕虿糠直怀兯〈牧馨蜆蛹?xì)胞的轉(zhuǎn)基因非人動物，其中所說的細(xì)胞在編碼RAD51蛋白平行進(jìn)化同源物和類似物的基因中無不良突變，且其中所說的細(xì)胞能通過超變或超變與基因轉(zhuǎn)變的聯(lián)合而進(jìn)行轉(zhuǎn)基因靶核酸的定向和選擇性遺傳多樣化。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述動物是雞。在另一方面，本發(fā)明提供了用于制備能通過超變或超變與基因轉(zhuǎn)變的聯(lián)合而進(jìn)行轉(zhuǎn)基因靶核酸的定向和選擇性遺傳多樣化的細(xì)胞的方法。所述方法包括(a)用含靶核酸的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)染能進(jìn)行基因轉(zhuǎn)變的淋巴樣細(xì)胞，并且(b)鑒定含有內(nèi)源V基因區(qū)段或其部分被靶核酸所取代的細(xì)胞。依照另一實(shí)施方案，含有靶核酸的遺傳構(gòu)建體進(jìn)一步包含至少一種能用作靶核酸的基因轉(zhuǎn)變供體的核酸。含有該靶核酸的基因座可通過用含該基因座不同組分的構(gòu)建體進(jìn)行單一的轉(zhuǎn)染或多輪轉(zhuǎn)染來構(gòu)建。在其中對具有所需活性的細(xì)胞進(jìn)行間接選擇的實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括(c)用含有能被靶核酸所影響的報(bào)導(dǎo)基因的另一遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)染來自步驟(b)的細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法進(jìn)一步包括(d)條件性地表達(dá)反式作用調(diào)控因子。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，該反式作用調(diào)控因子是活化誘導(dǎo)型脫氨酶(AID)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過靶向整合將所述的靶核酸插入細(xì)胞中。在另一方面，本發(fā)明提供了制備具有所需活性的基因產(chǎn)物的方法，包括如下步驟(a)在適于表達(dá)靶核酸的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)胞；(b)鑒定細(xì)胞群中表達(dá)具有該預(yù)期活性的突變基因產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞；并(c)從步驟(b)所鑒定的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞建立一個(gè)或多個(gè)無性繁殖細(xì)胞群，并從所說的無性繁殖細(xì)胞群中選擇表達(dá)具有改良的預(yù)期活性的基因產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，循環(huán)重復(fù)步驟(b)和(c)，直至產(chǎn)生具有優(yōu)化型預(yù)期活性的基因產(chǎn)物。依照另一實(shí)施方案，當(dāng)產(chǎn)生具有優(yōu)化型預(yù)期活性的基因產(chǎn)物的細(xì)胞已被鑒定出來之時(shí)，可關(guān)閉遺傳多樣化，例如通過下調(diào)反式作用調(diào)控因子的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。反式作用調(diào)控因子可以是，例如，活化誘導(dǎo)型脫氨酶(AID)或除了RAD51平行進(jìn)化同源物或類似物之外的同源重組或DNA修復(fù)中所涉及因子。在另一實(shí)施方案中，通過靶序列的優(yōu)化作用對靶核酸的多樣化進(jìn)行了進(jìn)一步的修飾，諸如引入免疫球蛋白超變熱點(diǎn)或提高GC含量。在本發(fā)明的另一方面，提供了利用能通過超變或超變及基因轉(zhuǎn)變的聯(lián)合而對靶核酸進(jìn)行定向和選擇性遺傳多樣化的細(xì)胞制備具有預(yù)期活性的基因產(chǎn)物的用途。附圖簡述圖1.ΨV基因缺失(A)雞重排免疫球蛋白輕鏈基因座和ΨV敲除構(gòu)建體的物理圖譜。所說的基因座包含功能性V區(qū)段上游的總共25個(gè)ΨV基因。通過靶向整合pΨVDel1-25和pΨVDel3-25構(gòu)建體進(jìn)行ΨV基因敲除的策略顯示如下。只有相關(guān)的EcoRI位點(diǎn)被標(biāo)出。(B)EcoRI消化后用(A)中所示的探針進(jìn)行野生型和敲除克隆的DNA印跡分析。野生型基因座以12-kb長的片段形式雜交，而ΨVpartial及ΨV-基因座則分別以7.4-kb和6.3-kb片段的形式雜交。(C)AID狀況。PCR擴(kuò)增AID基因以證實(shí)AIDcDNA表達(dá)盒的存在或缺乏。圖2.對照和ΨV敲除克隆的sIgM表達(dá)分析。(A)來自最初的sIgM(+)克隆的代表性亞克隆的FACS抗IgM染色圖譜。(B)以24個(gè)亞克隆的檢測值為基礎(chǔ)落入sIgM(-)組的事件的平均百分率。圖3.ΨV敲除克隆的Ig輕鏈序列分析。AIDRΨV-和AIDRΨVpartial克隆的突變圖譜。不同序列中從前導(dǎo)序列至J-C內(nèi)含子之間的區(qū)域內(nèi)鑒定的所有核苷酸取代被作圖于AIDR前體克隆中所存在的重排輕鏈序列上。AIDRΨV-和AIDRΨVpartial克隆的突變分別顯示于參照序列的上面和下面。缺失、插入和基因轉(zhuǎn)變也被標(biāo)出。熱點(diǎn)基元(RGYW及其互補(bǔ)物WRCY)用粗體標(biāo)出。圖4.超變細(xì)胞系的突變圖譜。(A)攜帶某一數(shù)目突變的序列百分?jǐn)?shù)。計(jì)算各個(gè)非模板的核苷酸取代，但涉及多個(gè)核苷酸的基因轉(zhuǎn)變、缺失和插入被計(jì)算為單個(gè)事件。PM點(diǎn)突變；GC基因轉(zhuǎn)變；D缺失；I插入。