專利名稱：：產(chǎn)生風(fēng)味穩(wěn)定飲料的大麥的制作方法1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)，它公開(kāi)了脂加氧酶(LOX)LOX-1合成有缺陷的大麥和麥芽，因此為產(chǎn)業(yè)使用提供了一種新原料。例如所述原材料可以用來(lái)制造沒(méi)有或僅有可忽略量的異味(off-flavor)化合物——反式2-壬烯醛(T2N)的一種新的有特色的風(fēng)味穩(wěn)定啤酒。所述T2N由LOX路徑中的酶的依次作用形成，其中LOX-1代表主要活性，它使亞油酸雙氧化產(chǎn)生9-過(guò)氧氫十八碳二烯酸(9-HPODE)。本發(fā)明的大麥和植物產(chǎn)品顯示出無(wú)9-HPODE或僅有可忽略量的9-HPODE。另外，本發(fā)明涉及利用所述大麥和/或麥芽產(chǎn)生的飲料。2.發(fā)明背景與現(xiàn)代啤酒生產(chǎn)相關(guān)的研究目標(biāo)之一是確定影響啤酒質(zhì)量和穩(wěn)定性的分子因素。大部分啤酒是以大麥(Hordeumvulgare，L)為基礎(chǔ)生產(chǎn)的。大麥?zhǔn)菃巫尤~作物，它生長(zhǎng)在世界上的許多地方，這不僅是因?yàn)樗鳛楣I(yè)產(chǎn)品來(lái)源，例如啤酒來(lái)源的經(jīng)濟(jì)重要性，而且也因?yàn)樗莿?dòng)物飼料的來(lái)源。美國(guó)現(xiàn)在是麥芽大麥(maltingbarley)的領(lǐng)先生產(chǎn)者之一，占世界農(nóng)作物的大約13％；加拿大、澳大利亞和歐洲合在一起占生產(chǎn)的大約70％(BiosIntern.，2001)。為了研制出農(nóng)藝學(xué)上可靠的穩(wěn)定高產(chǎn)的載培品種，大麥育種者不斷努力。為了完成這一目標(biāo)，已經(jīng)嘗試通過(guò)化學(xué)處理引起隨機(jī)誘變，或者通過(guò)輻射修飾有興趣的特性，例如改變一般對(duì)植物生長(zhǎng)和農(nóng)作物生產(chǎn)率，以及使由該農(nóng)作物制造的產(chǎn)品具有額外品質(zhì)的特性可能有有害作用的特異基因的表達(dá)。疊氮化鈉NaN3是誘變大麥的有用化學(xué)制劑已經(jīng)得以很好建立。特別地，已經(jīng)利用NaN3衍生的誘變來(lái)誘導(dǎo)大麥中的遺傳變化，以產(chǎn)生花色素苷和原花色素合成受阻的突變體(vonWettsteineta1.，1977；vonWettsteinetal.，1985；Jende-Strid，1991；Jende-Strid，1993；Olsenetal.，1993)。第二個(gè)實(shí)例涉及用NaN3誘變處理的大麥顆粒篩選高水平游離磷酸鹽(phosphate)，旨在鑒定低肌醇六磷酸鹽(phytate)突變體(RasmussenandHatzak，1998)；從2,000個(gè)篩選的顆粒中總共鑒定出10個(gè)突變體。雖然大麥遺傳學(xué)的主要缺點(diǎn)是不能通過(guò)反向遺傳學(xué)具體研究基因功能，但是，例如，NaN3誘導(dǎo)誘變后的向前遺傳篩選(forwardgeneticscreens)繼續(xù)考慮與大麥和麥芽的營(yíng)養(yǎng)和產(chǎn)品質(zhì)量參數(shù)有關(guān)的改進(jìn)。除在大體和一般方式中外，育種人員在常規(guī)植物育種過(guò)程中不能預(yù)計(jì)正在發(fā)育的新植物系的結(jié)果。這種不可預(yù)知性主要是由缺乏細(xì)胞水平的對(duì)照引起的，更具體地是由缺乏核DNA水平的對(duì)照引起的，其中核DNA的復(fù)雜性很高。許多其他的因素，例如植物繁殖地理位置的氣候和土壤質(zhì)量影響植物育種過(guò)程的結(jié)果。因此，使用常規(guī)方法的不同大麥育種人員決不會(huì)研制出具有相同特性的植物。在常規(guī)育種過(guò)程中，最困難的任務(wù)是鑒定遺傳優(yōu)良植物，其中優(yōu)良不僅與有價(jià)值(interest)的特性，而且也與植物生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)的生理學(xué)問(wèn)題相關(guān)。當(dāng)其他混淆特性掩蔽了目的特性時(shí)，選擇過(guò)程會(huì)特別艱難。當(dāng)現(xiàn)代植物育種方法包括突變基因DNA序列的確定時(shí)，確定過(guò)程是在育種計(jì)劃晚期，即在突變體表征鑒定之后進(jìn)行，例如，最近已經(jīng)描述在擬南芥屬(Arabidopsis)及其他植物中篩選化學(xué)方法誘導(dǎo)的突變(Colbertetal.，2001)。到目前為止，已經(jīng)報(bào)告在完整基因組規(guī)模上對(duì)釀酒酵母創(chuàng)造以基因索引(gene-indexed)的功能損失突變(Giaeveretal.，2002)。對(duì)植物Arabidopsis來(lái)說(shuō)，通過(guò)插入土壤桿菌屬(Agrobacterium)T-DNA序列已經(jīng)使～29,454個(gè)預(yù)計(jì)基因中的21,700個(gè)基因失活(Alonsoetal.，2003)。到目前為止，從首次誘變或雜交到銷售植物或種子的常規(guī)育種過(guò)程占用＞10年時(shí)間的情形并不是罕見(jiàn)的。具體地，利用檢測(cè)與目的特性相關(guān)的基因中的突變的方法提供植物育種者可能是優(yōu)良的方法。這種改進(jìn)將增強(qiáng)育種方案中可預(yù)測(cè)性的水平，特別是，當(dāng)突變體的篩選針對(duì)在目的基因的蛋白質(zhì)編碼部分具有無(wú)義突變的那些時(shí)也會(huì)出現(xiàn)這一情形。在其它情況下，DNA突變的早期鑒定也是優(yōu)選的，例如利用以目的基因的啟動(dòng)子突變或影響表達(dá)的其他DNA突變?yōu)樘卣鞯南党废M(jìn)一步的育種，這只是因?yàn)榄h(huán)境或生理學(xué)因素可以使誘變劑誘導(dǎo)的特性回復(fù)。因此，需要發(fā)現(xiàn)在育種計(jì)劃早期檢測(cè)有價(jià)值突變的可選擇方法。這將使整個(gè)育種過(guò)程更快，并產(chǎn)生更高的經(jīng)濟(jì)利益，從而使土地上生產(chǎn)的谷物的量最大化。生產(chǎn)的大麥的主要部分包含通過(guò)大麥的可控浸泡、萌發(fā)和干燥步驟能將其種子(kernels)變成麥芽的制麥芽品種(maltingvarieties)。小部分麥芽被用作食品工業(yè)的配料，而大部分麥芽隨后在麥芽衍生飲料，包括但不限于啤酒和威士忌的生產(chǎn)中被用作主要配料(ingredient)。在啤酒廠，磨碎的麥芽進(jìn)行糖化(mashing)步驟，該步驟包括逐步升高麥芽水懸浮液的溫度使部分酶降解，以及提取，例如顆粒聚合淀粉和β葡聚糖。過(guò)濾后，用酒花煮沸含水的麥芽醪(mash)產(chǎn)生麥芽汁(malt)。隨后用酵母使所述麥芽汁發(fā)酵產(chǎn)生啤酒產(chǎn)品，當(dāng)啤酒產(chǎn)品成熟時(shí)將其裝入瓶中。該麥芽汁也可以用于生產(chǎn)非發(fā)酵麥芽飲料。飲料的可口性和風(fēng)味穩(wěn)定性是與大麥和麥芽組合物相關(guān)聯(lián)的重要因素。這是因?yàn)閬?lái)源于所述大麥和麥芽的天然風(fēng)味分子，或者在從所述大麥和麥芽中提取的酶的作用下產(chǎn)生的天然風(fēng)味分子可以賦予最終產(chǎn)物不受歡迎的味道特性(Drostetal.，1990)。在這方面，產(chǎn)生紙板味樣風(fēng)味的揮發(fā)性化合物的形成似乎具有特殊的生物化學(xué)效益和經(jīng)濟(jì)利益。在1970年，已經(jīng)分離負(fù)責(zé)紙板樣風(fēng)味的分子，經(jīng)鑒定它是九碳(C9)alkenalT2N(Jamieson和Gheluwe，1970)。因?yàn)槿梭w內(nèi)T2N的味覺(jué)閾值水平非常低，以前確定大約是0.7nM或0.1ppb(Meilgaard，1975)，因此平均醛濃度極低的產(chǎn)品會(huì)因?yàn)樵摦a(chǎn)品的異常味道而被認(rèn)為是老化產(chǎn)品。而且，啤酒儲(chǔ)存期間分解T2N加合物釋放T2N可以引起該產(chǎn)品變質(zhì)(Nyborgetal.，1999)。對(duì)植物組織的放射性標(biāo)記研究已經(jīng)確定壬烯醛(壬烯醛s)來(lái)源于C18脂肪酸亞油酸，而己醛和壬二烯醛是從C18脂肪酸亞麻酸形成的(GroschandSchwartz，1971；PhillipsandGalliard，1978)。已經(jīng)將這些研究和隨后的許多觀察結(jié)果，例如Tijet等(2001)，Noordermeer等(2001)和Matsui等(2003)概括的觀察結(jié)果解釋為T2N是由LOX路徑特異酶的連續(xù)作用形成，且LOX的作用代表早期酶催化步驟的證據(jù)。與這一觀念一致，Kurodo等(2003)發(fā)現(xiàn)麥芽包含將LOX產(chǎn)生的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成T2N必需的熱穩(wěn)定酶因子。大麥顆粒(kernel)包含被稱為L(zhǎng)OX-1、LOX-2和LOX-3的三種LOX酶(vanMechelenetal.，1999)。LOX-1催化從亞油酸形成T2N前體——9-HPODE和三羥基十八碳烯酸(縮寫(xiě)為″THOEs″或僅為″THAs″)，LOX-2催化亞油酸轉(zhuǎn)化成13-HPODE，其中13-HPODE更進(jìn)一步地被代謝為己醛(圖1B)，己醛是味覺(jué)閾值水平為大約0.4ppm的C6醛(Meilgaard，上文)。雖然LOX-3的產(chǎn)品特異性仍然難以捉摸，但是vanMechelen等(上文)顯示對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)水平極低，這表明它對(duì)T2N形成的貢獻(xiàn)是可忽略的。正在進(jìn)行研究以確定LOX活性是否是產(chǎn)生與T2N特異異味形成相關(guān)聯(lián)的亞油酸過(guò)氧化氫前體的唯一酶來(lái)源，或者確定脂肪酸自動(dòng)氧化步驟是否也參與該過(guò)程。值得注意的是C18過(guò)氧化氫物可以被超過(guò)七個(gè)不同家族的植物和動(dòng)物酶更進(jìn)一步地轉(zhuǎn)換，其中所有反應(yīng)統(tǒng)稱為L(zhǎng)OX路徑(FeussnerandWasternack，2002)；該路徑也被稱為oxylipin路徑。Oxylipins就象他們的名稱暗示的那樣，是氧化的類脂衍生分子，該分子由LOX反應(yīng)氧化不飽和脂肪酸產(chǎn)生，而且包括來(lái)源于這種氧化分子的任何分子。在Douma等的以WO02/053721A1公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT/IB01/00207中公開(kāi)了具有活性降低的LOX-1蛋白質(zhì)的大麥顆粒和大麥植物。但是，所述申請(qǐng)沒(méi)有教導(dǎo)用失活的LOX-1酶來(lái)產(chǎn)生和分析大麥顆粒。合成低水平LOX的突變植物的幾個(gè)實(shí)例已經(jīng)已知。例如在20世紀(jì)八十年代早期已經(jīng)鑒定三個(gè)大豆系，每個(gè)系的成熟大豆種子中缺乏這三個(gè)LOX酶中的一個(gè)(i)LOX-1。雖然LOX-1無(wú)效突變的分子基礎(chǔ)仍然不確定，但它與缺少對(duì)應(yīng)的成熟mRNA相關(guān)聯(lián)(HildebrandtandHymowitz，1982；Startetal.1986)；(ii)LOX-2。檢測(cè)突變基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，觀察到將組氨酸配體替換到鐵活性部位的導(dǎo)致酶不穩(wěn)定的單個(gè)堿基變化(DaviesandNielsen，1986；Wangetal.，1994)；(iii)LOX-3。LOX-3無(wú)效突變體可能是由于基因啟動(dòng)子中的順式作用元件而沒(méi)有顯示出可檢測(cè)水平的對(duì)應(yīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(Kitamuraetal.，1983；Wangetal.，1995)。在豌豆種子中，發(fā)現(xiàn)LOX-2無(wú)效系攜帶導(dǎo)致大多數(shù)LOX-2蛋白質(zhì)缺失的缺陷(Forsteretal.，1999)。因?yàn)樵撓碉@示LOX-2mRNA的量大大下降，這表明突變導(dǎo)致mRNA穩(wěn)定性顯著降低。在稻中，提取物的免疫印跡篩選顯示存在兩個(gè)天然栽培變種，DawDam和CI-115，其中每個(gè)都缺乏三種LOX酶中的一種(Ramezanzadehetal.，1999)。已經(jīng)確定在存儲(chǔ)期間，具有全部三種LOXs的正常稻中的己醛、戊醛和戊醇的量被顯著誘導(dǎo)，而DawDam和CI-115中的量卻減少了66％-80％的范圍。盡管結(jié)果表明稻谷中缺乏LOX酶會(huì)減輕氧化變質(zhì)，但賦予DawDam和CI-115更少LOX特性的分子決定因素仍然難以捉摸。已經(jīng)證明反義介導(dǎo)和共抑制介導(dǎo)的LOX基因的轉(zhuǎn)基因消耗對(duì)闡明特異LOX酶和他們的對(duì)應(yīng)產(chǎn)物在植物防衛(wèi)信號(hào)發(fā)送中的功能有用。例如在擬南芥屬(Arabidopsis)中，消耗LOX酶導(dǎo)致傷口誘導(dǎo)的茉莉酮酸積聚減少(Belletal.，1995)。而且反義介導(dǎo)LOX編碼基因消耗的結(jié)果確定對(duì)真菌病原體有抗力的煙草植物的不相容特性涉及對(duì)應(yīng)的酶(Ranceetal.1998)。其中已經(jīng)用轉(zhuǎn)基因方法來(lái)闡明LOX功能的第三個(gè)實(shí)例與馬鈴薯植物生長(zhǎng)發(fā)育中的名稱為L(zhǎng)OX-H1的馬鈴薯LOX的作用有關(guān)(Leónetal.，2002)。已經(jīng)顯示LOX-H1消耗導(dǎo)致?lián)]發(fā)性脂肪族C6醛，參與植物防衛(wèi)反應(yīng)和作為創(chuàng)傷誘導(dǎo)的基因表達(dá)的信號(hào)分子或作為抗微生物物質(zhì)的化合物的顯著減少。更進(jìn)一步的研究顯示LOX酶的基因表達(dá)耗盡的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植物顯示出塊莖發(fā)育異常(Kolomietsetal.，2001)。但是，沒(méi)有鑒定出解釋塊莖表型的具體oxylipins。在另一個(gè)研究中，反義介導(dǎo)的馬鈴薯LOX-H3的消耗抑制植物的可誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)，而且伴有更高的塊莖產(chǎn)量(Royoetal.，1999)。這些數(shù)據(jù)共同表明編碼LOX酶的基因的表達(dá)在植物發(fā)育過(guò)程中很重要，其中一些LOX酶可能顯示出防衛(wèi)病原體的作用，而另外的LOX酶產(chǎn)生可調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育的產(chǎn)物。注意到兩個(gè)LOX酶水平降低2-20％的番茄果實(shí)的風(fēng)味揮發(fā)物與野生型果實(shí)相比沒(méi)有顯示出顯著變化也具有重要意義(Griffithsetal.，1999)。這些發(fā)現(xiàn)表明極低水平的LOX足以產(chǎn)生醛和醇(alcohol)，或者其他LOX酶在產(chǎn)生這些化合物的過(guò)程中是有活性的。飲食工業(yè)越來(lái)越多的意識(shí)到氧化酶，因?yàn)樗麄儗?duì)與植物衍生產(chǎn)品風(fēng)味和顏色有關(guān)的重要方面有影響。在這方面，LOXs由于具有誘導(dǎo)自由基形成的能力引起了大家的興趣，其中自由基能攻擊其他成分，例如維生素，著色劑，酚和蛋白質(zhì)等等。值得注意的是認(rèn)為一些自由基在游離脂肪酸的自動(dòng)氧化中起作用。一些產(chǎn)生自由基的物質(zhì)可以經(jīng)受熱處理，因此在加工食物中仍然保留足夠的活性，在產(chǎn)品存儲(chǔ)期間仍會(huì)啟動(dòng)變質(zhì)?？寡趸瘎┍粡V泛用作LOX抑制劑，其中一些抑制劑也抑制LOX底物的自動(dòng)氧化。但是，沒(méi)有鑒定出有用的作為飲料風(fēng)味改善添加劑的LOX抑制劑。LOX酶的作用也與啤酒制造領(lǐng)域以外的問(wèn)題相關(guān)，例如與抑制真菌污染敏感植物中真菌毒素形成的過(guò)氧氫脂肪酸的LOX催化產(chǎn)生相關(guān)，在Keller的美國(guó)專利No.5,942,661中已經(jīng)公開(kāi)這一點(diǎn)。雖然LOX酶在植物防衛(wèi)和創(chuàng)傷反應(yīng)中的作用仍然不太清楚，但創(chuàng)傷和病原體攻擊時(shí)會(huì)誘導(dǎo)該酶產(chǎn)生(BellandMullet，1991；BellandMullet，1993；Melanetal.，1993；SarvitzandSiedow，1996)。LOX酶在創(chuàng)傷和植物防衛(wèi)中的作用可以是產(chǎn)生對(duì)抗病原體的活性脂肪酸氫過(guò)氧化物(Rogersetal.，1988)。另外，應(yīng)激反應(yīng)可以誘導(dǎo)LOXs產(chǎn)生信號(hào)分子，例如茉莉酮酸甲酯(Belletal.，上文)。也已經(jīng)描述，將在LOX酶的作用下產(chǎn)生的13-HPODE作為過(guò)氧化氫轉(zhuǎn)換酶產(chǎn)生風(fēng)味活性醛的底物的策略(Noordermeeretal.，2002；HussonandBelin，2002)。在許多專利，例如Husleretal的美國(guó)專利No.6,150,145和Holtzetal的美國(guó)專利No.6,274,358中公開(kāi)了類似步驟。而且，也已經(jīng)顯示LOX酶為面包制作貢獻(xiàn)了幾個(gè)有益效果(Casey，1997)。而且，Handa和Kausch的美國(guó)專利No.6,355,862B1已經(jīng)公開(kāi)抑制LOX的產(chǎn)生可以增強(qiáng)果實(shí)品質(zhì)，例如使產(chǎn)品的保存期更長(zhǎng)。3.發(fā)明概述因?yàn)閺幕旧蠜](méi)有LOX-1活性的大麥植物制備的飲料將具有極低水平的T2N，因此對(duì)這種植物仍存在未滿足的需要。另外，本發(fā)明顯示從這種植物制備的飲料將具有極低水平的9，12，13-THOE。而且，這種植物可用于其他目的。令人驚訝地，本發(fā)明公開(kāi)了制備沒(méi)有或有極少LOX-1活性的大麥植物的方法。特別地本發(fā)明公開(kāi)了LOX-1基因的無(wú)效突變。本發(fā)明的預(yù)期收益包括從LOX路徑的對(duì)應(yīng)支路完全消除T2N，因此本發(fā)明提供了大麥顆粒中T2N水平的優(yōu)良方法；而且由這些顆粒產(chǎn)生的啤酒在延期儲(chǔ)存之后由顯示出特別的味道穩(wěn)定性，即使在高溫條件下也是如此。有趣的是，本發(fā)明也提供了早期突變檢測(cè)的方法，因此晚期突變體表征鑒定的缺點(diǎn)已經(jīng)被本發(fā)明解決。本發(fā)明利用吸引人的新方法產(chǎn)生改進(jìn)的麥芽(malting)大麥栽培變種，在育種過(guò)程的早期時(shí)間點(diǎn)插入連續(xù)使用的突變體群體中的目標(biāo)基因的表型鑒定和DNA序列確定。利用多種的植物育種方法可以更進(jìn)一步地改進(jìn)分離的植物。本發(fā)明解決了目前與大麥中活性LOX-1酶的存在有關(guān)的問(wèn)題、限制和缺點(diǎn)。首先，本發(fā)明提供了顯著降低篩選化學(xué)誘變大麥時(shí)間和勞動(dòng)量的效率高的新篩選方法。第二，本發(fā)明包括LOX-1無(wú)效新大麥，例如對(duì)生產(chǎn)風(fēng)味穩(wěn)定啤酒有用的大麥。如上所述的植物L(fēng)OX突變體的理論
背景技術(shù)：
涉及LOX活性水平降低的植物。相反，本發(fā)明通過(guò)提供有效產(chǎn)生LOX-1無(wú)效大麥植物的方法克服了與低LOX活性或殘留LOX活性相關(guān)的限制和缺點(diǎn)。具體的差異包括(i)與Douma等的以WO02/053721A1公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT/IB01/00207中公開(kāi)的大麥植物相比，本發(fā)明的植物基本上不包含LOX-1活性，優(yōu)選植物是真正的LOX-1無(wú)效植物，即顯示出完全缺乏LOX-1蛋白質(zhì)功能的植物；(ii)通過(guò)篩選對(duì)應(yīng)基因中無(wú)義突變的存在可以鑒定出這里描述的真正LOX-1無(wú)效的特性。因此，具有那種特性的大麥植物純合子中活性酶的合成將被完全阻斷，阻斷與生長(zhǎng)條件或環(huán)境效應(yīng)無(wú)關(guān)。這是植物育種技術(shù)中的理想特性，對(duì)比
背景技術(shù)：
中大豆LOX突變體可能的分子方案，其中生命或無(wú)生命狀態(tài)可以影響細(xì)胞生理狀態(tài)的變化使隨后翻譯LOX的mRNA穩(wěn)定；(iii)大豆和稻LOX突變體中的有關(guān)特性包括主食中氣味強(qiáng)烈的化合物--己醛的水平降低，本發(fā)明與飲料中特有的味道化合物T2N的較低水平和飲料中9，12，13-THOE的較低水平有關(guān)；(iv)大豆和稻LOX突變體受13-HPODE下游的LOX路徑分子的影響，而LOX-1無(wú)效的特性與包含9-HPODE下游的分子的LOX路徑的支路有關(guān)；(v)而該大豆突變體包括LOX基因的輻射誘導(dǎo)的突變，DawDam和CI-115代表選擇的稻育種系的天然發(fā)生的栽培變種，具有LOX-1無(wú)效特性的大麥植物中的突變是由化學(xué)制劑NaN3誘導(dǎo)的。因此，提供包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的LOX-1活性的5％，優(yōu)選小于1％的大麥植物，其部分或片段是本發(fā)明的目標(biāo)。從包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物L(fēng)OX-1活性的5％，優(yōu)選小于1％的植物提供種子或顆粒(kernel)是本發(fā)明的第二個(gè)目標(biāo)。提供含有包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的LOX-1活性的5％，優(yōu)選小于1％的大麥植物，其部分或片段的組合物是本發(fā)明的第三個(gè)目標(biāo)。提供含有包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的LOX-1活性的5％，優(yōu)選小于1％的加工的大麥植物的麥芽組合物是本發(fā)明的更進(jìn)一步的目標(biāo)。麥芽組合物優(yōu)選可以是純麥芽組合物。但是，麥芽組合物也可以是大麥和麥芽混和混合物。提供感官品質(zhì)穩(wěn)定的飲料也是本發(fā)明的目標(biāo)，其中利用本發(fā)明的大麥植物或其部分制造所述飲料。特別地，優(yōu)選利用麥芽組合物，例如上述的純麥芽組合物或大麥和麥芽的混合物制造所述的飲料。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，所述飲料由啤酒組成。提供感官品質(zhì)穩(wěn)定的飲料是本發(fā)明的另外目標(biāo)，其中利用大麥植物制造所述飲料，所述飲料中9，12，13-三羥基十八碳烯酸(trihydroxyoctadecenoicacid)(在這里縮寫(xiě)為9，12，13-THOE或只表示為9，12，13-THA)與9，10，13-三羥基十八碳烯酸(在這里縮寫(xiě)為9，10，13-THOE或僅9，10，13-THA)的比例最大是1.8。所述飲料優(yōu)選是啤酒。而且，本發(fā)明的目的是提供組合物，例如包含本發(fā)明的大麥植物或其部分的食物組合物、飼料組合物或香原料組合物是本發(fā)明的目標(biāo)。另外，提供在本發(fā)明的大麥植物中表達(dá)重組蛋白質(zhì)的方法是本發(fā)明的目標(biāo)，其中所述方法包括用包含操作性連接的在大麥植物或其部分中可表達(dá)的啟動(dòng)子成分，編碼所述重組蛋白質(zhì)的DNA序列和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域的核酸序列轉(zhuǎn)化所述植物，使所述重組蛋白質(zhì)在所述大麥植物中表達(dá)。更進(jìn)一步地，提供降低本發(fā)明的大麥植物中的蛋白質(zhì)水平的方法是本發(fā)明的目標(biāo)，其中所述方法包括用包括操作性連接的在大麥植物或其部分中可表達(dá)的啟動(dòng)子成分，DNA序列和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域的核酸序列轉(zhuǎn)化所述植物，使所述DNA序列的表達(dá)通過(guò)反義抑制或共抑制或RNA干擾降低編碼所述蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)。因此，提供制備包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的5％，優(yōu)選小于1％的大麥植物的方法是本發(fā)明另外目標(biāo)，它包括步驟(i)確定野生型大麥顆粒(kernel)或其部分的LOX-1活性；和(ii)誘變處理大麥植物和/或大麥顆粒和/或大麥胚，從而獲得M0代大麥；和(iii)繁殖所述誘變處理的大麥植物、顆粒和/或胚至少2代，獲得Mx代大麥植物，其中X是≥2的整數(shù)；和(iv)從所述Mx大麥植物獲取顆粒或其部分；和(v)確定所述顆粒或其部分的LOX-1活性；和(vi)選擇誘變處理的顆粒或其部分的LOX-1活性小于野生型或其部分的LOX-1活性的5％的植物；從而獲取包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的LOX-1活性的5％的大麥植物。更進(jìn)一步，本發(fā)明的目標(biāo)是提供制造具有穩(wěn)定感官品質(zhì)的飲料的方法，該方法包括步驟(i)提供本發(fā)明的麥芽組合物；(ii)將所述麥芽組合物加工成飲料；從而獲取感官(organoleptic)品質(zhì)穩(wěn)定的飲料。本發(fā)明的另外目標(biāo)是提供產(chǎn)生LOX-1活性低的麥芽組合物的方法，該方法包括步驟(i)提供本發(fā)明的顆粒；(ii)浸泡所述顆粒；(iii)在預(yù)先確定的狀態(tài)下使浸泡的顆粒萌發(fā)；(iv)加熱處理萌發(fā)的顆粒(kernel)；從而產(chǎn)生LOX-1活性低或沒(méi)有LOX-1活性的麥芽組合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明以大麥突變體D112(在這里也稱為″突變體D112″或″大麥D112″)的功能研究的不可預(yù)知的結(jié)果為基礎(chǔ)，其中顯示主要的9-HPODE形成酶LOX-1的功能完全喪失。在設(shè)計(jì)的確定LOX催化亞油酸轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物分布圖的生物化學(xué)測(cè)定中檢測(cè)到9-HPODE∶13-HPODE的分布是10％∶90％，這是一個(gè)令人驚奇的發(fā)現(xiàn)?？紤]到T2N的味覺(jué)閾值非常低，因此突變體D112的顆粒中殘余的9-HPODE等等的降解僅引起從所述顆粒的麥芽制造的啤酒產(chǎn)物在陳釀(aging)期間釋放極低的T2N，使T2N正好低于味覺(jué)閾值，這一點(diǎn)更令人驚奇。對(duì)利用野生型和LOX-1無(wú)效顆粒進(jìn)行分析的結(jié)果的調(diào)查為L(zhǎng)OX-1活性高可以增強(qiáng)T2N的不新鮮紙板風(fēng)味提供了明顯的證據(jù)，因此證實(shí)了LOX路徑在控制alkenal形成中的重要作用。這一結(jié)論與建議LOX活性僅有助于小部分T2N前體分子的Liégeois等(上文)的意見(jiàn)對(duì)立。LOX-1無(wú)效的特性可以被引入任何其他大麥植物，例如確立的大麥品種，如確立的麥芽大麥品種，因此允許產(chǎn)生保存限期延長(zhǎng)的風(fēng)味穩(wěn)定的飲料。例如，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)繁育方法來(lái)完成這一過(guò)程。該方法不僅不依賴突變體D112衍生大麥生長(zhǎng)的地理區(qū)域，而且不依賴制造突變體D112衍生啤酒和出售給顧客的場(chǎng)所。突變體D112大麥植物或其衍生植物是種植該農(nóng)作物的農(nóng)場(chǎng)主和利用它作為啤酒生產(chǎn)或基于大麥的其他飲料生產(chǎn)的原材料的啤酒廠的潛在重要的經(jīng)濟(jì)因素。也預(yù)料依賴沒(méi)有9-HPODE/9-HPOTE形成活性的原材料的其他應(yīng)用將從大麥突變體D112的特性中受益。依照本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了幾個(gè)新的麥芽大麥突變體，例如大麥突變體D112或大麥突變體A618(在這里也稱為″突變體A618″或″大麥A618″)。本發(fā)明因此涉及大麥突變體D112或A618的顆粒，大麥D112或A618植物，將大麥突變體D112或A618與自身或另一個(gè)大麥系雜交，衍生產(chǎn)生大麥植物的方法。而且，本發(fā)明包括通過(guò)誘變或轉(zhuǎn)化大麥突變體D112或A618產(chǎn)生的LOX-1無(wú)效變體。因此，利用大麥突變體D112或A618或其衍生物作為親本株產(chǎn)生的所有植物都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。另一方面，本發(fā)明提供供組織培養(yǎng)大麥突變體植物D112或A618使用的可再生細(xì)胞。組織培養(yǎng)優(yōu)選用于再生具有上述大麥植物特征，包括形態(tài)學(xué)和遺傳學(xué)特征的植物。在這種組織培養(yǎng)中再生的細(xì)胞可能是胚、原生質(zhì)體、分生細(xì)胞、愈傷組織、花粉、花藥等等。應(yīng)理解本發(fā)明提供了從本發(fā)明的組織培養(yǎng)再生的大麥植物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明包含來(lái)源于LOX-1無(wú)效大麥顆粒的麥芽。本發(fā)明也涉及從LOX-1無(wú)效大麥植物或其部分或者從這種大麥植物制備的麥芽組合物制備的麥芽汁組合物。本發(fā)明更進(jìn)一步地包括飲料，例如利用本發(fā)明的LOX-1無(wú)效大麥顆粒或來(lái)源于所述顆粒的麥芽制造的啤酒。