專利名稱：：植物通過選擇性抑制海藻糖-6-磷酸磷酸酶的脅迫耐性的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明包括能下調(diào)海藻糖-6-磷酸磷酸酶活性的核酸序列的響應(yīng)脅迫的表達(dá)，以提高植物產(chǎn)量和/或增強(qiáng)植物非生物脅迫耐性。
背景技術(shù)：
：非生物脅迫會(huì)以不同方式影響植物發(fā)育，這取決于脅迫的出現(xiàn)時(shí)間、嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間。例如，玉米植物相對耐旱，在生長季的早期和晚期可耐受中度到重度干旱。但是，玉米在開花前后10-14天期間對水脅迫相當(dāng)敏感。生長于美國玉米產(chǎn)區(qū)的抗旱玉米通常在開花期間的季夏中會(huì)經(jīng)歷水脅迫。該脅迫通常以由于胚珠/胚敗育致使籽粒形成減緩的形式表現(xiàn)。簡而言之，根系經(jīng)歷滲透脅迫時(shí)，它們可產(chǎn)生脫落酸(abscisisacid，ABA)并將其轉(zhuǎn)移至整林植物。在葉中，這可觸發(fā)氣孔封閉，由此減少蒸騰引起的水分損失。遺憾的是，這同時(shí)會(huì)限制氣體交換，由此減少光合作用。沒有獲自光合作用的蔗糖，正在發(fā)育的胚珠或胚很快就會(huì)耗盡其淀粉儲(chǔ)備，并且停止發(fā)育。植物的海藻糖途徑示于圖1。表明該途徑與通過蔗糖-6-磷酸合成酶(8)和蔗糖-6-磷酸磷酸酶(9)的蔗糖合成相似。海藻糖合成由海藻糖-6-磷酸合成酶(T6PS)(10)催化，產(chǎn)生海藻糖-6-磷酸(T6P)和海藻糖-6-磷酸磷酸酶(T6PP)(11)，產(chǎn)生海藻糖。海藻糖酶(12)可將海藻糖剪切成兩個(gè)葡萄糖分子。這些酶在微生物中得到很好的表征，并且由于在將植物完全干燥時(shí)可累積得到可測量的海藻糖，因此認(rèn)為這些酶僅出現(xiàn)在少數(shù)植物例如耐旱W/roMa/wzwM/7a6e/7/尸o7/a等中(參見Mtilleretal，1995)。很多作物并不累積可檢測的海藻糖，因此大部分研究人員認(rèn)為它們?nèi)狈Ξa(chǎn)生海藻糖的能力。另外，外用海藻糖可能對植物組織有毒(Veluthambietal.，1981)。二十世紀(jì)90年代早期克隆了編碼T6PS和T6PP的大腸桿菌基因(Kaasenetal.，1992)，這形成了使用遺傳工程來改進(jìn)植物水脅迫耐性的早期研究的基礎(chǔ).，1996;Goddijnetal.，1997)。這項(xiàng)早期的植物遺傳工程研究以獲自微生物的證據(jù)為基礎(chǔ)。非常確定的是海藻糖可增強(qiáng)微生物和大分子的干燥耐性(Weimken，1990)。這些實(shí)驗(yàn)表明海藻糖水平和干燥耐性之間存在直接關(guān)系。很多小組曾嘗試通過遺傳工程在植物中實(shí)現(xiàn)海藻糖合成(Ronteinetal.，2002)。他們的大部分研究旨在提高海藻糖水平(Hoekemaetal.，1999)。許多發(fā)明使用大腸桿菌或酵母的海藻糖合成基因。總之，盡管工程化植物將植物產(chǎn)生海藻糖的能力提高了十倍，但是它們也僅產(chǎn)生少量的海藻糖(Londesboroughetal.，2000)。另一些研究表明，轉(zhuǎn)基因植物中僅有少量海藻糖累積的部分原因是由于內(nèi)源海藻糖酶活性(Goddijnetal.，1997)。其它研究人員認(rèn)為蔗糖和淀粉合成限制了植物產(chǎn)生海藻糖的能力(Hoekemaetal.，1999)。最近的出版物公開了通過抑制海藻糖酶(Goddijnetal.，2003)、表達(dá)大腸桿菌T6PS-T6PP融合蛋白(Gargetal.，2002;Jangetal.,2003)以及在質(zhì)體中表達(dá)大腸桿菌海藻糖合成基因(Lebeletal.，2004)來增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物中海藻糖累積的方法。一些小組獲得了有所改進(jìn)的海藻糖累積，并且，大部分小組報(bào)道，盡管在轉(zhuǎn)基因植物中觀察到總體生長缺陷，但耐旱性卻小有改進(jìn)。酵母的基因組信息和互補(bǔ)研究的進(jìn)展鑒定了編碼功能性T6PS、T6PP和海藻糖酶的植物基因(Vogeletal.，1998;Bldzquezetal.，1998;Aescherbacheretal.,1999;Mtilleretal.，2001;Vogeletal.，2001)。海藻糖途徑的基因表達(dá)水平較低，但是在所有被檢測組織中均檢測到表達(dá)。幾個(gè)植物品種的序列信息表明存在*藻糖代謝基因(Leymanetal.，2001;Wingler，2002;EastmondandGraham,2003;Eastmondetal.，2003)。大部分植物遺傳工程研究中，將海藻糖途徑酶或經(jīng)過設(shè)計(jì)來影響海藻糖途徑酶活性的基因(例如反義RNA構(gòu)建體)打靶至胞質(zhì)溶膠(Holmstrometal.，1996;Goddijnetal.，1997;Romeroetal.，1997;Pilon-Smitsetal.，1998;Gargetal.，2002;Jangetal.,2003)。盡管這些植物的合成能力大大提高或有所改觀，但是這些實(shí)驗(yàn)對這些植物中的海藻糖或海藻糖-6-磷酸影響甚小。事實(shí)上，表達(dá)大腸桿菌T6PS和T6PP基因的煙草和馬鈴薯植物易于遭受多種(pleotropic)生長缺陷(Goddijnetal.，1997)。因此，需要開發(fā)耐脅迫并且不表現(xiàn)生長缺陷的植物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及包含一種多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物，所述多核苷酸編碼一種靶向內(nèi)源T6PP基因的核酸，其中分離的DNA分子受控于在營養(yǎng)組織中受脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。該核酸還可在正在成熟的籽粒中發(fā)育表達(dá)。植物在脅迫條件如水分虧缺等條件下，本發(fā)明的核酸的脅迫"^秀導(dǎo)表達(dá)可提高碳的利用率以發(fā)育成小花/籽粒。因此，轉(zhuǎn)化至植物中的本發(fā)明多肽可使得更多光合產(chǎn)物被指引至正在發(fā)育的胚珠/胚，從而在遭遇階段性脅迫的生長環(huán)境中產(chǎn)生穩(wěn)定產(chǎn)量。本發(fā)明還包括含有編雞核酸的多核苷酸的分離的DM分子，該分離的DNA序列有效連接至在營養(yǎng)組織中受脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其中所述核酸能下調(diào)T6PP基因。本發(fā)明包括一種提高植物的籽粒中淀粉含量的方法，包括如下步驟用包含編碼核酸的多核苷酸的DNA分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述多核苷酸有效連接至在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其中所述核酸能下調(diào)T6PP;由所述植物細(xì)胞形成植物；在所述植物繁殖期間遭遇脅迫條件時(shí)，誘導(dǎo)所述核酸在所述植物的營養(yǎng)組織中表達(dá)；并且所述轉(zhuǎn)基因植物和不含所述DM分子的同源植物在基^同的脅迫條件下生長時(shí)，與所述同源植物的籽粒中的淀粉含量相比，提高籽粒中的淀粉含量。本發(fā)明還包括下調(diào)植物的營養(yǎng)組織中的T6PP基因的表達(dá)的雙鏈短干擾核酸(siRM)分子，其中所述siRNA分子包含至少約21個(gè)堿基對。