(B)來自ΨV和XRCC3敲除克隆的序列內(nèi)的核苷酸取代模式。作為基因轉(zhuǎn)變事件一部分的核苷酸取代被排除在外。還顯示了轉(zhuǎn)換(trs)和顛換(trv)之比。(C)優(yōu)選的非模板核苷酸取代突變熱點(diǎn)。以百分率顯示了發(fā)生在熱點(diǎn)基元(RGYW或其互補(bǔ)序列WRCY)內(nèi)的突變。(D)以臺盼藍(lán)陽性細(xì)胞作為自發(fā)死亡細(xì)胞的指示劑。圖5.未分揀的AIDRΨV-細(xì)胞基因組序列內(nèi)和分揀的IgM(-)AIDRΨV-細(xì)胞cDNA序列內(nèi)的核苷酸取代分布。每50bp計(jì)數(shù)突變數(shù)目，與輕鏈基因座位或cDNA序列的相應(yīng)物理圖譜一起顯示。圖6.說明免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)變和免疫球蛋白超變的模型。圖7.GFP基因的原位誘變。(A)免疫球蛋白VJ置換載體。(B)通過超變進(jìn)行GFP基因的體內(nèi)誘變。(C)ΨV供體置換載體。(D)通過基因轉(zhuǎn)變和超變進(jìn)行GFP基因的體內(nèi)誘變。發(fā)明詳述本發(fā)明提供了特別有效的細(xì)胞體系用于通過超變或超變和基因轉(zhuǎn)變聯(lián)合進(jìn)行任一核酸的定向選擇性遺傳多樣化。所述體系是基于B細(xì)胞系的，其在體外組成型地使重排的免疫球蛋白V基因發(fā)生多樣化而無需胞外刺激，諸如與其它細(xì)胞或分子的相互作用或B細(xì)胞抗原受體的維持。用于此處時(shí)，“定向和選擇性的多樣化”指某些細(xì)胞引起內(nèi)源或轉(zhuǎn)基因核酸特定區(qū)域內(nèi)核酸序列發(fā)生改變而這些區(qū)域外的序列不被突變的能力。“遺傳多樣化”指核酸內(nèi)個(gè)體核苷酸或核苷酸伸展片段的變化。本發(fā)明的細(xì)胞內(nèi)遺傳多樣化是通過超變、基因轉(zhuǎn)變或超變和基因轉(zhuǎn)變的聯(lián)合產(chǎn)生的。“超變”指細(xì)胞內(nèi)核酸以高于背景的速率發(fā)生的突變。優(yōu)選的，超變指突變率在每世代每bp10-5至10-3bp-1個(gè)突變之間。這大大超過了背景突變率，后者通常是每世代每bp10-9至10-10個(gè)突變的級別(Drake等，1988)且是PCR中觀察到的自發(fā)突變。用Pfu聚合酶進(jìn)行30輪擴(kuò)增會導(dǎo)致產(chǎn)物中每bp有小于0.05×10-3個(gè)突變，在本發(fā)明情況下這只代表了所觀察到的100個(gè)突變中小于1個(gè)突變(Lundberg等1991)。“基因轉(zhuǎn)變”指序列信息以單向方式從某一同源等位基因向其它等位基因轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。基因轉(zhuǎn)變可能是DNA聚合酶沿模板移動和復(fù)制同源序列的結(jié)果，或者是異源雙鏈核酸分子形成后錯(cuò)配修復(fù)(核苷酸被從某一鏈上去除并通過利用另一鏈進(jìn)行修復(fù)合成而被取代)的結(jié)果。超變和基因轉(zhuǎn)變產(chǎn)生了B細(xì)胞的免疫球蛋白V(D)J區(qū)段內(nèi)的自然多樣性。超變是在抗原刺激后在諸如小鼠和人等物種的生發(fā)中心內(nèi)發(fā)生的。基因轉(zhuǎn)變則不依賴于抗原刺激而在諸如雞、牛、兔、綿羊和豬等物種的初級淋巴器官、象法氏囊或腸相關(guān)淋巴組織內(nèi)發(fā)生。在雞中，來自上游假V基因的伸展片段被轉(zhuǎn)移入重排的V(D)J區(qū)段內(nèi)。因此，依照本發(fā)明的細(xì)胞或細(xì)胞系優(yōu)選是能使其重排的免疫球蛋白基因發(fā)生多樣化的免疫球蛋白生產(chǎn)細(xì)胞或細(xì)胞系。在本文所報(bào)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)中首次建立了超變和基因轉(zhuǎn)變起始之間的直接聯(lián)系。具體的說，部分或全部缺失細(xì)胞系中在細(xì)胞培養(yǎng)中繼續(xù)基因轉(zhuǎn)變的假V基因?qū)?dǎo)致免疫球蛋白基因座內(nèi)超變的激活。所有假基因的缺失導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)變停止并同時(shí)激活了高速率的超變，而一些假基因的缺失則導(dǎo)致了基因轉(zhuǎn)變的下調(diào)并同時(shí)激活了其速率較整個(gè)假基因缺失所觀察到的速率低的超變。因此，可供利用的假基因供體的數(shù)目與基因轉(zhuǎn)變速率直接相關(guān)，而與超變速率負(fù)相關(guān)?；蜣D(zhuǎn)變和超變被確定為互相相反的關(guān)系。因此，本發(fā)明首次提供了允許通過聯(lián)合超變和基因轉(zhuǎn)變而對靶核酸進(jìn)行遺傳多樣化的細(xì)胞體系，從而可以通過改變基因轉(zhuǎn)變供體的數(shù)目、它們的方位或者同源性程度或長度來調(diào)控這兩種現(xiàn)象所起的作用。本發(fā)明細(xì)胞體系優(yōu)于諸如基于人伯基特淋巴瘤細(xì)胞系Ramos(WO00/22111和WO02/100998)的細(xì)胞體系等只具有超變活性的細(xì)胞體系的地方在于它能通過同一細(xì)胞內(nèi)的超變和基因轉(zhuǎn)變來聯(lián)合進(jìn)行遺傳多樣化。例如，用基因轉(zhuǎn)變比用隨機(jī)超變可將更確定的變異引入靶基因中，因?yàn)榛蜣D(zhuǎn)變供體可被改造成含有可能以有利方式影響靶核酸活性的序列。因此基因轉(zhuǎn)變和超變可能提高產(chǎn)生所需變體的機(jī)會，因?yàn)轭A(yù)先測定的序列模塊是與隨機(jī)超變結(jié)合的。具有與靶基因某一區(qū)域相同的序列的假基因也可被用于通過頻繁轉(zhuǎn)換使靶核酸的一部分保持穩(wěn)定，所述的頻繁轉(zhuǎn)換具有只在非轉(zhuǎn)換部分內(nèi)保持超變的效果。