另外，本發(fā)明涉及由LOX-1無(wú)效大麥植物或其部分產(chǎn)生的植物產(chǎn)品。所述植物產(chǎn)品可能是加工處理所述大麥植物或其部分產(chǎn)生的任何產(chǎn)品。優(yōu)選的，所述植物產(chǎn)品選自由麥芽、麥芽汁、發(fā)酵飲料，例如啤酒、非發(fā)酵飲料、食物產(chǎn)品，例如大麥粉和飼料產(chǎn)物組成的組。提供顯示出不能與野生型大麥植物相區(qū)別的抗病力水平或顯示出具有改進(jìn)的抗病力的LOX-1無(wú)效大麥顆粒也是本發(fā)明的目標(biāo)。更進(jìn)一步地，本發(fā)明包括LOX-1無(wú)效大麥顆粒和來(lái)源于所述顆粒的麥芽，其中顆粒和麥芽都顯示真菌毒素水平降低。而且本發(fā)明也包括相對(duì)于野生型植物，抗病性增強(qiáng)的LOX-1無(wú)效大麥品種。更進(jìn)一步地公開(kāi)了相對(duì)于野生型植物，抗病性降低的LOX-1無(wú)效大麥品種，條件是所述植物的其他特性提供了比抗病性降低特性更重要的益處。另外，本發(fā)明提供可用于產(chǎn)生LOX路徑衍生的香料，包括青香韻(greennote)化合物的LOX-1無(wú)效大麥顆粒。而且，本發(fā)明提供LOX-1無(wú)效大麥突變體D112或A618的轉(zhuǎn)基因植物或其衍生植物，其中插入的基因賦予如除草劑抗性、抗蟲(chóng)性、細(xì)菌、真菌或病毒疾病抗性、增強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和在產(chǎn)業(yè)中使用的特性?；蚩梢允莾?nèi)源大麥基因，或可迭地通過(guò)基因工程方法插入的轉(zhuǎn)基因。最后，本發(fā)明提供利用LOX-1抑制劑降低LOX-1活性的方法。通過(guò)所述方法獲取的植物產(chǎn)品或來(lái)源于植物的產(chǎn)品，包括飲料和啤酒可以具有與以LOX-1無(wú)效大麥作為原材料制備的產(chǎn)物相似的特性。參照下列定義、說(shuō)明書(shū)、實(shí)施例、附加的權(quán)利要求書(shū)，伴隨的序列表和附圖可以更好地理解本發(fā)明的這些及其他特征、方面和優(yōu)點(diǎn)。3.1定義在隨后的說(shuō)明書(shū)、附圖和表中使用了許多術(shù)語(yǔ)。為了提供說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)，包括這些術(shù)語(yǔ)限定的范圍，提供了下列定義這里使用的″a″可以指一個(gè)或多個(gè)，這取決于使用它的上下文。術(shù)語(yǔ)″農(nóng)學(xué)特性″描述的是有助于所述植物的性能或經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物表型特性。這種特性包括抗病性、抗蟲(chóng)性、抗病毒性、抗線蟲(chóng)性、干旱耐受性、高鹽度耐受性、產(chǎn)量、株高、成熟天數(shù)、顆粒的等級(jí)(grading)(即顆粒的大小分級(jí))、顆粒的含氮量等等?！宸戳x核苷酸序列″指方向與核苷酸序列正常編碼的5′-3′方向相反的序列。當(dāng)存在于植物細(xì)胞中時(shí)，反義DNA序列優(yōu)選抑制內(nèi)源基因核苷酸序列的正常表達(dá)，因此可以破壞對(duì)應(yīng)天然蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。與啤酒制造過(guò)程有關(guān)的術(shù)語(yǔ)″大麥″，特別是用來(lái)描述麥芽制造過(guò)程的術(shù)語(yǔ)″大麥″指大麥顆粒。在其他情形下，除非另作說(shuō)明，否則″大麥″指包括任何品種的大麥植物(Hordeumvulagre，L)?！蹇共⌒浴逯钢参锉苊獬霈F(xiàn)是植物病原體相互作用結(jié)果的疾病癥狀。這樣就可以阻止病原體引起植物疾病和相關(guān)的疾病癥狀，或疾病癥狀?；蛘?，病原體引起的疾病癥狀被減到最低程度或降低了。在此公開(kāi)文本中限定的″谷類″植物是禾本科(Graminae)植物家族的成員，其中耕種禾本科植物家族主要是為了獲取他們的含淀粉種子。谷類植物包括，但不局限于大麥(Hordeum屬)、小麥(Triticum屬)、稻(Oryza屬)、玉蜀黍(Zea屬)、黑麥(Secale屬)、燕麥(Avena屬)、高梁(Sorghum屬)、Triticale和黑麥-小麥雜交種。在特定核酸上下文中的″編碼″或″編碼的″指包含翻譯成特定蛋白質(zhì)的信息。編碼蛋白質(zhì)的核酸在核酸翻譯區(qū)內(nèi)可以包含非翻譯序列(例如，內(nèi)含子)，或者可以缺乏這種插入的非翻譯序列(例如，在cDNA中)。利用密碼子對(duì)編碼蛋白質(zhì)的信息進(jìn)行說(shuō)明。這里在核酸上下文中使用的″表達(dá)″應(yīng)理解為來(lái)源于核酸片段的有義mRNA或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和積聚。在蛋白質(zhì)上下文中使用的″表達(dá)″指將mRNA翻譯成多肽?！屣L(fēng)味分子″指制造的是植物中氣味和/或味道成分的醛和/或醇(alcohol)。特別地，風(fēng)味分子包括某些揮發(fā)性醇和醛。揮發(fā)性的風(fēng)味分子的實(shí)例包括，但是不限于己醛、(3Z)-己烯醛、(2E)-己烯醛、(2E)-己烯醇、(3Z)-壬烯醛、(2E)-壬烯醛。本發(fā)明可用于調(diào)節(jié)植物中風(fēng)味分子的水平。術(shù)語(yǔ)″基因″指參與產(chǎn)生多肽鏈的DNA節(jié)段；它包括在編碼區(qū)之前和之后的區(qū)域(啟動(dòng)子和終止子)。真核基因間斷編碼蛋白質(zhì)，由被內(nèi)含子中斷的外顯子組成。在轉(zhuǎn)錄成RNA以后，通過(guò)拼接除去內(nèi)含子產(chǎn)生成熟信使RNA(mRNA)。典型地，通過(guò)作為拼接過(guò)程的拼接信號(hào)的共有序列確定外顯子之間的″拼接位點(diǎn)″，拼接過(guò)程由從初級(jí)RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物缺失內(nèi)含子和在切除的內(nèi)含子的任一側(cè)連接或融合剩余RNA的末端組成。有時(shí)輪流的拼接模式或不同的拼接模式可以從相同的單個(gè)DNA范圍產(chǎn)生不同的蛋白質(zhì)。天然基因被可以稱為內(nèi)源基因?！寤虺聊迨歉淖兓虮磉_(dá)的方法。它指RNA沉默，RNA沉默是各種生物體之間保守的翻譯后基因沉默機(jī)制。該方法包括翻譯后基因沉默(PTGS)和RNA干擾(RNAi)。PTGS是內(nèi)源和外源同源基因的基因沉默現(xiàn)象。雖然關(guān)于PTGS的大多數(shù)實(shí)例與共抑制構(gòu)建物或轉(zhuǎn)基因反義方向的表達(dá)所引起的效果有關(guān)，但是在常規(guī)育種計(jì)劃的植物中也已經(jīng)觀察到這一現(xiàn)象，例如在稻中的Lgcl突變(Kusabaetal.，2003)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這一突變通過(guò)RNA沉默抑制谷蛋白表達(dá)，可能是由于在兩個(gè)高度相似的谷蛋白基因之間刪除3.5kbp后形成了尾到尾反向重復(fù)，而這種重復(fù)可以產(chǎn)生成為RNA沉默的有效誘導(dǎo)物的雙鏈RNA分子。RNA沉默的第二種形式被稱為RNA干擾(RNAi)，RNAi的基本前提是雙鏈RNA注入或攝取到細(xì)胞中時(shí)具有特異阻斷其同源基因表達(dá)的能力。這里使用的與核酸有關(guān)的″異源″指來(lái)源于外來(lái)物種的核酸，或者指來(lái)源于相同物種的，通過(guò)人的故意干預(yù)從組合物的天然形式和/或基因組位點(diǎn)獲得的基本上被修飾的核酸。這里使用的術(shù)語(yǔ)″萌發(fā)″(germination)指在各種組合物中，例如在自然界中發(fā)現(xiàn)的普通土壤中，大麥顆粒開(kāi)始或恢復(fù)生長(zhǎng)。萌發(fā)也可以在放入生長(zhǎng)室的盆的土壤中進(jìn)行，或者，例如可以在放入標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室Petri培養(yǎng)皿的濕濾紙上進(jìn)行。一般理解的萌發(fā)包括顆粒的水合作用、顆粒的膨脹和誘導(dǎo)胚生長(zhǎng)。影響萌發(fā)的環(huán)境因素包括濕度、溫度和含氧量。觀察根和芽的發(fā)育?！迩嘞沩崱迨敲枋龃嬖谟谠S多植物中的揮發(fā)性風(fēng)味和香料分子的術(shù)語(yǔ)，表現(xiàn)感官術(shù)語(yǔ)鮮綠和草綠的特性。植物中類脂和游離脂肪酸，例如亞油酸和亞麻酸的降解會(huì)產(chǎn)生這些分子。這里使用的術(shù)語(yǔ)″分離的″指從原料的原始環(huán)境中除去該原料。例如存在于活生物中的天然發(fā)生的多核苷酸或者多肽不是分離的，而與天然系統(tǒng)中的一些或全部共存原料分離的相同的多核苷酸或多肽是分離的。這種多核苷酸可以是載體的一部分和/或這種多核苷酸或多肽可以是組合物的一部分，但他們?nèi)匀皇欠蛛x的，因?yàn)檫@種載體或組合物不是它的天然環(huán)境的一部分。限定術(shù)語(yǔ)″顆粒″包括谷類穎果，也稱為內(nèi)部種子(internalseed)，外稃和內(nèi)稃。在大多數(shù)大麥品種中，外稃和內(nèi)稃附著于穎果，而且是脫粒后的顆粒的一部分。但是，存在裸大麥品種。在這些大麥中，穎果沒(méi)有外稃和內(nèi)稃，因此象小麥一樣，捶擊(threshout)就可以釋放穎果。術(shù)語(yǔ)″顆粒″和″谷?！骞阮w粒(grain)在這里可交換使用?！孱w粒成熟″或″谷物發(fā)育″指開(kāi)始于儲(chǔ)存可代謝的儲(chǔ)備物，例如糖、低聚糖、淀粉、酚醛塑料、氨基酸和蛋白質(zhì)的施肥，結(jié)束于顆粒(谷粒)脫水的周期，其中施肥過(guò)程有和沒(méi)有液泡靶向到顆粒(谷粒)的各種組織，例如胚乳、外種皮、糊粉和角質(zhì)鱗片，導(dǎo)致顆粒(谷粒)膨大、顆粒(谷粒)裝滿。術(shù)語(yǔ)″LOX-1活性″指大麥LOX-1酶的酶活性。特別地，在本發(fā)明的上下文中″LOX-1活性″是LOX-1酶催化亞油酸雙氧化成9-HPODE。即使LOX-1能夠催化其他反應(yīng)，但為了依照本發(fā)明確定LOX-1的活性仍應(yīng)僅考慮形成9-HPODE的活性。圖1B概述了把亞油酸轉(zhuǎn)化為T2N的生物化學(xué)路徑。術(shù)語(yǔ)″低LOX″指在一個(gè)或幾個(gè)內(nèi)源基因中存在一個(gè)或幾個(gè)突變，導(dǎo)致特定LOX酶的功能部分損失，優(yōu)選指，但不局限于酶活性的損失。例如在Douma等的以WO02/053721A1公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT/IB01/00207中公開(kāi)的大麥植物產(chǎn)生了與對(duì)應(yīng)的野生型酶相比，具有10％殘余活性的突變的LOX-1酶?！宓蚅OX″的植物指特定LOX酶功能部分損失的植物?！妍溠恐圃臁?malting)是大麥顆粒在可控的環(huán)境條件下，包括但不限于在麥芽浸泡池和萌發(fā)箱中進(jìn)行的特殊萌發(fā)形式。與本發(fā)明的這一步驟一致，萌發(fā)過(guò)程在浸泡大麥顆粒期間和/或已經(jīng)浸泡大麥顆粒之后開(kāi)始發(fā)生?？梢酝ㄟ^(guò)干燥大麥顆粒停止萌發(fā)過(guò)程。應(yīng)理解從LOX-1無(wú)效大麥制備的麥芽組合物包括LOX-1無(wú)效麥芽，例如純LOX-1無(wú)效麥芽或包含LOX-1無(wú)效麥芽的任何混合物?！逄腔?mashing)是在水中溫育磨碎的麥芽。優(yōu)選在特定的溫度和特定體積的水中進(jìn)行糖化。溫度和水的體積很重要，因?yàn)樗麄儠?huì)影響來(lái)源于麥芽的酶活性下降的速率，因此特別會(huì)影響發(fā)生的淀粉水解的量。存在添加劑時(shí)可以發(fā)生糖化，應(yīng)理解添加劑包含除麥芽以外的任何碳水化合物來(lái)源，例如主要作為提取物的另外來(lái)源的大麥(包括LOX-1無(wú)效大麥)、玉蜀黍和稻添加劑。在啤酒廠加工處理添加劑的要求取決于使用的添加劑的狀態(tài)和種類，特別是取決于淀粉膠化或液化的溫度。如果膠化溫度超過(guò)正常的麥芽糖化溫度，那么在添加淀粉到碎麥芽中之前淀粉就被膠化和液化?！逋蛔儭灏ɑ蚓幋a區(qū)和非編碼區(qū)的缺失、插入、顛換和點(diǎn)突變。缺失可以是缺失整個(gè)基因或僅缺失基因的一部分。點(diǎn)突變可以產(chǎn)生終止密碼子，移碼突變或氨基酸替換。體細(xì)胞突變是那些僅僅發(fā)生在植物的某些細(xì)胞或組織中，但不遺傳到下一代的突變。在植物的任何細(xì)胞中可以發(fā)現(xiàn)種系突變，這種突變可以遺傳。術(shù)語(yǔ)″無(wú)效的LOX″指在LOX編碼基因內(nèi)存在突變，導(dǎo)致編碼的LOX酶的功能完全喪失。在編碼LOX的基因中產(chǎn)生早熟終止(無(wú)意義)密碼子的突變僅僅代表一個(gè)可以使功能完全喪失的機(jī)制。使LOX酶功能完全喪失的分子方法包括產(chǎn)生導(dǎo)致所述酶的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物完全缺失的突變，或產(chǎn)生使編碼的酶完全失活的突變。″無(wú)效的LOX″的植物指特定LOX酶功能完全喪失的植物?！宀僮餍赃B接″是用來(lái)指關(guān)聯(lián)單個(gè)多核苷酸上的兩個(gè)或更多個(gè)核酸片段，使一個(gè)片段的功能受另一個(gè)的影響的術(shù)語(yǔ)。例如當(dāng)啟動(dòng)子能夠影響編碼序列的表達(dá)，即編碼序列位于啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下時(shí)，啟動(dòng)子是操作性地與編碼序列連接的。可以以有義或反義方向?qū)⒕幋a序列操作性地與調(diào)節(jié)序列連接?！錚CR″或″聚合酶鏈反應(yīng)″是本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的用于擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)(Mullis等的美國(guó)專利號(hào)Nos.4,683,195和4,800,159)?！逯参铩寤颉逯参锊牧稀灏ㄖ参锛?xì)胞、植物原生質(zhì)體、從中可以再生大麥植株的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織，植物或植物部分，例如胚、花粉、胚珠、花、顆粒、葉、根、根尖、花藥中完整的植物細(xì)胞，或植物的任何部分或產(chǎn)品。術(shù)語(yǔ)″植物產(chǎn)品″指由加工處理植物或植物部分產(chǎn)生的產(chǎn)品。因此所述植物產(chǎn)品可以是麥芽、麥芽汁、發(fā)酵或非發(fā)酵飲料、食品或飼料產(chǎn)品。這里使用的與蛋白質(zhì)有關(guān)的″重組體″指來(lái)源于外來(lái)物種的蛋白質(zhì)，或者指來(lái)源于相同物種的，通過(guò)人的故意干預(yù)從組合物的天然形式獲得的基本上被修飾的蛋白質(zhì)。″RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物″(transcript)指由RNA聚合酶催化DNA序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的產(chǎn)物。當(dāng)RNA轉(zhuǎn)錄物是DNA序列的完全互補(bǔ)拷貝時(shí)，稱它為初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。當(dāng)RNA序列來(lái)源于初級(jí)轉(zhuǎn)錄物的翻譯后處理時(shí)，稱它為成熟RNA?！逍攀筊NA″或″mRNA″指沒(méi)有內(nèi)含子，而且能夠被細(xì)胞翻譯成蛋白質(zhì)的RNA?！錭DNA″指與來(lái)源于mRNA模板，與mRNA模板互補(bǔ)的DNA。cDNA可以是單鏈的，或者可以利用例如，DNA聚合酶I的Klenow片段把其變成雙鏈形式?！逵辛xRNA″指包括mRNA，因此能被細(xì)胞翻譯成多肽的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。″反義RNA″指與初級(jí)靶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或mRNA的全部或部分互補(bǔ)，而且能阻斷靶基因表達(dá)的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。反義RNA的互補(bǔ)性可以指與特定核苷酸序列的任何一部分，即5′非編碼序列、3′非編碼序列、內(nèi)含子或蛋白質(zhì)編碼序列互補(bǔ)?！骞δ躌NA″指有義RNA，反義RNA，或者其他的可以不被翻譯成蛋白質(zhì)，但對(duì)細(xì)胞過(guò)程有影響的RNA。除非另作說(shuō)明，否則″T2N″指T2N的游離形式。術(shù)語(yǔ)″潛在T2N″(T2Npotential)描述的是具有在一個(gè)或多個(gè)反應(yīng)中釋放T2N的能力，或具有被轉(zhuǎn)化成T2N的能力的化學(xué)物質(zhì)。可以以在高溫(例如，100℃)和低酸度(例如pH4.0)條件下溫育(例如，2h)的溶液，例如麥芽汁或啤酒中T2N的濃度測(cè)量潛在T2N。樣品處理使T2N從潛在的T2N，例如從″T2N加合物″釋放，其中T2N加合物是用來(lái)描述連接到一種或多種物質(zhì)，包括但不限于蛋白質(zhì)、亞硫酸鹽、細(xì)胞碎片、細(xì)胞壁等等上的T2N的術(shù)語(yǔ)。通常T2N加合物本身不會(huì)被人感覺(jué)到作為異味。但是，通過(guò)加熱或酸從所述T2N加合物釋放的T2N可以產(chǎn)生異味。″組織培養(yǎng)″顯示包含相同或不同類型的分離的細(xì)胞或這種細(xì)胞的集合的組合物構(gòu)成植物的一部分，例如原生質(zhì)體、愈傷組織、胚、花粉、花藥等等。″轉(zhuǎn)化″指將DNA插入生物體中，以便將DNA作為染色體外元件(沒(méi)有整合和穩(wěn)定遺傳)或染色體組成部分(遺傳學(xué)上穩(wěn)定遺傳)保持。除非另有說(shuō)明，否則這里使用的轉(zhuǎn)化大腸桿菌的方法是CaCl2方法(SambrookandRussel，上文)。為了轉(zhuǎn)化大麥，除了使用另一個(gè)栽培變種，例如栽培變種GoldenPromise作為宿主外，基本上可以按照Tingay等(1997)和Wang等(2001)的描述實(shí)施農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化?！遛D(zhuǎn)基因″是通過(guò)轉(zhuǎn)化過(guò)程導(dǎo)入基因組的基因。這里使用的″轉(zhuǎn)基因的″包括通過(guò)引入異源核酸已經(jīng)被修飾的細(xì)胞或由這種修飾的細(xì)胞衍生而來(lái)的細(xì)胞。因此，例如轉(zhuǎn)基因細(xì)胞表達(dá)未以相同形式在細(xì)胞的天然形式中被發(fā)現(xiàn)的基因，或者表達(dá)由于人的故意干預(yù)另外異常表達(dá)、低表達(dá)或非根本不表達(dá)的天然基因。這里使用的術(shù)語(yǔ)″轉(zhuǎn)基因″植物，特別是大麥植物不包括通過(guò)傳統(tǒng)植物育種方法產(chǎn)生的細(xì)胞改變，例如NaN3衍生的誘變，以及通過(guò)天然發(fā)生事件，例如人沒(méi)有故意創(chuàng)造發(fā)生的那些事件產(chǎn)生的細(xì)胞改變。術(shù)語(yǔ)″野生型大麥植物″指常規(guī)大麥植物，該術(shù)語(yǔ)優(yōu)選指從中可以衍生本發(fā)明的大麥植物的大麥植物，即親本株。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，″野生型大麥植物″選自由cv.sCeleste、Lux、Prestige、Saloon和Neruda組成的組。更優(yōu)選的″野生型大麥植物″是栽培變種Barke。通常從普通的種子公司可獲得野生型大麥栽培變種或者其種子。4.序列表簡(jiǎn)述參考下列構(gòu)成本申請(qǐng)一部分的詳細(xì)的說(shuō)明書(shū)和伴隨的序列表(概括在表9中)可以更充分地理解本發(fā)明。所述的表列出了這里描述的核酸和多肽，cDNA克隆的名稱包括編碼代表這些多肽的全部或重要(substantial)部分的多肽的核酸片段和對(duì)應(yīng)的標(biāo)識(shí)符[SEQIDNO]。在此附上的序列說(shuō)明和序列表遵守管理專利申請(qǐng)中核苷酸和/或氨基酸序列公開(kāi)的規(guī)則。序列表包含限定和標(biāo)準(zhǔn)化介紹一致的核苷酸和氨基酸序列的一字母代碼(Cornish-Bowden，1985；IUPAC-IUBJointCommissiononBiochemicalNomenclature，1984)，在此將其引入作為參考。核苷酸和氨基酸序列數(shù)據(jù)使用的符號(hào)和格式遵守管理專利申請(qǐng)中序列公開(kāi)的規(guī)則。5.附圖簡(jiǎn)述圖1被分成三個(gè)流程圖表A、B和C。圖1A顯示怎樣繁殖NaN3誘變處理的大麥顆粒。M0代的顆粒生長(zhǎng)為形成M1代顆粒的植物?？梢圆シN這些M1代顆粒，讓其發(fā)展成為產(chǎn)生M2代新顆粒的M1植物。接下來(lái)，M2植物生長(zhǎng)，并產(chǎn)生可以收獲進(jìn)行篩選分析的M3代顆粒。也可以播種M3種子，利用對(duì)應(yīng)植物的花進(jìn)行雜交獲取M4代植物。圖lB是生物化學(xué)LOX路徑怎樣降解亞油酸，并最終產(chǎn)生T2N的簡(jiǎn)化圖表。圖1C舉例說(shuō)明亞油酸怎樣在LOX-1作用下被變成對(duì)應(yīng)的9-過(guò)氧氫酸(9-hydroperoxyacid)(9-HPODE)，接下來(lái)是通過(guò)環(huán)氧醇合成酶(epoxyalcoholsynthase)和環(huán)氧水解酶更進(jìn)一步的酶轉(zhuǎn)化變成9，12，13-三羥基-10-十八碳烯酸(9，12，13-THOE)。圖2是測(cè)量的cvBarke、突變體D112的胚提取物和包含加熱失活的cv.Barke胚提取物的對(duì)照樣品的總LOX活性的圖解比較。圖3顯示的是測(cè)量的突變體A618、cv.Neruda的胚提取物和包含加熱失活的cv.Barke胚提取物的對(duì)照樣品的總LOX活性的圖解比較。圖4顯示的是測(cè)量的突變體D112的M4子代系的12個(gè)獨(dú)立顆粒的總LOX活性的比較。由cv.Barke顆粒提取物組成的對(duì)照樣品和cv.Barke加熱失活的顆粒提取物的活性被歸入進(jìn)行比較。圖5概括了對(duì)突變體D112的M5子代系的90個(gè)獨(dú)立顆粒提取物的總LOX活性進(jìn)行分析的結(jié)果。cv.Barke對(duì)照顆粒提取物和cv.Barke加熱失活的顆粒提取物的活性被歸入進(jìn)行比較。圖6對(duì)測(cè)量的突變體A618的M4子代系的40個(gè)獨(dú)立顆粒的提取物的總LOX活性的比較進(jìn)行了概括。對(duì)照樣品cv.Barke顆粒提取物和cv.Barke加熱失活的顆粒提取物的活性被歸入進(jìn)行比較。圖7由兩個(gè)分離的免疫印跡組成，顯示突變體D112，M3代的顆粒提取物中的免疫活性LOX-1蛋白質(zhì)是不可檢測(cè)的。每個(gè)免疫印跡用針對(duì)大麥LOX-1的抗體作探針，樣品由表達(dá)重組LOX-1的大腸桿菌細(xì)胞的提取物(第1道)、cv.Vintage(第2道)、突變系G(第3道和第7道)、cv.Barke(第6道和第8道)和突變體D112的分離系、M3代(第4-5和9-16道)的顆粒提取物組成。標(biāo)明了免疫活性LOX-1蛋白質(zhì)的位點(diǎn)。圖8顯示了詳述突變體A618、M3和M4代的顆粒提取物中缺乏LOX-1的兩個(gè)分離的免疫印跡。每個(gè)免疫印跡用針對(duì)大麥LOX-1的抗體作探針，樣品由突變系G(第1道)、cv.Neruda(第6道和第16道)的顆粒提取物組成。分別在第2-5和8-12道分離了隨機(jī)選擇的沒(méi)有通過(guò)LOX選擇過(guò)程的M3和M4顆粒的提取物；所有這些提取物包含LOX-1免疫活性蛋白質(zhì)。突變體A618、M3代(第7道)的顆粒提取物的LOX-1無(wú)效的表型在突變體A618-82的分離的M4子代系(8-12道)中被遺傳。標(biāo)明了免疫活性LOX-1蛋白質(zhì)的位點(diǎn)。圖9概略說(shuō)明了從突變體D112到cv.Prestige的回交程序的遺傳學(xué)。野生型LOX-1特性被指定為NN，而LOX-1無(wú)效的突變體特性是nn。對(duì)具有下劃線所示基因型的植物進(jìn)行雜交。圖10提供了七個(gè)分離的免疫印跡的圖，其中每個(gè)免疫印跡都用針對(duì)大麥LOX-1的抗體作探針。免疫印跡顯示在突變體D112到cvPrestige的第一回交代的分離植物的顆粒(第1-6道和第9-14道)中存在或者缺少免疫活性LOX-1蛋白質(zhì)，在突變體D112到cvPrestige的第二回交代的顆粒(第17-22道，第25-30道，第33-38道，第41-45道和第48-52道)中存在或者缺少免疫活性LOX-1蛋白質(zhì)。缺乏免疫活性LOX-1的突變體D112的對(duì)照顆粒提取物(第7、15、23、31、39、46、53道)和包含免疫活性LOX-1的cv.Prestige(第8、16、24、32、40、47、54道)被用作對(duì)照。標(biāo)明了免疫活性LOX-1蛋白質(zhì)的位點(diǎn)。圖11是沒(méi)有使用添加劑，但包括浸泡大麥谷粒(1)、發(fā)麥芽(malting)(2)、窯烘(kiln)(3)、碾磨干燥的麥芽(4)、糖化(5)、過(guò)濾(6)、在添加酒花的情況下煮沸麥芽汁(wortboiling)(7)、在存在酵母的情況下發(fā)酵(8)、啤酒成熟(9)、啤酒過(guò)濾(10)、包括但不限于包裝到瓶，罐等容器中的包裝(11)和貼標(biāo)簽(12)的啤酒生產(chǎn)過(guò)程的簡(jiǎn)單圖解概述。這些獨(dú)立的步驟可以集合成包含生產(chǎn)麥芽(1-3)、生產(chǎn)麥芽汁(4-7)、發(fā)酵(8-9)和制備成品(finished)啤酒(10-12)的部分。圖12集中描述了利用來(lái)源于LOX-1無(wú)效突變體D112的大麥的麥芽生產(chǎn)的啤酒的特征。圖12A舉例說(shuō)明了在37℃強(qiáng)迫陳釀4周期間游離T2N的積聚。測(cè)量了由LOX-1無(wú)效突變體D112的麥芽(▲)和cv.Barke的對(duì)照麥芽(●)制備的啤酒中的醛。啤酒中T2N的味覺(jué)閾值是大約0.05ppb。圖12B提供了啤酒品嘗小組對(duì)20℃溫育12個(gè)月的啤酒的獨(dú)立味道特征進(jìn)行評(píng)價(jià)后搜集的數(shù)據(jù)的圖解表示。啤酒是由來(lái)源于cv.Barke大麥(實(shí)心條)或LOX-1無(wú)效突變體D112的大麥(空心條)的麥芽制成的。圖13顯示了用來(lái)測(cè)定大麥組織中9-和13-HPODEs形成的HPLC分析的色譜圖。通過(guò)測(cè)量234nm處的吸光度對(duì)HPODEs水平進(jìn)行分析，以毫吸光度單位(mAU)給出結(jié)果。用箭頭標(biāo)明了洗脫圖中相當(dāng)于9-HPODE和13-HPODE的峰。圖13A顯示9-HPODE和13-HPODE標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。圖13B是從cv.Barke的成熟胚制備的提取物中形成的HPODEs的色譜圖。圖13C是從低LOX顆粒的成熟胚制備的提取物中形成的HPODEs的色譜圖。圖13D是從LOX-1無(wú)效突變體D112的成熟胚制備的提取物中形成的HPODEs的色譜圖。圖14描述了用來(lái)測(cè)定麥芽中9-和13-HPODEs形成的HPLC分析的色譜圖。通過(guò)測(cè)量234nm處的吸光度對(duì)所述HPODEs水平進(jìn)行分析，以毫吸光度單位(mAU)給出結(jié)果。用箭頭標(biāo)明了洗脫圖中相當(dāng)于9-HPODE和13-HPODE的峰。圖14A顯示9-HPODE和13-HPODE標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。用箭頭標(biāo)明了相當(dāng)于9-HPODE和13-HPODE的色譜峰。圖14B是來(lái)自cv.Barke的麥芽的提取物中形成的HPODEs的色譜圖。圖14C是來(lái)自低LOX大麥的麥芽的提取物中形成的HPODEs的色譜圖。圖14D是來(lái)自LOX-1無(wú)效突變體D112的麥芽的提取物中形成的HPODEs的色譜圖。圖15是顯示跨越起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)的大麥LOX-1基因結(jié)構(gòu)的圖。長(zhǎng)4,165bp的序列的示意圖顯示出7個(gè)外顯子(填充盒)和6個(gè)內(nèi)含子(線)。用箭頭標(biāo)明了經(jīng)鑒定的LOX-1基因中的突變位點(diǎn)，即突變系G(低LOX)，突變體A618和突變體D112特異的突變位點(diǎn)。圖16概括了預(yù)計(jì)的與野生型大麥植物、突變體A618和突變體D112大麥植物的LOX-1基因相關(guān)的分子差異。列在欄中的標(biāo)明為″結(jié)果″、″氨基酸長(zhǎng)度和″以kDa為單位的質(zhì)量″的信息是從DNA序列預(yù)計(jì)的。圖17提供了用來(lái)實(shí)施RT-PCR突變體分析和驗(yàn)證與編碼LOX-1的大麥基因相關(guān)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的方法。A中概略顯示了用RT-PCR檢測(cè)cv.Vintage和低LOX-1突變系G的正在發(fā)育的胚中的編碼LOX-1的基因的特定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的原理。引物由與位于長(zhǎng)83bp的內(nèi)含子5側(cè)面的外顯子復(fù)性的FL821[SEQIDNO11]和FL852[SEQIDNO12]組成；標(biāo)明了使用基因組DNA模板或者mRNA模板的PCR產(chǎn)物的差異。B顯示了焦點(diǎn)在于檢測(cè)正在發(fā)育的cv.Vintage和突變系G的胚中與編碼LOX-1的基因相關(guān)的特定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RT-PCR瓊脂糖凝膠分析的結(jié)果。第1和5道包含標(biāo)記片段，第2、3和4道分別包含來(lái)源于開(kāi)花(DAF)20、40和60天后的cv.Vintage的胚組織的PCR產(chǎn)物。第6、7和8道分別包含來(lái)源于DAF20、40和60天后的突變系G的胚組織的產(chǎn)物。