本發(fā)明包括下調(diào)T6PP基因的表達(dá)的雙鏈siRNA分子，其中所述雙鏈siRNA分子的第一條鏈包括與T6PP基因或其一部分的核苷酸序列基本相似的核苷酸序列，并且其中所述雙鏈siRNA分子的另一條鏈包括與第一條鏈的序列互補(bǔ)的核苷酸序列。本發(fā)明還包括含有編碼核酸的多核苷酸的分離的DNA分子，所述多核苷酸有效連接至在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其中所述核酸能下調(diào)T6PP基因。本發(fā)明包括包含多核苷酸的分離的DNA分子，其中所述多核苷酸表示于SEQIDNO.6。本發(fā)明包括包含多核苷酸的分離DM分子，其中所述核苷酸序列包含SEQIDNO.6的至少約21個(gè)連續(xù)堿基對。本發(fā)明包括包含編碼核酸的多核苷酸的分離DNA分子，所述多核苷酸有效連接至在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其中所述核酸能下調(diào)T6PP基因，并且其中所述多核苷酸位于相對于所述啟動(dòng)子的有義或反義方向。本發(fā)明還包括包含編碼核酸的多核苷酸的分離DNA分子，所述多核苷酸有效連接至營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其中所述核酸能下調(diào)T6PP基因，其中所述啟動(dòng)子來源于Rabl7基因的5，區(qū)域，并在植物中展現(xiàn)出啟動(dòng)子活性。本發(fā)明還包括包含編碼核酸的多核苷酸的分離DNA分子，所述多核苷酸有效連接至在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其中所述核酸能下調(diào)T6PP基因，其中所述啟動(dòng)子來源于Rabl7基因的5'區(qū)域，并在植物中展現(xiàn)出啟動(dòng)子活性，并且還包含來源于Rabl7基因的3'區(qū)域，并在植物中展現(xiàn)出終止子活性。本發(fā)明還包括包含編碼核酸的多核苷酸的分離DNA分子，所述多核苷酸有效連接至在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其中所述核酸能下調(diào)T6PP基因，其中所述啟動(dòng)子包含DNA的約100-1649個(gè)連續(xù)核苷酸，其中所述DNA的連續(xù)核苷酸與具有序列SEQIDNO.42的DNA的約100至1649個(gè)連續(xù)核苷酸具有85%至100%同一性。本發(fā)明還包括包含編碼核酸的多核苷酸的分離DNA分子，其中所述核酸能形成雙鏈RNA。本發(fā)明還包括包含編碼核酸的多核苷酸的分離DNA分子，其中所述核酸包含共抑制型RNA。本發(fā)明還包括包含編碼核酸的多核苷酸的分離DNA分子，其中所述核酸包含催化性RM。本發(fā)明還包括包含編碼核酸的多核苷酸的分離DNA分子，其中所述核酸序列能形成三鏈核酸。本發(fā)明還包括包含編碼核酸的多核苷酸的分離DNA分子，所述多核苷酸有效連接至在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其中所述核酸能下調(diào)T6PP基因，其中所述啟動(dòng)子也在種子組織中表達(dá)。本發(fā)明還包括具有包含編碼核酸的多核苷酸的分離DNA分子的植物細(xì)胞，所述多核苷酸有效連接至在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其中所述核酸能下調(diào)T6PP基因，并且本發(fā)明還包括來源于所述植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還包括一種分離的DNA分子，其中所述DM分子表示于SEQIDNO.8或SEQIDNO.18。圖l為典型植物細(xì)胞中的初級(jí)糖代謝途徑的模式圖。示出了與淀粉和蔗糖合成相關(guān)的各種糖和活化糖。本領(lǐng)域已表明海藻糖合成的永久性阻斷是致命的。但是，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，由于使用脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子在營養(yǎng)組織中表達(dá)T6PP-RNAi所致的T-6-P至海藻糖途徑的條件性阻斷將在脅迫誘導(dǎo)或發(fā)育模式中重新引導(dǎo)合成為蔗糖或淀粉的流量。圖2為示出玉米T6PP1cDNA序列如何組裝的模式圖。在(A)部分，通過玉米EST和cDNA數(shù)據(jù)庫的TBLASTN查詢鑒定cDNA，并由Sequencher組裝。A部分的底部示出的鏈l、2和3示出plus(+)可譯框架。鏈l(ZmT6PP-1)含有最大的連續(xù)可譯框架并被加粗。(B瑯分示出ZmT6PP-l蛋白質(zhì)序列。圖3A和3B示出T6PP蛋白質(zhì)序列的比對圖。擬南芥(Arabidopsis)AtT6PPA和AtT6PPB序列與水稻和玉米同源物0sT6PP-l、0sT6PP-2、ZmT6PP-1、ZmT6PP-2和ZmT6PP-3進(jìn)行比對。比對圖還包括ZmT6PP-乾標(biāo)。使用VectorNTI中的AlignX(第7.1版)進(jìn)行比對。圖4A示出玉米、水稻和擬南芥T6PP蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。圖4B示出相似性和變異性表，該表顯示出每種蛋白質(zhì)彼此之間沿橫軸的相似性以及每種蛋白質(zhì)彼此之間沿縱軸的變異性。相似性數(shù)值在每一列的數(shù)字"100"之上，變異性數(shù)值在其下。圖5是示出0sT6PP-l基因在不同組織中的表達(dá)分布的直方圖。相對表達(dá)在100之上時(shí)被認(rèn)為是顯著的。該表達(dá)分布與已知的擬南芥AtT6PP-A基因表達(dá)相一致。圖6為示出玉米EST(GenBank編號(hào)No.BE510187、AW171812、A畫1181、AI855276、BE453688和AI941695)的序列比對的才莫式圖。ZmT6PP克隆序列數(shù)據(jù)表示為t3.rev.91331.abi和tl.rev.91323.abl。還鑒定了用來克隆ZmT6PP-lcDNA片段和構(gòu)建ZmT6PP-dsRNA盒的引物。圖7是被稱為pCR4-T0P0-ZmT6PP-NS的pCR4TOPO載體中的玉米T6PP-1cDNA片段的圖i普。圖8是pNOV3210表達(dá)盒的圖鐠。圖9是pN0V3232表達(dá)盒的圖譜。圖10是pRabl7-T6PP-RMi構(gòu)建體的圖i普。完整的Rabl7表達(dá)盒可以Kpnl片段形式轉(zhuǎn)移。圖11A為才艮癌土i襄桿菌(J^ro6a"er/wzfz/邁e/"ac/e"s)二元載體pN0V2117的圖鐠，所述載體的T-DNA邊界內(nèi)含有磷酸甘露糖異構(gòu)酶(phosphmannoseisomerase，cPMI-Ol)的植物選捧標(biāo)記。圖11B為克隆至pN0V2117的才艮癌土壤桿菌Rabl7-T6PP-RNAi表達(dá)盒的圖鐠。圖12示出溫室實(shí)驗(yàn)的籽粒形成產(chǎn)量數(shù)據(jù)。代表每種基因型的植物在開花前后兩周期間經(jīng)受澆灌充分(WW)或鹽脅迫(SS)條件。然后對單性合子(WT)和半合子(TPP)的籽粒形成情況進(jìn)行評(píng)分。數(shù)據(jù)為平均值，n=3-5。圖13示出第二次溫室實(shí)驗(yàn)的籽粒形成產(chǎn)量數(shù)據(jù)。代表每種基因型的植物在開花前后兩周期間經(jīng)受澆灌充分(WW)或鹽脅迫(SS)條件。然后對單性合子(WT)和半合子(TPP)的籽粒形成情況進(jìn)行評(píng)分。數(shù)據(jù)為平均值，n=14-20。圖14示出田間Rabl7-T6PP-RNAiEvent(實(shí)例)78A18B的籽粒形成產(chǎn)量數(shù)據(jù)。