當(dāng)靶核酸包含為了達(dá)到最佳活性應(yīng)保持穩(wěn)定的區(qū)域時(shí)，此方法是很有用的。本發(fā)明的細(xì)胞體系比以基因轉(zhuǎn)變活躍細(xì)胞(WO02/100998)中同源重組活性的抑制為基礎(chǔ)的細(xì)胞體系優(yōu)越之處在于細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性，反映在正常增殖速率、放射抗性和DNA修復(fù)能力方面。本發(fā)明細(xì)胞體系比所有已知體系的特別優(yōu)越之處在于本發(fā)明的細(xì)胞能通過靶向整合至同源的內(nèi)源基因座而整合被轉(zhuǎn)染的核酸構(gòu)建體?！鞍邢蛘稀笔峭ㄟ^同源重組將含有與內(nèi)源核酸序列同源的核酸序列的被轉(zhuǎn)染核酸構(gòu)建體整合入內(nèi)源基因座內(nèi)。靶向整合可以將任一核酸直接插入確定的染色體位置處。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過定向整合入免疫球蛋白基因座內(nèi)、代替重排V(D)J區(qū)段或其中某一部分處而插入編碼目的基因產(chǎn)物的核酸。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的細(xì)胞來源于經(jīng)歷體內(nèi)免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)變的細(xì)胞或者與此類細(xì)胞相關(guān)。經(jīng)歷體內(nèi)基因轉(zhuǎn)變的細(xì)胞是，例如，在諸如鳥類法氏囊B細(xì)胞等主要淋巴器官內(nèi)表達(dá)表面免疫球蛋白的B細(xì)胞。來源于主要淋巴器官B細(xì)胞的淋巴瘤細(xì)胞是用于構(gòu)建本發(fā)明的細(xì)胞和細(xì)胞系的特別好的候選細(xì)胞。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞來源于雞的法氏囊淋巴瘤細(xì)胞系DT40。本發(fā)明使用了通過超變和基因轉(zhuǎn)變而進(jìn)行組成性遺傳多樣化的方法，從而產(chǎn)生具有預(yù)期的新型或改良活性的基因產(chǎn)物?！鞍泻怂帷笔窃诒景l(fā)明的細(xì)胞內(nèi)被定向選擇性遺傳多樣化的核酸序列或染色體區(qū)域。靶核酸可以是內(nèi)源性的或是轉(zhuǎn)基因的，并可包含編碼基因產(chǎn)物的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。用于此處時(shí)，“轉(zhuǎn)基因”是通過諸如轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)導(dǎo)被插入細(xì)胞內(nèi)的核酸分子。例如，轉(zhuǎn)基因可能包含可插入細(xì)胞基因組預(yù)期位置處的異源轉(zhuǎn)錄單位。在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)基因是在免疫球蛋白生產(chǎn)細(xì)胞中找到的免疫球蛋白V基因或V基因片段。優(yōu)選的，靶核酸是人的免疫球蛋白V基因。在此情況下，本發(fā)明的細(xì)胞是能結(jié)合任何給定抗原的人抗體變體的“制造廠”?；蛘?，靶核酸是非免疫球蛋白核酸，例如，編碼選擇性標(biāo)記、DNA結(jié)合蛋白、酶或受體蛋白質(zhì)的基因。例如，新的熒光選擇標(biāo)記可通過超變或通過超變和基因轉(zhuǎn)變的聯(lián)合，利用具有不同熒光光譜的其它已知標(biāo)記作為基因轉(zhuǎn)變供體，使已知標(biāo)記發(fā)生突變而產(chǎn)生。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，靶核酸直接編碼目的基因產(chǎn)物。所述核酸的基因多樣化將導(dǎo)致所編碼的基因產(chǎn)物的截短或其一級序列的改變。通過每輪多樣化和選擇，搜索表達(dá)具有改良活性的基因產(chǎn)物的細(xì)胞?；蛘?，所述靶核酸是調(diào)控元件，例如，諸如啟動子或增強(qiáng)子等轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件，或者干擾RNA(RNAi)。在此實(shí)施方案中，受靶核酸影響且編碼可鑒定的基因產(chǎn)物的額外核酸(報(bào)導(dǎo)基因)是鑒定攜帶目的靶核酸的細(xì)胞所必需的。在其中靶核酸的遺傳多樣化是通過聯(lián)合超變和基因轉(zhuǎn)變發(fā)生的實(shí)施方案中，能用作基因轉(zhuǎn)變供體的額外核酸被插入細(xì)胞基因組中，優(yōu)選在靶核酸的上游。“能用作基因轉(zhuǎn)變供體的核酸”是具有與靶核酸同源的序列的核酸。天然基因轉(zhuǎn)變供體的例子是某些物種的免疫球蛋白基因座中的假V基因。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，能進(jìn)行靶核酸的定向選擇性多樣化的細(xì)胞是通過將靶核酸在確定的染色體位點(diǎn)處的靶向整合插入宿主細(xì)胞而構(gòu)建的。為此，被轉(zhuǎn)染的構(gòu)建體可能包含與預(yù)期染色體整合位點(diǎn)同源的靶核酸序列的上游和下游。優(yōu)選的，通過同源重組或基因打靶用轉(zhuǎn)基因取代內(nèi)源V基因或其片段來構(gòu)建所述細(xì)胞，以便轉(zhuǎn)基因成為基因轉(zhuǎn)變和/或超變事件的靶目標(biāo)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因還包含指導(dǎo)超變和/或基因轉(zhuǎn)變的序列。因此，能表達(dá)基因產(chǎn)物并將超變和基因轉(zhuǎn)變指導(dǎo)至此轉(zhuǎn)錄單位的完整基因座被轉(zhuǎn)移入所述細(xì)胞內(nèi)，并且即使在隨機(jī)染色體整合后仍然被活躍的多樣化。經(jīng)靶向整合而摻入了轉(zhuǎn)基因的克隆的篩選可通過DNA印跡分析或PCR完成。