在C中，第1-5道顯示與B中第1-5道詳述的實(shí)驗(yàn)類似的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，而第6、7和8道分別包含來(lái)源于DAF20、40和60天后的突變體D112的胚特異的LOX-1基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RT-PCR檢測(cè)的產(chǎn)物。D中顯示了由LOX-1基因特有的RT-PCR片段的測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)生的的電泳圖譜。序列分析顯示RT-PCR目標(biāo)RNA中沒(méi)有DNA。黑色三角形指向顯示轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物正確拼接的拼接點(diǎn)。圖18詳述了大麥突變體D112的SNP協(xié)助檢測(cè)的結(jié)果。分析以每個(gè)樣品使用兩組PCR反應(yīng)產(chǎn)生特定的PCR片段模式為基礎(chǔ)，在A中進(jìn)行了大概說(shuō)明(引物組合1由FL820[SEQIDNO13]和引物FL823[SEQIDNO15]組成，引物組合2由FL820[SEQIDNO13]和引物FL825[SEQIDNO14]組成。B中顯示了良種育種材料的PCR模式分析的結(jié)果。對(duì)植物的基因組DNA進(jìn)行PCR分析。利用引物組合1(偶數(shù)道)或引物組合2(奇數(shù)道)的結(jié)果顯示在第2-3道(植物1)、第4-5道(植物2)、第6-7道(植物3)、第8-9道(植物4)、第10-11道(植物5)、第12-13道(植物6)、第14-15道(植物7)、第16-17道(植物8)和第18-19道(植物9)中。與A中顯示的帶型進(jìn)行比較顯示植物1、2、4、5、7和8是純合子突變體，而植物3、6和9的基因型可以被分為純合子野生型。在第1和20道分離了標(biāo)記DNA。圖19表明了對(duì)包含突變體G或突變體D112的原料的大麥樣品進(jìn)行多重SNP分析的原理。使用多重PCR反應(yīng)分析，這樣使擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度與所添加材料的基因型有關(guān)。370-bp片段的擴(kuò)增將顯示麥芽樣品包含來(lái)源于突變系G的材料，而166-bp片段的擴(kuò)增將表明存在來(lái)源于突變體D112的材料。圖A是詳述特異引物怎樣配對(duì)的簡(jiǎn)圖，其中每個(gè)引物對(duì)都具有一個(gè)包含特異性針對(duì)目的突變體的序列的引物(星號(hào)指突變系G的LOX-1的基因組克隆的核苷酸編號(hào)2279和突變體D112的位點(diǎn)3574)。引物組合FL918[SEQIDNO16]和FL920[SEQIDNO17]用于檢測(cè)突變系G特異突變，而FL820[SEQIDNO13]和FL823[SEQIDNO15]被用來(lái)檢測(cè)突變體D112特異的堿基變化。B中顯示樣品中突變體特異材料(第2-7道突變系G；第8-13道突變體D112)的相對(duì)量怎樣增強(qiáng)特異PCR片段的合成(第2和8道沒(méi)有添加突變體材料第3和9道添加了20％的突變體材料；第3和9道添加了20％的突變體材料；第4和10道添加了40％的突變體材料；第5和11道添加了60％的突變體材料；第6和12道添加了80％的突變體材料；第7和13道添加了100％的突變體材料)。第1道由標(biāo)記片段組成。圖20給出了來(lái)自用載體質(zhì)粒pET19b(第2-5道)、表達(dá)質(zhì)粒pETL1(第6-10道)和表達(dá)質(zhì)粒pETL2(第11-15道)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞的親合純化的His標(biāo)記的LOX-1的SDS-PAGE的結(jié)果。分析了來(lái)自包含非結(jié)合蛋白質(zhì)(第2，6，11道)；第一洗液(第3，7，12道)；第二洗液(第4，8，13道)；第一洗脫物(第5，9，14道)和第二洗脫物(第10，15道)的部分的蛋白質(zhì)。上部的箭頭標(biāo)明了重組LOX-1(相當(dāng)于野生型LOX-1)的位置，下部的箭頭標(biāo)明了截短的重組LOX-1(相當(dāng)于大麥突變體D112中LOX-1)的位置。第1道包含分離的標(biāo)記蛋白質(zhì)。圖21舉例說(shuō)明了轉(zhuǎn)化大麥的質(zhì)粒插入物。A中舉例說(shuō)明了由玉蜀黍泛素-1啟動(dòng)子和內(nèi)含子1(一起稱為UBI啟動(dòng)子)組成的指導(dǎo)bar基因(BAR)基本表達(dá)的表達(dá)盒，其中bar基因編碼可選擇的標(biāo)記膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶。NOS終止序列(N)提供轉(zhuǎn)錄終止。B中舉例說(shuō)明了由上述UBI啟動(dòng)子組成的以有義或反義方向指導(dǎo)大麥LOX-1的cDNA序列的基本表達(dá)的表達(dá)盒。C中舉例說(shuō)明了由UBI啟動(dòng)子組成的指導(dǎo)包含內(nèi)含子的發(fā)夾式構(gòu)建物的基本表達(dá)的表達(dá)盒，其中脂肪酸去飽和酶FAD2內(nèi)含子1(Int)的擬南芥基因的內(nèi)含子1的序列的兩側(cè)側(cè)接了LOX-1基因的大約200-bp長(zhǎng)的片段的有義臂(→))和反義臂(←)。NOS終止序列(N)提供轉(zhuǎn)錄終止。為了產(chǎn)生顯示出LOX-1基因共抑制的大麥植物，使用了包含等量含有A和B中詳述的插入物的表達(dá)質(zhì)粒的質(zhì)?；旌衔?。為了產(chǎn)生顯示出LOX-1基因完全沉默的大麥植物，使用了包含等量含有A和C中的插入物的表達(dá)質(zhì)粒的質(zhì)?；旌衔?。圖22詳述了關(guān)于降低LOX-1活性的抑制劑的試驗(yàn)結(jié)果。A中描述了在10％SDS-PAGE中進(jìn)行的蛋白質(zhì)電泳分離，分離的條帶說(shuō)明了來(lái)自大腸桿菌細(xì)胞的His標(biāo)記的LOX-1的逐步純化結(jié)果(參照實(shí)施例18)。載體pET19b和質(zhì)粒pETL1的轉(zhuǎn)化體的粗提物中的蛋白質(zhì)分別顯示在第1道和第2道，第3-5道包含洗液2，3和4的分離的蛋白質(zhì)。在第6道(洗脫物1)、第7道(洗脫物2)、第8道(洗脫物3)和第9道(洗脫物4)中分離了來(lái)自親和層析柱的1ml洗脫物的3ul的樣品等份。水平的箭頭標(biāo)明了重組LOX-1的位置。如B中概括的那樣，用來(lái)自洗脫物2的等分LOX-1進(jìn)行抑制劑研究。其中在抑制劑，NDGA(●)或沒(méi)食子酸辛酯(▲)中的任何一個(gè)存在的情況下，溫育5ml的LOX-1(洗脫物2)后測(cè)量剩余的LOX-1活性。圖23提供了詳述從沒(méi)有添加抑制劑的糖化過(guò)程制備的麥芽汁樣品(空心條)或存在0.5mM的LOX-1抑制劑沒(méi)食子酸辛酯(實(shí)心條)時(shí)制備的麥芽汁樣品中的T2N水平的概要。在開(kāi)始糖化(37℃)后或者在煮沸(煮沸的麥芽汁)后提取的樣品包括用大麥cv.Barke或LOX-1無(wú)效大麥突變體D112的麥芽得到的碎麥芽的麥芽汁。6.發(fā)明詳述將發(fā)明的詳細(xì)描述分成了下列分部，其目的是為了使描述清楚，而不是限制發(fā)明(i)大麥植物；(ii)制備LOX-1無(wú)效大麥；(iii)組合物；(iv)化學(xué)誘變；(v)選擇大麥突變體；(vi)植物育種；(vii)大麥雜交；(viii)LOX酶；(ix)LOX路徑的產(chǎn)物；(x)潛在的T2N；(xi)抗病性；(xii)真菌毒素；(xiii)香料；(xiv)編碼LOX基因的異源表達(dá)；(xv)LOX抑制劑。6.1大麥植物認(rèn)為″野生大麥″，″Hordeumvulgaressp.spontaneum″是今天栽培的大麥類型的祖先。在長(zhǎng)時(shí)間里已經(jīng)接受開(kāi)發(fā)這一谷類能提供解釋在FertileCrescent上開(kāi)始谷物耕作的鑰匙。人類在長(zhǎng)夏季節(jié)期間收集谷物的事實(shí)使他們成為預(yù)先適應(yīng)的馴養(yǎng)候選人。對(duì)來(lái)自以色列、土耳其和伊朗的野生型大麥的研究(Nevo，1992)支持早期的養(yǎng)馴植物可能在遺傳上變化非常多的觀點(diǎn)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)野生大麥群體的等位基因含量大大不同。在27個(gè)均分位點(diǎn)的127個(gè)等位基因中，發(fā)現(xiàn)65個(gè)等位基因是獨(dú)一無(wú)二的，即他們僅出現(xiàn)在一個(gè)國(guó)家。認(rèn)為大麥從野生狀態(tài)到耕種狀態(tài)的轉(zhuǎn)換與許多位點(diǎn)的等位基因頻率的根本變化一致。珍貴的等位基因和新的突變事件被農(nóng)場(chǎng)主積極挑選出來(lái)，其中農(nóng)場(chǎng)主能很快確定表示為″大麥當(dāng)?shù)仄贩N″(barleylandraces)的馴養(yǎng)植物群體中的新特性。與野生大麥相比較，這些大麥在遺傳上與現(xiàn)代栽培變種更密切相關(guān)，而且他們代表對(duì)更進(jìn)一步繁殖工作有用的等位基因的來(lái)源(Ellisetal.，1998)。直到十九世紀(jì)晚期，大麥當(dāng)?shù)仄贩N才作為近親交配系的高度異種混合物和雜種分離子存在，在較早代的植物中幾乎不包括來(lái)源于隨機(jī)雜交的植物。通過(guò)純系栽培變種已經(jīng)將大部分當(dāng)?shù)仄贩N轉(zhuǎn)移到先進(jìn)的農(nóng)業(yè)中。中等水平或高水平的遺傳多樣性成為剩余當(dāng)?shù)仄贩N的特性。最初、″現(xiàn)代大麥″(modernbarley)栽培變種代表來(lái)自當(dāng)?shù)仄贩N的選擇物。后來(lái)他們來(lái)源于確定的純系，例如不同地理起源的那些純系之間的逐次循環(huán)雜交。最后導(dǎo)致在許多，也可能是所有先進(jìn)農(nóng)業(yè)中遺傳堿基明顯變窄。和當(dāng)?shù)仄贩N相比，現(xiàn)代大麥栽培變種具有許多改進(jìn)的特性(Nevo1992andvonBothmeretal.，)，例如，但不是限于(i)隱蔽和裸露的顆粒(ii)種子休眠(iii)抗病性(iv)賴氨酸及其他氨基酸比例(v)蛋白含量(vi)氮含量(vii)碳水化合物組成(viii)大麥醇溶蛋白模式因此在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，大麥植物是包含的LOX-1活性少于對(duì)應(yīng)野生型大麥植物的LOX-1活性的1％的修飾的現(xiàn)代大麥栽培變種。因此在這個(gè)實(shí)施例中，大麥植物優(yōu)選不是大麥當(dāng)?shù)仄贩N。本發(fā)明涉及包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的LOX-1活性的5％，優(yōu)選小于4％，更優(yōu)選小于3％，更加優(yōu)選小于2％，更優(yōu)選小于1％的大麥植物和其部分。包含小于1％的LOX-1活性的本發(fā)明的大麥植物在這里也被稱為″LOX-1無(wú)效大麥植物″。大麥植物可以是任何適當(dāng)形式。例如本發(fā)明的大麥植物可以是有生活力的大麥植物、干燥的植物、均質(zhì)化處理的植物，例如磨碎的大麥顆粒。植物可以是成熟植物、胚、萌發(fā)的顆粒、麥芽顆粒等等。大麥植物部分可以是該植物的任何適當(dāng)?shù)牟糠?，例如顆粒、胚、葉、莖、根、花或其部分。例如，小部分可以顆粒、胚、葉、莖、根或花的一部分。大麥植物部分也可以是勻漿或磨碎的大麥植物或顆粒的小部分。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，大麥植物部分可以是所述大麥植物的細(xì)胞，優(yōu)選是那些在體外組織培養(yǎng)中能繁殖的活細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，LOX-1無(wú)效大麥植物包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物活性的5％、優(yōu)選小于3％，更優(yōu)選小于1％，優(yōu)選小于0.5％，更優(yōu)選小于0.1％。可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒ù_定活性，但是優(yōu)選使用下文實(shí)施例1中的方法確定活性。在本發(fā)明的一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施例中，LOX-1無(wú)效大麥植物基本上沒(méi)有LOX-1活性，更優(yōu)選根本沒(méi)有LOX-1活性?！寤旧蠜](méi)有LOX-1活性″指使用下文描述的LOX-1活性測(cè)定法時(shí)沒(méi)有可檢測(cè)的LOX-1活性。例如，LOX-1無(wú)效大麥幾乎缺乏LOX-1活性可能是所述大麥包含不起作用的LOX-1蛋白質(zhì)，例如突變的LOX-1蛋白質(zhì)的結(jié)果。但是，與野生型大麥植物相比，LOX-1無(wú)效大麥僅包含微乎其微的LOX-1蛋白質(zhì)，更優(yōu)選不包含LOX-1蛋白質(zhì)，例如包含小于5％、優(yōu)選小于3％，更優(yōu)選小于1％，優(yōu)選小于0.5％，更優(yōu)選小于0.1％的LOX-1蛋白質(zhì)。更優(yōu)選地，LOX-1無(wú)效大麥植物基本上不包含LOX-1蛋白質(zhì)，最優(yōu)選根本不包含LOX-1蛋白質(zhì)。″基本上沒(méi)有LOX-1蛋白質(zhì)″指不包括可檢測(cè)的LOX-1蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的任何合適的方法來(lái)檢測(cè)LOX-1蛋白質(zhì)，但是優(yōu)選使用通過(guò)LOX-1特異性抗體檢測(cè)LOX-1蛋白質(zhì)的方法來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。例如，所述方法可以是Western印跡或ELISA。所述的特異性抗體可以是單克隆或多克隆抗體，但是優(yōu)選識(shí)別LOX-1蛋白質(zhì)內(nèi)的幾個(gè)不同表位的多克隆抗體。例如，也可以通過(guò)確定LOX-1活性的方法、檢測(cè)編碼LOX-1的基因中的突變的方法或檢測(cè)LOX-1基因表達(dá)的方法間接檢測(cè)LOX-1蛋白質(zhì)。例如，可以通過(guò)對(duì)編碼LOX-1的基因進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)所述基因中的突變。例如，通過(guò)Nothern印跡或RT-PCR可以檢測(cè)LOX-1基因的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，使用本公開(kāi)文本的實(shí)施例4中列出的方法來(lái)檢測(cè)LOX-1蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)″LOX-1蛋白質(zhì)″包括[SEQIDNO3]或[SEQIDNO7]中列出的全長(zhǎng)大麥LOX-1蛋白質(zhì)或其功能同系物。LOX-1的活性部位位于LOX-1的C末端部分。特別是與LOX-1的活性相關(guān)的跨越氨基酸殘基520-862的區(qū)域或其部分。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，LOX-1無(wú)效大麥優(yōu)選包含編碼突變體形式LOX-1的基因，其中突變體形式的LOX-1缺乏LOX-1氨基酸520-862中的部分或全部。所述突變體LOX-1也可以缺乏存在于野生型LOX-1中的其他的氨基酸殘基。因此，LOX-1無(wú)效大麥可以包含沒(méi)有功能的截短形式的LOX-1，例如N-末端或C末端截短形式。所述截短形式優(yōu)選包含不超過(guò)800個(gè)、更優(yōu)選不超過(guò)750個(gè)、更加優(yōu)選不超過(guò)700個(gè)，更優(yōu)選不超過(guò)690個(gè)、更加優(yōu)選不超過(guò)680個(gè)、更加優(yōu)選不超過(guò)670個(gè)的LOX-1連續(xù)氨基酸，例如包含不超過(guò)665個(gè)、不超過(guò)650個(gè)、不超過(guò)600個(gè)、不超過(guò)550個(gè)、不超過(guò)500個(gè)、不超過(guò)450個(gè)、不超過(guò)425個(gè)、不超過(guò)399個(gè)的[SEQIDNO3]的LOX-1的連續(xù)氨基酸。所述截短形式優(yōu)選僅包含LOX-1的N-末端片段。所述截短形式優(yōu)選包含最多800個(gè)、更優(yōu)選最多750個(gè)、更加優(yōu)選最多700個(gè)，更優(yōu)選最多690個(gè)、更加優(yōu)選最多680個(gè)、更加優(yōu)選最多670個(gè)、更加優(yōu)選最多665個(gè)的[SEQIDNO3]的N-末端氨基酸，例如包含不超過(guò)665個(gè)、不超過(guò)650個(gè)、不超過(guò)600個(gè)、例如最多550個(gè)、最多500個(gè)、最多450個(gè)、最多425個(gè)、最多399個(gè)的[SEQIDNO3]的N-末端氨基酸。在一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施例中，截短形式可以由[SEQIDNO3]的1-665位氨基酸組成。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，大麥植物包含能轉(zhuǎn)錄成編碼LOX-1的mRNA的基因，其中所述mRNA在野生型LOX-1mRNA的終止密碼子的上游包含無(wú)義密碼子或終止密碼子。這種無(wú)義密碼子在這里被命名為早熟無(wú)義密碼子。所有轉(zhuǎn)錄成編碼所述植物的LOX-1的mRNA的基因都包含早熟無(wú)義密碼子或終止密碼子是優(yōu)選的。無(wú)義密碼子或終止密碼子優(yōu)選位于起始密碼子下游的最多800個(gè)、更優(yōu)選最多750個(gè)、更加優(yōu)選最多700個(gè)，更優(yōu)選最多690個(gè)、更加優(yōu)選最多680個(gè)、更加優(yōu)選最多670個(gè)、更加優(yōu)選最多665個(gè)密碼子中。[SEQIDNO1]或[SEQIDNO5]中給出了編碼LOX-1的野生型基因組DNA的序列。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，大麥植物包含編碼LOX-1的基因，從所述基因轉(zhuǎn)錄的前mRNA包含相當(dāng)于[SEQIDNO2]的核糖核酸序列。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，大麥植物包含編碼突變LOX-1的基因，所述基因在至少一個(gè)拼接位點(diǎn)，例如1、2、3個(gè)拼接位點(diǎn)中包含至少一個(gè)突變，例如1，2、3、4、5個(gè)突變。所述突變優(yōu)選導(dǎo)致至少一個(gè)所述拼接位點(diǎn)無(wú)功能。因此從這種基因轉(zhuǎn)錄的mRNA將由于異常拼接而變得不正常。因此，從本發(fā)明的LOX-1無(wú)效大麥植物的LOX-1基因轉(zhuǎn)錄的mRNA優(yōu)選不編碼蛋白質(zhì)或編碼僅包含LOX-1N-末端的蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)可以包含由不是來(lái)源于LOX-1基因的異常mRNA編碼的其他序列。在這里，LOX-1的N-末端包含氨基酸1到氨基酸N，其中N是2-800，更優(yōu)選2-750，更優(yōu)選2-700，更優(yōu)選2-650，更優(yōu)選2-600，更優(yōu)選2-550，更優(yōu)選2-500，更優(yōu)選2-450，更優(yōu)選2-400，更優(yōu)選2-378范圍內(nèi)的整數(shù)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，大麥植物包含編碼突變LOX-1的基因，其中所述基因在拼接位點(diǎn)具有一個(gè)突變，導(dǎo)致mRNA編碼由[SEQIDNO3]的氨基酸1-378，以及不是來(lái)源于LOX-1的另外氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。所述LOX-1突變體優(yōu)選由[SEQIDNO8]中列出的序列組成。在本發(fā)明的一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施例中，編碼LOX-1無(wú)效大麥植物的LOX-1突變體的基因包含無(wú)義突變，所述突變相當(dāng)于[SEQIDNO1]的位點(diǎn)3574的G→A替換。更優(yōu)選的LOX-1無(wú)效大麥植物是被命名為D112的植物，該植物在美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)(ATCC)的保藏號(hào)是No.PTA-5487。在本發(fā)明的另一個(gè)非常優(yōu)選的實(shí)施例中，編碼LOX-1無(wú)效大麥植物的LOX-1的基因包含無(wú)功能的內(nèi)含子3供體拼接位點(diǎn)。因此所述植物的LOX-1mRNA編碼包含LOX-1的氨基酸1-378和來(lái)自內(nèi)含子3的另外氨基酸的包含在[SEQIDNO8]中的蛋白質(zhì)。更優(yōu)選的LOX-1無(wú)效大麥植物是被命名為A618的植物，該植物在美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)(ATCC)的保藏號(hào)是No.PTA-5584。本發(fā)明的大麥植物也可以是LOX無(wú)效大麥植物的子代。因此，大麥植物可以是被命名為D112的具有ATCC保藏號(hào)No.PTA-5487或被命名為A618的具有ATCC保藏號(hào)No.PTA-5584的植物的子代。采用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知的任何適當(dāng)方法可以制備本發(fā)明的大麥植物，優(yōu)選通過(guò)下文列出的方法中的一種來(lái)制備(例如，參見(jiàn)6.2″制備LOX-1無(wú)效大麥″)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的LOX-1無(wú)效大麥植物優(yōu)選具有可與野生型大麥相比較的植物生長(zhǎng)生理學(xué)和谷物發(fā)育。因此LOX-1無(wú)效大麥植物在株高、每株植物的分蘗數(shù)，開(kāi)花的起始和/或每一個(gè)穗的谷物數(shù)目方面與野生型大麥相似是優(yōu)選的。提供LOX-1無(wú)效大麥植物也是本發(fā)明的一個(gè)方面，其中所述植物的特點(diǎn)在于(i)具有增強(qiáng)的抗病性；或(ii)產(chǎn)生真菌毒素的潛能降低；或(iii)包含供組織培養(yǎng)使用的可再生細(xì)胞；或(iv)(i)到(iii)的特性的任何組合。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，大麥植物是附帶條件為所述大麥植物在內(nèi)含子5的拼接供體部位不攜帶G突變的LOX-1無(wú)效大麥植物。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案也涉及從附帶條件為所述大麥植物在內(nèi)含子5的拼接供體部位不攜帶G突變的LOX-1無(wú)效大麥植物或其部分制備的植物產(chǎn)品，例如麥芽、麥芽汁、發(fā)酵或非發(fā)酵飲料、啤酒、食物或飼料產(chǎn)品。例如，所述G相當(dāng)于SEQID1的位點(diǎn)2968上的G。通過(guò)采用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法從植物產(chǎn)品分離DNA并鑒定存在或不存在所述突變可以確定所述植物產(chǎn)品是否是從具有給定突變的大麥植物制備的。例如，可以通過(guò)冷凍干燥、在含水緩沖液中的重懸浮、氯仿/異戊醇抽提，以及隨后的乙醇沉淀從麥芽汁、啤酒或另外的飲料中分離DNA。例如可以用與Hirota等在WO2004/085652中的描述類似的方式鑒定內(nèi)含子5的拼接供體部位的G突變。6.2制備LOX-1無(wú)效大麥采用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知的任何適當(dāng)方法可以制備本發(fā)明的大麥植物。優(yōu)選通過(guò)包含誘變處理大麥植物或其部分，例如大麥顆粒的步驟的方法來(lái)制備本發(fā)明的大麥植物，其中誘變處理步驟后對(duì)大麥植物進(jìn)行篩選和選擇，以挑選出LOX-1活性小于5％的植物。有趣地是，本發(fā)明一方面涉及效率非常高的新篩選方法，例如顯著優(yōu)于Douma等在WO02/053721中的描述的篩選方法。新的篩選方法允許重現(xiàn)性地鑒定沒(méi)有LOX-1活性或有極低LOX-1活性的大麥植物。這種新篩選法包括從誘變處理的大麥獲取顆粒或其部分，例如胚，以及確定所述顆?；蚱洳糠种械腖OX-1活性。因此，提供制備包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的LOX-1活性的5％的大麥植物的方法是本發(fā)明的目標(biāo)，它包括步驟(i)確定野生型大麥顆?；蚱洳糠值腖OX-1活性；和(ii)誘變處理大麥植物和/或大麥細(xì)胞和/或大麥組織和/或大麥顆粒和/或大麥胚，從而獲得M0代大麥；和(iii)繁殖所述誘變處理的大麥植物、顆粒和/或胚至少2代，獲得Mx代大麥植物，其中X是≥2的整數(shù)；和(iv)從所述Mx大麥植物獲取顆粒或其部分；和(v)確定所述顆?；蚱洳糠值腖OX-1活性；和(vi)選擇誘變處理的顆?；蚱洳糠值腖OX-1活性小于野生型顆?；蚱洳糠值腖OX-1活性的5％的植物；從而獲取包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的LOX-1活性的5％的大麥植物。上述列表中的步驟(ii)涉及誘變處理從由大麥細(xì)胞、大麥組織、大麥顆粒和大麥胚組成的組中選擇出來(lái)的生活物質(zhì)(livingmaterial)，優(yōu)選從由大麥植物、大麥顆粒和大麥胚組成的組中選擇出來(lái)的生活物質(zhì)，更優(yōu)選從大麥顆粒中選擇出來(lái)的生活物質(zhì)。用確定野生型大麥顆粒的LOX-1活性時(shí)所用材料的同類材料來(lái)確定誘變處理顆粒的LOX-1活性是優(yōu)選的，即步驟(i)的大麥顆粒或其部分是步驟(iv)中提到的大麥顆?；蚱洳糠值耐愂莾?yōu)選的。舉例來(lái)說(shuō)，如果在野生型大麥的胚中確定野生型大麥的LOX-1活性，那么步驟(iv)優(yōu)選包括確定誘變處理的大麥植物的胚中的LOX-1活性。可以通過(guò)任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄍ瓿烧T變。在一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)用誘變處理制劑溫育大麥植物或其部分，例如大麥顆?；騺?lái)自大麥的單獨(dú)的細(xì)胞來(lái)完成誘變。所述制劑為本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知，例如不限于疊氮化鈉(NaN3)、乙基甲磺酸鹽(EMS)、疊氮丙三醇(AG，3-疊氮基-1，2-丙二醇)、甲基亞硝基脲(MNU)和順丁烯二酰肼(MH)。在另一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)照射，例如通過(guò)UV照射大麥植物或其部分，例如顆粒來(lái)完成誘變。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例中，依照下文6.4″化學(xué)誘變″中列出的任何方法來(lái)完成誘變。在實(shí)施例1中給出了適當(dāng)誘變規(guī)程的非限制例子。優(yōu)選利用篩選M3大麥時(shí)，使想要的突變體的期望頻率達(dá)到每10,000谷物顆粒最少0.5，例如0.5-5，例如0.9-2.3的方式完成誘變。在優(yōu)選實(shí)施例中，對(duì)大麥顆粒實(shí)施誘變。誘變處理的顆粒被命名為M0代(也參見(jiàn)圖1A)。在誘變之后，挑選出包含小于5％，優(yōu)選小于1％的LOX-1活性的大麥植物或其部分?？梢砸勒毡绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知的任何適當(dāng)方法完成選擇。優(yōu)選地，選擇包含從大麥植物，例如大麥顆粒獲取樣品，確定所述樣品中的LOX-1活性和選擇植物，其中所述樣品具有的LOX-1活性小于野生型大麥植物的LOX-1活性的5％，優(yōu)選小于1％?？梢詮乃鲋参锏娜魏芜m當(dāng)部分獲取樣品。但是，樣品優(yōu)選取自顆粒，更優(yōu)選取自顆粒的胚組織，樣品更優(yōu)選由顆粒的胚組織組成。通常，在確定LOX-1活性之前，必須使用任何適當(dāng)?shù)姆椒▽悠穭蚧?。在?yōu)選實(shí)施例中，樣品取自Mx代顆粒，其中x是≥2的整數(shù)，x優(yōu)選是2-10范圍內(nèi)的整數(shù)，更優(yōu)選是3-8范圍內(nèi)的整數(shù)。在非常優(yōu)選的實(shí)施例中，確定M3顆?；騺?lái)源于顆粒的樣品的LOX-1活性。在那個(gè)實(shí)施例中，栽培誘變處理的大麥顆粒(M0代)獲取大麥植物是優(yōu)選的，雜交該大麥植物可獲取顆粒M1。重復(fù)這一過(guò)程直到得到M3顆粒(參見(jiàn)圖1A)。使用任何適當(dāng)?shù)臏y(cè)定方法，優(yōu)選通過(guò)下文列出的方法中的一種，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)LOX-1活性的確定。特別地，優(yōu)選監(jiān)測(cè)LOX-1將亞油酸雙氧化成9-HPODE的測(cè)定方法。通常，測(cè)定(assaying)因此涉及步驟(i)提供從大麥顆粒或其部分制備的樣品；和(ii)提供亞油酸；和(iii)用所述亞油酸溫育所述樣品；和(iv)檢測(cè)亞油酸雙氧化成9-HPODE?？芍苯踊蜷g接完成檢測(cè)。本發(fā)明可以使用任何適當(dāng)?shù)臋z測(cè)方法。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中檢測(cè)亞油酸氫過(guò)氧化物。例如，可以通過(guò)將所述亞油酸氫過(guò)氧化物(hydroperoxides)的降解與形成可檢測(cè)化合物的氧化反應(yīng)偶聯(lián)來(lái)檢測(cè)亞油酸氫過(guò)氧化物。