收集田間每林植物的穗并將其去殼。對籽粒進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重。計(jì)算半合子植物和單性合子植物的平均值。星號(hào)表示半合子植物和單性合子植物之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異。圖15示出田間Rabl7-T6PP-RNAiEvent(實(shí)例)81A10B后代的產(chǎn)量數(shù)據(jù)。收集田間每抹植物的穗并對將其去殼。對籽粒進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重。計(jì)算半合子植物和單性合子植物的平均值。星號(hào)表示半合子植物和單性合子植物之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上存在顯著差異。圖16A和16B示出幾種植物的保守T6PPcDM序列的比對情況。該比對還包括T6PP-RNAi序列。使用VectorNTI中的AlignX(第7.1版)進(jìn)行比對。圖17示出幾種植物的保守T6PPcMA序列的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。該表示出每段序列與橫軸其它序列之間的相似性百分比。使用VectorNTI中的AlignX(第7.l版)進(jìn)行分析。具體實(shí)施例方式海藻糖途徑表示通過中心糖代謝的流量控制水平。幾項(xiàng)研究鑒定了調(diào)節(jié)圖1所示代謝網(wǎng)絡(luò)中的酶的控制機(jī)理。這些數(shù)據(jù)并不詳盡。但是，考慮到植物中海藻糖途徑和途徑基因表達(dá)的普遍存在(Wingler，2002)以及途徑進(jìn)入點(diǎn)的基因敲除的致命性(Eastmondetal.，2002)，本發(fā)明認(rèn)為海藻糖途徑可能作為幫助調(diào)節(jié)胞質(zhì)溶膠中葡萄糖-l-磷酸(g-l-P)、葡萄糖-6-磷酸(g-6-P)和果糖-6-磷酸(f-6-P)含量多少的限制點(diǎn)起作用。在形成這些分子的能力超過利用它們的能力的情況下，海藻糖途徑可作為"溢洪道"快速滅活g-6-P和二磷酸尿苷葡萄糖(UDP-g)，并循環(huán)使用葡萄糖部分。通過這種將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物隨后將這些產(chǎn)物再轉(zhuǎn)化成原來的底物的能力，該途徑建立了無需消耗能量的表觀無效循環(huán)。這種觀點(diǎn)在植物生物化學(xué)網(wǎng)絡(luò)中并非沒有先例(Ronteinetal.,2002b;Ronochaetal.，2001)。由于這種控制機(jī)理在維持系統(tǒng)穩(wěn)定中起著更大的作用，因此它們消耗少量但必須的能量是值得的。因此，本發(fā)明還認(rèn)為海藻糖途徑可提供快速和可能低容量的(low-capacity)控制機(jī)制，以穩(wěn)定胞質(zhì)溶膠的己糖磷酸含量。海藻糖途徑用來與g-6-p和UDP-g的其它代謝過程如淀粉合成、蔗糖合成和糖酵解相竟?fàn)?。本發(fā)明考慮到，如果使用強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子使基因工程植物表達(dá)異源蛋白質(zhì)例如T6PP或T6PS,它們可能會(huì)不受內(nèi)源性的調(diào)節(jié)，而使得活化的糖類離開中心碳代謝。這會(huì)浪費(fèi)相當(dāng)?shù)哪芰坎⑶視?huì)阻礙生長。因此，本發(fā)明的組合物和方法包括使用這樣一種啟動(dòng)子它在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)，還可在正在成熟的籽粒中發(fā)育表達(dá)，將它有效連接至一種核酸分子，所述核酸分子在植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)可抑制內(nèi)源T6PP基因或其產(chǎn)物的表達(dá)。通過使用這種啟動(dòng)子，植物遭受環(huán)境脅迫時(shí)，可指導(dǎo)糖類合成籽粒發(fā)育所需的淀粉和蔗糖。本發(fā)明使用遺傳工程通過下調(diào)來降低或消除玉米內(nèi)源T6PP基因的表達(dá)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知多種改變內(nèi)源基因表達(dá)的方法。如下文詳細(xì)描述的那樣，轉(zhuǎn)錄后基因沉默(PTGS)、三鏈形成核酸、核酶、失活蛋白亞基和單鏈單克隆抗體全都可用來消除或遏制基因表達(dá)。在包括植物在內(nèi)的多種真核生物中，雙鏈RM(dsMA)可觸發(fā)與雙鏈RNA分子的序列相同的任何RNA的破壞(HutvignerandZamore，2002)。這始于通過多結(jié)構(gòu)域RNA酶mDicer酶將dsRNA轉(zhuǎn)化成為21-23個(gè)核苷酸的短片段(Leeetal.，2004;Phametal.,2004)。這些小干擾RNA(siRNA)可指導(dǎo)與siRNA序列互補(bǔ)的靼RNA的降解(Elbashiretal.，2001)。另外，Dicer還可將約70個(gè)核苷酸的前體莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA剪切成被稱為微小RNA(miRNA)的21-23個(gè)核苷酸的單鏈RNA(Grishoketal.，2001;Reinhartetal.，2002)。這是用于以序列特異性方式抑制內(nèi)源和異源基因的表達(dá)的RNA干擾(RNAi)技術(shù)的基礎(chǔ)(Fireetal.，1998;Carthew，2001;Elbashiretal.，2001)?？梢远喾N方式設(shè)計(jì)RNAi抑制構(gòu)建體，例如，轉(zhuǎn)錄可以形成長發(fā)夾分子的反向重復(fù)序列，轉(zhuǎn)錄被間隔序列(可為例如GUS或內(nèi)含子序列等無關(guān)序列)分開的反向重復(fù)序列等。本發(fā)明還考慮到通過相對啟動(dòng)子對有義和反義RNA鏈的轉(zhuǎn)錄，或有義和反義基因的共轉(zhuǎn)錄。反義RNA技術(shù)還可用來下調(diào)特異性內(nèi)源基因的表達(dá)。這是一種用來改變目標(biāo)植物酶的水平或活性的下調(diào)方法。反義RNA在RNA翻譯水平上引起下調(diào)。已表明Shewmaker等人(1992)所述反義RNA引起的下調(diào)對多種植物基因均是有效的(Rothsteinetal.，1987;Smithetal.，1988;vanderKroletal.，1988;Birdetal.，1991;Bartleyetal.,1992;Grayetal"1992;Knutzonetal.，1992;Shimadaetal.，1993;Kull，etal.，1995;SlabasandElborough,2000)。在細(xì)胞核中，反義RNA可直接干擾轉(zhuǎn)錄或與異源核RNA(hrRNA)形成雙鏈體。或者，在細(xì)胞質(zhì)中，反義RNA可與互補(bǔ)mRNA形成雙鏈分子并阻止mRNA翻譯成為蛋白質(zhì)。Seymour等人(1993)所述的共抑制是可用于下調(diào)植物基因表達(dá)的另一種方法。與反義RM不同，共抑制型RNA位于與從靶基因轉(zhuǎn)錄的RNA相同的方向，即"有義"方向。它已被廣泛用于生產(chǎn)基因水平發(fā)生改變的轉(zhuǎn)基因植物(Napolietal.,1990;Brusslanetal.，1993;Vaucheretetal.,1995;Jorgensenetal.，1996)。