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因包含可選擇的標(biāo)記基因，這樣的基因可用于選擇已穩(wěn)定整合了轉(zhuǎn)基因的克隆。隨后該可選擇的標(biāo)記基因可通過重組除去或通過其它方式滅活。本發(fā)明進(jìn)一步提供了通過重復(fù)循環(huán)細(xì)胞擴(kuò)增和選擇攜帶具有所需活性的靶核酸的細(xì)胞來制備具所需活性的基因產(chǎn)物的方法。用于此處時(shí)，“選擇”指測定靶核酸中序列變化的存在，所述變化產(chǎn)生了由所述靶核酸編碼的基因產(chǎn)物的所需活性或產(chǎn)生了靶核酸調(diào)控功能的所需活性。基因轉(zhuǎn)變和超變的方法在體內(nèi)被用于在免疫球蛋白分子中產(chǎn)生改良的或新的結(jié)合特異性。因此，通過選擇所產(chǎn)生的免疫球蛋白能結(jié)合預(yù)期抗原的本發(fā)明細(xì)胞并隨后將這些細(xì)胞擴(kuò)增以產(chǎn)生更多的突變體，可分離表達(dá)與預(yù)期抗原的結(jié)合有所提高的免疫球蛋白的細(xì)胞。有多種選擇方法可用于分離具所需特異性的突變體。這些方法包括熒光活化細(xì)胞分揀術(shù)(FluorescenceActivatedCellSorting，F(xiàn)ACS)、用磁性顆粒分離細(xì)胞、抗原層析法以及諸如使用聚苯乙烯珠子等其它細(xì)胞分離技術(shù)。熒光活化細(xì)胞分揀術(shù)(FACS)可用于分離細(xì)胞，該法是以細(xì)胞不同的表面分子為基礎(chǔ)的，例如表面展示的免疫球蛋白。用與細(xì)胞表面分子結(jié)合的特殊熒光試劑對樣品中的細(xì)胞或待分揀的細(xì)胞群進(jìn)行染色。這些試劑可以是連接了(直接或間接的)熒光標(biāo)記物的目的抗原，所述的熒光標(biāo)記物是諸如熒光素、德克薩斯紅、孔雀綠、綠色熒光蛋白(GFP)等，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它熒光基團(tuán)。然后將細(xì)胞群導(dǎo)入FACS機(jī)器的振蕩流動室中。從室內(nèi)穿出的細(xì)胞流被諸如PBS(磷酸緩沖鹽)等緩沖液所包圍。用激光照亮細(xì)胞流并檢測各細(xì)胞的熒光，指示出熒光標(biāo)記抗原的結(jié)合。細(xì)胞流的振動使其分裂成攜帶小電荷的小滴。這些小滴可在計(jì)算機(jī)控制下被電偏轉(zhuǎn)板所指引，根據(jù)它們對熒光標(biāo)記抗原親和力的不同收集不同的細(xì)胞群。以此方式，可以很容易的將不結(jié)合抗原的細(xì)胞與對目的抗原展現(xiàn)出不同親和力的細(xì)胞群分離開。FACS機(jī)器和FACS中所用的試劑可廣泛的獲自世界上各種來源，諸如Becton-Dickinson，或者諸如ArizonaResearchLaboratories(http//www.arl.arizona.edu/facs/)等服務(wù)供應(yīng)商。可用于根據(jù)其表面蛋白質(zhì)對特殊抗原的親和力分離細(xì)胞群的另一種方法是親和層析。在這種方法中，將適當(dāng)?shù)臉渲?例如CL-600Sepharose，PharmaciaInc.)共價(jià)偶聯(lián)合適的抗原。用此樹脂填充柱子，然后使混合的細(xì)胞群通過此柱子。經(jīng)過適當(dāng)?shù)谋仄?例如20分鐘)后，用(例如)PBS緩沖液洗去未結(jié)合的細(xì)胞。這樣就只留下了所表達(dá)的免疫球蛋白與目的抗原結(jié)合的細(xì)胞亞群，然后用(例如)過量的目的抗原將這些細(xì)胞從柱子上洗脫下來，或者通過酶促或化學(xué)裂解將抗原從樹脂上裂解下來。可以通過諸如因子X、凝血酶等特殊的蛋白酶或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它特殊蛋白酶將抗原在事先已摻入抗原樹脂復(fù)合物的適當(dāng)裂解位點(diǎn)處從柱子上裂解下來，完成此步?；蛘撸蓱?yīng)用非特異性蛋白酶，例如胰蛋白酶，從樹脂上除去抗原，從而釋放出對目的抗原呈現(xiàn)親和力的細(xì)胞群。本發(fā)明首次提供了可調(diào)控靶核酸遺傳多樣化的機(jī)制。如本發(fā)明的發(fā)明者所證明的，活化誘導(dǎo)型脫氨酶(AID)是調(diào)控免疫球蛋白基因座內(nèi)基因轉(zhuǎn)變以及超變的一個(gè)因子。有人提出AID誘發(fā)了重排V(D)J區(qū)段內(nèi)的普遍修飾，在存在鄰近供體序列的情況下產(chǎn)生轉(zhuǎn)換段，而在無鄰近供體序列存在時(shí)導(dǎo)致點(diǎn)突變。因此，通過調(diào)控AID的表達(dá)，可以調(diào)控兩種現(xiàn)象。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，AID基因被瞬時(shí)表達(dá)于含靶核酸的細(xì)胞中。例如，AID可在藥物響應(yīng)型啟動子的調(diào)控下表達(dá)，諸如四環(huán)素依賴性基因表達(dá)體系。否則的話，基因表達(dá)可通過誘導(dǎo)性重組切除AID表達(dá)盒而關(guān)閉。關(guān)閉AID表達(dá)可防止靶序列的進(jìn)一步多樣化。優(yōu)選的，為了防止可導(dǎo)致所需活性喪失的進(jìn)一步突變，在生產(chǎn)具有所需活性的基因產(chǎn)物的細(xì)胞中關(guān)閉AID的表達(dá)。本發(fā)明通過以下實(shí)施例進(jìn)行說明。實(shí)施例1.AID通過共同的中間物起始免疫球蛋白基因轉(zhuǎn)變和超變在此報(bào)導(dǎo)的是ΨV供體的切除激活了雞B細(xì)胞系DT40中的AID依賴性Ig超變。這表明Ig基因轉(zhuǎn)變和超變是來自同一AID起始的中間物的競爭性途徑。此外，NrV敲除的DT40被提議作為理想的模型體系去探索Ig超變的分子機(jī)制以及作為原位誘變的新工具。方法細(xì)胞系。由于v-myb轉(zhuǎn)基因而顯現(xiàn)出Ig基因轉(zhuǎn)變增加且包含他莫西芬誘導(dǎo)型Cre重組酶的DT40Crel以前已被描述過(Arakawa等，2001)。