例如可以按照實(shí)施例1的描述來(lái)實(shí)施這一過(guò)程。在另一個(gè)實(shí)施例中，例如，通過(guò)實(shí)施例9中描寫(xiě)的分光光度分析法，HPLC可直接檢測(cè)9-HPODE。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，通過(guò)確定來(lái)自大麥顆粒的樣品中的9-HPODE的量來(lái)簡(jiǎn)單確定LOX-1活性。通過(guò)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知的任何適當(dāng)方法，例如實(shí)施例9中列出的方法可以完成這一過(guò)程。在什么pH條件下完成對(duì)LOX-1活性的確定很重要。優(yōu)選在允許LOX-1活性高，但只允許LOX-2活性低的pH條件下完成所述確定。因此，優(yōu)選在3-6.5的pH范圍內(nèi)，例如3-4的pH范圍內(nèi)，4-5的pH范圍內(nèi)，5-6的pH范圍內(nèi)，6-6.5的pH范圍內(nèi)進(jìn)行LOX活性確定。pH優(yōu)選是大約3，例如大約3.5，大約4，大約4.5，大約5，大約5.5，大約6，大約6.5，大約7。也優(yōu)選在適當(dāng)?shù)膒H，例如在3-6.5的pH范圍內(nèi)，例如3-4的pH范圍內(nèi)，4-5的pH范圍內(nèi)，5-6的pH范圍內(nèi)，6-6.5的pH范圍內(nèi)制備所述樣品。pH優(yōu)選是大約3，例如大約3.5，大約4，大約4.5，大約5，大約5.5，大約6，大約6.5，大約7。在下文的6.5″選擇大麥突變體″部分中描述了依照本發(fā)明選擇大麥植物的優(yōu)選方法。在實(shí)施例1中給出了確定LOX-1活性的優(yōu)選實(shí)例。這種選擇方法適合于微滴定板分析程序或允許快速篩選許多樣品的其他已知的高通量重復(fù)測(cè)定方式。優(yōu)選分析至少5,000株、例如至少7,500株、例如至少10,000株、例如至少15,000株誘變處理的大麥植物的LOX-1活性。在挑選出有用的具有小于5％LOX-1活性的大麥植物之后，可以隨意實(shí)施一種或多種另外的篩選。例如可以更進(jìn)一步地繁殖選擇的突變體，并再一次篩選后代的LOX-1活性。在挑選出有用的大麥植物之后，可以使這些植物繁殖，例如常規(guī)繁殖。下文(6.6″植物育種″部分和6.7″大麥雜交″部分)中描述了繁殖方法。但是，也可以用其他方法，例如導(dǎo)致LOX-1轉(zhuǎn)錄和/或翻譯降低的方法來(lái)制備本發(fā)明的大麥植物。因此，用包含操作性連接的在大麥植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子部分，DNA序列和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域的核酸序列轉(zhuǎn)化大麥植物可以制備LOX-1無(wú)效大麥植物，其中所述DNA序列的表達(dá)通過(guò)下列機(jī)制降低LOX-1編碼基因的表達(dá)(i)反義沉默；或(ii)共抑制沉默；或(iii)RNA干擾。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)涉及用能降低LOX-1編碼基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的核酸序列，例如包含反義LOX-1序列的核酸序列轉(zhuǎn)化大麥植物的方法，來(lái)制備本發(fā)明的大麥植物。例如所述反義序列可以是[SEQIDNO1]的反義序列或其片段。反義序列應(yīng)該操作性地與在大麥植物中表達(dá)的基因的啟動(dòng)子序列連接。在下文的實(shí)施例16中列出了這種方法的非限制性例子?？梢杂萌魏斡杏玫姆椒?，例如根癌土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移或粒子轟擊介導(dǎo)的DNA吸收來(lái)轉(zhuǎn)化大麥植物。通過(guò)包含下列步驟的方法制備的LOX-1無(wú)效大麥植物也在本發(fā)明的范圍內(nèi)(i)誘變處理大麥植物和/或大麥顆粒和/或大麥胚；和(ii)確定LOX-1基因中存在或缺少突變，其中所述突變導(dǎo)致LOX-1基因編碼包含SEQIDNO3中所列出的序列的不到700個(gè)連續(xù)氨基酸的LOX-1多肽形式；所述多肽優(yōu)選是包含[SEQIDNO3]的最多700個(gè)N-末端氨基酸的LOX-1的N-末端片段，(iii)選擇攜帶所述突變的植物，從而獲取包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的LOX-1活性的5％的大麥植物。更優(yōu)選地，所述突變可以導(dǎo)致LOX-1基因編碼上述任何一個(gè)LOX-1N-末端片段?？梢允褂萌魏芜m當(dāng)?shù)姆椒?，例如，?duì)LOX-1基因進(jìn)行測(cè)序或單核苷酸多態(tài)性(SNP)分析來(lái)檢測(cè)所述突變。在下文的實(shí)施例13和實(shí)施例14中描述了怎樣實(shí)施SNP分析的實(shí)例。一旦制備出在LOX-1基因中具有特殊突變(例如，任何上述突變)的LOX-1無(wú)效大麥植物，就可以通過(guò)本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的常規(guī)繁育方法來(lái)產(chǎn)生具有相同突變的另外的大麥植物。例如所述LOX-1無(wú)效大麥植物可以回交到另一個(gè)大麥栽培變種環(huán)境中。圖9公開(kāi)了這種回交的圖解實(shí)例。6.3組合物本發(fā)明也涉及包含如上所述的大麥植物或其部分的組合物，或者從所述大麥植物或其部分制備的組合物。因?yàn)樗龃篼溨参锞哂胁坏?％、優(yōu)選具有不到1％的LOX-1活性，因此包含所述大麥植物或其部分或由所述大麥植物或其部分制備的組合物通常包含極低水平的T2N和潛在T2N。下文在這里描述了包含LOX-1無(wú)效大麥或由LOX-1無(wú)效大麥制備的有用組合物的實(shí)例。所述組合物與包含野生型大麥植物或由野生型大麥植物制備的相似組合物相比具有下列特點(diǎn)是優(yōu)選的(i)小于30％、優(yōu)選小于20％、更優(yōu)選小于10％、更加優(yōu)選小于5％、例如小于2％、小于1％的T2N；和/或(ii)小于30％、優(yōu)選小于20％、更優(yōu)選小于10％、更加優(yōu)選小于5％、例如小于2％、小于1％的潛在T2N；本發(fā)明一方面涉及與野生型顆粒相比包含的LOX-1活性小于1％的大麥顆粒。顆粒優(yōu)選不包含LOX-1活性。本發(fā)明也涉及包含所述顆粒的組合物和從所述顆粒制備的組合物。一方面，本發(fā)明涉及通過(guò)發(fā)麥芽從LOX-1無(wú)效顆粒制備的麥芽組合物。應(yīng)理解術(shù)語(yǔ)″發(fā)麥芽″指已浸泡的大麥顆粒在可控的環(huán)境條件下萌發(fā)(例如圖11中的步驟2和3)。發(fā)麥芽(malting)是受控的浸泡和萌發(fā)過(guò)程，其中萌發(fā)后對(duì)大麥顆粒進(jìn)行干燥。這一作業(yè)順序?qū)铣稍S多使谷物顆粒改良(modification)的酶很重要，其中谷物顆粒改良主要是解聚死胚乳細(xì)胞的細(xì)胞壁和動(dòng)員顆粒營(yíng)養(yǎng)素的過(guò)程。在隨后的干燥過(guò)程中，由于化學(xué)褐變反應(yīng)而產(chǎn)生風(fēng)味和著色。雖然麥芽的主要用途是生產(chǎn)飲料，但是它也可以用于其他工業(yè)過(guò)程，例如作為焙烤食品工業(yè)的酶來(lái)源、或者作為食品工業(yè)的調(diào)味品和著色劑、作為麥芽或麥芽粉、間接地作為麥芽糖漿等等。一方面，本發(fā)明涉及生產(chǎn)所述麥芽組合物的方法。該方法優(yōu)選包含步驟(i)提供LOX-1無(wú)效大麥顆粒；(ii)浸泡所述顆粒；(iii)在預(yù)先確定的條件下使浸泡的顆粒萌發(fā)；(iv)干燥所述萌發(fā)的顆粒；從而產(chǎn)生LOX-1活性低或沒(méi)有LOX-1活性的麥芽組合物。例如可以通過(guò)Hoseney(1994)中描述的任何方法來(lái)制備麥芽。但是，產(chǎn)生麥芽的任何其他合適的方法，例如產(chǎn)生特色麥芽的方法，包括但不限于焙燒(roasting)麥芽的方法也可以用于本發(fā)明。實(shí)施例6中描述了一個(gè)非限制性實(shí)例。另一方面，本發(fā)明涉及從麥芽組合物制備的麥芽汁組合物，其中麥芽組合物是從LOX-1無(wú)效顆粒制備的。可以從只有LOX-1無(wú)效顆粒的顆?；虬渌w粒的混合物制備所述麥芽。本發(fā)明也涉及使用LOX-1無(wú)效大麥或其部分制備的單獨(dú)的或與其他組分混合的麥芽汁組合物。所述麥芽汁可以是第一和/或第二和/或更進(jìn)一步的麥芽汁。通常麥芽汁組合物已經(jīng)有高含量的氨基氮和發(fā)酵性糖，主要是麥芽糖。在圖11中，步驟4到6舉例說(shuō)明了從麥芽制備麥芽汁的常見(jiàn)方法。通常，通過(guò)用水溫育麥芽，即通過(guò)糖化制備麥芽汁。在糖化期間，麥芽/水組合物中可以補(bǔ)充另外的富含糖類的組合物，例如大麥、玉蜀黍或稻添加劑。未萌發(fā)的谷類添加劑通常不包含活性酶，因此依靠麥芽或外來(lái)酶來(lái)提供糖轉(zhuǎn)化所必需的酶。通常，麥芽汁生產(chǎn)過(guò)程的第一步是碾磨麥芽，其目的在于讓水在糖化期間可以進(jìn)入谷物顆粒，而這基本上是用酶解聚底物的發(fā)麥芽過(guò)程的延伸。在糖化期間，用液體部分，例如水溫育磨碎的麥芽。溫度可以保持恒定(等溫糖化)或逐漸升高。兩種情況下，在通過(guò)過(guò)濾將液體部分分離成麥芽汁和被命名為酒糟的剩余固體顆粒之前，發(fā)麥芽和糖化過(guò)程中產(chǎn)生的可溶性物質(zhì)已經(jīng)被萃取到所述液體部分。這種麥芽汁也可以表示為初次麥芽汁。過(guò)濾后可以獲取第二麥芽汁。通過(guò)重復(fù)這一過(guò)程可以制備更進(jìn)一步的麥芽汁。在Hoseney(上文)中描述了制備麥芽汁的適當(dāng)工序的非限制性實(shí)例。也可以通過(guò)用一種或多種適當(dāng)?shù)拿?，例如酶組合物或酶混合劑組合物，例如Ultraflo或Cereflo(Novozymes)溫育LOX-1無(wú)效大麥植物或其部分，例如未萌發(fā)的LOX-1無(wú)效大麥植物或其部分來(lái)制備麥芽汁組合物。也可以使用麥芽混合物和未萌發(fā)的大麥植物或其部分，通過(guò)在所述制備期間隨意添加一種或多種適當(dāng)?shù)拿竵?lái)制備麥芽汁組合物。本發(fā)明也涉及包含LOX-1無(wú)效大麥植物或其部分的食物組合物、飼料組合物或香原料組合物。例如，食物組合物可以包括，但不局限于萌發(fā)和未萌發(fā)的大麥顆粒、大麥粉、面包、粥、包含大麥的谷類混合物、保健品、例如包含大麥的飲料、大麥糖漿，以及薄片狀、磨碎的或擠壓的大麥組合物。例如，飼料組合物包括包含大麥顆粒和/或粗粉的組合物。下面將在這里描述香原料組合物。本發(fā)明也涉及本發(fā)明的組合物的混合物。例如本發(fā)明一方面涉及通過(guò)混合(i)包含大麥植物或其部分的組合物，其包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的LOX-1活性的5％和(ii)從LOX-1無(wú)效顆粒制備的麥芽組合物制備得到的組合物。在優(yōu)選方面，本發(fā)明涉及飲料、更優(yōu)選的涉及麥芽衍生飲料、更加優(yōu)選的涉及醇飲料，例如具有穩(wěn)定感官品質(zhì)的啤酒，其中所述飲料是使用LOX-1無(wú)效大麥或其部分制備的。因此，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，優(yōu)選通過(guò)單獨(dú)或與其他組分結(jié)合發(fā)酵LOX-1無(wú)效大麥或其部分或其提取物，例如發(fā)酵用麥芽生產(chǎn)的麥芽汁來(lái)制備飲料，其中麥芽是由LOX-1無(wú)效大麥產(chǎn)生的。但是，在本發(fā)明的其他實(shí)施例中，飲料是非發(fā)酵飲料，例如麥芽汁。從未萌發(fā)的大麥植物或其部分制備所述飲料也包括在本發(fā)明中。但是優(yōu)選從麥芽組合物制備所述飲料，其中麥芽組合物是從LOX-1無(wú)效大麥顆粒制備的。所述飲料更優(yōu)選是啤酒?？梢允潜绢I(lǐng)域熟練技術(shù)人員所知的任何一種啤酒。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，啤酒是貯藏(lager)啤酒。優(yōu)選使用包含萌發(fā)的LOX-1無(wú)效大麥的麥芽組合物釀造啤酒。但是，麥芽組合物也可以包含其他組分，例如其他萌發(fā)的或未萌發(fā)的谷類，例如野生型大麥、LOX-1無(wú)效大麥、小麥和/或黑麥，未萌發(fā)的包含糖的原材料或來(lái)源于萌發(fā)的或未萌發(fā)的原材料的組合物，例如糖漿組合物?！甯泄倨焚|(zhì)″指對(duì)嗅覺(jué)和味覺(jué)有吸引力的品質(zhì)。例如，經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的品嘗小組可以對(duì)他們進(jìn)行分析。所述的經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的品嘗小組進(jìn)行過(guò)識(shí)別醛，例如T2N異味的特別訓(xùn)練是優(yōu)選的。通常，品嘗小組將由3-30名成員組成，例如由5-15名成員組成。品嘗小組可以評(píng)估存在的各種風(fēng)味，例如異味、似紙的、氧化的、老化的和面包樣風(fēng)味。在下文的實(shí)施例6中描述了確定飲料″感官品質(zhì)″的方法。在優(yōu)選實(shí)施例中，穩(wěn)定的感官品質(zhì)至少部分是產(chǎn)生的T2N或潛在T2N低的結(jié)果。因此，提供使用大麥植物制造的飲料(例如啤酒)是本發(fā)明的目標(biāo)，其中飲料在儲(chǔ)藏至少1周，優(yōu)選至少2周，更優(yōu)選至少3周，更優(yōu)選至少4周，例如1-3個(gè)月，3-6個(gè)月，6-12個(gè)月，一年以上以后，與從野生型大麥制備的飲料相比優(yōu)選包含小于50％、優(yōu)選小于40％、更優(yōu)選小于35％、例如小于30％、小于20％、小于10％、例如優(yōu)選小于5％、小于2％、小于1％的T2N和/或潛在T2N。在15-40℃，優(yōu)選在30-37℃的溫度范圍，更優(yōu)選在37℃進(jìn)行儲(chǔ)藏。本發(fā)明的飲料在15-40℃，優(yōu)選在30-37℃的溫度范圍，更優(yōu)選在37℃儲(chǔ)藏至少1周，優(yōu)選至少2周，更優(yōu)選至少3周，更加優(yōu)選至少4周，例如1-3個(gè)月，3-6個(gè)月，6-12個(gè)月，一年以上以后優(yōu)選包含最多0.07、優(yōu)選最多0.06、更優(yōu)選最多0.05、更加優(yōu)選最多0.04，例如最多0.03ppb(10億(billon)分之幾)的游離T2N。該飲料優(yōu)選也包含1-10ppm(百萬(wàn)分之幾)、更優(yōu)選2-8ppm、更優(yōu)選3-7ppm、更加優(yōu)選4-6ppm的亞硫酸鹽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的飲料在37℃儲(chǔ)藏2周之后包含最多0.04、更優(yōu)選最多0.03，例如最多0.025ppb的游離T2N。在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，本發(fā)明的飲料在存在4-6ppm亞硫酸鹽的情況下，在37℃儲(chǔ)藏4周之后包含最多0.07、優(yōu)選最多0.06，更優(yōu)選最多0.05，更加優(yōu)選最多0.04，例如最多0.03ppb(10億分之幾)的游離T2N。本發(fā)明的飲料在15-25℃，例如大約20℃儲(chǔ)藏至少10個(gè)月后，與從除LOX-1無(wú)效大麥外的不同大麥制備的相似飲料相比具有較少的似紙味道是優(yōu)選的。優(yōu)選地，經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的品嘗小組評(píng)估，所述似紙味道小于90％、更優(yōu)選小于80％、例如小于70％。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及具有低水平的某些三羥基十八碳烯酸的飲料，例如啤酒，特別涉及具有低水平9，12，13-THOE的飲料。三羥基十八碳烯酸具有苦味(BaurandGrosch，1977andBauretal.，1977)，因此不受歡迎。因此，9，12，13-THOE的水平盡可能低是合乎需要的，優(yōu)選低于1.3ppm，例如低于1ppm。但是，麥芽衍生飲料(例如啤酒)中9，12，13-THOE的總濃度也依賴于用來(lái)制備所述具體飲料的麥芽的量。因此，通常，濃啤酒比淡些的啤酒含有更多的9，12，13-THOE，而且在更濃的啤酒中可以接受總水平更高的9，12，13-THOE。因此，與類似種類的正常啤酒相比，本發(fā)明的飲料優(yōu)選包含更低水平的9，12，13-THOE。通過(guò)使用制備所述飲料的LOX-1無(wú)效大麥可以獲取這種飲料。因此，與內(nèi)(internal)標(biāo)準(zhǔn)相比，本發(fā)明的優(yōu)選飲料包含低比例的9，12，13-THOE，其中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)可校正制備所述飲料中使用的麥芽的量。例如，所述標(biāo)準(zhǔn)可以是另一個(gè)三羥基十八碳烯酸。因此，保持各種三羥基十八碳烯酸(THAs)的比例不超出特定范圍，對(duì)飲料，例如啤酒的質(zhì)量很重要。令人驚訝地是，除低水平的T2N之外，LOX-1路徑的產(chǎn)物(參見(jiàn)圖1B)--從本發(fā)明的LOX-1無(wú)效大麥制備的飲料也具有極低水平的9，12，13-THOE(參見(jiàn)圖1C)，因此9，12，13-THA/9，10，13-THA的比例極低。因此，本發(fā)明一方面涉及具有穩(wěn)定感官品質(zhì)的飲料，例如啤酒，其中利用大麥植物或其部分，優(yōu)選LOX-1無(wú)效大麥制造所述飲料，所述飲料中9，12，13-THA與9，10，13-THA的比例最大是1.8，優(yōu)選最大是1.7，更優(yōu)選最大是1.6，更優(yōu)選最大是1.5，更加優(yōu)選最大是1.4。因此所述比例在0-1.8的范圍之內(nèi)，優(yōu)選在0-1.6的范圍之內(nèi)，例如在0-1.4的范圍之內(nèi)是非常優(yōu)選的。在一個(gè)實(shí)施例中，所述比例是大約1.3。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法，例如Hamber，1991中描寫(xiě)的氣相色譜-質(zhì)譜分析法可以確定飲料中9，12，13-THOE和9，10，13-THOE的量。所述THAs優(yōu)選是亞油酸轉(zhuǎn)化的oxylipins。有趣地是，利用本發(fā)明的大麥植物可以制備具有這種THA比例的飲料。優(yōu)選地，不使用除LOX-1無(wú)效大麥以外的其他大麥，例如不使用除從LOX-1無(wú)效大麥制備的麥芽以外的其他麥芽制備所述飲料。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，飲料包含(i)如上所述的9，12，13-THA/9，10，13-THA比例；和(ii)儲(chǔ)藏之后具有如上所述水平的游離T2N。在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及與相似的常規(guī)飲料相比，具有改進(jìn)的泡沫穩(wěn)定性的飲料，例如啤酒。例如，可以從LOX-1無(wú)效大麥或其部分，例如麥芽制備這種飲料。例如，可以按照BrautechnischeAnalysenmetoden，2002中的描述確定泡沫穩(wěn)定性。本發(fā)明也涉及制造所述飲料的方法。該方法優(yōu)選包含步驟(i)提供包含萌發(fā)的LOX-1無(wú)效顆粒的麥芽組合物；(ii)將所述麥芽組合物加工成飲料；從而獲取感官品質(zhì)穩(wěn)定的飲料。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，這種飲料是啤酒。在這種情況下，工藝步驟優(yōu)選包含通過(guò)，例如上述的任何方法從所述麥芽組合物制備麥芽汁，以及發(fā)酵所述麥芽汁。一般說(shuō)來(lái)，可以用萌發(fā)的和/或未萌發(fā)的大麥谷物制造醇飲料，例如啤酒。除酒花和酵母之外，麥芽也促成了啤酒的風(fēng)味和顏色。而且，麥芽作為發(fā)酵性糖和酶的來(lái)源起作用。啤酒制造一般步驟的簡(jiǎn)略圖顯示在圖11中，適當(dāng)?shù)拿劝l(fā)和釀造方法的例子的詳細(xì)描述可以在例如，Hoseney(上文)的近期出版物中找到。分析大麥、麥芽和啤酒產(chǎn)品的許多更新的方法已經(jīng)存在[例如，但不限于；AmericanAssociationofCerealChemist(1995)AmericanSocietyofBrewingChemists(1992)；EuropeanBreweryConvention(1998)；InstituteofBrewing(1997]。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到給定的啤酒廠使用了許多有顯著差異的具體過(guò)程，這些過(guò)程與當(dāng)?shù)氐南M(fèi)者喜好有關(guān)。本發(fā)明可以使用任何這種制造啤酒的方法。實(shí)施例6中描述了一個(gè)非限制性實(shí)例。例如，可以通過(guò)上述的任何方法獲取適合制備所述飲料，例如啤酒、麥芽飲料或非發(fā)酵麥芽汁的麥芽組合物?？梢詮乃鳆溠拷M合物制備麥芽汁，這一點(diǎn)上文已經(jīng)描述。從麥芽汁生產(chǎn)啤酒的第一步優(yōu)選涉及煮沸所述麥芽汁。在煮沸期間，可以添加其他組分，例如提供典型的苦啤酒和芳香啤酒特征的酒花。煮沸麥芽汁也會(huì)導(dǎo)致多酚和變性蛋白質(zhì)之間形成主要在隨后的麥芽汁冷卻階段沉淀的聚集物。在冷卻之后，麥芽汁被轉(zhuǎn)移到包含酵母的發(fā)酵罐中。所述酵母優(yōu)選是啤酒酵母、卡爾酵母(SaccharomycesCarlsbergensis)。麥芽汁可以發(fā)酵任何適當(dāng)時(shí)間，一般發(fā)酵1-100天。在持續(xù)幾天的發(fā)酵過(guò)程期間，糖被轉(zhuǎn)變成乙醇和CO2，同時(shí)伴隨有一些調(diào)味劑的發(fā)生。隨后可以更進(jìn)一步處理啤酒。一般要冷卻啤酒。也可以過(guò)濾和/或陳貯啤酒，陳貯(lagered)是產(chǎn)生令人愉快的芳香和風(fēng)味，以及較少泡沫(yeasty)的過(guò)程。最后可以在包裝(例如裝入瓶中或罐中)前，將啤酒巴氏滅菌或過(guò)濾啤酒。盡管在啤酒制造領(lǐng)域已經(jīng)取得進(jìn)步，但降低啤酒中T2N、T2N前體和潛在T2N水平是有益的。因此，仍然對(duì)新原材料有需求，特別是有助于成品啤酒產(chǎn)生較少異味的大麥和麥芽。因此提供這種大麥和麥芽是本發(fā)明的目標(biāo)。6.4化學(xué)誘變一方面，本發(fā)明基于，至少部分基于使用大麥顆粒的化學(xué)誘變，其中化學(xué)誘變是已知的隨機(jī)插入突變的方法?？梢允褂萌魏握T變處理化學(xué)制劑完成大誘變麥，但是優(yōu)選通過(guò)用NaN3處理顆粒，使幸存的顆粒萌發(fā)，然后分析子代植物來(lái)完成大麥誘變。由誘變處理的顆粒長(zhǎng)成的稱為M0的一代植物包含任何給定突變的雜合子嵌合體。在自花傳粉之后收集的子代稱為M1代，分離給定突變的雜合子和純合子(參照?qǐng)D1A和9)。用NaN3處理顆粒不等同于處理單個(gè)細(xì)胞，因?yàn)樘幚碇蟮念w粒將包含一些未突變細(xì)胞和具有DNA突變的多種細(xì)胞。因?yàn)槟切┎划a(chǎn)生種系的細(xì)胞譜系的突變可能丟失，因此目標(biāo)就是將誘變劑靶向那些發(fā)育為有助于產(chǎn)生M1代的再生組織的少數(shù)細(xì)胞。為了評(píng)價(jià)總的突變效率，白化(albino)嵌合體和白化植物分別被計(jì)算入M0和M1代。作為成活植物函數(shù)的記分突變體數(shù)給出了對(duì)突變效率的估計(jì)，而作為已處理種子函數(shù)的記分突變體數(shù)測(cè)量了突變效率和殺死的顆粒的組合。人們注意到事實(shí)上在每個(gè)基因表達(dá)步驟，細(xì)胞都具有可能緩和突變損害效果的質(zhì)量保證機(jī)制。真核生物中的一個(gè)較好的研究例子是被命名為NMD的無(wú)義介導(dǎo)的mRNA衰退，NMD防止合成潛在有害的截短的早熟蛋白質(zhì)(Maquat和Carmichael，2001)。在NMD中，通過(guò)終止密碼子相對(duì)于下游脫穩(wěn)定元件的位置已經(jīng)確定終止密碼子早熟。在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，他們被寬松地限定為mRNA序列，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，他們是在前mRNA拼接期間存放在外顯子-外顯子接合處的蛋白質(zhì)復(fù)合物。無(wú)義mRNAs怎樣降解和他們生產(chǎn)的蛋白質(zhì)怎樣定位是將來(lái)研究的領(lǐng)域。產(chǎn)生早熟終止(無(wú)義)密碼子(PTCs)的突變有時(shí)會(huì)增加那些跳過(guò)有害突變的替代拼接轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的水平，因此有可能補(bǔ)救蛋白質(zhì)的功能(MendellandDietz，2001)。因?yàn)檎J(rèn)為翻譯和RNA拼接發(fā)生在不同的細(xì)胞室，因此發(fā)現(xiàn)無(wú)義密碼子特異mRNA上調(diào)機(jī)制在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中獨(dú)立于拼接增強(qiáng)子破壞起作用是矛盾的。但是，在當(dāng)前發(fā)明的大麥植物和其他植物中都沒(méi)有觀察到這種機(jī)制。NMD、PCT等等在植物育種環(huán)境中具有特殊的意義，因?yàn)檫@種現(xiàn)象會(huì)增加待篩選的顆?；蚬任镱w粒的數(shù)目以鑒定出有價(jià)值的新特性。6.5大麥突變體的選擇本發(fā)明一方面是提供LOX-1活性的篩選條件，在該條件下LOX-2的活性減弱。該方法基于待篩選的大麥組織的性質(zhì)和反應(yīng)條件可以增加來(lái)源于LOX-1酶的LOX活性和減弱來(lái)自LOX-2酶的LOX活性這一令人驚奇的發(fā)現(xiàn)。在Douma等的以WO02/053721A1公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT/IB01/00207中詳述的低LOX突變體的篩選使用了大麥葉尖的蛋白質(zhì)提取物，而且在pH7.5時(shí)確定酶活性，而當(dāng)前的公開(kāi)文本詳述了允許重復(fù)鑒定LOX無(wú)效大麥突變體的有利篩選參數(shù)。首先，篩選LOX-1活性時(shí)，使用大麥植物特異組織很重要。優(yōu)選地，所述組織包含該大麥顆粒，更優(yōu)選地包含大麥顆粒的胚。一般，對(duì)所述組織的提取物，即大麥顆?；虼篼溑叩奶崛∥镞M(jìn)行篩選。更優(yōu)選地，確定LOX-1活性的提取物包含干燥大麥顆粒的勻化胚組織，最優(yōu)選地，提取物由干燥大麥顆粒的勻化胚組織組成。這樣，僅僅是來(lái)源于LOX-2的邊緣活性有助于活性確定。第二，優(yōu)選在使丙二烯氧化物合酶失活的pH條件下完成LOX-1活性測(cè)定，這樣可以提供產(chǎn)量?jī)?yōu)良的HPODEs。6.6植物育種本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例的目標(biāo)是提供包含LOX-1無(wú)效特性的農(nóng)藝學(xué)有用大麥植物?？梢园艳r(nóng)作物發(fā)育看做僅始于引入新特性的延伸步驟。植物育種家的觀點(diǎn)認(rèn)為這一步驟通常產(chǎn)生與現(xiàn)在的市場(chǎng)品種相比，具有較少合乎需要的農(nóng)業(yè)性狀總體輪廓的植物。除LOX-1無(wú)效特性之外，在本領(lǐng)域產(chǎn)生商業(yè)麥芽大麥品種中要考慮其他重要因素，例如顆粒產(chǎn)量、顆粒大小及涉及萌發(fā)性能的其他參數(shù)。因?yàn)橐呀?jīng)證明許多這種特性--如果不是所有的這種特性處于遺傳控制下，因此提供現(xiàn)代的純合高產(chǎn)麥芽栽培變種是非常合乎需要的，其中的麥芽栽培變種是與當(dāng)前文本中公開(kāi)的LOX-1無(wú)效大麥植物雜交的結(jié)果。這種大麥植物的顆粒提供了沒(méi)有或僅有最低的將亞油酸轉(zhuǎn)化成9-HPODE能力的優(yōu)越的新原材料。因此大麥育種人員必須選擇和研制具有產(chǎn)生喪失LOX-1功能的優(yōu)良栽培變種特性的大麥植物?；蛘撸篼溣N人員可以利用本發(fā)明的植物進(jìn)行更進(jìn)一步的誘變以產(chǎn)生來(lái)源于LOX-1無(wú)效大麥的新栽培變種?？梢砸勒杖魏芜m當(dāng)?shù)姆桨阜敝潮景l(fā)明的大麥植物。6.7大麥雜交本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供包含LOX-1無(wú)效特性的農(nóng)藝學(xué)良種大麥植物。因此，本發(fā)明也涉及通過(guò)將第一親代大麥植物與第二親代大麥植物雜交產(chǎn)生LOX-1無(wú)效新大麥植物的方法，其中第一或第二植物是LOX-1無(wú)效大麥。另外，第一和第二親代大麥植株都可以來(lái)自LOX-1無(wú)效大麥品種。因此，任何這種使用LOX-1無(wú)效大麥品種的方法都是本發(fā)明的一部分自花授粉、回交、群體雜交等等。利用LOX-1無(wú)效大麥品種作為親代產(chǎn)生的所有植物都在本發(fā)明的范圍內(nèi)，包括那些從衍生于LOX-1無(wú)效大麥品種的品種發(fā)展得到的植物。LOX-1無(wú)效大麥還可以用于遺傳轉(zhuǎn)化，在這種情況下，外源DNA被導(dǎo)入LOX-1無(wú)效植物或植物組織，并在其中表達(dá)。本發(fā)明可以使用回交方法將突變大麥植物的LOX無(wú)效特性導(dǎo)入另一個(gè)品種，例如都是當(dāng)代高產(chǎn)麥芽大麥載培品種的cv.Scarlett或cv.Jersey中。在標(biāo)準(zhǔn)回交操作規(guī)程，有價(jià)值的原有(original)品種(回歸親本)與攜帶單個(gè)有意義的待轉(zhuǎn)移基因的第二品種(非回歸親本)雜交。接著再一次將這次雜交產(chǎn)生的LOX-1無(wú)效子代與回歸親本雜交，重復(fù)這一步驟直到獲取其中基本上全部的回歸親本特有特征都在轉(zhuǎn)換的植物中被恢復(fù)的大麥植物，除轉(zhuǎn)移的非回交親本的LOX-1無(wú)效特性的遺傳結(jié)構(gòu)(set-up)外。