共抑制機(jī)理被認(rèn)為是由于通過位于染色體DNA的相對鏈上的遠(yuǎn)側(cè)啟動(dòng)子的連讀轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義RNA所致(Griersonetal.1991)。現(xiàn)已理解所有形式的RNA介導(dǎo)基因沉默之間存在著共有特征(Matzkeetal.，2002;Tijstermanetal.，2002)。另一種下調(diào)方法涉及核酶技術(shù)的使用(Atkinsetal.，1995;De-Feyteretal.，1996)。同反義方法一樣，核酶技術(shù)也是在RM翻譯水平上起作用并涉及可結(jié)合并剪切所目的mRNA的催化性RNA分子的制備。最近已表明核酶技術(shù)是下調(diào)植物蛋白(WaterhouseandWang,2002)和控制植物病原體(Atkinsetal.，2002)的有效方法。再一種下調(diào)方法包括共抑制型核酸或"有義"核酸和dsRNA的使用?？蓸?gòu)建能結(jié)合基因中或轉(zhuǎn)錄DNA:RNA復(fù)合物中的雙螺旋核酸的核酸序列，以形成穩(wěn)定的含有三螺旋的核酸或三鏈體核酸來抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)(Frank-KamenetskiiandMirkin，1995)。使用形成三螺旋的堿基配對原則和目的基因或mRNA的核苷酸序列來構(gòu)建這類核酸序列。這類核酸序列可以多種方式阻斷靶基因型的活性，包括阻止基因的轉(zhuǎn)錄或通過結(jié)合由所述基因轉(zhuǎn)錄的mRNA。還可使用顯性失活遺傳學(xué)方法來下調(diào)特定類型的酶。顯性特征即轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的存在會(huì)使得酶活性降低或酶學(xué)最終產(chǎn)物的產(chǎn)量降低。一些酶是兩種或多種蛋白質(zhì)亞基的復(fù)合物。這種酶活性有賴于這些亞基形成功能性酶的正確組裝?？膳c其它亞基相互作用的非功能性亞基的表達(dá)可產(chǎn)生非功能性酶，由此降低酶活性。非功能性方面可涉及但不限于例如亞基相互作用、底物結(jié)合或酶催化。另一種下調(diào)植物中的蛋白質(zhì)的方法依賴于單克隆抗體(MAb)和/或其功能性片段例如特異性識(shí)別和結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)肽的單鏈抗體(SCAb)等的使用(Sukhapindaetal.，2004)。因此，可以降低相應(yīng)的過客蛋白(passengerprotein)的穩(wěn)態(tài)7jc平。上述技術(shù)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于下調(diào)基因的其它技術(shù)均可用于本發(fā)明。本發(fā)明包括通過構(gòu)建嵌合多核苷酸來下調(diào)內(nèi)源玉米T6PP基因，所述嵌合多核苷酸包括在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)的啟動(dòng)子和與啟動(dòng)子有效連接的一種核酸，其中所述核酸或其一部分在植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，它能降低植物細(xì)胞的內(nèi)源T6PP基因的表達(dá)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子在營養(yǎng)組織中可被干旱誘導(dǎo)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子來源于Rabl7基因的5'區(qū)域。本發(fā)明包括還具有來源于Rabl7基因的3，區(qū)域的終止子序列的多肽。使用重組啟動(dòng)子時(shí)，還對啟動(dòng)子進(jìn)行篩選使其引起T6PP-RNAi表達(dá)，并且該表達(dá)方式不同于天然狀態(tài)植物表達(dá)ZmT6PP-l蛋白的表達(dá)方式。例如，啟動(dòng)子可以對ZmT6PP-l蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有影響；無需由環(huán)境脅迫誘導(dǎo)而表達(dá)T6PP-RNAi;和/或脅迫表達(dá)T6PP-RNAi所響應(yīng)的環(huán)境脅迫與誘導(dǎo)Zm-T6PP-1蛋白表達(dá)所需的環(huán)境脅迫的形式或程度不同。本發(fā)明認(rèn)為不應(yīng)使用強(qiáng)組成型啟動(dòng)子來引起ZmT6PP-l基因表達(dá)的水平降低。這種強(qiáng)的組成型啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于胭脂氨酸合成酶(NOS)和章魚堿合酶(OCS)啟動(dòng)子(Jonesetal.，1992)、花椰菜花葉病毒(CaMV)19S和35S啟動(dòng)子(Odelletal.，1985)或增強(qiáng)型CaMV35S啟動(dòng)子(Kayetal.，1987)。已知海藻糖途徑的組成型下調(diào)會(huì)引起多種生長缺陷。最好是特異性下調(diào)T6PP來指導(dǎo)選擇細(xì)胞中的光合產(chǎn)物合成淀粉和蔗糖。組織特異性啟動(dòng)子可用來改變對脅迫高度敏感的組織中ZmT6PP-l的基因表達(dá)。組織特異性啟動(dòng)子的實(shí)例包括但不限于甘藍(lán)型油菜(及napin基因的種子特異性啟動(dòng)子(KridlandKnauf，1995)、大豆7S啟動(dòng)子(FujiwaraandBeachy，1994)、擬南芥12S球蛋白(十字花考牛蛋白，cruciferin)啟動(dòng)子(Pangetal.，1988)、玉米27kD玉米醇溶蛋白啟動(dòng)子(Uedaetal.，1992)和水稻谷蛋白l啟動(dòng)子(Gotoetal.，1999)、水果活性啟動(dòng)子例如番茄的E8啟動(dòng)子(Mehtaetal.，2002)、塊莖特異性啟動(dòng)子如patatin啟動(dòng)子(Kuehnetal.，2003)和核酮酶-1,5-雙-磷酸羧化酶小亞基(ssRUBISCO)(其表達(dá)在光合組織如葉中可被激活)的啟動(dòng)子(Laporteetal.，2001)?；蛘撸瑔?dòng)子可用來誘導(dǎo)T6PP-RNAi基因只在恰當(dāng)時(shí)間如在開花時(shí)或其前后出現(xiàn)的干旱之前表達(dá)，由此提高谷物的繁殖能力并提高土地的產(chǎn)量。這可通過種植者在需要時(shí)施用外源性誘導(dǎo)物來實(shí)現(xiàn)(ChuaandAoyama，2000;Caddocketal.，2003)。同樣，可4吏用這樣一種啟動(dòng)子在與植物正常展現(xiàn)其脫水耐性的脫水條件相比更潮濕的脫水條件下該啟動(dòng)子可開啟。這可以使植物響應(yīng)脫水的水平發(fā)生改變。已知的或已發(fā)現(xiàn)可使得植物細(xì)胞中的DNA被誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄為mRNA的啟動(dòng)子可用于本發(fā)明。這類啟動(dòng)子可獲自多種來源如植物和可誘導(dǎo)的微生物來源，并可被多種外源性刺激如冷、熱、脫水、發(fā)病和化學(xué)處理等激活。所選擇的具體啟動(dòng)子優(yōu)選能使得T6PP-RNAi充分表達(dá)以增強(qiáng)植物對環(huán)境脅迫條件如水分虧缺等的耐受性?？捎玫膯?dòng)子的實(shí)例包括但不限于由脫水和高鹽脅迫激活的DRE(C-重復(fù)序列)結(jié)合蛋白基因dreb2a的啟動(dòng)子(Liuetal.