通過靶向破壞DT40Crel的兩個(gè)AID等位基因產(chǎn)生DT40CrelAID-/-(Arakawa等，2002)。AIDR是在帶有flox的AID-IRES-GFP雙順反子盒穩(wěn)定整合后由DT40CrelAID-/-衍生的，其中AID和GFP均表達(dá)自同一β-肌動蛋白啟動子。AIDRΨV-是通過pΨVDel1-25轉(zhuǎn)染而衍生自AIDR(圖1A)。然后通過基因座特異PCR鑒定已將所述構(gòu)建體整合入重排輕鏈基因座內(nèi)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子。pΨVDel1-25的靶向整合導(dǎo)致從ΨV25上游0.4kb處開始、ΨV1下游1bp處結(jié)束的完整ΨV基因座位的缺失。AIDRΨVpartial是以與AIDRΨV-相似的方式通過pΨVDel3-25的轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的，其通過靶向整合而導(dǎo)致從ΨV25上游0.4kb處開始、ΨV3下游1bp處結(jié)束的ΨV位點(diǎn)的部分缺失。如前所述進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和電穿孔(Arakawa等，2002)。XRCC3-/-是通過在XRCC3敲除構(gòu)建體轉(zhuǎn)染后缺失XRCC3基因的氨基酸72-170而衍生自DT40Crel的。最初用長片段PCR鑒定已經(jīng)歷靶向整合的克隆，然后用DNA印跡分析證實(shí)XRCC3的缺失。Ig反向檢測法。亞克隆、抗體染色、流式細(xì)胞術(shù)和sIgM表達(dá)的定量先前已有描述(Arakawa等，2002)。由于基因轉(zhuǎn)變事件造成原始C118(-)變體(Buerstedde等，1990)輕鏈移框的修復(fù)，所有用于此試驗(yàn)的克隆均為sIgM(+)。PCR。為了使PCR誘發(fā)的人工突變最小化，在測序之前利用PfuUltra熱啟動聚合酶(Stratagene)進(jìn)行擴(kuò)增。長片段PCR、RT-PCR和Ig輕鏈測序如前所述進(jìn)行(Arakawa等，2002)。用M13正向和反向引物對Ig輕鏈質(zhì)粒克隆的啟動子和J-C內(nèi)含子區(qū)域進(jìn)行測序。分別用以下引物對擴(kuò)增Bu-1和EF1α基因BU1/BU2(BU1，GGGAAGCTTGATCATTTCCTGAATGCTATATTCA；BU2，GGGTCTAGAAACTCCTAGGGGAAACTTTGCTGAG)和EF6/EF8(EF6，GGGAAGCTTCGGAAGAAAGAAGCTAAAGACCATC；EF8，GGGGCTAGCAGAAGAGCGTGCTCACGGGTCTGCC)。將這些基因的PCR產(chǎn)物克隆入pBluescript質(zhì)粒載體并用M13反向引物進(jìn)行測序。結(jié)果靶向缺失重排輕鏈基因座內(nèi)的ΨV供體序列。通過克隆基因組序列制備兩個(gè)ΨV敲除構(gòu)建體，所述序列位于目缺失終點(diǎn)、帶有flox的-gpt(鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶)盒上游和下游的側(cè)翼(Arakawa等，2001)。通過靶向整合，第一個(gè)構(gòu)建體pΨVDel1-25缺失了所有的假基因(ΨV25至ΨV1)，而第二個(gè)構(gòu)建體pΨVDel3-25則缺失了大部分假基因(ΨV25至ΨV3)(圖1A)。選擇通過帶有flox的AID-IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)行位點(diǎn))-GFP轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定整合而衍生自DT40CrelAID-/-細(xì)胞(Arakawa等，2002)的表面IgM陽性(sIgM(+))克隆，用于ΨV敲除構(gòu)建體的轉(zhuǎn)染。這種被命名為AIDR的AID再生克隆的優(yōu)勢在于，通過sIgM表達(dá)的喪失可方便的檢測到有害Ig輕鏈突變的出現(xiàn)，而且在遺傳自DT40Crel的Cre重組酶轉(zhuǎn)基因的他莫昔芬誘導(dǎo)之后可關(guān)閉GFP標(biāo)記的AID表達(dá)(Arakawa等，2002)。將ΨV敲除構(gòu)建體轉(zhuǎn)染入AID克隆中后，鑒定具有重排輕鏈基因座的靶向缺失的霉酚酸抗性克隆。這些初級ΨV敲除克隆含兩種帶flox轉(zhuǎn)基因，在重排輕鏈基因座處插入的gpt標(biāo)記基因和AID祖克隆的AID-IRES-GFP基因。由于gpt基因可能干擾鄰近的轉(zhuǎn)錄或染色質(zhì)構(gòu)型，將初級ΨV敲除克隆暴露于低濃度的他莫苷芬中，然后通過有限稀釋法進(jìn)行亞克隆。用此方式可分離次級ΨV敲除克隆，它只缺失了gpt基因(AIDRΨV-和AIDRΨVpartial)或gpt基因和AID-IRES-GFP基因(AID-/-ΨV-和AID-/-ΨVpartial)一起缺失。重排輕鏈基因座處ΨV基因的破壞以及AID過表達(dá)盒的切除分別通過DNA印跡分析(圖1B)和PCR(圖1C)證實(shí)。AID陽性克隆中ΨV基因缺失后sIgM表達(dá)損失增加為了估計(jì)有害Ig突變的速率，在將DT40Crel、AIDR、DT40CrelAID-/-和ΨV敲除克隆各24個(gè)亞克隆培養(yǎng)兩周后，用FACS檢測sIg的表達(dá)(圖2A和2B)。分析具完整ΨV基因座的對照，表明DT40Crel和AIDR亞克隆分別平均有0.52％和2.27％sIgM(-)細(xì)胞，但DT40CrelAID-/-只有0.08％。早先對自發(fā)產(chǎn)生的sIgM(-)DT40變體的分析證實(shí)了大約有三分之一含有重排輕鏈V區(qū)段內(nèi)的移碼突變，這被認(rèn)為是Ig基因轉(zhuǎn)變活性的副產(chǎn)物(Buerstedde等，1990)。此觀點(diǎn)現(xiàn)在得到了以下發(fā)現(xiàn)的支持，即應(yīng)喪失了Ig基因轉(zhuǎn)變活性的AID陰性DT40CrelAID-/-克隆仍然穩(wěn)定保持sIgM(+)。