然后，最后的回交代自交可產(chǎn)生LOX-1無(wú)效特性的純種繁育子代(參照?qǐng)D9)。適當(dāng)?shù)幕貧w親本對(duì)成功的回交過(guò)程很重要，回交過(guò)程的目標(biāo)將LOX-1無(wú)效特性導(dǎo)入原有品種。為了完成這一過(guò)程，在基本保留來(lái)自原有品種的所有剩余特性時(shí)，用來(lái)自非回交親本的低LOX-1特性修飾回歸品種的遺傳結(jié)構(gòu)。雖然當(dāng)被轉(zhuǎn)移的特征是顯性等位基因時(shí)回交方法被簡(jiǎn)化，但是回交那些隱性(recessive)LOX-1無(wú)效特性是可能的，在這種情況下必須引入生化分析來(lái)評(píng)價(jià)想要的特征是否被轉(zhuǎn)移。一種加快植物育種過(guò)程的方法包含通過(guò)應(yīng)用組織培養(yǎng)和再生技術(shù)對(duì)所產(chǎn)生的突變體進(jìn)行初始倍增。因此，本發(fā)明另一個(gè)方面提供生長(zhǎng)和分化時(shí)產(chǎn)生具有LOX-1無(wú)效特性的大麥植物的細(xì)胞。例如育種可以涉及傳統(tǒng)雜交、制備可增殖的花藥衍生植物或利用小孢子培養(yǎng)。6.8LOX酶本發(fā)明的一個(gè)重要目標(biāo)是提供缺乏合成活性LOX-1酶能力的大麥植株。LOXs是具有單個(gè)非血紅素鐵因子的大單體蛋白質(zhì)。在http://www.rcsb.org/pdb對(duì)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢查顯示通過(guò)X-射線晶體衍射已經(jīng)確定幾個(gè)LOX酶的結(jié)構(gòu)。這些蛋白質(zhì)共有全部折疊和域結(jié)構(gòu)，每一個(gè)折疊和域結(jié)構(gòu)具有較小的N-末端八鏈β桶狀域和較大的主要由長(zhǎng)α螺旋組成的C末端域。鐵原子位于C末端域，在那里鐵原子被配位到組氨酸殘基和唯一的正好是異亮氨酸的多肽羧基末端上。蛋白質(zhì)表面的幾個(gè)通道通向鐵位點(diǎn)附近，推測(cè)這些通道為底物、多不飽和脂肪酸和分子氧到達(dá)活性部位提供了通路。因?yàn)辄S瓜類脂體LOX結(jié)合脂質(zhì)體和類脂體依賴于N-末端β桶的存在(Mayetal.，2000)，在通過(guò)鈣離子增強(qiáng)的過(guò)程中大豆LOX-1結(jié)合雙層膜(TatulianandSteczko，1998)，因此可以推測(cè)LOX酶結(jié)合脂質(zhì)雙層膜，而這很可能就是N-末端域的功能。確定LOX活性的方法，以及分離、特征鑒定和LOX催化作用的直接的下游產(chǎn)品的定量的方法本領(lǐng)域普通技術(shù)人員很容易得到。6.9LOX路徑產(chǎn)品在各種實(shí)施例中，本發(fā)明涉及形成鏈烴T2N的能力被阻斷的大麥植物或其產(chǎn)品。LOX酶通過(guò)順式-1，順式-4戊二烯系統(tǒng)催化不飽和脂肪酸雙氧化。在植物中，C18多不飽和脂肪酸亞油酸(18:2Δ9，12)和α亞麻酸(18:3Δ9，12，15)是主要的LOX底物。脂肪酸代謝的脂加氧酶路徑的起始于在?；湹腃-9或C-13位置添加分子氧產(chǎn)生對(duì)應(yīng)的9-和13-亞油酸或亞麻酸氫過(guò)氧化物。當(dāng)以亞油酸作底物時(shí)，可以形成9-或13-亞油酸(HPODEs)中的任何一種，而當(dāng)?shù)孜锸铅羴喡樗釙r(shí)，形成的產(chǎn)品是9-或13-氫過(guò)氧亞麻酸(HPOTEs)。在LOX路徑的氫過(guò)氧化物裂解酶支路中，隨后9-和13-氫過(guò)氧化物可以被切割成短鏈酮酸和醛(參照?qǐng)D1B)。值得注意的是9-HPODE可以被進(jìn)一步地代謝為9，12，13-THOE(參照?qǐng)D1C)，9，12，13-THOE是具有苦味的THOE(Bauretal.，1977；BaurandGrosch1977)。因此，LOX-1失活植物將形成比例不同于野生型植物中觀察到的比例的THOEs。已經(jīng)認(rèn)識(shí)到本發(fā)明包括影響LOX-1催化作用的下游代謝物的生產(chǎn)，其中下游代謝物不是作為L(zhǎng)OX-1催化反應(yīng)的直接產(chǎn)物而產(chǎn)生的，它是涉及LOX-1催化作用的產(chǎn)物的一系列反應(yīng)連續(xù)反應(yīng)的結(jié)果。這些反應(yīng)包括自發(fā)的、因子誘導(dǎo)的或酶催化的異構(gòu)化。因此，通過(guò)調(diào)整氫過(guò)氧化物裂解酶(HPL)的表達(dá)可以影響這些下游代謝物的產(chǎn)生。假設(shè)亞油酸的自動(dòng)氧化可以產(chǎn)生與T2N形成相關(guān)的前體分子，那么更進(jìn)一步地降低alkenal的水平是可能的。特別地，預(yù)計(jì)編碼Δ9-去飽和酶(將硬脂酸轉(zhuǎn)換變成油酸)或Δ12去飽和酶(將油酸轉(zhuǎn)換變成亞油酸)基因的下調(diào)將通過(guò)降低有關(guān)酶下游脂肪酸的水平和增加中間脂肪酸底物的水平，改變C18脂肪酸(硬脂酸，油酸和亞油酸)相對(duì)比例。運(yùn)用天然變體或誘發(fā)突變進(jìn)行選擇育種的例子被用來(lái)研制含油種子農(nóng)作物中改進(jìn)的油范圍，其中含油種子農(nóng)作物包括但不限于高硬脂酸(stearic)(HS)大豆(Graefetal.，1985)、高油酸(coleic)(HO)菜籽(Auldetal.，1992)，以及Osorio等(1995)和Soldatov(1976)分別研制的HS和HO向日葵。特別有價(jià)值的是本發(fā)明包括產(chǎn)生不是LOX-1作用直接產(chǎn)物的醛，這種醛是在LOX路徑的酶的作用下產(chǎn)生的，或者是通過(guò)醛的異構(gòu)化，例如圖1B中提供的(3Z)-壬烯醛到(2E)-壬烯醛的異構(gòu)化產(chǎn)生的。也承認(rèn)本發(fā)明包括產(chǎn)生相當(dāng)于LOX路徑的酶產(chǎn)生的醛和/或相當(dāng)于所述異構(gòu)化產(chǎn)生的醛的醇。所述醇典型地是在醛-酮還原酶超家族的酶成員(Srivastavaetal.，1999)的作用下產(chǎn)生的，例如通過(guò)酶將(2E)-壬烯醛轉(zhuǎn)化成(2E)-壬烯醛產(chǎn)生的。6.10潛在T2N(T2NPotential)本發(fā)明更進(jìn)一步的目標(biāo)是降低或者消除與T2N形成，包括T2N前體和醛加合物的形成相關(guān)的分子。雖然與啤酒老化相關(guān)的幾個(gè)化學(xué)反應(yīng)仍然難以捉摸，但是認(rèn)為氧化過(guò)程是啤酒產(chǎn)物中產(chǎn)生腐敗味的主要原因(Narziss，1986；Ohtsuetal.，1986)。已經(jīng)公知腐敗味的主要的分子貢獻(xiàn)者是T2N，這一點(diǎn)在第2部分(″發(fā)明背景″)中已經(jīng)詳述描述。在制造啤酒的過(guò)程中，當(dāng)在發(fā)酵前的生產(chǎn)階段產(chǎn)生這種醛時(shí)，這種醛可以通過(guò)結(jié)合氨基酸和蛋白質(zhì)參與加合物的形成(NoёlandCollin，1995)，但也可能結(jié)合核酸、谷胱甘肽等等，后來(lái)通過(guò)發(fā)酵酵母可以防止它還原或氧化(Lermusieauetal.，1999)。但是，在發(fā)酵期間還可以和亞硫酸鹽形成T2N加合物使該醛保持風(fēng)味非活性狀態(tài)(Nyborgetal.，上文)。大部分T2N加合物被轉(zhuǎn)入成品啤酒中，在成品啤酒中游離T2N被釋放(Ligeoisetal.，2002)，酸度條件和溫度條件是這一過(guò)程中的重要因素。T2N加合物包含在限定的反應(yīng)條件下，例如在100℃，pH4.0的條件下溫育2h會(huì)降解T2N加合物釋放T2N的部分潛在T2N。熟練技術(shù)人員知道如何將潛在T2N作為啤酒儲(chǔ)藏期間怎樣釋放T2N的指示物，例如Drost等(上文)已經(jīng)描述這一過(guò)程。當(dāng)前發(fā)明的大麥顆粒在LOX-1催化形成9-HPODE方面受到限制，其中9-HPODE通常在LOX路徑支路中作為產(chǎn)生T2N的前體分子起作用。因此利用LOX無(wú)效大麥顆粒生產(chǎn)的啤酒將不僅具有極低水平的T2N，而且也具有極低水平的潛在T2N。LOX-1無(wú)效大麥顆粒產(chǎn)生的完全缺乏T2N，或包含可忽略水平的潛在T2N，包括T2N加合物的啤酒產(chǎn)物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，利用LOX-1無(wú)效大麥生產(chǎn)的啤酒在儲(chǔ)藏期間基本上不產(chǎn)生或僅僅產(chǎn)生可忽略的T2N特異的異味。6.11抗病性本發(fā)明更進(jìn)一步地涉及抗病大麥。認(rèn)為植物L(fēng)OXs與活性抗病機(jī)制，總稱為過(guò)敏反應(yīng)(HR)的發(fā)展有關(guān)，其中過(guò)敏反應(yīng)是程序性細(xì)胞死亡的一種形式(Rustéruccietal.，1999)在HR中，感染后位于傳染位點(diǎn)附近的植物細(xì)胞的迅速死亡導(dǎo)致形成壞死斑。這樣，病原體傳播被限制，而且能防止對(duì)剩余植物器官的更進(jìn)一步破壞。在幾個(gè)植物病原體系統(tǒng)中，HR與LOXs的表達(dá)相聯(lián)系，其中LOXs具有產(chǎn)生HPODE而且9-HPOTE的特異性(Rustéruccietal.，上文；Jallouletal.，2002)，這可能是因?yàn)闅溥^(guò)氧脂肪酸的大量產(chǎn)生導(dǎo)致組織壞死。編碼LOX-1的基因主要在大麥顆粒中表達(dá)，而許多另外的LOX酶在植物的葉中表達(dá)。因此，導(dǎo)致9-HPODE、13-HPODE、9-HPOTE和13-HPODE形成的LOX路徑分支在大麥葉中是有功能的，而且不同的oxylipins組合反映單獨(dú)的感染和創(chuàng)傷事件。已經(jīng)描述馬鈴薯葉相似的分子方案(Weberetal.，1999)。天然發(fā)生的揮發(fā)性醛抑制某些病原體在植物上生長(zhǎng)，一些植物對(duì)特殊病原體的天然抵抗力可以歸于揮發(fā)性醛的產(chǎn)生(Croftetal.，1993；BleéandJoyard，1996；Vancanneytetal.，2001)。因此，相對(duì)于野生型植物，本發(fā)明的LOX-1無(wú)效大麥植物的改變的oxylipin輪廓可以防止、降低、改善或消除病原體、病原體產(chǎn)物或植物-病原體相互作用產(chǎn)物的存在。病原體的一個(gè)非限制性例子是曲霉屬(Aspergillus)(參見(jiàn)下文)。因此，在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及顯示出抗病性增強(qiáng)的LOX-1無(wú)效大麥植物。6.12真菌毒素本發(fā)明也公開(kāi)了曲霉群(clonization)敏感度降低的大麥植物的用途。曲霉是大麥顆粒麻煩的殖民者，經(jīng)常導(dǎo)致污染致癌真菌毒素(mycotoxins)黃曲霉毒素(aflatoxin)和柄曲菌素(sterigmatocystin)。因?yàn)檎婢a(chǎn)生黃曲霉毒素受高水平9-HPODE、9-HPOTE、13-HPODE和13-HPOTE的影響，因此Keller在美國(guó)專利No.5,942,661中要求保護(hù)產(chǎn)生的所述氫過(guò)氧脂肪酸的量足以抑制真菌毒素產(chǎn)生的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物。另外，所述美國(guó)專利和Burow等(2000)的資料詳細(xì)說(shuō)明13-HPODE抑制黃曲霉毒素的產(chǎn)生，而9-HPODE增強(qiáng)黃曲霉毒素的產(chǎn)生。因?yàn)長(zhǎng)OX-1無(wú)效顆粒缺乏活性LOX-1酶，因此所述顆粒包含比野生型植物水平略高的13-HPODE，而且包含相對(duì)于所述顆粒的非遺傳修飾親本組織，水平較低的9-HPODE。因此相對(duì)于野生顆粒，LOX-1無(wú)效顆?？梢员苊馇辜木?，或者在曲霉污染后顯示出水平降低的真菌毒素。因此，本發(fā)明涉及與野生型大麥植物相比，真菌毒素水平降低的大麥植物。6.13香料利用LOX-1無(wú)效大麥生產(chǎn)香料和青香韻化合物也是本發(fā)明的一個(gè)方面。到目前為止，大多數(shù)與大麥LOX路徑的各種支路相關(guān)的研究工作都集中在從13-HPOTE產(chǎn)生茉莉酮酸(Turneretal.，2002)和如上所述的抗病性方面。為了選擇性的商業(yè)目的對(duì)大麥氫過(guò)氧脂肪酸的注意較少。但是，值得注意的是LOX-1無(wú)效大麥顆粒中完全缺少活性LOX-1預(yù)期會(huì)導(dǎo)致所述顆粒中富集13-HPODE和13-HPOTE。以這種新特性為基礎(chǔ)，新應(yīng)用可能涉及大麥農(nóng)作物的工業(yè)用途，例如用于生產(chǎn)短鏈脂族醛和乙醇(例如，青香韻化合物己醛/己烯醛和己醇/己烯醇)。與生產(chǎn)青香韻相關(guān)的幾個(gè)方面已經(jīng)在專利，包括但不限于討論的美國(guó)專利No.s6,008,034、6,150,145和6,274,358中公開(kāi)。Husler等的美國(guó)專利No.6,008,034中公開(kāi)了利用特異的氫過(guò)氧化物裂解酶生產(chǎn)青香韻化合物的過(guò)程，Huseretal.等的美國(guó)專利No.6,150,145和Holtz等的美國(guó)專利No.6,274,358中描述了利用標(biāo)準(zhǔn)植物原料的這一過(guò)程。利用LOX-1無(wú)效顆粒生產(chǎn)青香韻化合物包含為實(shí)現(xiàn)所述生產(chǎn)使用新原材料。不能認(rèn)為來(lái)源于本發(fā)明的LOX-1無(wú)效大麥顆粒的新原材料是標(biāo)準(zhǔn)植物原料，因?yàn)樗茄苌哉T變操作規(guī)程后已經(jīng)經(jīng)過(guò)挑選的顆粒，在本公開(kāi)文本的6.4-6.7部分已經(jīng)詳述誘變操作規(guī)程。認(rèn)為L(zhǎng)OX-1無(wú)效大麥顆粒的工業(yè)用途超出了該專利前一段敘述的權(quán)利要求的范圍，主要因?yàn)橛僧?dāng)前發(fā)明的LOX-1無(wú)效顆粒產(chǎn)生的新原材料將大大改進(jìn)LOX-1催化產(chǎn)生9-HPODE和9-HPOTE過(guò)程強(qiáng)加的正常限制，其中9-HPODE和9-HPOTE兩氫過(guò)氧脂肪酸不能作為酶催化產(chǎn)生青香韻順式3-己烯醛和順式3-己烯醇的前體分子。6.14編碼LOX的基因的異源表達(dá)在多個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有LOX-1無(wú)效特性的轉(zhuǎn)基因大麥植物。預(yù)想植物基因工程將來(lái)的發(fā)展將導(dǎo)致產(chǎn)生LOX-1合成被抑制的大麥植物。已經(jīng)作為控制異味形成的方式提出這一概念，但是還沒(méi)有報(bào)道這種方法的結(jié)果(McElroyandJacobsen，1995)。這里描述的發(fā)明可以與將來(lái)的這種改進(jìn)結(jié)合使用，以構(gòu)建具有與LOX-1序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互補(bǔ)的反義構(gòu)建物的反義LOX-1植物。構(gòu)建與對(duì)應(yīng)mRNA雜交的反義核苷酸與在轉(zhuǎn)基因大麥中表達(dá)反義SnRK1蛋白激酶序列中的描述相似(Zhangetal.，2001)?？梢詷?gòu)造反義序列修飾，只要該序列能與對(duì)應(yīng)mRNA雜交并干擾對(duì)應(yīng)mRNA的表達(dá)就可以。這樣就可以使用與對(duì)應(yīng)反義序列具有70％、優(yōu)選80％、更優(yōu)選85％的序列同一性的反義構(gòu)建物。而且，反義核苷酸的部分可以用來(lái)破壞靶基因的表達(dá)。通?？梢允褂弥辽?0個(gè)核苷酸、100個(gè)核苷酸、200個(gè)核苷酸或更多個(gè)核苷酸的序列。因此，本發(fā)明的適用范圍并不僅限于那些通過(guò)常規(guī)誘變方法產(chǎn)生的植物。雖然經(jīng)由同源重組的靶基因替換在酵母中非常容易，但是它的效率在大多數(shù)多細(xì)胞真核生物中仍然有限，而且還不允許產(chǎn)生這種大麥植物和一組基因組范圍的基因破壞(ParinovandSundaresan，2000)。最近已經(jīng)在幾個(gè)發(fā)育過(guò)程中利用基因沉默來(lái)研究秀麗隱桿線蟲(chóng)基因組的86％的預(yù)知基因的作用(Ashrafietal.，；Kamathetal.，2003)。為了產(chǎn)生具體基因，例如LOX-1編碼基因的功能完全喪失的大麥植物使用RNA干擾(RNAi)方法有幾個(gè)缺點(diǎn)。這些缺點(diǎn)包括表型缺乏穩(wěn)定遺傳率、剩余基因活性水平不定(Hannon，2002；Bargman，2001；Wesleyetal.，2001)，而且不能同時(shí)沉默幾個(gè)不相關(guān)基因(Kamathetal.，2000)。也可以以有義方向使用本發(fā)明的核苷酸序列來(lái)抑制植物中編碼LOX酶的內(nèi)源基因的表達(dá)。以有義方向利用本核苷酸序列抑制植物中基因表達(dá)的方法本領(lǐng)域已經(jīng)已知(例如，參見(jiàn)Jorgensen和Napoli的美國(guó)專利5,283,184)。該方法通常涉及用DNA構(gòu)建物轉(zhuǎn)化植物，DNA構(gòu)建物包含操作性地與相應(yīng)于內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的核苷酸序列的至少一部分連接的驅(qū)動(dòng)植物中的表達(dá)的啟動(dòng)子。典型地，這種核苷酸序列與內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物序列具有較高的序列同一性，優(yōu)選大于大約65％的序列同一性、更優(yōu)選大于大約85％的序列同一性，最優(yōu)選大于大約95％的序列同一性。在Cahoon等的美國(guó)專利申請(qǐng)公布No.2003/0074693A1中描述和公開(kāi)了與編碼LOX酶的基因的異源表達(dá)相關(guān)的各個(gè)方面。雖然所述專利申請(qǐng)敘述了關(guān)于大麥LOX酶的
背景技術(shù)：
，并公開(kāi)了許多編碼LOX的基因序列，但是編碼LOX-1、LOX-2和LOX-3的大麥基因中沒(méi)有任何一個(gè)顯示出包括在Cahoon等的美國(guó)專利申請(qǐng)公布No.2003/0074693A1敘述的權(quán)利要求范圍內(nèi)的足夠程度的同一性。當(dāng)本發(fā)明已經(jīng)在上述描述中進(jìn)行詳細(xì)描述時(shí)，認(rèn)為相同的序列是作例證的，在性質(zhì)上并不是限制性的，應(yīng)理解來(lái)自本發(fā)明精神內(nèi)的所有變化和修飾都是希望得到保護(hù)的。因此，在本發(fā)明的范圍內(nèi)實(shí)踐某些變化和修飾，例如單個(gè)基因修飾和突變、somaclonal變體、從當(dāng)前的載培品種的大量植物群體中選擇的變體個(gè)體等等是很明顯地，發(fā)明的范圍只能由附加的權(quán)利要求的范圍限定。參考下列具體的實(shí)施例更進(jìn)一步地對(duì)本發(fā)明進(jìn)行描述；提供這些實(shí)施例是更進(jìn)一步地舉例說(shuō)明本發(fā)明，不應(yīng)認(rèn)為他們是限制本發(fā)明的范圍6.15LOX抑制劑本發(fā)明也涉及降低或防止大麥LOX-1活性的方法。幾個(gè)LOX抑制劑可以選自氧化還原和非氧化還原抑制劑類、抗氧化劑、鐵螯合劑、包含咪唑的化合物、苯并吡喃衍生物等等。因此在一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明涉及降低大麥LOX(優(yōu)選LOX-1)活性的方法，包括步驟(i)提供大麥植物或其部分或從大麥制備的植物產(chǎn)品，(ii)提供LOX抑制劑(iii)用所述LOX抑制劑溫育所述大麥植物或其部分或從大麥制備的植物產(chǎn)品，因此降低大麥LOX(優(yōu)選LOX-1)的活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述植物產(chǎn)品是麥芽，在糖化步驟期間將所述LOX抑制劑添加到所述麥芽中。這將優(yōu)選導(dǎo)致所述糖化步驟產(chǎn)生的麥芽汁中的T2N水平低些。所述大麥植物或其部分或從大麥制備的植物產(chǎn)品可以是LOX-1無(wú)效大麥或其部分或從LOX-1無(wú)效大麥制備的植物產(chǎn)品。但是，其他大麥可以優(yōu)選用于該方法。在多種LOX抑制劑中，氧化還原LOX抑制劑可以選自鄰苯二酚丁烷(catecholbutane)衍生物，例如Jordan等的美國(guó)專利No.s5,008,294，Allen的美國(guó)專利No.s4,708,964和Jordan的美國(guó)專利No.s4,880,637中描述的任何一種，例如去甲二氫愈創(chuàng)木酸(nordihydroguaiareticacid)(NDGA)或其enatiomers中的一個(gè)?？寡趸瘎㎜OX抑制劑可方便地選自石炭酸、類黃酮等等。抗氧化劑LOX抑制劑也可以選自沒(méi)食子酸鹽，包括沒(méi)食子酸辛酯。通過(guò)下文實(shí)施例18中描述的測(cè)定可證實(shí)實(shí)際上是LOX抑制劑的化合物。在工業(yè)上，沒(méi)食子酸辛酯已知的大豆脂加氧酶抑制劑(Haetal.，2004)，具有特殊價(jià)值，現(xiàn)在允許將它作為食物中的抗氧化添加劑使用(Aruomaetal.，1993)。這一特性使得在存在公認(rèn)的抑制劑沒(méi)食子酸辛酯的情況下測(cè)試純化的大麥LOX-1活性有意義。有趣地是，糖化期間存在沒(méi)食子酸辛酯導(dǎo)致T2N水平較低。因此當(dāng)前發(fā)明的實(shí)施方案提供了添加到碎麥(mash)芽中后將使T2N水平降低的LOX-1抑制劑及其用途。7.實(shí)施例這里的例子舉例說(shuō)明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不應(yīng)認(rèn)為是對(duì)本發(fā)明的限制。除非另有陳述，否則是按照Sambrook等(1989)和SambrookandRussell(2001)中的描述操作核酸和細(xì)菌，完成基本的分子生物技術(shù)。將本部分的例子分成下列主題，其目的是為了使說(shuō)明書(shū)清楚，而不是限制發(fā)明(i)篩選和突變體選擇(ii)大麥突變體D112和A618(iii)大麥突變體D112和A618的生理學(xué)特性(iv)突變體D112和A618是LOX-1無(wú)效植物(v)糖化(vi)利用野生型和突變體大麥的麥芽生產(chǎn)麥芽和啤酒(vii)LOX-1無(wú)效麥芽的啤酒中的三羥基十八碳烯酸(viii)啤酒中的三羥基十八碳烯(ix)大麥中來(lái)自LOX作用的酶產(chǎn)物的生化特征鑒定(x)突變大麥突變體D112中的LOX-1基因(xi)突變大麥突變體A618中的LOX-1基因(xii)LOX-1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RT-PCR檢測(cè)(xiii)攜帶D112突變的大麥突變體的遺傳檢測(cè)(xiv)樣品混合物中的突變體檢測(cè)(xv)突變體D112的重組LOX-1是失活的(xvi)轉(zhuǎn)基因大麥植物(xvii)青香韻化合物(xviii)LOX-1抑制劑(xix)用沒(méi)食子酸辛酯糖化實(shí)施例1篩選和突變體選擇大麥誘變。依照Kleinhofs等(1978)提供的詳細(xì)描述，分別用誘變劑NaN3溫育從cv.sBarkeCeleste、LuxPrestige、Saloon和Neruda大麥植物收集的顆粒。選擇這一過(guò)程是因?yàn)橐阎鼤?huì)在大麥基因組DNA中誘導(dǎo)點(diǎn)突變，并在誘變處理的DNA編碼的那些蛋白質(zhì)中產(chǎn)生氨基酸替換或截?cái)?。在?dāng)前公布的誘變實(shí)驗(yàn)中，選擇在實(shí)驗(yàn)點(diǎn)通過(guò)隨后繁殖突變的M1代谷物顆粒兩代，最后產(chǎn)生高比例的供篩選的純合子植物(圖1A)。預(yù)計(jì)產(chǎn)生的M3代突變體谷物發(fā)生的頻率為0.9-2.3/10,000谷物顆粒(Kleinhofsetal.，上文)。值得注意的是沒(méi)有篩選M2顆粒，主要因?yàn)檫@些顆粒包含比例相對(duì)高的雜合點(diǎn)突變。篩選。目的在于研制檢測(cè)缺乏LOX-1活性的M3突變體大麥顆粒的快速高通量篩選程序，以避免使用已知的包含幾種LOX活性的葉尖的麻煩的篩選程序(在Douma等的以WO02/053721A1公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT/IB01/00207中公開(kāi))。焦點(diǎn)在于確定成熟大麥顆粒的胚，包括scutellum組織中的LOX活性。一般，測(cè)定條件與Anthon和Barrett(2001)描述的那些條件相似。測(cè)定基于LOX催化產(chǎn)生亞油酸氫過(guò)氧化物，亞油酸氫過(guò)氧化物在血紅蛋白催化反應(yīng)中將3-甲基-2-苯噻唑啉腙(benzothiazolinone)與3-(二甲氨基)安息香酸氧化偶聯(lián)，導(dǎo)致形成分光光度計(jì)可以測(cè)量的藍(lán)顏色。實(shí)際上，一個(gè)測(cè)定系列起始于將96個(gè)大麥胚組織，包括胚鱗(scutellum)分開(kāi)均化成細(xì)粉組合物。這些細(xì)粉被轉(zhuǎn)入冰冷的存儲(chǔ)板(ABgene)，其中1.2ml的96個(gè)孔中的每一個(gè)孔都包含一個(gè)圓的5-mm的玻璃珠和200ul水。然后在MM300實(shí)驗(yàn)型磨機(jī)(Retsch)中溫育存儲(chǔ)板35秒，電子調(diào)節(jié)搖動(dòng)頻率為27秒-1。隨后，在4℃用Allegra6R離心機(jī)(Beckman-Coulter)以4,000rpm離心儲(chǔ)存板15分鐘沉淀不溶性物質(zhì)，此后繼續(xù)保存在冰上最多120分鐘直到下一個(gè)步驟。96孔板被轉(zhuǎn)入能依照Anthon和Barrett(上文)中描述的LOX測(cè)定，按程序移液的Biomek2000實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)化工作站(Beckman-Coulter)。最后，96×26ul的胚提取物被轉(zhuǎn)入標(biāo)準(zhǔn)的96孔微量滴定板(Nunc)，接著添加90ul的試劑A[12.5mM3-(二甲氨基)安息香酸，0.625mM亞油酸(實(shí)施例9詳細(xì)描述了其制備過(guò)程)]和90ul試劑B(0.25mM3-甲基-2-苯噻唑啉腙(benzothiazolinehydrazone)，0.125mg/ml血紅蛋白)；試劑A是通過(guò)先混合相當(dāng)于134mg游離酸的155ul亞油酸(Sigma，L-1376)和257ulTween-20，然后加入水使體積達(dá)到5ml，接下來(lái)添加600ul的1MNaOH，當(dāng)溶液變清澈時(shí)，用另外的水將其調(diào)節(jié)為20ml而制備的。利用FlourostarGalaxy分光光度計(jì)(BMGLabtechnologies)測(cè)量96孔板的每一孔中的A595，其中氫過(guò)氧化物產(chǎn)物的顏色形成是測(cè)量存在的總LOX活性的尺度[因此以A595單位(A595U)給出活性]。潛在突變體的鑒定。篩選大麥cv.Barke(來(lái)源于總共2,160個(gè)系)、cv.Celeste(2,867個(gè)系)、cv.Lux(2,625個(gè)系)、cv.Prestige(1,379個(gè)系)、cv.Saloon(1,743個(gè)系)和cv.Neruda(3,780個(gè)系)的谷物顆粒的LOX活性，目的在于鑒定和野生型顆粒相比所述活性大大降低的顆粒。在M3代鑒定了總共90個(gè)潛在的未加工突變體[cv.Barke(12個(gè)系)、cv.Celeste(38個(gè)系)、cv.Lux(9個(gè)系)、cv.Prestige(16)、cv.Saloon(12個(gè)系)和cv.Neruda(3個(gè)系)]。從這些突變體中的每一個(gè)突變體獲得的谷物被繁殖到M4代，然后再收獲，篩選與極低LOX活性相關(guān)的特性。最后表明只有命名為突變體D112的一個(gè)cv.Barke系和命名為突變體A618的一個(gè)cv.Neruda系顯示出所述總LOX活性極低。用成熟靜態(tài)(quiescene)谷物的提取物來(lái)完成對(duì)LOX活性的詳細(xì)測(cè)量，成熟靜態(tài)谷物中的活性幾乎專門由LOX-1提供(SchmittandvanMechelen，1997)。按照如上所述的比色LOX測(cè)定確定的突變體D112的干燥成熟M3谷物胚的總LOX活性(參照?qǐng)D2；表1)是0.407±5.8％A595U/胚，而cv.Barke的是1.245±7.6％A595U/胚。在第二組實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)突變體A618的M3代成熟干燥谷物的胚提取物中的LOX活性是0.221±2.6％A595U/胚，而野生型cv.Neruda的提取物是0.721±3.6％A595U/胚(圖3，表1)。實(shí)施例2大麥突變體D112和A618進(jìn)行分析確定M4和M5代LOX-1無(wú)效植物是否是對(duì)應(yīng)突變表型的純合子。這類分析對(duì)確定M3代中的目的突變是隱性性狀或顯性性狀有用。換句話說(shuō)，如果M3代植物是顯性突變的雜合體，那么后代將使那個(gè)表型分離開(kāi)。測(cè)量大麥突變體D112和A618的M3、M4和M5代胚中的總LOX活性，并將活性與分別來(lái)自cv.Barke和cv.Neruda的活性進(jìn)行比較。在當(dāng)前公布文本的實(shí)施例1中描述了對(duì)LOX活性的確定。在所有實(shí)驗(yàn)中，來(lái)自cv.Barke胚的標(biāo)準(zhǔn)提取物和加熱失活的來(lái)自cv.Barke胚的標(biāo)準(zhǔn)提取物被用作對(duì)照樣品。突變體D112M4代谷物胚的平均總LOX活性是0.334±1.5％A595U(n＝12)，而對(duì)于突變體D112M5代胚的是0.294±4.1％A595U(n＝90)。對(duì)比的野生型cv.Barke的M4代胚和M5代胚分別產(chǎn)生0.738±3.2％A595U(n＝2)和0.963±7.5％A595U(n＝90)(參照?qǐng)D4；圖5；表1，實(shí)驗(yàn)1)。大麥突變體A618的M4代胚產(chǎn)生0.222±2.1％A595U的平均LOX活性(n＝4)。