，1998);其表達(dá)由脫水、高鹽和用植物激素脫落酸(ABA)處理所誘導(dǎo)的△l-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)的啟動(dòng)子(Yoshibaetal.，1995;Zhangetal.，1997);其轉(zhuǎn)錄由鹽脅迫、水分虧缺和內(nèi)源性ABA所誘導(dǎo)的來自擬南芥的rd22基因的啟動(dòng)子(Yamaguchi-ShinozakiandShinozaki，1993a);其表達(dá)由干燥、鹽脅迫和外源性ABA處理所誘導(dǎo)的rd29b基因(Yamaguchi-ShinizakiandShinozaki,1993b)的啟動(dòng)子(Ishitanietal.，1998);其轉(zhuǎn)錄物在暴露于水分虧缺或外源性ABA處理的植物中累積的來自擬南芥的rabl8基因或其它脫水誘生蛋白基因的啟動(dòng)子(Nylanderetal.，2001);在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)并在正在成熟的籽粒中發(fā)育表達(dá)的玉米R(shí)abl7啟動(dòng)子(Vilardelletal.，1991);以及其表達(dá)可由發(fā)病生物誘導(dǎo)或由化學(xué)品如水楊酸和聚丙烯酸等誘導(dǎo)的發(fā)病相關(guān)蛋白la(PR-la)基因的啟動(dòng)子(Uknesetal.，1993)。應(yīng)該注意的是，可將上述啟動(dòng)子進(jìn)一步修飾以改變其表達(dá)特征。例如，可將rabl8基因的干旱/ABA誘導(dǎo)型啟動(dòng)子引入種子特異性啟動(dòng)子，使得rabl8啟動(dòng)子僅在正在發(fā)育的種子中被干旱/ABA誘導(dǎo)。同樣，通過連接來自上述啟動(dòng)子的足以賦予環(huán)境脅迫誘導(dǎo)性的DM片段可形成任何數(shù)目的嵌合啟動(dòng)子，以構(gòu)成具有其它特性的啟動(dòng)子，例如組織特異性啟動(dòng)子、發(fā)育調(diào)控啟動(dòng)子、光調(diào)控啟動(dòng)子、激素應(yīng)答啟動(dòng)子等。這可形成能用來在任何植物組織或植物組織的組合中表達(dá)T6PP-RMi的嵌合啟動(dòng)子。還可使表達(dá)出現(xiàn)在植物生命周期的某一特定時(shí)間或出現(xiàn)在整個(gè)植物生命周期。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的啟動(dòng)子可調(diào)節(jié)植物中ZmT6PP-l的表達(dá)，所述植物經(jīng)歷著多種非生物脅迫或環(huán)境脅迫，包括冷、熱、脫水和/或直接影響植物水分關(guān)系的鹽脅迫在內(nèi)。這些啟動(dòng)子來自下述基因或類似基因，包括但不限于表現(xiàn)出受冷、鹽和脫水脅迫誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子的CBF/DREB家族(Jaglo-0ttosenetal.，1998);在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)并在正在成熟的籽粒中發(fā)育表達(dá)的玉米R(shí)abl7啟動(dòng)子(Vilardelletal.，1991);LP3水分虧缺誘導(dǎo)基因(Wangetal.，2002);能響應(yīng)ABA和包括冷、高鹽、受傷和干旱在內(nèi)的脅迫條件的擬南芥CIPK3基因(Kimetal.，2003);受脫水、鹽度、極端溫度和ABAi秀導(dǎo)的大麥(Ao/^ew邁^//gare)HVA22基因(BrandsandHo，2002);來自鹽生植物中亞濱藜("r/;^eice/zm/as/a"'caIljin)的受干旱、鹽度、冷脅迫和ABA誘導(dǎo)的甜菜堿醛脫氫酶(AcBADH)基因(Yinetal.，2002);以及受鹽脅迫和ABA誘導(dǎo)的小麥Esi47基因(Shenetal.，2001)。脅迫誘導(dǎo)啟動(dòng)子指導(dǎo)下的內(nèi)源或外源核苷酸的表達(dá)可使得在不利環(huán)境條件如水分虧缺等下維持所需植物表型。含有上述啟動(dòng)子的表達(dá)盒可與轉(zhuǎn)錄終止子一起起作用。很多情況下，胭脂氨酸合成酶(NOS)終止子就起這種作用。本領(lǐng)域的許多技術(shù)人員認(rèn)為該終止子對于大部分應(yīng)用而言已經(jīng)足夠(Lessardetal.，2002)。但是也有例外。在某些情況下，NOS終止子被來濾于啟動(dòng)子所基于的相同基因的相似序列替換時(shí)，表達(dá)盒性能得到提高(Noetal.，2000;NuccioandThomas,2000;Moreno-FonsecaandCovarrubias，2001)。這些例外通常出現(xiàn)在使用NOS終止子不能產(chǎn)生令人滿意的結(jié)果時(shí)?；蚪K止序列在整個(gè)調(diào)控中的作用尚不能充分理解。認(rèn)識(shí)到這種潛能并需要真實(shí)再現(xiàn)內(nèi)源基因表達(dá)模式的那些技術(shù)人員將會(huì)用來源于用來產(chǎn)生啟動(dòng)子的基因的相似序列替換NOS終止子。同樣，本領(lǐng)域的技術(shù)人員也會(huì)選擇來源于非啟動(dòng)子所用的基因的基因終止子，目的是構(gòu)建具有所需調(diào)控性質(zhì)的表達(dá)盒。植物在花期前約兩周期間以及在花期第一周期間經(jīng)歷脅迫時(shí)，玉米中的脅迫誘導(dǎo)產(chǎn)量下降最為顯著。這對應(yīng)玉米發(fā)育的V12-V18期(Ritchieetal.，1997)。在此期間形成穗并確定小穂的數(shù)目和排布(Kiesselbach，1999)。胚珠(籽粒的前體)在小穗內(nèi)發(fā)育，并且它對脅迫(Zinselmeieretal.，1995a)如干旱等非常敏感。一項(xiàng)研究表明胚珠淀粉耗竭和發(fā)育不全的傾向之間有關(guān)系(Zinselmeieretal.，1999)。其它研究提出通過在脅迫期間增加流向胚珠的碳水化合物流量可逆轉(zhuǎn)子房發(fā)育不全(Zinselmeieretal.，1995b)。本發(fā)明涉及遺傳工程解決方案來減少玉米的環(huán)境脅迫相關(guān)產(chǎn)量損失，這通過使用在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)并且還會(huì)在正在成熟的籽粒中發(fā)育表達(dá)的啟動(dòng)子，在籽粒在環(huán)境脅迫期間發(fā)育時(shí)提高流向所述正在發(fā)育的籽粒中的碳水化合物流量來實(shí)現(xiàn)?？捎帽景l(fā)明的方法誘導(dǎo)脅迫耐性、并可用本發(fā)明的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化的合適植物的實(shí)例包括單子葉植物和雙子葉植物，例如農(nóng)作物、谷物、水果和蔬菜，例如油菜、向日葵、煙草、甜菜、棉花、大豆、玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、番茄、芒果、桃、蘋果、梨、草莓、香蕉、甜瓜、馬鈴薯、胡蘿卜、萵筍、甘藍(lán)和洋蔥等。實(shí)施例1:ZmTPPl基因的鑒定和獲取通過酵母^W缺失突變體的互補(bǔ)作用，第一種維管植物海藻糖-6-磷酸磷酸酶基因從擬南芥(^ra62Vo/^/s^^//a加)克隆得到(Vogeletal.1998)。當(dāng)時(shí)就已表明，被命名為"77^j和^777^(GenBank編號(hào)為AF007778和AF007779)的基因具有海藻糖-6-磷酸磷酸酶活性。將AtTPPA和AtTTPB蛋白序列用于玉米和水稻序列數(shù)據(jù)庫的TBLASTN查詢。