最有趣的是，AID陽性ΨV敲除克隆(AIDRΨVpartial和AIDRΨV-)的亞克隆迅速積累sIgM(-)群，而AID陰性ΨV敲除克隆(AID-/-ΨVpartial和AID-/-ΨV-)的亞克隆則保持sIgM(+)(圖2A和2B)。這顯示了假基因的缺失大大增加了AID表達(dá)細(xì)胞中有害輕鏈突變的速率。在缺失ΨV供體的情況下超變?nèi)〈鶬g基因轉(zhuǎn)變?yōu)榱朔治鲂妈b定的突變活性，在亞克隆后5-6周對ΨV敲除克隆的重排輕鏈VJ區(qū)段進(jìn)行測序。來自AIDRΨV-克隆(圖3，參照序列上方)的95個(gè)序列中總共找到了135個(gè)核苷酸變化(圖4A，表1)，位于V前導(dǎo)序列和J-C內(nèi)含子5’末端之間的0.5kb長的區(qū)域內(nèi)。與野生型DT40細(xì)胞中觀察到的轉(zhuǎn)換段相反，幾乎所有的改變都是單一堿基的取代，并且除了一些短的缺失和雙核苷酸改變之外，未觀察到成簇突變。仍然具有未重排輕鏈基因座的ΨV基因的AIDRΨV-中轉(zhuǎn)換事件的缺乏，證明了Ig基因轉(zhuǎn)變只募集同一染色體上的ΨV基因用于重排輕鏈基因的多樣化(Carlson等，1990)。在來自AID-/-ΨV-克隆的95個(gè)輕鏈基因序列集合中未發(fā)現(xiàn)序列多樣性(圖4A，表1)，表明AID是突變活性所必需的。衍生自AIDRΨVPartial克隆的序列有時(shí)顯示突變段，這可能是剩余的ΨV1和ΨV2造成的(圖3，參照序列下方)。不過，正如對AIDRΨV-細(xì)胞所觀察到的，多數(shù)AIDRΨVpartial突變是單一的非模板堿基取代(圖4A，表1)。在AID-/-ΨVpartial克隆的92個(gè)序列中只找到了可能是由PCR造成的3個(gè)堿基取代，這證明了AIDRΨVpartial的基因轉(zhuǎn)變和突變活性是AID依賴型的。ΨV敲除克隆的新的突變活性與體細(xì)胞超變非常類似。已發(fā)現(xiàn)的ΨV敲除克隆中具單一核苷酸取代優(yōu)勢的Ig突變活性表明體細(xì)胞超變已取代了Ig基因轉(zhuǎn)變。不過，在AIDRΨVpartial和AIDRΨV-克隆內(nèi)核苷酸取代與生發(fā)中心B細(xì)胞內(nèi)Ig超變之間存在不同，不同之處在于這些克隆顯示出在A/T堿基上的突變非常少且優(yōu)選顛換突變(圖4B)。Ig超變通常位于轉(zhuǎn)錄基因序列的1kb之內(nèi)，優(yōu)選V(D)J區(qū)段的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)，而在下游C區(qū)沒有或很少有突變(Lebecque和Gearhart，1990)。為了研究AIDRΨV-克隆的突變是否遵循相似的分布，將序列分析擴(kuò)大到啟動子區(qū)和重排輕鏈基因的J-C內(nèi)含子處(圖5)。盡管在鄰近啟動子處和J區(qū)段下游內(nèi)含子內(nèi)發(fā)現(xiàn)了突變，但最高概率明顯落在CDR1和CDR3處，它們也是DT40中基因轉(zhuǎn)變的優(yōu)選位點(diǎn)(結(jié)果未公布)。全部點(diǎn)突變中幾乎有一半位于RGYW(R＝A/G；Y＝C/T；W＝A/T)序列基元或其互補(bǔ)序列WRCY內(nèi)(圖4C)，已知它們在人和小鼠中是Ig超變的熱點(diǎn)。先前報(bào)導(dǎo)過RAD51平行進(jìn)化同源物的缺失誘發(fā)了DT40中的Ig超變(Sale等，2001)。為了比較ΨV基因陰性和RAD51平行進(jìn)化同源物陰性背景之間的超變活性，在亞克隆6周后破壞DT40crel克隆中的XRCC3基因并對重排的VJ基因進(jìn)行測序。類似于AIDRΨV-克隆中的突變圖譜和先前所報(bào)導(dǎo)的突變圖譜(Sale等，2001)，來自XRCC3-/-細(xì)胞的序列中的突變顯示出顛換偏好性并且沒有A/T堿基的突變(圖4B)。不過XRCC3突變體中的突變率比AIDRΨV-克隆中的突變率大約低2.5倍，并且與野生型DT40和AIDRΨV-克隆相比，XRCC3突變體呈現(xiàn)出生長明顯減慢的表型(圖4D)。為了鑒定造成AIDRΨV-克隆中sIgM表達(dá)喪失的突變，對來自已分揀的sIgM(-)細(xì)胞的94個(gè)輕鏈cDNA進(jìn)行了擴(kuò)增和測序。盡管在此集合中檢測到了一個(gè)短的插入和五個(gè)缺失(表1)，全部245個(gè)突變中有89％是位于VJ區(qū)段內(nèi)的單一核苷酸取代(圖5)。令人吃驚的是，只有約10％的序列含有終止密碼子或移碼，表明缺乏sIgM(-)表達(dá)主要是由影響Ig輕鏈和重鏈蛋白質(zhì)配對的氨基酸取代造成的。超變的Ig座位特異性據(jù)報(bào)導(dǎo)，成纖維細(xì)胞(Yoshikawa等，2002)和B細(xì)胞雜交瘤(Martin和Scharf，2002)中的高AID表達(dá)導(dǎo)致了被轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因中頻繁的突變。為了排除假基因缺失誘發(fā)了整體超變的表型，對AIDRΨV-克隆中編碼B細(xì)胞特異性標(biāo)記Bu-1的基因的5’末端和翻譯延伸因子EF1α進(jìn)行測序。在Bu-1基因的95個(gè)序列中只發(fā)現(xiàn)了單獨(dú)一個(gè)堿基的缺失，在EF1α的89個(gè)序列中只發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)單核苷酸取代(表1)。由于這些變異最可能是PCR的副產(chǎn)物，這進(jìn)一步支持了由于ΨV缺失誘發(fā)的超變是Ig座位特異性的觀點(diǎn)。討論結(jié)果證明鄰近假基因供體的缺失完全消除了DT40中的Ig基因轉(zhuǎn)變并激活了非常類似于超變的突變活性。新活性和體細(xì)胞超變之間共有的特性包括1)AID依賴性，2)單核苷酸取代優(yōu)勢，3)突變分布在5′轉(zhuǎn)錄區(qū)內(nèi)，4)偏好在熱點(diǎn)進(jìn)行和5)Ig基因特異性。