這一實(shí)驗(yàn)的其他結(jié)果顯示cv.Neruda胚中的LOX活性是0.684±5.8％A595U(n＝90)。結(jié)果概括在圖6，表1和實(shí)驗(yàn)2中?？傊?，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)突變體D112的M4和M5代谷粒是總LOX活性極低的特異遺傳特性的純合子。突變體A618的M4代谷物顯示相同的特性。實(shí)施例3大麥突變體D112和A618的生理學(xué)特性在溫室繁殖植物。cv.Barke和突變體D112的谷物(M4和M5代)在溫室中，在相對(duì)濕度為65％，光照為20h，溫度為12℃的條件下萌發(fā)和生長(zhǎng)。突變體D112和野生型cv.Barke植物的在株高、每株植物的分蘗數(shù)，開(kāi)花的起始(on-set)和/或每一個(gè)穗的谷物數(shù)目方面的生長(zhǎng)特點(diǎn)與野生型大麥相似。因此，不僅能推斷出突變體D112具有野生型植物的生長(zhǎng)生理學(xué)，而且可推斷出突變體D112具有正常的谷物發(fā)育。突變體A618谷粒的M4代和cv.Neruda谷物在溫室中，在相對(duì)濕度為65％，光亮/黑暗條件為20h/4h，溫度為12℃的條件下萌發(fā)和生長(zhǎng)。進(jìn)行比較時(shí)，沒(méi)有觀察到突變體A618和cv.Neruda在株高、每株植物的分蘗數(shù)，開(kāi)花的起始和/或每一個(gè)穗的谷粒數(shù)目方面存在差異。但是，突變體A618的背側(cè)(dorsalside)谷物因?yàn)楫惓５亩礃?hole-like)結(jié)構(gòu)不同于母本cv.Neruda?？傊梢酝茢喑鐾蛔凅wA618顯示出與野生型植物類似的生長(zhǎng)生理學(xué)，但是顯示出異常的谷物發(fā)育。在田間條件下，突變體D112的農(nóng)學(xué)性能。在田間試驗(yàn)中比較鑒定突變體D112和cv.Barke植物在株高、抽穗期、抗病性、倒伏(lodging)、穗斷裂、成熟時(shí)間和產(chǎn)量方面的可能差異(參見(jiàn)表2)。依照田間試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)程序完成該試驗(yàn)。因此，將等份的突變體D112和cv.Barke顆粒種植在2個(gè)地點(diǎn)的7.88m2地塊里，其中每個(gè)樣品包含3份復(fù)制。在整個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)，仔細(xì)地觀察農(nóng)學(xué)數(shù)據(jù)特征，重點(diǎn)是如上所述的特性。觀察到的突變體D112和cv.Barke的農(nóng)業(yè)性狀都不是沒(méi)有差異。實(shí)施例4突變體D112和A618是LOX-1無(wú)效植物蛋白質(zhì)分析。進(jìn)行下列分析以表征突變體D112和A618的突變表型特征。對(duì)從靜態(tài)大麥谷物中除去的胚的提取物進(jìn)行Western印跡分析。在motar中的300ul冰冷的水中提取一個(gè)胚，提取物被轉(zhuǎn)入微量離心管中以10,000g的離心力離心。依照Laemmli(1970)提供的描述，通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離包含10ul粗提物的樣品等分。此后，通過(guò)Towbin等(1979)已經(jīng)詳細(xì)描述的半干印跡將分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。用1∶500稀釋的LOX-1特異單克隆抗體5D2(Holtmanetal.，1996)作為探針探察印跡，然后用與堿性磷酸酶偶連的山羊抗小鼠抗體溫育，并用堿性磷酸酶底物氮藍(lán)四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽進(jìn)行檢測(cè)，這一點(diǎn)Holtman等已經(jīng)描述(上文)。通過(guò)5D2抗體識(shí)別cv.Barke胚的提取物中的LOX-1，在SDS-PAGE中蛋白質(zhì)的遷移與來(lái)自cv.Vintage的LOX-1相似。在突變體D112的樣品中沒(méi)有免疫可檢測(cè)LOX-1，但是在cv.Barke、突變系G和cv.Vintage的提取物中可以鑒定這種蛋白質(zhì)。cv.Barke和突變體D112的M4子代系的Westem分析顯示來(lái)自cv.Barke胚的谷物中存在LOX-1蛋白質(zhì)，而不是突變體D112的任何子代谷物中存在LOX-1蛋白質(zhì)(圖7)，因此證實(shí)LOX-1無(wú)效特性在遺傳上是穩(wěn)定的。通過(guò)卡方檢驗(yàn)(chi-square)確定這些數(shù)據(jù)在統(tǒng)計(jì)上有顯著意義(p＜3.84)。如上所述，分析突變體A618和cv.Neruda的M3和M4代胚中的LOX-1蛋白質(zhì)。在兩代cv.Neruda的胚提取物中都可以檢測(cè)到LOX-1蛋白質(zhì)。但是，在未加工突變體A618和子代系的胚中(圖8)觀察到非常模糊的LOX-1蛋白質(zhì)條帶，這可能是因?yàn)槠渌鸏OX酶的交叉反應(yīng)引起的?；亟?。利用重復(fù)回交將LOX-1無(wú)效表型從突變體D112轉(zhuǎn)移到回歸親本里(參照?qǐng)D9)，在本公開(kāi)文本中回歸親本是cv.Prestige。在圖9中舉例說(shuō)明了計(jì)劃的與選擇有價(jià)值的特性結(jié)合的回交程序。目的是逐步用回歸親本的基因組取代突變體D112的基因組。這樣，可以消除在NaN3誘變處理期間引入突變體D112基因組的其他潛在的不利突變。預(yù)計(jì)純合的LOX-1無(wú)效突變體D112(基因型表示為nn)與cv.Prestige(基因型表示為NN)第一次回交的子代系包含雜合的基因型(基因型表示為Nn)。值得注意的是由于低LOX表型是隱性性狀，因此在是這種突變的雜合體的系中它將逃脫檢測(cè)。預(yù)計(jì)自花傳粉后代產(chǎn)生以正常孟德?tīng)柲Ｊ椒蛛x的植物群體，也就是比例為1NN∶2Nn∶1nn的植物群體。包含LOX-1無(wú)效基因型的由第一個(gè)回交產(chǎn)生的純合nn基因型包含cv.Prestige的50％的遺傳背景。在10輪回交之后，回歸親本背景預(yù)計(jì)達(dá)到99.9％。在整個(gè)回交程序中，在溫室繁殖cv.Prestige和LOX-1無(wú)效突變體D112的大麥植物。按照實(shí)施例1中的描述分析回交子代的胚提取物中LOX-1蛋白質(zhì)的存在。在第一和第二回交代的分離的子代中LOX-1無(wú)效表型的期望頻率是25％的隱性突變(圖10)。利用western印跡分析作為檢測(cè)缺乏LOX-1蛋白質(zhì)條帶的大麥突變系的基礎(chǔ)，第一回交代的頻率相當(dāng)于3個(gè)系/12個(gè)總回交系。在第二回交代中，9個(gè)系/28個(gè)總回交系在western印跡分析中缺少LOX-1蛋白條帶(圖10)。因?yàn)樵诘诙亟蛔哟谢貧w親本背景達(dá)到大約75％，因此LOX-1突變基因和對(duì)應(yīng)LOX-1無(wú)效表型的共遺傳證實(shí)了他們的遺傳連鎖。卡方檢驗(yàn)顯示觀測(cè)到的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)上有顯著意義。p值低(＜3.84)，p值是顯示第一、第二、第三和第四回交代有意義的特性?；亟怀绦虮砻鳟a(chǎn)生LOX-1無(wú)效表型的突變體等位基因可以被轉(zhuǎn)入替換的遺傳背景中，而且以遵循孟德?tīng)柗蛛x法則的隱性單因素方式遺傳。實(shí)施例5糖化制備麥芽汁。為了測(cè)試新大麥載培品種的特性，制備了新大麥載培品種的25-225g麥芽樣品(參照?qǐng)D11)。利用包含外部攪拌器和配備了恒溫器的水浴裝備的實(shí)驗(yàn)室麥芽糖化系統(tǒng)，可以小規(guī)模地完成糖化過(guò)程，其中恒溫器能夠以明確限定的梯度勻變溫度。用紙過(guò)濾器過(guò)濾最后的碎麥芽。利用加熱壁爐臺(tái)和連接到回流冷凝器上的圓底燒瓶，以實(shí)驗(yàn)室規(guī)模完成麥芽汁煮沸。實(shí)施例6利用野生型和突變體大麥的麥芽生產(chǎn)麥芽和啤酒為了獲取足夠的制麥芽和釀造的谷物原料，在田間繁殖cv.Barke和突變體D112大麥幾季。對(duì)成品啤酒的T2N分析和感官分析表明用突變體D112麥芽釀造的啤酒具有改進(jìn)的風(fēng)味穩(wěn)定性。使來(lái)源于突變體D112和cv.Barke的顆粒萌發(fā)。在麥芽作坊實(shí)施20kg規(guī)模的制麥芽過(guò)程，步驟如下突變體D112大麥谷物(在2003年收獲)，cv.Barke谷物(在2002年收獲)。浸泡條件是8h濕潤(rùn)；14h干燥；8h濕潤(rùn)；10h干燥；16℃在浸泡水中潤(rùn)濕4h。萌發(fā)條件是18℃12h；16℃24h；14℃24h；12℃60h。干燥條件是60℃12h；68℃3h；74℃4h；80℃3h。在表3中比較了利用來(lái)源于突變體D112和cv.Barke麥芽的麥芽樣品進(jìn)行麥芽制造分析的數(shù)據(jù)。結(jié)果表明突變體D112和cv.Barke的麥芽滿足麥芽規(guī)范，而且證實(shí)這些麥芽適合釀造。突變體D112的麥芽與cv.Barke麥芽相比，其中T2N水平明顯降低，相當(dāng)于降低～64％(表4)。用來(lái)源于突變體D112和cv.Barke的麥芽進(jìn)行釀造。進(jìn)行的50-1規(guī)模的釀造，涉及下列步驟(i)制備麥芽汁；(ii)分離麥芽汁；(iii)煮沸麥芽汁；(iv)發(fā)酵；(v)貯藏；(vi)淺色(bright)啤酒過(guò)濾；和(v)裝入瓶中。利用突變體D112或cv.Barke的麥芽制備麥芽汁，其中后者用作參比樣品。每種釀造，總共使用13.5kg麥芽。按照47℃20分鐘，接著加熱18分鐘，其中加熱過(guò)程中溫度從48℃升高到67℃；在67℃暫停30分鐘；然后加熱5分鐘到72℃；在72℃暫停15分鐘，加熱6分鐘到78℃；在78℃暫停5分鐘的條件進(jìn)行糖化。依照標(biāo)準(zhǔn)釀造實(shí)踐的規(guī)范完成釀造步驟中的麥芽汁過(guò)濾和煮沸、渦流分離、發(fā)酵、貯藏和包裝到綠玻璃瓶中?？偣惭b瓶331啤酒。風(fēng)味穩(wěn)定性和T2N分析。如上所述利用突變體D112和cv.Barke的麥芽生產(chǎn)啤酒。新近裝瓶的啤酒儲(chǔ)存在5℃，并在生產(chǎn)2個(gè)月內(nèi)對(duì)其進(jìn)行分析。在兩個(gè)不同類型的啤酒儲(chǔ)存條件后，評(píng)估新鮮和儲(chǔ)存啤酒的風(fēng)味穩(wěn)定性。在一個(gè)試驗(yàn)系列中，讓啤酒在37℃經(jīng)受1-4周的強(qiáng)迫老化過(guò)程?；旧习凑誈rnqvist等的(1993)描述，在用O-(2，3，4，5，6-五氟苯甲基)-羥胺衍生羰基后，通過(guò)用質(zhì)譜檢測(cè)的氣相色譜法確定啤酒樣品的T2N水平。受過(guò)訓(xùn)練的啤酒品嘗小組評(píng)估啤酒的總風(fēng)味得分。檢查包括對(duì)啤酒中指示游離T2N的紙板風(fēng)味的檢測(cè)。值得注意的是，兩種新鮮啤酒都包含相似水平的亞硫酸鹽，即來(lái)源于突變體D112和cv.Barke麥芽的啤酒的亞硫酸鹽分別是4ppm和5ppm。強(qiáng)迫老化。研究和比較由cv.Barke麥芽和來(lái)源于突變體D112的麥芽生產(chǎn)的瓶裝碑酒，有關(guān)在強(qiáng)迫老化期間游離T2N產(chǎn)生的特異數(shù)據(jù)顯示在圖12A和表5中。可以看到，啤酒在T2N的產(chǎn)生動(dòng)力學(xué)方面有顯著差異，因此能互相區(qū)分。參考啤酒的結(jié)果正如所料，在來(lái)源于突變體D112的啤酒中觀察到出乎意料且顯著低的T2N發(fā)生。強(qiáng)迫老化實(shí)驗(yàn)加強(qiáng)了兩個(gè)啤酒之間的差異。在2周半之后，參考啤酒的T2N水平超過(guò)了味覺(jué)閾值水平，而利用突變體D112麥芽生產(chǎn)的啤酒在溫育2-3周后，T2N濃度穩(wěn)定在0.025ppb?？紤]到味道和風(fēng)味的穩(wěn)定性，一組風(fēng)味專家評(píng)估了利用LOX-1無(wú)效大麥突變體D112生產(chǎn)的啤酒。焦點(diǎn)集中在37℃經(jīng)歷了強(qiáng)迫老化的啤酒樣品上。品嘗小組發(fā)現(xiàn)新鮮和強(qiáng)迫老化啤酒兩種類型都顯示令人滿意地風(fēng)味輪廓。但是，參考啤酒的似紙味道評(píng)分高于利用LOX無(wú)效突變體D112麥芽生產(chǎn)的啤酒(表5)，即提及的異味在參考啤酒中具有更強(qiáng)烈的味道。一般，品嘗小組優(yōu)選由LOX-1無(wú)效突變體D112麥芽產(chǎn)生的啤酒(風(fēng)味接受得分，表5)。當(dāng)在20℃溫育了12個(gè)月時(shí)，10位啤酒品嘗者組成的小組比較了由LOX-1無(wú)效突變體D112和對(duì)照麥芽產(chǎn)生的啤酒，其中品嘗者是經(jīng)過(guò)訓(xùn)練的品嘗啤酒異味的專家。對(duì)包括例如″似紙的″、″氧化的″、″老化的″、″面包樣的″、″焦糖″、″燒焦″和″甜″的味道特征的全面評(píng)價(jià)顯示對(duì)照啤酒中老化特異異味的水平高于從LOX-1無(wú)效麥芽制備的啤酒(圖12B)。利用標(biāo)尺為0-5的等級(jí)評(píng)定，其中數(shù)值高是優(yōu)選的，判定對(duì)照啤酒和用LOX-1無(wú)效大麥突變體D112的麥芽生產(chǎn)的啤酒的一般風(fēng)味接受得分分別是1.0和2.0?？傊?，從大麥突變體D112的麥芽釀造的啤酒的改進(jìn)的風(fēng)味穩(wěn)定性是顯著的，這主要是因?yàn)?7℃貯藏后的啤酒中T2N水平低。集中于使用LOX-1無(wú)效大麥芽的釀造試驗(yàn)為制造麥芽和釀造過(guò)程中LOX-1的作用構(gòu)成老化啤酒中主要的異味化合物-T2N出現(xiàn)的關(guān)鍵決定因素提供了證據(jù)。實(shí)施例7LOX-1無(wú)效麥芽的啤酒中的三羥基十八碳烯酸在30多年前已經(jīng)描述來(lái)源于亞油酸的啤酒特異的三羥基十八碳烯酸(THAs；也可以縮寫(xiě)為THOEs)(Drostetal.，1974)。從那時(shí)起，多份報(bào)告已經(jīng)證實(shí)啤酒中THAs的總量在5.7-11.4μg/ml間變化(Hamberg1991；和其中的參考文獻(xiàn))。9，12，13-THA通常構(gòu)成啤酒THAs的75-85％，而9，10，13-THA通常只占15-25％。也發(fā)現(xiàn)痕量的其他異構(gòu)體。由大麥突變體D112的麥芽(即LOX-1無(wú)效制麥芽)產(chǎn)生的啤酒中的9，12，13-THA的濃度與由cv.Barke的麥芽制成的參考啤酒相比降低到了20％(即幾乎5倍)，那就是說(shuō)在利用LOX無(wú)效突變體D112麥芽生產(chǎn)的啤酒中，異構(gòu)體9，12，13-THA和9，10，13-THA幾乎等量存在。利用標(biāo)準(zhǔn)的HPLC質(zhì)譜分析進(jìn)行測(cè)量。實(shí)施例8啤酒中的三羥基十八碳烯酸市場(chǎng)上可買到的啤酒樣品的寬范圍的THAs濃度顯示在表7中。如表7所示，對(duì)啤酒樣品中關(guān)于THAs的結(jié)果的嚴(yán)格檢查顯示9，12，13-THA∶9，10，13-THA的比例總是超過(guò)3.5。相反，由D112產(chǎn)生的啤酒中9，12，13-THA∶9，10，13-THA的比例是1.3。因此，由LOX-1無(wú)效大麥產(chǎn)生的啤酒包含顯著降低的比例，確定9，12，13-THA/9，10，13-THA比例為確定啤酒是否是利用LOX無(wú)效大麥突變體的麥芽，例如大麥突變體D112的麥芽生產(chǎn)的提供了工具。值得注意的是，由來(lái)源于LOX-1無(wú)效突變體大麥D112的麥芽生產(chǎn)的啤酒與由正常麥芽產(chǎn)生的啤酒相比，具有顯著低水平總9，12，13-THA。實(shí)施例9大麥中來(lái)自LOX作用的酶產(chǎn)物的生化特征鑒定成熟野生型大麥谷物包含來(lái)源于LOX-1和LOX-2酶的兩種主要LOX活性。這種酶催化亞油酸雙氧化成過(guò)氧氫亞油酸(HPODEs)，酶LOX-1催化形成9-HPODE，酶LOX-2催化形成13-HPODE。在成熟谷物中，LOX衍生活性限制在胚中。為了研究LOX-1基因的突變?cè)鯓佑绊慔PODE形成，利用高壓液相色譜(HPLC)分析對(duì)來(lái)自cv.Barke的胚提取物，來(lái)自大麥系G(低LOX顆粒，在Douma等的以WO02/053721A1公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT/IB01/00207中)和LOX無(wú)效突變體D112的胚提取物進(jìn)行了研究。大麥胚。通過(guò)先利用解剖刀在胚鱗和胚乳之間切割，從成熟大麥谷物分割出器官來(lái)從胚制備粗蛋白提取物。然后將每份由4個(gè)胚組成的樣品放置在兩張稱重紙之間，輕輕錘擊產(chǎn)生同質(zhì)粉末。將粉末轉(zhuǎn)入1.5ml微量離心管中，添加200mM，pH4.5的乳酸緩沖液600ul，在利用塑料研棒更進(jìn)一步均化之前，將管在冰上放置10分鐘。隨后，每個(gè)管中添加600μl水，以20,000g離心樣品2分鐘。100ul產(chǎn)生的上層清液等分被轉(zhuǎn)入15ml離心管[從GreinerBio-One購(gòu)買的Cellstar(Cat.No.188271)中準(zhǔn)備分析LOX作用后的反應(yīng)產(chǎn)物。通過(guò)將10ml100mM，pH6.5的磷酸鈉緩沖液與100ml24mM的亞油酸原液混合，制備2ml的包含260mM亞油酸[底物，通過(guò)先混合155ul亞油酸(相當(dāng)于134mg游離酸；Sigma，L-1376)和257ulTween-20，然后加入水使體積達(dá)到5ml，接下來(lái)添加600ul的1MNaOH，當(dāng)溶液變清澈時(shí)，用H2O將其最終容積調(diào)節(jié)為20ml而制備的]的pH6.5的100mM的磷酸鈉緩沖液。在旋轉(zhuǎn)振蕩器上溫育15分鐘之后，添加2ml乙酸乙酯，為了提取9-HPODE和13-HPODE，通過(guò)用力搖振混合樣品內(nèi)容物。然后以800g離心樣品10分鐘，將1ml乙酸乙酯轉(zhuǎn)入1.5ml微量離心管中，其中乙酸乙酯在氮?dú)饬髯饔孟聲?huì)蒸發(fā)。隨后，將HPODEs再懸浮在300ul甲醇中，用0.45um的膜(Millex-HN過(guò)濾器，Millipore)過(guò)濾。通過(guò)HPLC完成對(duì)HPODE含量的分析。每個(gè)樣品總共15ul被注入配備有4.6×250mmSymmetryC18柱(Waters)的HPLC儀器(HP1100系列、HewlettPackard)中。使用的流動(dòng)相是16∶12∶12∶10∶0.5(v∶v∶v∶v∶v)的水∶甲醇∶乙腈∶四氫呋喃∶三氟乙酸的混合物。流動(dòng)相的流量是每分鐘1ml，柱前面測(cè)量的壓力是140bar。在30℃完成分離。在234nm處完成對(duì)共軛雙鍵氫過(guò)氧化物的檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)樣品包含9(S)-過(guò)氧氫-10(E)，12(Z)-十八碳二烯酸[(9(S)-HPODE]和13(S)-過(guò)氧氫-9(Z)，11(E)-十八碳二烯酸[(13(S)-HPODE]的混合物，圖13A已經(jīng)詳細(xì)描述這一點(diǎn)。色譜圖分析顯示主要的9-HPODE由從cv.Barke的成熟大麥胚中提取的LOX酶形成(圖13B)，而9-和13-HPODE都在低LOX系G的成熟胚的提取物中形成(圖13C)。突變體D112胚的提取物形成極低量的9-HPODE，但是形成的13-HPODE的量高，因此證實(shí)突變體D112缺乏LOX-1活性(圖13D)。因此，與野生型大麥系相比較，突變體D112的胚提取物形成的9-HPODE較少。大麥芽。大麥芽包含來(lái)源于LOX-1和LOX-2酶的兩種主要LOX活性。LOX-1催化形成9-HPODE，LOX-2作用產(chǎn)生13-HPODE。為了研究LOX-1編碼基因的突變對(duì)麥芽提取物中HPODE形成的影響，利用HPLC分析對(duì)從來(lái)源于cv.Barke、低LOX系大麥和突變體D112的麥芽制備的提取物進(jìn)行了分析。按照下列方法制備來(lái)自麥芽的粗蛋白提取物樣品。將一個(gè)萌發(fā)的大麥顆粒放置在兩張稱重紙之間，輕輕錘擊產(chǎn)生同質(zhì)粉末。所有后續(xù)工序、溫育混合物和HPLC分析方法與本申請(qǐng)上述的與測(cè)量胚提取物中的LOX產(chǎn)物有關(guān)的實(shí)施例部分相同。為了進(jìn)行HPLC分析，使用了包含9(S)-過(guò)氧氫-10(E)，12(Z)-十八碳二烯酸[(9(S)-HPODE]和13(S)-過(guò)氧氫-9(Z)，11(E)-十八碳二烯酸[(13(S)-HPODE]的混合物的標(biāo)準(zhǔn)樣品，圖14A中已經(jīng)舉例說(shuō)明這一點(diǎn)。對(duì)萌發(fā)的Barke、低LOX和D112的提取物中的HPODE形成活性的分析表明在cv.barke中9-和13-HPODE形成活性的分布為60∶40(圖14B)、在衍生自低LOX大麥的麥芽中有一些9-HPODE形成活性(圖14c)，在突變體D112的麥芽中9-HPODE形成的水平極低(圖14d)。這些數(shù)據(jù)表明與來(lái)源于其他大麥系的麥芽提取物相比，突變體D112的麥芽提取物中的9-HPODE的形成顯著降低。實(shí)施例10突變大麥突變體D112中的LOX-1基因獲取突變體D112[SEQIDNO2]和cv.Barke[SEQIDNO1]中的LOX-1基因的核苷酸序列，并進(jìn)行比較以確定突變體D112LOX-1無(wú)效表型的分子基礎(chǔ)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LOX-1無(wú)效表型表現(xiàn)的特征是谷物顆粒中缺乏對(duì)應(yīng)的LOX-1酶。利用植物DNA分離試劑盒(RocheAppliedScience)，依照廠家的介紹，從幼苗的葉組織分離突變體D112和野生型cv.Barke的大麥基因組DNA。利用引物5′＞GAAAGCGAGGAGAGGAGGCCAAGAACAA＜3′[SEQIDNO9]和5′＞TTATTCATCCATGGTTGCCGATGGCTTAGA＜3′[SEQIDNO10]，通過(guò)PCR擴(kuò)增突變體D112和cv.Barke基因組DNA中在LOX-1的蛋白質(zhì)編碼區(qū)側(cè)面的4,224-bp的序列。引物序列的基礎(chǔ)是LOX-1基因的基因組序列(vanMechelenetal.，1995；Rousteretal.，1997，跨越LOX-1編碼區(qū)的起始終止密碼子的基因組序列的簡(jiǎn)圖顯示在圖15中)。20ul體積的PCR反應(yīng)包括基因組DNA100ng，每個(gè)引物5pmol和伸展高保真度聚合酶3.5U(RocheAppliedScience)。在MJ循環(huán)控制裝置中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用下列循環(huán)參數(shù)96℃2分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃1分鐘、69℃1分鐘和72℃5分鐘，30個(gè)循環(huán)；72℃10分鐘，1個(gè)循環(huán)。在1.0％的瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物。利用QiaexII凝膠抽提試劑盒(Qiagen)純化長(zhǎng)度與被擴(kuò)增區(qū)域?qū)?yīng)的DNA片段，并將片段插入質(zhì)粒載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中。用特異的寡核苷酸引物，通過(guò)雙脫氧核苷酸鏈終止反應(yīng)確定編碼區(qū)的兩條鏈的核苷酸序列，在MegaBACE1000DNA測(cè)序儀(Amersham)進(jìn)行分析。利用Lasergene序列分析軟件包ver.5(DNASTAR)完成序列比較。野生型cv.Barke的LOX-1序列[SEQIDNO1]和突變體D112的LOX-1序列[SEQIDNO2]之間的直接比較顯示突變體的核苷酸序列在外顯子7的位置3574處有一個(gè)G→A替換形式的點(diǎn)突變(圖15；圖16)。野生型LOX-1序列編碼長(zhǎng)862個(gè)殘基的預(yù)計(jì)分子量為96.4kDa的蛋白質(zhì)[SEQIDNO3]。相反，突變體D112的對(duì)應(yīng)序列在位置3574處的突變導(dǎo)致引入早熟終止密碼子。預(yù)計(jì)突變體D112的LOX-1編碼基因中的終止密碼子導(dǎo)致對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)C末端截?cái)?97個(gè)氨基酸，因此編碼序列列在[SEQIDNO4]中的74.2kDa的蛋白質(zhì)。實(shí)施例11突變大麥突變體A618中的LOX-1基因大麥突變體A618和野生型cv.Neruda的基因組DNA的制備、PCR反應(yīng)、DNA序列確定和基因組DNA分析與實(shí)施例10中描述的突變體D112和cv.Barke的相應(yīng)處理相同。大麥突變體A618的LOX-1的核苷酸[SEQIDNO6]和親本cv.Neruda的LOX-1的核苷酸[SEQIDNO5]之間的比較顯示突變體序列有一個(gè)相當(dāng)于基因組序列位置2311處的G→A替換的點(diǎn)突變(圖15；圖16)。cv.Neruda的野生型LOX-1序列編碼長(zhǎng)862個(gè)殘基的預(yù)計(jì)分子量為96.4kDa的蛋白質(zhì)[SEQIDNO7]。相反，突變體A618的對(duì)應(yīng)序列在位置2311處的突變使內(nèi)含子3供體部位發(fā)生了突變。這導(dǎo)致內(nèi)含子3出現(xiàn)拼接錯(cuò)誤，從理論上說(shuō)，在翻譯399個(gè)氨基酸之后會(huì)在內(nèi)含子3中產(chǎn)生早熟終止密碼子。突變體A618LOX-1基因結(jié)構(gòu)內(nèi)的終止密碼子將產(chǎn)生44.5kDa的截短的翻譯蛋白質(zhì)[SEQIDNO8]。實(shí)施例12LOX-1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的RT-PCR檢測(cè)在2002年春季期間，在丹麥的哥本哈根將cv.Vintage、突變系G(低LOX，在Douma等的以WO02/053721A1公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT/IB01/00207中)、cv.Barke和突變體D112的大麥植物栽培在溫室中。在開(kāi)花那天標(biāo)記麥穗，在開(kāi)花(DAF)20、40和60天后收獲麥穗。將麥穗保持在-80℃，直到可以同時(shí)處理全部樣品。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，從正在發(fā)育的穎果上分割出總共10個(gè)胚，利用FastRNA、GreenRNA分離試劑盒(Qbiogene)，依據(jù)廠家的介紹提取RNA。RT-PCR反應(yīng)模板由100ng上述胚RNA組成。20ulRT-PCR反應(yīng)包含每個(gè)引物50pmol，RT-PCR酶混合物5U(Promega)。在MJ循環(huán)控制裝置中進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增48℃45分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃1分鐘，1個(gè)循環(huán)；94℃1分鐘、65℃1分鐘和72℃1分鐘，30個(gè)循環(huán)；最后72℃10分鐘，1個(gè)循環(huán)。利用正向引物5′＞AGGGACTGCCGGACGATCTCA＜3′[SEQIDNO11]和反向引物5′＞GCCAGCTCCGGCACACTT＜3′[SEQIDNO12]產(chǎn)生292bp的RT-PCR片段。在1.0％的瓊脂糖凝膠上分離RT-PCR產(chǎn)物。利用QiaexII凝膠抽提試劑盒(Qiagen)純化長(zhǎng)度與被擴(kuò)增區(qū)域?qū)?yīng)的DNA片段，并將片段插入質(zhì)粒載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中。利用ABIPrism310遺傳分析器(ABI)對(duì)質(zhì)粒插入物的核苷酸序列進(jìn)行測(cè)序。利用Lasergene序列分析軟件包ver.5(DNASTAR)完成DNA序列比較。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物跨越相當(dāng)于基因組克隆[SEQIDNO1]的核苷酸位置3283-3659的區(qū)域。這一區(qū)域包含長(zhǎng)83bp的內(nèi)含子5，而不含有DNA的RNA制備物的RT-PCR模板缺少內(nèi)含子5(圖17A)。因?yàn)镈NA序列分析證實(shí)分離的片段是LOX-1基因的組成部分，而且也證實(shí)缺少內(nèi)含子5序列，因此可以排除錯(cuò)誤擴(kuò)增產(chǎn)生來(lái)自LOX-2酶的大麥基因片段(圖17D)。因此，擴(kuò)增的片段代表RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物擴(kuò)增的產(chǎn)物。從cv.Vintage和突變系G的20、40和60DAF大麥胚純化的RNA的RT-PCR比較分析顯示，相似發(fā)育階段的兩個(gè)品種的LOX-1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的水平相似。在從20DAF到60DAF的時(shí)間期限里L(fēng)OX-1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物水平逐步增加(圖17B)。與此相反，當(dāng)對(duì)cv.Barke和突變體D112的相似數(shù)據(jù)集進(jìn)行研究時(shí)，卻觀察到顯著差異。RT-PCR實(shí)驗(yàn)顯示和cv.Barke相比，突變體D112中的LOX-1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的豐度基本上低于cv.Barke(圖17C)?？傊猛蛔凅wD112的LOX-1基因的啟動(dòng)子區(qū)域的潛在突變可以解釋這一觀察結(jié)果。其他仍未知的因素也可能參與突變體D112中LOX-1基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。在這方面，不能排除突變體D112的LOX-1的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的終止密碼子產(chǎn)生了無(wú)義密碼子介導(dǎo)的mRNA分解(Isshikietal.