序列比對將命中結(jié)果編組為單個(gè)基因。圖2A為描述定義ZmT6PP-l的比對的模式圖。鑒定了三種玉米T6PP同源物和兩種水稻T6PP同源物。對應(yīng)每種基因——ZmT6PP-l、-2和-3以及0sT6PP-l和-2——的所預(yù)測蛋白質(zhì)序列的cDNA序列被分別表示于SEQIDNO.1、2、3、4和5。圖3示出了這些T6PP與擬南芥T6PP的總體比對。使用系統(tǒng)樹(圖4A)和相似性/變異性表(圖4B)可進(jìn)一步分析每種蛋白質(zhì)彼此之間的關(guān)系。結(jié)果表明ZmT6PP-l是AtTPPA可能的玉米同源物，ZmT6PP-2是AtTPPB可能的玉米同源物。使ZmT6PP-l基因靶向失活，原因在于EST數(shù)據(jù)表明它以與AtT6PPA—致的方式表達(dá)。但是，由于玉米EST文庫的不相同的組織描述，EST數(shù)據(jù)有一定的局限性。為了進(jìn)行補(bǔ)償，使用0sT6PP-lcDNA序列來查詢表達(dá)分布數(shù)據(jù)。圖5中的結(jié)果表明，0sT6PP-l在大部分組織中以相對較低的水平表達(dá)，這與AtT6PPA的數(shù)據(jù)相一致(Vogeletal.，1998)。分兩步將來自玉米混合組織cDNA文庫的部分ZmT6PP-1cDM(SEQIDNO.13)進(jìn)行擴(kuò)增(圖6)。將文庫克隆至Invitrogen載體pCMVSP0RT6的Notl和Sail限制性酶切位點(diǎn)之間。被稱為T6PP1的第一片段在50ML反應(yīng)混合物中產(chǎn)生，所述反應(yīng)混合物由下述物質(zhì)組成1jliL玉米cDM文庫、200jiMdNTP(dATP、dCTP、dGTP、TTP)、1liL20jiM寡核苷酸引物ZmTPP-lb(5'-TTCTCCCTATCTATGTTGGAG-3，)(SEQIDNO.19)、1jlxL20juM寡核苷酸引物ZmTPP-2(5'-CGCAACACAGTGAAACACTAGAAGG-3，)(SEQIDN0.20)、1|uL10xExpandHighFidelity緩沖液和1|iLExpandHighFidelity聚合酶(RocheDiagnostics,Cat.No.1759078)。熱循環(huán)程序在94。C進(jìn)行2分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(94匸15秒、58°C30秒、68'C1.0分鐘)，之后68'C進(jìn)行5.0分鐘。被稱為T6PP2的第二片段在50jaL反應(yīng)混合物中產(chǎn)生，所述反應(yīng)混合物由下述物質(zhì)組成ljuL玉米cDM文庫、200juMdNTP、ljuL20yM寡核苷酸引物ZmTPP-2r(5'-CCTTCTAGTGTTTCACTGTGTTGCG-3，)(SEQIDNO.21)、1jiL20pM寡核苷酸引物psport-正向引物(5，-GCCAGTGCCTAGCTTATAATACG-3，)(SEQIDNO.22)、1jiL10xExpandHighFidelity緩沖液和1juLExpandHighFidelity聚合酶(RocheDiagnostics,Cat,No.1759078)。熱循環(huán)程序在94匸進(jìn)行2分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(94t)15秒、58°C30秒、68匸l.O分鐘)，之后68。C進(jìn)行5.Q分鐘。使用采用重疊延伸PCR法的剪接法將T6PP1和T6PP2片段連接起來。50pL反應(yīng)混合物由如下物質(zhì)組成2pLT6PPl反應(yīng)混合物、2jiLT6PP2反應(yīng)混合物、200jLiMdNTP、1jiL20juM寡核苷酸引物ZmTPP-lb、ljiL20mM寡核苷酸引物psport-正向引物、ljiL10xExpandHighFidelity緩沖液和1jiLExpandHighFidelity聚合酶(RocheDiagnostics,Cat.No.1759078)。熱循環(huán)程序先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)(94。C30秒、68匸1.0分鐘)，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)(94匸30秒、58匸30秒、681C1.0分鐘)，之后681C進(jìn)行7.0分鐘。使用用于測序的TOPOTA克隆試劑盒(Invitrogen，Cat.No.K4575-01),克隆編碼ZmT6PP-l片段的0.8kbDNA產(chǎn)物。將2.0yL反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化至50pLToplO感受態(tài)細(xì)胞(hivitrogen，Cat.No.C4040-03)。通過在含2pgBSA和2jaL10xEcoRI限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液(NewEnglandBiolabs)的20juL反應(yīng)物中用EcoRI(NewEnglandBiolabs)消化小量制備的LpCR-4-TOPO-ZmT6PP-NSDM(使用來自Qiagen的QIApr印SpinMiniprep方法制備得到，Cat.No,27106),可鑒定含有ZmT6PP-l片段的pCR-4-TOPO-ZmT6PP-NS重組體。反應(yīng)在37'C進(jìn)行2小時(shí)，然后在1%TAE瓊脂糖上辨析pCR-4-TOPO-ZmT6PP-NS(EcoRI)產(chǎn)物。使用ABIPRISM染料終止物循環(huán)測序試劑盒(PerkinElmer)對pCR-4-TOPO-ZmT6PP-NS克隆進(jìn)行測序。圖7示出pCR-4-TOPO-ZmT6PP-NS圖譜。實(shí)施例2:Rabl7表達(dá)盒的構(gòu)建已發(fā)現(xiàn)以玉米R(shí)abl7基因?yàn)榛A(chǔ)的表達(dá)盒在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)(Vilardelletal.，1990)并可在正在成熟的種子中發(fā)育表達(dá)(Vilardelletal.，1991)。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是提供一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包括與一種核酸分子有效連接的、在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其中當(dāng)所述核酸分子在植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，它能降低植物細(xì)胞的內(nèi)源性T6PP基因的表達(dá)。本發(fā)明包括一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體具有來源于Rabl7基因的5'區(qū)域并在植物中展現(xiàn)啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子。本發(fā)明還包括包含編碼T6PP-RNAi的核酸的全部或部分序列的核酸構(gòu)建體，其中所述Rabl7啟動(dòng)子驅(qū)使T6PP-RNAi表達(dá)盒在海藻糖途徑中形成條件性阻斷。本發(fā)明的T6PP-RNAi表達(dá)盒重新指導(dǎo)碳水化合物在水分虧缺期間在繁殖組織和營養(yǎng)組織中合成蔗糖或淀粉。本發(fā)明的核酸構(gòu)建體還包括來源于玉米R(shí)abl7基因的5，和3，-區(qū)域，其中所述區(qū)域在植物中分別展現(xiàn)出啟動(dòng)子和終止子活性。