相對于體內(nèi)Ig超變而言唯一的差異在于相對缺少A/T堿基的突變以及ΨV敲除克隆中的顛換突變優(yōu)勢。不過，在超變的EBV轉(zhuǎn)化B細(xì)胞系(Bachl和Wabl，1996；Faili等，2002)和RAD51-平行進(jìn)化同源物的DT40突變體中(Sale等，2001)也觀察到了這種差異，表明被轉(zhuǎn)化的B細(xì)胞系中喪失了部分Ig超變子活性。有趣的是，AIDRΨV-克隆中Ig超變的比率似乎高于DT40Crel祖克隆中Ig基因轉(zhuǎn)變的比率。對此的一種解釋可能是某些轉(zhuǎn)換段局限于與供體和靶序列相同的伸展片段處因而沒有留下痕跡。通過阻斷Ig基因轉(zhuǎn)變而誘發(fā)Ig超變支持了解釋超變和重組作用如何起始和調(diào)控的簡單模型(圖6)。在事件表的頂端是由AID直接或間接誘導(dǎo)的重排V(D)J區(qū)段的修飾。在缺乏鄰近供體或缺乏高同源重組活性的情況下默認(rèn)破壞此過程導(dǎo)致了單核苷酸取代形式的Ig超變(圖6，右側(cè))。不過，如果有供體序列可供利用，AID所誘導(dǎo)的損害的處理過程可被分為向Ig超變轉(zhuǎn)變?nèi)匀挥锌赡艿逆溄粨Q前階段和向Ig基因轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)變已完成的鏈交換后階段(圖6，左側(cè))。第一階段的完成需要RAD51平行進(jìn)化同源物的參與，而第二階段涉及類似RAD54蛋白等其它重組因子。行為的差異解釋了為何RAD51平行進(jìn)化同源物的破壞不僅減少了Ig基因轉(zhuǎn)變，還誘發(fā)了Ig超變(Sale等，2001)，而RAD54基因的破壞只減少了Ig基因轉(zhuǎn)變(Bezzubova等，1997)的原因。此模型還預(yù)測低細(xì)胞同源重組活性即使在有轉(zhuǎn)換供體存在的情況下也會抑制Ig基因轉(zhuǎn)變。這樣的低同源重組活性可能是造成人和小鼠B細(xì)胞盡管存在非重排V區(qū)段形式的鄰近候選供體、但從不使用Ig基因轉(zhuǎn)變的原因，以及為何雞生發(fā)中心B細(xì)胞幸免從Ig基因轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)變成Ig超變的原因(Arakawa等，1998)。AID和ΨV敲除DT40克隆是用于研究反式作用因子和順式作用調(diào)控序列對Ig基因轉(zhuǎn)變和超變的作用的有效實(shí)驗(yàn)體系。與備選的動物或細(xì)胞培養(yǎng)體系相比，它們的優(yōu)勢在于1)平行分析Ig基因轉(zhuǎn)變和Ig超變，2)條件性AID表達(dá)，3)通過基因打靶進(jìn)行方便的基因組修飾，4)正常的細(xì)胞增殖和修復(fù)能力以及5)超變的Ig座位特異性。在DT40細(xì)胞系中誘發(fā)基因特異性超變的能力還可能應(yīng)用于生物技術(shù)中。一種可能是用人的同等物取代雞抗體編碼區(qū)，然后用于從通過Ig超變而持續(xù)進(jìn)化的全部組分刺激抗體親和力成熟。2.通過基因轉(zhuǎn)變和超變進(jìn)行GFP的定向靶內(nèi)誘變編碼綠色熒光蛋白(GFP)的基因是能用本發(fā)明細(xì)胞體系(尤其是DT40細(xì)胞系)進(jìn)行遺傳多樣化的靶核酸的例子。通過打靶整合插入Ig輕鏈座位的GFP基因?qū)⒈怀?，而其有關(guān)顏色、強(qiáng)度和半衰期等活性將隨時(shí)間變化(圖7B)。如果聯(lián)合使用超變和基因轉(zhuǎn)變來修飾GFP活性，則將可用作GFP基因轉(zhuǎn)變供體的變體GFP序列插入Ig座位內(nèi)(圖7D)。圖7A描述了可用任意核酸靶目標(biāo)取代Ig輕鏈VJ基因的IgVJ取代載體pVjRepBsr。可將潛在的誘變目標(biāo)克隆入SpeI位點(diǎn)，它與XbaI、NheI、AvrII和SpeI位點(diǎn)可相容。例如，可用pVjRepBsr通過靶向整合將GFP基因插入Ig輕鏈座位。圖7C描述了可以用任意核酸靶目標(biāo)取代IgΨV基因輕鏈座位的所有ΨV-基因供體置換載體pPseudoRepBsr。可將潛在的基因轉(zhuǎn)變供體插入NheI或SpeI位點(diǎn)，它們與XbaI、NheI、AvrII和SpeI位點(diǎn)可相容。由于NheI位點(diǎn)位于兩個(gè)loxP之間，此位點(diǎn)可用于條件性敲除設(shè)計(jì)中。利用pPseudoRepGpt和pVjRepBsr進(jìn)行逐步定向整合，ΨV基因可被ΨGFP基因和其變體取代(例如ΨCFP藍(lán)色熒光蛋白和ΨYFP黃色熒光蛋白)，而VJ基因可被攜帶移碼突變的GFP(FsGFP)所取代，從而監(jiān)測GFP基因的遺傳多樣化。預(yù)期FsGFP中的移碼可通過以ΨGFP、ΨCFP和ΨYFP作為模板進(jìn)行基因轉(zhuǎn)變而修復(fù)。此外，所述基因?qū)⑼ㄟ^超變而被進(jìn)一步多樣化。參考文獻(xiàn)1.Milstein，C.&RadaC.Immunoglobulingenes(AcademicPress，London，ed.2，1995)，pp.57-81.2.Butler，J.E.Immunoglobulindiversity，B-cellandantibodyrepertoiredevelopmentinlargefarmanimals.Rev.Sci.Tech.17，43-70(1998).3.Reynaud，C-A.，Anquez，V.，Grimal，H.&Weill，J-C.Ahyperconversionmechanismgeneratesthechickenlightchainpreimmunerepertoire.Cell48，379-388(1987).4.Arakawa，H.&Buerstedde，J-M.ImmunoglobulinGeneConversionInsightsfromBursalBCellsandtheDT40CellLine.Dev.Dynamics，inpress.5.Arakawa，H.，F(xiàn)urusawa，S.，Ekino，S.