，2001)。實(shí)施例13攜帶D112突變的大麥突變體的遺傳檢測(cè)現(xiàn)代大麥育種策略經(jīng)常包含加速誘變到商業(yè)化過(guò)程的生物技術(shù)。因此，就檢測(cè)有價(jià)值基因中的單核苷酸多態(tài)性而言，早期篩選植物材料是有用的。將這一技術(shù)用于基因組DNA技術(shù)，并將其與高通量系統(tǒng)結(jié)合有可能在幼苗期將培育系的數(shù)目減少50％。CAPS測(cè)定。突變體D112子代系的LOX-1基因的克隆和測(cè)序已經(jīng)顯示突變被傳送到下一代。這是一項(xiàng)費(fèi)勁的技術(shù)，對(duì)實(shí)際的大麥育種沒(méi)有用處。利用酶切擴(kuò)增多態(tài)序列測(cè)定(CAPS)在育種材料中可以鑒定低LOX系G特異的突變，在Douma等的以WO02/053721A1公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT/IB01/00207的實(shí)施例4中已經(jīng)公開(kāi)這一點(diǎn)。但是，突變體D112的LOX-1基因中的突變性質(zhì)不能用來(lái)在包含該突變的60-bp的區(qū)域中產(chǎn)生改變的限制性酶切圖譜。SNP測(cè)定。這種方法的備用方案是進(jìn)行包含單個(gè)核苷酸多態(tài)性(SNP)的分析。SNP是在一個(gè)位點(diǎn)表現(xiàn)出至少兩個(gè)不同核苷酸的突變點(diǎn)。該分析以兩組基因組PCR反應(yīng)的組合為基礎(chǔ)。兩個(gè)反應(yīng)都包含一個(gè)位點(diǎn)特異性引物，以及兩個(gè)SNP引物中的一個(gè)(每個(gè)引物分別針對(duì)該系列的每個(gè)等位基因)。每個(gè)植物系進(jìn)行兩組PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)的結(jié)果是SNP引物結(jié)合突變體等位基因的序列或者結(jié)合野生型等位基因的序列(圖18A)。在這幾種方法的一種方法中，SNP分析以電泳PCR產(chǎn)物后評(píng)估染色體帶型鑒定突變系為基礎(chǔ)。利用植物DNA分離試劑盒(RocheAppliedScience)，依照廠家的介紹，從幼苗的葉組織分離17個(gè)培育系和野生型cv.Barke的大麥基因組DNA。用來(lái)擴(kuò)增野生型LOX-1基因的SNP的寡核苷酸引物是5′＞CAAGGTGCGGTTGCTGGTGTC＜3′[SEQIDNO13]和5′＞CTCGCGCGTCTCCTTCCAC＜3′[SEQIDNO14]。對(duì)應(yīng)突變體D112基因的引物是5′＞CAAGGTGCGGTTGCTGGTGTC＜3′[SEQIDNO13]和5′＞CTCGCGCGTCTCCTTCCAT＜3′[SEQIDNO15]。在擴(kuò)增包含突變體D112或cv.Barke的部分LOX-1編碼區(qū)域的166bp的DNA片段的PCR反應(yīng)中可以使用這些引物組合(圖18A)。依照廠家的說(shuō)明，20ul體積的PCR反應(yīng)包括基因組DNA100ng，25pmol引物和2.5UFastStartTaqDNA聚合酶(Roche)。在MJ循環(huán)控制裝置中進(jìn)行PCR擴(kuò)增96℃5分鐘，1個(gè)循環(huán)；95℃1分鐘、70℃1分鐘和72℃1min，20個(gè)循環(huán)；最后72℃10分鐘，1個(gè)循環(huán)。在1.0％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物。利用QiaexII凝膠抽提試劑盒(Qiagen)純化長(zhǎng)度與被擴(kuò)增區(qū)域?qū)?yīng)的DNA片段。利用雙脫氧核苷酸鏈終止反應(yīng)，在ABIPrism310遺傳分析器(ABI)直接對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。利用Lasergene序列分析軟件包ver.5(DNASTAR)完成序列比較。SNP分析篩選總共17個(gè)育種系的數(shù)據(jù)和直接對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)編輯后產(chǎn)生相同結(jié)果。以這些實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)推斷出SNP技術(shù)可用于證實(shí)原材料包含和大麥突變體D112的LOX-1基因的序列相同的基因序列(圖18B)。實(shí)施例14檢測(cè)樣品混合物中的突變體釀造工業(yè)可以使用大麥和麥芽的混合物來(lái)生產(chǎn)啤酒，這樣可以掩蔽具體麥芽品種不需要的化學(xué)特性。單純證實(shí)種子材料的用途可以包含通過(guò)PCR分析擴(kuò)增突變基因。利用突變體D112和cv.Barke的樣品混合物和突變系G(Douma等的以WO02/053721A1公開(kāi)的PCT申請(qǐng)PCT/IB01/00207)和cv.Barke的樣品混合物對(duì)麥芽混合物樣品進(jìn)行了SNP分析。分析了包含0、20、40、60、80和100％突變體D112谷物的六個(gè)大麥樣品。在另一個(gè)系列中，分析了包含0、20、40、60、80和100％突變系G谷物的六個(gè)大麥樣品。利用NucleonPhytopureDNA分離試劑盒(Amersham)，依照廠家的介紹從磨碎的谷物中分離DNA。用來(lái)擴(kuò)增突變體D112的LOX-1基因的166-bp的SNP的寡核苷酸引物是5′＞CAAGGTGCGGTTGCTGGTGTC＜3′[SEQIDNO13]和5′＞CTCGCGCGTCTCCTTCCAT＜3′[SEQIDNO15]。用來(lái)擴(kuò)增突變系G的LOX-1基因的370-bp的SNP的引物是5′＞TACGTGCCGCGGGACGAGAAG＜3′[SEQIDNO16]和5′＞TGATCATGACCGGGTTGACGT＜3′[SEQIDNO17]。同時(shí)利用四個(gè)引物以多重反應(yīng)完成PCRs(圖19A)。依照酶供應(yīng)商提供的說(shuō)明，每個(gè)20ul體積的反應(yīng)包括基因組DNA100ng，每個(gè)引物50pmol和10ulRedTaq聚合酶溶液(Sigma)。在MJ循環(huán)控制裝置中進(jìn)行PCR擴(kuò)增95℃1分鐘，1個(gè)循環(huán)；94℃1分鐘、66℃1分鐘和72℃30秒，25個(gè)循環(huán)；最后72℃10分鐘，1個(gè)循環(huán)。在1.0％瓊脂糖凝膠上分離PCR產(chǎn)物。利用QiaexII凝膠抽提試劑盒(Qiagen)純化長(zhǎng)度與被擴(kuò)增區(qū)域?qū)?yīng)的DNA片段，并將片段插入質(zhì)粒載體pCR2.1-TOPO(Invitrogen)中。用特異的寡核苷酸引物，通過(guò)雙脫氧核苷酸鏈終止反應(yīng)確定質(zhì)粒插入物的兩條鏈的核苷酸序列，在MegaBACE1000DNA測(cè)序儀(Amersham)進(jìn)行分析。利用Lasergene序列分析軟件包ver.5(DNASTAR)完成序列比較。存在于圖19B中的凝膠分析顯示所有來(lái)源于包含突變體D112谷物的混合物的樣品的SNP分析都是陽(yáng)性。類似地，鑒定包含來(lái)自突變系G的材料的樣品也是可能的?？傊z傳分析可以很容易地證實(shí)是否使用了包含突變系G或者突變體D112的突變體LOX植物的大麥混合物。實(shí)施例15突變體D112的重組LOX-1是失活的已經(jīng)顯示突變體D112的LOX-1基因包含早熟終止密碼子(參照實(shí)施例10)。因此，期待該基因在植物中的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致合成僅包含野生型LOX-1中發(fā)現(xiàn)的665個(gè)起始氨基酸殘基的截短形式的對(duì)應(yīng)LOX酶。在大腸桿菌細(xì)胞中表達(dá)限定截短形式的LOX-1的核苷酸序列以證實(shí)這種形式的LOX-1是失活的酶，不能催化大麥突變體D112的細(xì)胞中形成HPODEs。在大腸桿菌中表達(dá)野生型LOX-1和突變體LOX-1的質(zhì)粒。通過(guò)使用標(biāo)準(zhǔn)的PCR規(guī)程擴(kuò)增編碼LOX-1的全部開(kāi)放讀框。使用的模板是大麥cDNA(vanMechelen，1999)，引物是5′＞CATATGCTGCTGGGAGGGCTG＜3′(SEQIDNO18；起始密碼子用黑體字標(biāo)記；NdeI位點(diǎn)下面劃下劃線)和5′＞GAArTCTTAGATGGAGATGCTGTTGGG＜3′(SEQIDNO19；用黑體字顯示野生型終止密碼子的互補(bǔ)序列；EcoRI位點(diǎn)下面劃下劃線)。獲取和純化擴(kuò)增的2,597bp的DNA片段。用NdeI-EcoRI消化PCR片段，并將其連接到pET19b載體(Novagen)的大NdeI-EcoRI片段上，產(chǎn)生在下游的長(zhǎng)10個(gè)殘基的His尾的編碼序列的框架內(nèi)克隆了LOX-1的pETL1表達(dá)質(zhì)粒。DNA測(cè)序分析證實(shí)質(zhì)粒插入物包含正確的序列。下一個(gè)實(shí)驗(yàn)包含構(gòu)建表達(dá)截短形式的LOX-1的質(zhì)粒。目標(biāo)是將pETL1中的LOX-1的開(kāi)放讀碼框的666號(hào)密碼子變成終止密碼子，這樣使大腸桿菌細(xì)胞中蛋白質(zhì)合成產(chǎn)生截短形式的LOX-1。為了完全防止大腸桿菌中核糖體讀遍終止密碼子，構(gòu)建pETL1的LOX-1的665號(hào)密碼子下游的所有密碼子都被終止密碼子TGA移走和取代的表達(dá)質(zhì)粒。使用下列操作規(guī)程。在存在引物5′＞CTACCCGTACGCGGCGGACGGGCT＜3′([SEQIDNO20]，退火連接突變體D112的LOX-1基因中突變上游的序列；BsiWI位點(diǎn)下劃下劃線)和5′＞TCCTGAATTCACGCCTGCACCTCCGTATCGC＜3′([SEQIDNO21]，EcoRI位點(diǎn)下劃下劃線；黑體字標(biāo)明插入的終止密碼子的互補(bǔ)序列)的情況下，使用PCR從pETL1擴(kuò)增129bp的片段。擴(kuò)增將終止密碼子和EcoRI位點(diǎn)插入片段中。隨后用BsiWI-EcoRI消化片段，并將其與質(zhì)粒pETL1的大BsiwI-EcoRI片段連接。得到的表達(dá)質(zhì)粒被命名為pETL2，而且通過(guò)DNA測(cè)序?qū)Σ迦胛锏恼_序列進(jìn)行了驗(yàn)證。轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞合成重組LOX蛋白質(zhì)。用載體pET19b，表達(dá)質(zhì)粒pETL1和pETL2(如上所述)分別轉(zhuǎn)化從Novagen購(gòu)買的大腸桿菌BL21細(xì)胞。在標(biāo)準(zhǔn)LuriaBroth(LB)培養(yǎng)基上接種包含質(zhì)粒的細(xì)菌細(xì)胞，并在37℃生長(zhǎng)2h。此后，添加1mMIPTG誘導(dǎo)異源基因表達(dá)，并在20℃培養(yǎng)整夜。通過(guò)以14,000g離心1分鐘收獲細(xì)胞，接著將細(xì)胞團(tuán)重懸浮在由50mM磷酸鈉鹽緩沖液組成的變性溶液中，其中磷酸鈉鹽緩沖液中補(bǔ)充有6M鹽酸胍(hydrochloride)、0.3MNaCl和10mM咪唑。在冰上聲波處理后，14,000g離心溶解的細(xì)胞1分鐘，將上層清液與鎳-樹(shù)脂(Novagen)混合，接著在4℃溫育30分鐘。通過(guò)離心沉淀鎳-樹(shù)脂，用如上所述的變性溶液沖洗兩次。最后，利用補(bǔ)充有0.3MNaCl和0.5M咪唑的50mM的磷酸鈉緩沖液，從樹(shù)脂洗脫His標(biāo)記的蛋白質(zhì)兩次。通過(guò)SDS-PAGE分離等分的分級(jí)洗脫的樣品(圖20)。從攜帶pETL1和pETL2中的細(xì)胞中分別獲得100kDa的相當(dāng)于LOX-1的清晰條帶和66kDa的相當(dāng)于計(jì)算的截短LOX-1的質(zhì)量的清晰條帶。攜帶pET19b的細(xì)胞在洗脫部分不產(chǎn)生條帶。截短形式的LOX-1是失活的。在標(biāo)準(zhǔn)LB培養(yǎng)基上接種攜帶pET19b、pETL1和pETL2的大腸桿菌BL21，并在37℃生長(zhǎng)2h。此后，添加1mMIPTG誘導(dǎo)異源基因表達(dá)，并在20℃培養(yǎng)整夜。通過(guò)以14,000g離心1分鐘收獲細(xì)胞，通過(guò)將細(xì)胞團(tuán)重懸浮在BugBuster和Benzonase(Novagen)的混合物中獲取細(xì)胞溶解產(chǎn)物。利用包含6.25mM3-二甲基氨基苯甲酸(dimethylaminobenzoicacid)、0.3125mM亞油酸、0.1mM3-甲基-2-苯噻唑啉腙(benzothiazolinehydrazone)和0.05mg/ml血紅蛋白的脂加氧酶測(cè)定試劑測(cè)量溶解產(chǎn)物中的LOX活性。將180ul這種試劑與10ul各自的細(xì)胞溶解產(chǎn)物混合，在室溫下溫育10分鐘。通過(guò)分光光度計(jì)測(cè)量595nm處的吸光度確定的溫育期間產(chǎn)生的吲達(dá)胺的數(shù)值相當(dāng)于細(xì)胞溶解產(chǎn)物的脂加氧酶活性。用pETL1(產(chǎn)生His標(biāo)記LOX-1)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞顯示出大的LOX-1活性，而生產(chǎn)突變體D112特異的截短LOX-1的細(xì)胞與僅用載體轉(zhuǎn)化的對(duì)照細(xì)胞具有相同的LOX活性(表8)。這表明大麥突變體D112的截短的LOX-1是失活的。實(shí)施例16轉(zhuǎn)基因大麥植物質(zhì)粒構(gòu)建物?；蛐蛄斜徊迦霕?biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒載體，例如pUC18的聚合接頭區(qū)域。圖21中列出了插入物。在一個(gè)構(gòu)建物中(圖21A)，包含相同基因的內(nèi)含子1的玉蜀黍泛素-1啟動(dòng)子(Christensenetal.，1992；Jensenetal.，1996)指導(dǎo)bar基因轉(zhuǎn)錄(Whiteetal.，1990)，其中bar基因編碼可選擇標(biāo)記phoshinothricin乙酰轉(zhuǎn)移酶(PAT)。在第二個(gè)構(gòu)建物中，計(jì)劃有義抑制LOX-1基因(DoughertyandParks，1995)，大麥LOX-1的開(kāi)放閱讀框被立即插入玉蜀黍泛素-1啟動(dòng)子和內(nèi)含子1的下游(圖21B)。圖21C中顯示了使大麥LOX-1基因表達(dá)沉默的構(gòu)建物。大麥細(xì)胞中該構(gòu)建物的表達(dá)通過(guò)形成內(nèi)含子拼接的發(fā)夾式RNA使所述基因完全沉默，依照Smith等(2000)公開(kāi)的圖1a中詳細(xì)描述的數(shù)據(jù)來(lái)設(shè)計(jì)該構(gòu)建物。特別地，在圖21C的構(gòu)建物中表示為″內(nèi)含子1″的序列(上文)與Smith等(上文)公開(kāi)的圖1a中顯示的內(nèi)含子序列相同。圖21C中的構(gòu)建物的有義和反義臂代表相同的包含編碼大麥LOX-1的開(kāi)放閱讀框節(jié)斷的長(zhǎng)200bp的片段的相反方向，閱讀框的所述節(jié)段位于LOX-1開(kāi)放閱讀框的任何地方?；蛘?，長(zhǎng)200bp的序列是從大麥LOX-1編碼基因的終止密碼子下游的序列中選出來(lái)的。轉(zhuǎn)化和再生轉(zhuǎn)基因植物。為了共抑制編碼LOX-1的大麥基因，用包含圖21A，B中顯示的插入物的質(zhì)粒的混合物轟擊溫室生長(zhǎng)的cv.GoldenPromise供體大麥植物的不成熟的大麥胚，以及為了沉默所述基因用圖21A，C中顯示的質(zhì)?；旌衔镞M(jìn)行轟擊?？梢园凑誛an和Lemaux(1994)和Jensen等(上文)的詳細(xì)描述來(lái)完成轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)基因植物的繁殖?？梢陨L(zhǎng)轉(zhuǎn)基因植物幾代，或者用不同的大麥cv.對(duì)它授粉，然后鑒定具有想要的表型的后代植物?？梢陨L(zhǎng)兩代或更多代以保證想要的表型特征的表達(dá)能穩(wěn)定地保持和遺傳。收獲想要的表型特征已經(jīng)實(shí)現(xiàn)的種子進(jìn)行研究。為了研究編碼LOX-1的大麥基因的共抑制或沉默效果，首先分析轉(zhuǎn)基因顆粒來(lái)源于LOX-1的酶活力，本公開(kāi)文本的實(shí)施例1中已經(jīng)詳述這一點(diǎn)。隨后在制麥芽和釀造實(shí)驗(yàn)中研究沒(méi)有或有極少LOX-1活性的轉(zhuǎn)基因顆粒，本公開(kāi)文本的實(shí)施例5和實(shí)施例6中已經(jīng)詳述了對(duì)LOX-1無(wú)效顆粒進(jìn)行研究的方法。另外，對(duì)沒(méi)有或有極少LOX-1活性的轉(zhuǎn)基因顆粒的提取物進(jìn)行分析，利用Keller的美國(guó)專利No.5,942,661中描述的方法鑒定對(duì)曲霉生長(zhǎng)有消極效果的提取物。實(shí)施例17青香韻化合物生產(chǎn)青香韻化合物的過(guò)程包括(i)將LOX-1無(wú)效大麥顆粒轉(zhuǎn)換成磨得很細(xì)的粉末；(ii)將粉末懸浮到水里或指定的緩沖液中；(iii)溫育懸浮液。或者，讓粉末懸浮液和(a)脂肪酸(亞油酸或亞麻酸或其混合物)；或(b)對(duì)13-HPODE或13-HPOTE或兩者具有特異性的氫過(guò)氧化物裂解酶；或(c)包含所述脂肪酸和所述酶的混合物發(fā)生反應(yīng)；(iv)讓產(chǎn)生的醛與乙醇脫氫酶發(fā)生反應(yīng)；(v)純化醛或乙醇，制備有用的香料制品或香料組合物。實(shí)施例18LOX-1抑制劑用新近制備的重組LOX-1溶液進(jìn)行分析。在這一實(shí)驗(yàn)中，利用供應(yīng)商(Remel)介紹制備100ml的補(bǔ)充有100ug/ml氨芐青霉素的AB3菌種生長(zhǎng)培養(yǎng)基，然后接種用質(zhì)粒pETL1(編碼His標(biāo)記LOX-1；參照實(shí)施例15)轉(zhuǎn)化的整夜培養(yǎng)的大腸桿菌BL21(DE3)pLysS細(xì)胞5ml。在37℃繁殖獲得的細(xì)菌培養(yǎng)物直到細(xì)胞密度達(dá)到OD600＝0.8。在20℃溫育培養(yǎng)物30分鐘，然后補(bǔ)充0.4mMIPTG誘導(dǎo)異源基因表達(dá)，在20℃溫育整夜。離心15分鐘使培養(yǎng)細(xì)胞形成小丸，然后將其再懸浮在5mlBugBusterHT(Novagen)中，溫育20分鐘，同時(shí)溫和搖振水解核酸。此后，通過(guò)離心除去細(xì)胞碎片，過(guò)濾通過(guò)0.45μm過(guò)濾器使上層清液清澈，將上層清液添加到等體積的結(jié)合緩沖液中(50mM磷酸鈉緩沖液、pH7.5、補(bǔ)充有0.3MNaCl、10mM咪唑)。依照廠家的介紹，將得到的提取物加樣到HisTrapHP柱(AmershamBiosciences)上，用洗滌緩沖液(和結(jié)合緩沖液相同，除[咪唑＝150mM外)沖洗一次，用洗脫緩沖液(和結(jié)合緩沖液相同，除[咪唑＝500mM外)洗脫結(jié)合的蛋白質(zhì)。通過(guò)SDS-PAGE分析包含洗液和洗脫物蛋白質(zhì)的1ml級(jí)分的3ul等分(圖22A)，結(jié)果顯示洗脫物2的1ml級(jí)分包含～0.7mg的重組LOX-1。隨后純化的LOX-1被用于確定選擇的LOX抑制劑是否降低酶活性的測(cè)定中。首先，將亞油酸原液(按照實(shí)施例9的詳細(xì)描述制備)稀釋到初始濃度的1/10，產(chǎn)生2.4mM的亞油酸溶液。45ul的等份補(bǔ)充5ul包含0、5、12和24mM沒(méi)食子酸辛酯或NDGA(公認(rèn)的LOX-1抑制劑)的乙醇溶液。10ul等份的亞油酸抑制劑混合物被添加990ul的100mM的pH6.0的磷酸鈉緩沖液中，在添加5ul重組LOX-1(洗脫物2，參見(jiàn)上面)之前，在20℃溫育1分鐘。添加LOX-1后，記錄A2543分鐘。A254對(duì)時(shí)間的曲線圖的斜率決定LOX-1酶活力。結(jié)果概括在圖22B中，顯示微摩爾級(jí)濃度的抑制劑顯著抑制LOX-1。實(shí)施例19用LOX-1抑制劑--沒(méi)食子酸辛酯糖化利用與實(shí)施例5中描述的設(shè)備相似的設(shè)備可以對(duì)100ml包含25g大麥cv.Barke的麥芽或25gLOX-1無(wú)效突變體D112的麥芽的液體進(jìn)行糖化。37℃Mashing-in15分鐘、68℃糖化30分鐘、77℃mashing-off10分鐘，接下來(lái)最后煮沸麥芽汁60分鐘；溫度變化調(diào)節(jié)為1℃/分鐘。為了測(cè)試存在LOX-1抑制劑時(shí)的糖化效果，大麥cv.Barke的麥芽的碎麥芽在mashing-in階段補(bǔ)充0.5mM沒(méi)食子酸辛酯。平行開(kāi)動(dòng)的糖化包含用沒(méi)有添加沒(méi)食子酸辛酯的大麥cv.Barke的麥芽進(jìn)行試驗(yàn)，以及在存在或缺少0.5mM沒(méi)食子酸辛酯的情形下用LOX-1無(wú)效大麥突變體D112的麥芽進(jìn)行的糖化試驗(yàn)。在15分鐘mashing-in階段之后，在麥芽汁煮沸階段之后收集所有四種糖化的樣品等分，然后按照實(shí)施例6的描述確定T2N水平。結(jié)果概括在圖23中。在存在沒(méi)食子酸辛酯的情況下，觀察到用大麥cv.Barke的麥芽進(jìn)行糖化的麥芽汁樣品中T2N明顯下降，在mashing-in之后的樣品和煮沸的麥芽汁樣品中都是如此。此外，值得注意的是兩種麥芽的煮沸的麥芽汁中的T2N濃度達(dá)到相似的水平?？傊?，在mashing-in期間補(bǔ)充LOX-1抑制劑到碎麥芽中提供了一種產(chǎn)生以T2N水平降低為特征的麥芽汁的新方法。表1.未加工突變體(M3代)和子代(M4和M5代)的胚提取物的總LOX活性表2.農(nóng)學(xué)性能比較a在標(biāo)尺上指0-9，0代表沒(méi)有感染或倒伏，9代表嚴(yán)重感染或倒伏。b兩個(gè)不同地點(diǎn)的三個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的相對(duì)平均產(chǎn)量。表3.pilot麥芽制造實(shí)驗(yàn)后的分析表4.突變體D112產(chǎn)物中T2N水平降低。表5.啤酒儲(chǔ)藏對(duì)風(fēng)味的影響ppb等級(jí)評(píng)定a的等級(jí)評(píng)定標(biāo)度-0不存在；1弱；2顯著；3；中間；4強(qiáng)烈；5非常強(qiáng)烈。優(yōu)選低值b的等級(jí)評(píng)定標(biāo)度是1-5，優(yōu)選的高值，nd＝未確定表6.由正常大麥和突變體D112的麥芽產(chǎn)生的啤酒中的THAs表7.市場(chǎng)上可買到的啤酒中的THAs表8.從攜帶標(biāo)明的載體，在LB和IPTG中生長(zhǎng)過(guò)夜的細(xì)胞獲取的細(xì)胞粗提物的脂加氧酶活性a給出的是用方差標(biāo)明的四個(gè)單獨(dú)測(cè)量的平均值的結(jié)果。表9.序列表8.保藏信息已經(jīng)在美國(guó)的Va.20110的Manassas的Boulevard大學(xué)10801的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)對(duì)上面公開(kāi)的并在附加權(quán)利要求中敘述的CarlsbergA/S所有大麥突變體D112進(jìn)行保藏。保藏突變體D112的日期是2003年9月11日，由本申請(qǐng)的申請(qǐng)日之前取自在CarlsbergA/S的保藏物的2,500個(gè)顆粒組成。保藏突變體A618的日期是2003年10月13日，由本申請(qǐng)的申請(qǐng)日之前取自在CarlsbergA/S的保藏物的2,500個(gè)顆粒組成。為了滿足專利程序和其規(guī)則(布達(dá)佩斯條約)的要求，按照布達(dá)佩斯條約中有關(guān)國(guó)際承認(rèn)的微生物保存的條款來(lái)進(jìn)行這些保藏。這種保藏保證從保藏日起的30年里保持保藏物存活。保藏要滿足37C.F.R§1.801-1.809的全部要求，包含提供樣品成活的指征。突變體D112的ATCC登記號(hào)是PTA-5487。突變體A618的ATCC登記號(hào)是PTA-5584。通過(guò)說(shuō)明登記號(hào)碼和接受ATCC強(qiáng)加的標(biāo)準(zhǔn)限制，可以從ATCC獲得等分的保藏材料。但是，應(yīng)理解保藏物的可獲得性不構(gòu)成毀損政府行為授與的專利權(quán)而實(shí)施本發(fā)明主題的許可。在整個(gè)申請(qǐng)中，參考了多種出版物、專利和專利申請(qǐng)。為了更充分地描述本發(fā)明所屬領(lǐng)域的現(xiàn)狀，將這些出版物公開(kāi)的內(nèi)容在此全部引入本申請(qǐng)中作為參考。發(fā)明的上述說(shuō)明書(shū)是示范性的，其目的是為了說(shuō)明和解釋發(fā)明。應(yīng)理解可以不脫離本發(fā)明的精神和范圍對(duì)本發(fā)明作各種修飾。因此欲將下列權(quán)利要求書(shū)解釋為包含所有這種修飾。參考文獻(xiàn)專利文件US4,683,195；Mullis，K.B.etal.US4,708,964；Allen，L.M.US4,800,159；Mullis，K.B.etal.US4,880,637；Jordan，R.T.US5,008,294；Jordan，R.T.etal.US5,283,184；Jorgensen，R.A.andNapoli，C.A.US5,942,661；Keller，N.P.US6,008,034；Husleretal.US6,150,145；Husler，A.etal.US6,274,358；Holtz，R.B.etal.US6,355,862B1；Handa，A.K.andKausch，K.D；US專利申請(qǐng)2003/0074693A1；Cahoonetal.WO02/053721A1；12/2000；PCTInt′lAppl.；Douma，A.C.etal.WO2004/085652A1；10/2004；PCTInt′lAppl.；Hirota，N.etal.其他出版物Alonso，J.M.etal.，″Genome-wideinsertionalmutagenesisofArabidopsisthaliana.″Science301，653-657，2003.AmericanAssociationofCerealChemists，″ApprovedmethodsoftheAmericanAssociationofCerealChemists.″ISBN0-913250-86-4(1995).AmericanSocietyofBrewingChemists，″MethodsofanalysisoftheAmericanSocietyofBrewingChemists.″ISBN1-881696-01-4(1992).Anthon，G.E.andBarrett，D.M.，″Colorimetricmethodforthedeterminationoflipoxygenaseactivity．″J.Agric.FoodChem.4932＝37，2001.Aruoma，O.I.etal.，″Evaluationoftheantioxidantandprooxidantactionsofgallicacidanditsderivatives.″J.Agric.FoodChem.411880-1885，1993.Ashrafi，K.etal.，″RNAianalysisofCaenorhabditiselegansfatregulatorygenes.″Nature421268-272，2003.Auld，D.L.etal.，″Rapeseedmutantswithreducedlevelsofpolyunsaturatedfattyacidsandincreasedlevelsofoleicacid.″CropSci.32657-662，1992.Axelrod，B.etal.，″Lipoxygenasefromsoybeans.″MethodsEnzymol.71442-451，1981.Bargmann，C.I.，″reversegeneticsRNAiscreensinCaenorhabditiselegans.″GenomeBiol.2Reviews1005.1-1005.3，2001.Baur，C.andGrosch，W.″Investigationaboutthetasteofdi-，tri-andtetrahydroxyfattyacids.″Z.Lebensm.Unters.Forsch.16582-84，1977a.Baur，C.etal.″EnzymaticoxidationoflinoleicacidFormationofbittertastingfattyacids.″Z.Lebensm.Unters.Forsch.164171-176，1977b.Bell，E.etal.，″AchloroplastlipoxygenaseisrequiredforjasmonicacidaccumulationinArabidopsis.″Proc.Natl.Acad.Sci.USA928675-8679，1995.Bell，E.andMullet，J.E.，″Lipoxygenasegeneexpressionismodulatedinplantsbywaterdeficit，wounding，andmethyljasmonate.″Mol.Gen.Genet.230456-462，1991.Bell，E.andMullet，J.E.，″CharacterizationofanArabidopsislipoxygenasegeneresponsivetomethyljasmonateandwounding.″PlantPhysiol.1031133-1137，1993.BiosInternational，″Data.″BiosIntern.438-42，2001.Blée，E.andJoyard，J.，″Envelopemembranesfromspinachchloroplastsareasiteofmetabolismoffattyacidhydroperoxides.″PlantPhysiol.110445-454，1996.Bohland，C.etal.，″Differentialinductionoflipoxygenaseisoformsinwheatupontreatmentwithrustfunguselicitor，chitinoligosaccharides，chitosan，andmethyljasmonate.