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，5，和3，區(qū)域均用于核酸構(gòu)建體中以確保轉(zhuǎn)基因的表達(dá)可模擬玉米R(shí)ab的17表達(dá)。在開始時(shí)，收集、比對cDNA序列并對其標(biāo)注。使用已公開的gDNA序列(GenBank編號(hào)No.XI59940)來查詢公用數(shù)據(jù)庫和專有數(shù)據(jù)庫。將Rabl7cDNA序列斷成外顯子并與Rabl7gDNA比對，以提供必需的標(biāo)注并將翻譯起始密碼子和終止密碼子標(biāo)注在gDNA上。在由如下物質(zhì)組成的50nL反應(yīng)混合物中對來自玉米gDNA的ZmRabl7啟動(dòng)子進(jìn)4亍擴(kuò)增100ng玉米gDNA、200jaMdNTP、lpL20"M寡核苷酸引物000426A(5'-GGTACCAAGCTTAATTCGCCCTTATAAACT-3，)(SEQIDNO.33)、1jiL20jiM寡核苷酸引物000426B(5，-ACTGCAGTTAGATCTAGTCTTCGTGCTTGTGT-3，)(SEQIDNO.24)、1jaL10xExpandHighFidelity緩沖液和1/aLExpandHighFidelity聚合酶。熱循環(huán)程序在94'C進(jìn)行2分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(941C15秒、58°C30秒、68°C2.Q分鐘)，之后68'C進(jìn)行5.G分鐘。按照制造商的說明書，使用用于測序的T0P0TA克隆試劑盒，克隆了編碼ZmRabl7啟動(dòng)子的0.6kbDNA產(chǎn)物。按照制造商的說明書，將2.OpL反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化至50Topl0感受態(tài)細(xì)胞中。通過在含2pgBSA和2jiL10xEcoRI限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20liL反應(yīng)物中用EcoRI消化小量制備的5jjLpCR-4-T0P0-pZmRabl7DM,鑒定了含有ZmRabl7啟動(dòng)子的pCR-4-T0P0-pZmRab17重組體。反應(yīng)在37。C進(jìn)行2小時(shí)，然后在i%TAE瓊脂糖上辨析pCR-4-TOPO-pZmRabl7(EcoRI)產(chǎn)物。使用ABIPRISM染料終止物循環(huán)測序試劑盒對pCR-4-TOPO-pZmRab17克隆進(jìn)行測序。pCR-4-TOPO-pZmRabl7序列表示于SEQIDNO.11。在由如下物質(zhì)組成的50jiL反應(yīng)混合物中對來自玉米gDNA的ZmRabl7終止子進(jìn)4亍擴(kuò)增100ng玉米gDNA、200jaMdNTP、ljiL20/iM寡核苷酸引物000426C(5'-ACTGCAGTACGTGGCTGTGCTGTG-S，)(SEQIDNO.25)、1pL20yM寡核苷酸引物000426D(5，-CGGTACCAATTGCATGCGTCTAATCA-S，)(SEQIDNO.26)、1|iL10xExpandHighFidelity緩沖液和1juLExpandHighFidelity聚合酶。熱循環(huán)程序在94n進(jìn)行2分鐘，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(94n15秒、58匸30秒、68'C2.O分鐘)，之后68'C進(jìn)行5.O分鐘。使用TOPOTA克隆試劑盒，克隆了編碼ZmRabl7終止子的0.6kbDNA產(chǎn)物。將2.0juL反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化至50juLToplO感受態(tài)細(xì)胞中。通過在含2pgBSA和2jiL10xEcoRI限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的20liL反應(yīng)物中用EcoRI消化小量制備的5mLpCR-4-TOPO-tZmRab17DNA,鑒定了含有ZmRabl7終止子的pCR-4-TOPO-tZmRabl7重組體。反應(yīng)在37'C進(jìn)行2小時(shí)，然后在1%TAE瓊脂糖上辨析pCR-4-TOPO-tZmRab17(EcoRI)產(chǎn)物。然后對pCR-4-TOPO-tZmRabl7克隆進(jìn)行測序。pCR-4-TOPO-tZmRabl7序列表示于SEQIDNO.12。如上所述，分別從pCR-4-TOPO-pZmRabl7和pCR-4-T0P0-tZmRabl7中擴(kuò)增出pZmRabl7和tZmRabl7。用MinElutePCR純化試劑盒(Qiagen，Cat.No.28004)純化PCR產(chǎn)物，并在含5jugBSA、5jliLlOx限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液1、2.5pLKpnl和2.5mLPstl(NewEnglandBiolabs)的50pL反應(yīng)物中對其進(jìn)行消化。反應(yīng)在37^C進(jìn)行6個(gè)小時(shí)以上，然后在70'C進(jìn)行20分鐘。然后在1.0%TAE瓊脂糖上辨析0.5kbpRAB17(Kpnl/Pstl)DNA和0.7kbtZmRabl7(Kpnl/Pstl)DNA，并切割上述條帶。使用QIAquickGel提取試劑盒(Qiagen，Cat.No.28704)提取和回收DNA。每個(gè)片段在40jiLddH20中洗脫。在含10pL10xT4DNA連接酶緩沖液(NewEnglandBiolabs)和10T4DNA連接酶(400Units/jaL—NewEnglandBiolabs)的100pL反應(yīng)物中將40jliLpRAB17(Kpnl/Pstl)和40mLtZmRabl7(Kpnl/Pstl)連接起來。連接反應(yīng)在16。C進(jìn)行8個(gè)小時(shí)以上。將連接物在-20。C用20pg糖原、0.3MCH2COONa(pH5.2)和2.5倍體積乙醇沉淀2個(gè)小時(shí)以上。微量離心回收連接產(chǎn)物，70%乙醇洗滌，真空干燥并在14pLd歸中重懸。在含2pgBSA、2jiL10x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液1和2jliLKpnl的20juL反應(yīng)物中消化連接產(chǎn)物。反應(yīng)在37'C進(jìn)行6個(gè)小時(shí)以上，然后在701C進(jìn)行20分鐘。在1.0%TAE瓊脂糖上消化辨析得到的DNA并切割1.3kbpZmRabl7-tZmRab17(Kpnl)條帶。使用QIAquickGel提取試劑盒(Qiagen，Cat.No.28704)提取并回收pZmRabl7-tZmRab17(Kpnl)DNA。將回收得到的pZmRabl7-tZmRab17(Kpnl)DNA在-20。C用20yg糖原、Q.3MCH2C00Na(pH5.2)和2.5倍體積乙醇沉淀2個(gè)小時(shí)以上。微量離心回收pZmRabl7-tZmRaM7(Kpnl)DNA,70%乙醇洗滌，真空干燥并在5pLddH20中重懸。在含2mgBSA、2/iL10x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液1和2pLKpnl的20jliL反應(yīng)物中消化2ygpBluescriptn(KS-)一akapBS-DNA(Qiagen的QIAprepSpin小量制備方法，Cat.No.27106)。反應(yīng)在37C進(jìn)行6個(gè)小時(shí)以上，然后在70r:進(jìn)行20分鐘。