&Yamagishi，H.Immunoglobulingenehyperconversionongoinginchickensplenicgerminalcenters.EMBOJ.15，2540-2546(1996).6.Arakawa，H.，Hauschild，J.&Buerstedde，J-M.RequirementoftheActivation-InducedDeaminase(AID)GeneforImmunoglobulinGeneConversion.Science295，1301-1306(2002).7.Muramatsu，M.etal.Classswitchrecombinationandhypermutationrequireactivation-inducedcytidinedeaminase(AID)，apotentialRNAeditingenzyme.Cell102，553-563(2000).8.Revy，P.etal.Activation-inducedcytidinedeaminase(AID)deficiencycausestheautosomalrecessiveformoftheHyper-IgMsyndrome.Cell102，565-575(2000).9.Muramatsu，M.etal.Specificexpressionofactivation-inducedcytidinedeaminase(AID)，anovelmemberoftheRNA-editingdeaminasefamilyingerminalcenterBcells.J.Biol.Chem.274，18470-18476(1999).10.DiNoia，J.&Neuberger，M.S.Alteringthepathwayofimmunoglobulinhypermutationbyinhibitinguracil-DNAglycosylase.Nature419，43-48(2002).11.TaV.T.etal.AIDmutantanalysesindicaterequirementforclass-switch-specificcofactors.Nat.Immunol.4，843-848(2003).12.Barreto，V.，Reina-San-Martin，B.，Ramiro，A.R.，McBride，K.M.&NussenzweigM.C.C-terminaldeletionofAIDuncouplesclassswitchrecombinationfromsomatichypermutationandgeneconversion.Mol.Cell12，501-508(2003).13.Bezzubova，O.，Silbergleit，A.，Yamaguchi-Iwai，Y.，Takeda，S.&Buerstedde，J-M.ReducedX-rayresistanceandhomologousrecombinationfrequenciesinaRAD54-/-mutantofthechickenDT40cellline.Cell89，185-193(1997).14.Sale，J.E.，Calandrini，D.M.，Takata，M.，Takeda，S.&Neuberger，M.S.AblationofXRCC2/3transformsimmunoglobulinVgeneconversionintosomatichypermutation.Nature412，921-926(2001).15.Arakawa，H.，LodyginD.&BuersteddeJ-M.MutantloxPvectorsforselectablemarkerrecycleandconditionalknock-outs.BMCBiotechnology1，7(2001).16.Buerstedde，J-M.etal.LightchaingeneconversioncontinuesathighrateinanALV-inducedcellline.EMBOJ.9，921-927(1990).17.Carlson，L.M.，McCormack，W.T.，Postema，C.E.，Humphries，E.H.&Thompson，C.B.TemplatedinsertionsintherearrangedchickenIgLVgenesegmentarisebyintrachromosomalgeneconversion.GenesDev.4，536-547(1990).18.Lebecque，S.G.&Gearhart，P.J.Boundariesofsomaticmutationinrearrangedimmunoglobulingenes5′boundaryisnearthepromoter，and3′boundaryisapproximately1kbfromV(D)Jgene.J.Exp.Med.172，1717-1727(1990).19.Yoshikawa，K.etal.AIDenzyme-inducedhypermutationinanactivelytranscribedgeneinfibroblasts.Science296，2033-2036(2002).20.Marton，A.&Scharff，M.D.SomatichypermutationoftheAIDtransgeneinBandnon-Bcells.Proc.Natl.Acad.Sci.USA99，12304-12308(2002).21.Bachl，J.&Wabl，M.AnimmunoglobulinmutatorthattargetsG.Cbasepairs.Proc.Natl.Acad.Sci.USA93，851-855(1996).22.Faili，A.etal.AID-dependentsomatichypermutationoccursasaDNAsingle-strandeventintheBL2cellline.Nat.Immunol.3，815-821(2002).23.Arakawa，etal.OligoclonaldevelopmentofBcellsbearingdiscreteIgchainsinchickensinglegerminalcenters.J.Immunol.160，4232-4241(1998).24.Drake，J.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