″PlantPhysiol.114679-685，1997.BrautechnischeAnalysenmetoden，BandII，MetodensammlungderMitteleuropischenBrautechnischenAnalysenkommission.Section2.19″Schaum，″pp.118-125.SelbstverlagderMEBAK.ISBN3-9805814-5-4(2002)Burow，G.B.etal.，″ApeanutseedlipoxygenaseresponsivetoAspergilluscolonization.″PlantMol.Biol.42689-701，2000.Casey，R.，″Lipoxygenasesinthebreadmakingprocess.″In″FirstEuropeanSymposiumonEnzymesandGrainProcessing.″Angelino，S.A.G.F.，vanHamer，R.J.，Hartingsveldt，W.，Heidekamp，F(xiàn).，vanderLugt，J.P.，eds.，pp.188-194.TNONutritionandFoodResearchInstitute，1997.ISBN90-75202-04-0.Christensen，A.H.etal.，″MaizepolyubiquitingenesStructure，thermalperturbationofexpressionandtranscriptsplicing，andpromoteractivityfollowingtransfertoprotoplastsbyelectroporation.″PlantMol.Biol.18675-689，1992.Colbert，T.etal.，″High-throughputscreeningforinducedpointmutations.″PlantPhysiol.126480-484，2001.Cornish-Bowden，A.，″NomenclatureforincompletelyspecifiedbasesinnucleicacidsequencesRecommendations1984.″NucleicAcidsRes.133021-3030，1985.Croft，K.P.C.etal.，″VolatileproductsofthelipoxygenasepathwayevolvedfromPhaseolusvulgaris(L.)leavesinoculatedwithPseudomonassyringaepvphaseolicola.″PlantPhysiol.10113-24，1993.Davies，C.S.andNielsen，N.C.，″Geneticanalysisofnull-alleleforlipoxygenase-2insoybean.″CropSci.26460-463，1986.Dougherty，W.G.andParks，T.D.，″TransgenesandgenesuppressionTellingussomethingnew？″Curr.Opin.CellBiol.7399-405，1995.Drost，B.W.etal.，″Roleofindividualcompoundsinbeerstaling.″Tech.Q.MBAA11127-134，1974.Drost，B.W.etal.，″Flavorstability.″J.Am.Soc.Brew.Chem.48124-131，1990.Ellis，R.P.etal.，″Barleydomestication-Hordeumspontaneum，asourceofnewgenesforcropimprovement.″ScottishCropResearchInstitute，AnnualReport1998/9997-100，1999.Alsoavailableathttp:/www.scri.sari.ac.uk/SCRI/upload/annualreportdocuments/99Indiv/14Barley.pdf.EuropeanBreweryConvention，″Analytica-EBC.″ISBN3-418-00759-7(1998).Feussner，I.andWasternack，C.，″Thelipoxygenasepathway.″Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.53275-297，2002.Forster，C.etal.，″Molecularanalysisofanullmutantforpea(PisumsativumL.)seedlipoxygenase-2.″PlantMol.Biol.391209-1220，1999.Gardner，H.W.andGrove，M.J.，″Methodtoproduce9(S)-hydroperoxidesoflinoleicandlinolenicacidsbymaizelipoxygenase.″Lipids36529-533，2001.Giaever，G.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tgtgggagctcgccaaggcctacgtcgccgtcaatgactc2940cgggtggcaccagctcgtcagccactggtacgttctccacggtcgatgtgattcagtcag3000tcgatgcacaacaactgatcgaaatatgattgattgaaacgcgcaggctgaacactcacg3060cggtgatggagccgttcgtgatctcgacgaaccggcaccttagcgtgacgcacccggtgc3120acaagctgctgagcccgcactaccgcgacaccatgaccatcaacgcgctggcgcggcaga3180cgctcatcaacgccggcggcatcttcgagatgacggtgttcccgggcaagttcgcgttgg3240ggatgtcggccgtggtgtacaaggactggaagttcaccgagcagggactgccggacgatc3300tcatcaagaggtacgtacctggtaaatgttatgaatgtgtaaaacaaattgggcgtctcg3360ctcactgacaggaacgtggtaaaaaaaatgcaggggcatggcggtggaggacccgtcgag3420cccgtacaaggtgcggttgctggtgtcggactacccgtacgcggcggacgggctggcgat3480ctggcacgccattgagcagtacgtgagcgagtacctggccatctactacccgaacgacgg3540cgtgctgcagggcgatacggaggtgcaggcgtggtggaaggagacgcgcgaggtcgggca3600cggcgacctcaaggacgccccatggtggcccaagatgcaaagtgtgccggagctggccaa3660ggcgtgcaccaccatcatctggatcgggtcggcgctgcatgcggcagtcaacttcgggca3720gtacccctacgcggggttcctcccgaaccggccgacggtgagccggcgccgcatgccgga3780gcccggcacggaggagtacgcggagctggagcgcgacccggagcgggccttcatccacac3840catcacgagccagatccagaccatcatcggcgtgtcgctgctggaggtgctgtcgaagca3900ctcctccgacgagctgtacctcgggcagcgggacacgccggagtggacctcggacccaaa3960ggccctggaggtgttcaagcggttcagcgaccggctggtggagatcgagagcaaggtggt4020gggcatgaaccatgacccggagctcaagaaccgcaacggcccggctaagtttccctacat4080gctgctctaccccaacacctccgaccacaagggcgccgctgccgggcttaccgccaaggg4140catccccaacagcatctccatctaa4165<212>類型DNA<211>長(zhǎng)度4165序列名稱SEQIDNO6序列描述突變體A618大麥的基因組序列，其跨越相應(yīng)于編碼cv.NerudaLOX-1的基因的起始密碼子和終止密碼子之間區(qū)域的片段序列--------<213>生物體名稱大麥(Hordeumvulgare)cv.Neruda<400>PreSequenceStringMLLGGLIDTLTGANKSARLKGTVVLMRKNVLDLNDFGATIIDGIGEFLGKGVTCQLISST60AVDQDNGGRGKVGAEAELEQWVTSLPSLTTGESKFGLTFDWEVEKLGVPGAIVVNNYHSS120EFLLKTITLHDVPGRSGNLTFVANSWIYPAANYRYSRVFFANDTYLPSQMPAALKPYRDD180ELRNLRGDDQQGPYQEHDRIYRYDVYNDLGEGRPILGGNSDHPYPRRGRTERKPNASDPS240LESRLSLLEQIYVPRDEKFGHLKTSDFLGYSIKAITQGILPAVRTYVDTTPGEFDSFQDI300INLYEGGIKLPKVAALEELRKQFPLQLIKDLLPVGGDSLLKLPVPHIIQENKQAWRTDEE360FAREVLAGVNPVMITRLTEFPPKSSLDPSKFGDHTSTITAEHIEKNLEGLTVQQALESNR420LYILDHHDRFMPFLIDVNNLPGNFIYATRTLFFLRGDGRLTPLAIELSEPIIQGGLTTAK480SKVYTPVPSGSVEGWVWELAKAYVAVNDSGWHQLVSHWLNTHAVMEPFVISTNRHLSVTH540PVHKLLSPHYRDTMTINALARQTLINAGGIFEMTVFPGKFALGMSAVVYKDWKFTEQGLP600DDLIKRGMAVEDPSSPYKVRLLVSDYPYAADGLAIWHAIEQYVSEYLAIYYPNDGVLQGD660TEVQAWWKETREVGHGDLKDAPWWPKMQSVPELAKACTTIIWIGSALHAAVNFGQYPYAG720FLPNRPTVSRRRMPEPGTEEYAELERDPERAFIHTITSQIQTIIGVSLLEVLSKHSSDEL780YLGQRDTPEWTSDPKALEVFKRFSDRLVEIESKVVGMNHDPELKNRNGPAKFPYMLLYPN840TSDHKGAAAGLTAKGIPNSISI862<212>類型PRT<211>長(zhǎng)度862序列名稱SEQIDNO7序列描述cv.NerudaLOX-1全長(zhǎng)蛋白的蛋白質(zhì)序列序列--------<213>生物體名稱大麥(Hordeumvulgare)突變體A618<400>PreSequenceStringMLLGGLIDTLTGANKSARLKGTVVLMRKNVLDLNDFGATIIDGIGEFLGKGVTCQLISST60AVDQDNGGRGKVGAEAELEQWVTSLPSLTTGESKFGLTFDWEVEKLGVPGAIVVNNYHSS120EFLLKTITLHDVPGRSGNLTFVANSWIYPAANYRYSRVFFANDTYLPSQMPAALKPYRDD180ELRNLRGDDQQGPYQEHDRIYRYDVYNDLGEGRPILGGNSDHPYPRRGRTERKPNASDPS240LESRLSLLEQIYVPRDEKFGHLKTSDFLGYSIKAITQGILPAVRTYVDTTPGEFDSFQDI300INLYEGGIKLPKVAALEELRKQFPLQLIKDLLPVGGDSLLKLPVPHIIQENKQAWRTDEE360FAREVLAGVNPVMITRLTMSQRLFVHCVCMVSMVRKCRS399<212>類型PRT<211>長(zhǎng)度399序列名稱SEQIDNO8序列描述突變體A618的失活的、截短的LOX-1蛋白質(zhì)序列序列--------<213>生物體名稱寡核苷酸<400>PreSequenceStringgaaagcgaggagaggaggccaagaacaa28<212>類型DNA<211>長(zhǎng)度28序列名稱SEQIDNO9序列描述用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物(有義引物)序列<213>生物體名稱寡核苷酸<400>PreSequenceStringttattcatccatggttgccgatggcttaga30<212>類型DNA<211>長(zhǎng)度30序列名稱SEQIDNO10序列描述用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物(反義引物)序列--------<213>生物體名稱寡核苷酸<400>PreSequenceStringagggactgccggacgatctca21<212>類型DNA<211>長(zhǎng)度21序列名稱SEQIDNO11序列描述用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物(有義引物)序列--------<213>生物體名稱寡核苷酸<400>PreSequenceStringgccagctccggcacactt18<212>類型DNA<211>長(zhǎng)度18序列名稱SEQIDNO12序列描述用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物(反義引物)序列--------<213>生物體名稱寡核苷酸<400>PreSequenceStringcaaggtgcggttgctggtgtc21<212>類型DNA<211>長(zhǎng)度21序列名稱SEQIDNO13序列描述用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物(有義引物)序列--------<213>生物體名稱寡核苷酸<400>PreSequenceStringctcgcgcgtctccttccac19<212>類型DNA<211>長(zhǎng)度19序列名稱SEQIDNO14序列描述用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物(反義引物)序列--------<213>生物體名稱寡核苷酸<400>PreSequenceStringctcgcgcgtctccttccat19<212>類型DNA<211>長(zhǎng)度19序列名稱SEQIDNO15序列描述用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物(反義引物)序列--------<213>生物體名稱寡核苷酸<400>PreSequenceStringtacgtgccgcgggacgagaag21<212>類型DNA<211>長(zhǎng)度21序列名稱SEQIDNO16序列描述用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物(有義引物)序列--------<213>生物體名稱寡核苷酸<400>PreSequenceStringtgatcatgaccgggttgacgt21<212>類型DNA<211>長(zhǎng)度21序列名稱SEQIDNO17序列描述用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物(反義引物)序列--------<213>生物體名稱寡核苷酸<400>PreSequenceStringcatatgctgctgggagggctg21<212>類型DNA<211>長(zhǎng)度21序列名稱SEQIDNO18序列描述用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物(有義引物)序列--------<213>生物體名稱寡核苷酸<400>PreSequenceStringgaattcttagatggagatgctgttggg27<212>類型DNA<211>長(zhǎng)度27序列名稱SEQIDNO19序列描述用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物(反義引物)序列--------<213>生物體名稱寡核苷酸<400>PreSequenceStringctacccgtacgcggcggacgggct24<212>類型DNA<211>長(zhǎng)度24序列名稱SEQIDNO20序列描述用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物(有義引物)序列--------<213>生物體名稱寡核苷酸<400>PreSequenceStringtcctgaattcacgcctgcacctccgtatcgc31<212>類型DNA<211>長(zhǎng)度31序列名稱SEQID.NO21序列描述用于PCR擴(kuò)增的寡核苷酸引物(反義引物)權(quán)利要求1.包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的LOX-1活性的5％的大麥植物或其部分。2.權(quán)利要求1的大麥植物或其部分，其中所述大麥植物的所述部分是顆粒。3.權(quán)利要求1的大麥植物或其部分，其中所述植物的胚包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的胚的LOX-1活性的5％。4.權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)的大麥植物或其部分，其中所述大麥植物或其部分與野生型大麥植物相比，包含小于1％的LOX-1蛋白質(zhì)。5.權(quán)利要求1到4任一項(xiàng)的大麥植物或其部分，其中所述大麥植物是通過(guò)包含下列步驟的方法產(chǎn)生的；或者所述植物是通過(guò)包括下列步驟的方法產(chǎn)生的植物的子代(i)確定野生型大麥顆?；蚱洳糠值腖OX-1活性；(ii)誘變處理大麥植物，和/或大麥顆粒，和/或大麥胚，和/或大麥細(xì)胞和/或大麥組織，從而獲得M0代大麥；(iii)繁殖所述誘變處理的大麥植物、顆粒、細(xì)胞、組織和/或胚至少2代，獲得Mx代大麥植物，其中X是≥2的整數(shù)；(iv)從所述Mx代大麥植物獲取顆?；蚱洳糠?；(v)確定所述顆粒或其部分的LOX-1活性；和(vi)選擇誘變處理的顆?；蚱洳糠值腖OX-1活性小于野生型或其部分的LOX-1活性的5％的植物；6.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的大麥植物或其部分，其中所述植物L(fēng)OX-1的編碼基因包含早熟無(wú)義密碼子。7.權(quán)利要求6的大麥植物或其部分，其中所述植物L(fēng)OX-1的編碼基因包含無(wú)義密碼子，所述密碼子相當(dāng)于SEQIDNO2的堿基no.s3572-3574。8.權(quán)利要求6的大麥植物或其部分，其中所述植物選自由命名為D112，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)的保藏號(hào)是No.PTA-5487的植物和其子代植物組成的組。9.權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的大麥植物或其部分，其中所述植物L(fēng)OX-1的編碼基因在拼接位點(diǎn)內(nèi)包含至少一個(gè)突變。10.權(quán)利要求9的大麥植物或其部分，其中所述植物L(fēng)OX-1的編碼基因包含拼接位點(diǎn)突變，所述突變相當(dāng)于SEQIDNO6的堿基no.2311。11.權(quán)利要求9的大麥植物或其部分，其中所述植物選自由命名為A618，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)保藏號(hào)是No.PTA-5584的植物和其子代植物組成的組。12.權(quán)利要求1到11的任一項(xiàng)的大麥植物或其部分，其中所述植物的特征在于(i)具有增強(qiáng)的抗病性；或(ii)具有產(chǎn)生真菌毒素的潛能降低；或(iii)包含供組織培養(yǎng)用的可再生細(xì)胞；或(iv)(i)到(iii)的特性的任何組合。13.權(quán)利要求12的大麥植物或其部分，更進(jìn)一步地以存在LOX-1編碼基因?yàn)樘卣鳎渲兴龌虬?i)早熟無(wú)義密碼子；或(ii)拼接位點(diǎn)突變。14.權(quán)利要求13的大麥植物，更進(jìn)一步地以存在LOX-1編碼基因?yàn)樘卣?，其中所述基因包?i)相當(dāng)于SEQIDNO2的堿基no.s3572-3574的無(wú)義密碼子；或(ii)相當(dāng)于SEQIDNO6的堿基no.2311的拼接位點(diǎn)突變。15.包含權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的大麥植物或其部分的組合物。16.包含加工的大麥植物或其部分的麥芽組合物，其中所述大麥植物是權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的大麥植物。17.權(quán)利要求16的麥芽組合物，其中所述大麥植物的所述部分是顆粒。18.利用權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的大麥植物或其部分，或利用從所述大麥植物或其部分或其混合物制備的麥芽組合物制備的麥芽汁組合物。19.權(quán)利要求18的麥芽汁組合物，其中所述大麥植物的所述部分是顆粒。20.權(quán)利要求18的麥芽汁組合物，其中所述麥芽組合物是權(quán)利要求16和17任一項(xiàng)的麥芽組合物。21.權(quán)利要求18-20任一項(xiàng)的麥芽汁組合物，其中利用酶組合物或酶混合劑組合物制備所述組合物。22.從(i)包含權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的大麥植物或其部分的組合物和(ii)權(quán)利要求16和17任一項(xiàng)的麥芽組合物的混合物制備的組合物。23.從權(quán)利要求22的組合物制備的麥芽汁組合物或飲料。24.具有穩(wěn)定感官品質(zhì)的飲料，其中所述飲料是通過(guò)加工權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的大麥植物或其部分獲得的。25.權(quán)利要求24的飲料，其中所述飲料是啤酒。26.權(quán)利要求24的飲料，其中所述飲料是利用從所述大麥植物的顆粒制備的麥芽制備的。27.權(quán)利要求24-26任一項(xiàng)的飲料，其中所述飲料是利用從大麥植物或其部分制備的麥芽汁組合物，或者從大麥植物或其部分制備的麥芽組合物制備的，其中所述大麥植物包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的LOX-1活性的5％。28.權(quán)利要求24的飲料，其中所述飲料是從未發(fā)芽的大麥植物或其部分制備的。29.權(quán)利要求24-28任一項(xiàng)的飲料，其中所述飲料是非發(fā)酵飲料。30.權(quán)利要求24-29任一項(xiàng)的飲料，其中所述大麥植物或其部分包含編碼LOX-1的基因，所述基因包含(i)無(wú)義密碼子；或(ii)拼接位點(diǎn)突變。31.權(quán)利要求30的飲料，其中編碼LOX-1的基因包含(i)無(wú)義密碼子，所述密碼子相當(dāng)于SEQIDNO2的堿基no.s3572-3574；或(ii)拼接位點(diǎn)突變，所述突變相當(dāng)于SEQIDNO6的堿基no.2311。32.具有穩(wěn)定感官品質(zhì)的飲料，其中所述飲料是通過(guò)利用大麥植物制造的，所述飲料內(nèi)9，12，13-三羥基十八碳烯酸與9，10，13-三羥基十八碳烯酸比例最大是1.8。33.權(quán)利要求32的飲料，其中所述飲料是發(fā)酵大麥植物或其部分或其提取物而制備的，其中所述大麥植物包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的5％。34.權(quán)利要求32-33任一項(xiàng)的飲料，其中所述飲料是啤酒。35.具有穩(wěn)定感官品質(zhì)的飲料，其中所述飲料是通過(guò)利用大麥植物制造的，所述飲料在存在4-6ppm亞硫酸鹽的情況下，在37℃溫育4周后包含最多0.05ppb的游離反式2-壬烯醛(T2N)。36.權(quán)利要求35的飲料，其中所述飲料是通過(guò)發(fā)酵大麥植物或其部分或其提取物而制造的，其中所述大麥植物包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的5％。37.權(quán)利要求35-36任一項(xiàng)的飲料，其中所述飲料內(nèi)9，12，13-三羥基十八碳烯酸與9，10，13-三羥基十八碳烯酸比例最大是1.8。38.權(quán)利要求35-37任一項(xiàng)的飲料，其中所述飲料是啤酒。39.由權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的大麥植物或其部分產(chǎn)生的植物產(chǎn)品。40.權(quán)利要求39的植物產(chǎn)品，其中所述植物產(chǎn)品是飲料。41.利用權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的大麥植物或其部分生產(chǎn)(i)食物組合物；或(ii)飼料組合物；或(iii)香味原料組合物；或(iv)(i)到(iii)的任何組合的方法。42.包含權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)的大麥植物或其部分的食物組合物、飼料組合物或香原料組合物。43.在大麥中表達(dá)重組蛋白質(zhì)以獲取權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的大麥植物的方法，其中所述方法包括用包含，作為可操作性連接的元件，在大麥植物或其部分中可表達(dá)的啟動(dòng)子、編碼所述重組蛋白質(zhì)的DNA序列和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域的核酸序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所述植物。44.調(diào)整大麥中蛋白質(zhì)水平以獲取權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的大麥植物的方法，其中該方法包括用包含，作為可操作性連接的元件，在大麥植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子、DNA序列和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域的核酸序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化所述植物，其中所述DNA序列的表達(dá)通過(guò)下列機(jī)制降低編碼所述蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)(i)反義沉默；或(ii)共抑制沉默；或(iii)RNA干擾。45.制備權(quán)利要求1-14任一項(xiàng)的大麥植物的方法，其中該方法包括用包含，作為可操作性連接的元件，在大麥植物中可表達(dá)的啟動(dòng)子，DNA序列和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域的核酸序列穩(wěn)定轉(zhuǎn)化該植物，其中所述DNA序列的表達(dá)通過(guò)下列機(jī)制降低編碼LOX-1的基因的表達(dá)(i)反義沉默；或(ii)共抑制沉默；或(iii)RNA干擾。46.生產(chǎn)具有穩(wěn)定感官品質(zhì)的飲料的方法，所述方法包括步驟(i)制備包含權(quán)利要求1的大麥植物或其部分的組合物；(ii)將(i)的組合物加工成飲料；從而獲得具有穩(wěn)定感官品質(zhì)的飲料。47.權(quán)利要求46的方法，其中步驟(i)包括從所述大麥植物或其部分的顆粒制備麥芽組合物。48.權(quán)利要求46和47任一項(xiàng)的方法，其中該方法更進(jìn)一步地包含與LOX抑制劑一起溫育。49.權(quán)利要求46的方法，其中將組合物加工成飲料包括糖化步驟。50.權(quán)利要求46的方法，其中在所述糖化步驟期間添加LOX抑制劑。51.產(chǎn)生具有低LOX-1活性或沒(méi)有LOX-1活性的麥芽組合物的方法，所述方法包括步驟(i)提供權(quán)利要求2的顆粒；(ii)浸泡所述顆粒；(iii)在預(yù)先確定的條件下使浸泡的顆粒萌發(fā)；(iv)熱處理萌發(fā)的顆粒；從而制造沒(méi)有LOX-1活性或LOX-1活性低的麥芽組合物。52.制備包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的LOX-1活性5％的大麥植物的方法，包括步驟(i)確定野生型大麥顆?；蚱洳糠值腖OX-1活性；和(ii)誘變處理大麥植物，和/或大麥顆粒，和/或大麥胚，和/或大麥細(xì)胞和/或大麥組織，從而獲得M0代大麥；和(iii)繁殖所述誘變處理的大麥植物、顆粒、細(xì)胞、組織和/或胚至少2代，獲得Mx代大麥植物，其中x是≥2的整數(shù)；和(iv)從所述Mx大麥植物獲取顆?；蚱洳糠?；和(v)確定所述顆粒或其部分的LOX-1活性；和(vi)選擇誘變處理的顆?；蚱洳糠值腖OX-1活性小于野生型或其部分的LOX-1活性的5％的植物；從而獲取包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的LOX-1活性的5％的大麥植物。53.制備包含的LOX-1活性小于野生型大麥植物的LOX-1活性5％的大麥植物的方法，包括步驟(i)誘變處理大麥植物和/或大麥顆粒和/或大麥胚；和(ii)任選培育所述誘變處理的大麥植物和/或大麥顆粒和/或大麥胚；和(iii)確定編碼LOX-1的大麥基因中存在或缺少突變，其中所述突變導(dǎo)致基因編碼包含SEQIDNO3中所列出的序列的不到700個(gè)連續(xù)氨基酸的LOX-1多肽形式；和(iv)選擇攜帶(ii)提供的突變的植物。54.降低大麥LOX活性的方法，所述方法包括步驟(i)提供大麥植物或其部分或從大麥制備的植物產(chǎn)品，(ii)提供LOX抑制劑，其中所述LOX抑制劑是沒(méi)食子酸，鹽或酯，(iii)用所述LOX抑制劑溫育所述大麥植物或其部分或從大麥制備的植物產(chǎn)品，由此降低大麥LOX(優(yōu)選LOX-1)的活性。55.權(quán)利要求54的方法，其中所述抑制劑是沒(méi)食子酸辛酯。全文摘要本發(fā)明提供了LOX－1無(wú)效大麥和它產(chǎn)生的植物產(chǎn)品，例如利用合成脂肪酸轉(zhuǎn)換酶脂加氧酶－1有缺陷的大麥顆粒制造的麥芽。所述酶解釋說(shuō)明了與亞油酸轉(zhuǎn)化成脂加氧酶路徑代謝物-9－氫過(guò)氧十八碳二烯酸相關(guān)的主要活性，通過(guò)更進(jìn)一步地酶反應(yīng)或自發(fā)反應(yīng)，9－氫過(guò)氧十八碳二烯酸可以導(dǎo)致反式2－壬烯醛的出現(xiàn)。本發(fā)明使啤酒工人能夠生產(chǎn)即使在延期儲(chǔ)存飲料之后，仍缺乏可檢測(cè)的反式2－壬烯醛特異異味的啤酒。文檔編號(hào)A01H5/10GK1981041SQ200580015328公開(kāi)日2007年6月13日申請(qǐng)日期2005年3月9日優(yōu)先權(quán)日2004年3月11日發(fā)明者克勞斯·布雷達(dá)姆,奧利·奧爾森,伯吉特·斯卡德豪奇,芬恩·洛克,索倫·克努森,萊恩·M·貝克申請(qǐng)人:卡爾斯伯格公司