然后將ljaL10x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液1、1jiL1單位/jiL牛小腸堿性磷酸酶和8jliLddH20加入反應(yīng)物并在37n孵育30分鐘。用1.0%TAE瓊脂糖辨析pBS(Kpnl/CIP)DNA并切割3.0kbpBS(Kpnl/CIP)條帶?；厥誴BS(Kpnl/CIP)DM并用20jig糖原、0.3MCH2C00Na(pH5.2)和2.5倍體積乙醇在-20'C沉淀2個(gè)小時(shí)以上。微量離心回收pBS(Kpnl/CIP)DNA，70%乙醇洗滌，真空干燥并用5pL(1犯20重懸。在含1jliL10xT4DM連接酶緩沖液和1jiLT4DNA連接酶(400單位/yL)的10jLiL反應(yīng)物中連接4.OpLpZmRabl7-tZmRab17(Kpnl)和4.OjliLpBS(Kpnl/CIP)，16。C進(jìn)行8個(gè)小時(shí)以上。將5.OjaL連接混合物轉(zhuǎn)化至50pLToplO感受態(tài)細(xì)胞中。通過在含ljigBSA和ljaL10xEcoRI限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液1的10juL反應(yīng)物中用1.0juLKpnl消化小量制備的2nLpBS-pZmRabl7/tZmRab17DNA，鑒定pBS-pZmRabl7/tZmRab17重組體。反應(yīng)在37。C進(jìn)行2個(gè)小時(shí)，然后在1%TAE瓊脂糖上辨才斤pBS-pZmRabl7/tZmRab17(Kpnl)DNA。然后對pBS-pZmRabl7/tZmRab17克隆進(jìn)行測序。pBS-pZmRabl7/tZmRab17序列被命名為pN0V3010(SEQIDNO.17)。圖8示出pN0V3010圖鐠。pNOV301G缺乏克隆所研究基因的靈活性。通過將合成接頭連接至載體，可在pZmRabl7/tZmRab17連接處引入其它限制性酶切位點(diǎn)來增加靈活性。接頭(合成接頭I)可通過將40nL50pM寡核苷酸000809A(5，-PGATCGGCGCGCCTGTTAATTAATTGCGGCCGC-3，)(SEQIDNO.27)、40jiL50pM寡核苷酸0Q0809B(5，-PGATCGCGGCCGCAATTAATTAACAGGCGCGCC-3，)(SEQIDNO.28)在100liL含25mMTris-HCl(pH8.0)和10mMMgCl2的混合物中混合制備得到，其中P為5，-磷酸基團(tuán)。將混合物煮沸5分鐘，離開熱源并自然冷卻至室溫(約60分鐘)。這樣可獲得20juM合成接頭I溶液。通過在含2jugBSA和2jiL10x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液3的20yL反應(yīng)物中用2jiLBgin消化14yL小量制備的pN0V3010DNA可制備得到pN0V3010。反應(yīng)在37"C進(jìn)行6個(gè)小時(shí)，然后在701C進(jìn)行20分鐘。將lpL10x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液3、1mL1羊位/mL牛小麻堿性磷酸酶(CIP-NewEnglandBiolabs)和8yL(1犯20加入反應(yīng)物，然后在37X:進(jìn)行30分鐘。在1.O訂AE瓊脂糖上辨析pNOV3010(Bgln/CIP)消化產(chǎn)物，并提取和回收pN0V3010(Bgin/CIP)DM條帶。pNOV3010(Bgin/CIP)DNA用20/ig糖原、0.3MCH2C00Na(pH5.2)和2.5倍體積乙醇在-20"C沉淀2個(gè)小時(shí)以上。微量離心回收pN0V3010(Bgin/CIP)DNA，70%乙醇洗滌，真空干燥并用5jnL(1犯20重懸。在含ljuL10xT4DNA連接酶緩沖液(NewEnglandBiolabs)和1jiLT4DNA連接酶(400單位/pL-NewEnglandBiolabs)的10pL反應(yīng)物中將4.5jaL合成接頭I連接至2.5jLiLpNOV3010(Bgin/CIP)，并在16C進(jìn)行8個(gè)小時(shí)以上。將4jiiL連接物轉(zhuǎn)化至50juLXL-1超感受態(tài)細(xì)胞(supercompetentcells)(Stratagene，Cat.No.200236)中。通過在含2jLigBSA、2jiL10x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液4和ljuLAscl的20yL反應(yīng)物中消化5jiL小量制備的DNA鑒定了重組體。用1.0°/。TAE瓊脂糖辨析產(chǎn)物。完成得到的克隆被命名為pNOV3232(SEQIDNO.7)。圖9示出pNOV3232的圖鐠。實(shí)施例3:T6PP-RNAi表達(dá)盒的構(gòu)建圖6示出用來產(chǎn)生T6PP-RNAi基因的引物。從pCR-4-T0P0-ZmT6PP-NS才莫板產(chǎn)生了兩個(gè)PCR片段(圖7)。片段l(SEQIDNO.15)含有在T6PP-RNAi基因產(chǎn)物中作為環(huán)的CMVpSP0RT6載體的一部分。使用高保真PCR在由如下物質(zhì)組成的50"L反應(yīng)混合物中從pCR-4-T0P0-ZmT6PP-l擴(kuò)增片段1:小量制備的1jaLpCR-4-T0P0-ZmT6PP-NSDNA、200yMdNTP、20yM寡核苷酸引物001L(5，-ATAGGCGCGCCATGTTGGAGATGACAGAACAGATC-3，)(SEQIDNO.38)、20nM寡核苷酸引物002R(5，-ATACCGCGGGGACTGTCCTGCAGGTTTAAACG-3，)(SEQIDNO.39)、5mL10x克隆pfu緩沖液和2.5單位PfuturboDNA聚合酶(Stratagene，Cat.No.600252),最終體積為50jiL。熱循環(huán)程序在95'C進(jìn)行30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(95。C10秒、65X:60秒、72'C2分鐘)，之后72'C進(jìn)行10分鐘?；厥掌蝜DM產(chǎn)物，并用糖原載體對該DNA進(jìn)行乙醇沉淀。微量離心回收片段1DNA，70%乙醇洗滌，真空干燥并在14pL(1犯20中重懸。片段2表示于SEQIDNO.16。使用高保真PCR在由如下物質(zhì)組成的50jiL反應(yīng)混合物中從pCR-4-TOPO-ZmT6PP-NS擴(kuò)增片段2:小量制備的1jiLpCR-4-TOPO-ZmT6PP-NSDNA、200pMdNTP、20pM寡核苷酸引物003L(5，-GCGTTAATTAAATGTTGGAGATGACAGAACAGATC-3，)(SEQIDNO.40)、20juM寡核苷酸引物004R(5，-ATACCGCGGCGCAACACAGTGAAACACTAGAAGG-3，)(SEQIDNO.41)、5L10x克隆pfu緩沖液和2.5單位PfuturboDNA聚合酶，最終體積為50jiL。熱循環(huán)程序在95。C進(jìn)行30秒，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(95"C10秒、65C60秒、721C2分鐘)，之后72t:進(jìn)行10分鐘?；厥掌?DNA產(chǎn)物，并用糖原載體對該DNA進(jìn)行乙醇沉淀。微量離心回收片段2DNA，70%乙醇洗滌，真空干燥并在14pL<1犯20中重懸。在含2|ugBSA、2pL10x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液和2yLSacn的20ML反應(yīng)混合物中分別消化片段1和片段2DNA。消化在37。C進(jìn)行2個(gè)小時(shí)。通過在65t:孵育15分鐘將酶滅活。在含ljiL10xT4DNA連接酶緩沖液和lyLT4DNA連接酶(400單位/pL)的10pL連接混合物中連接4.OpL片段1(Sacn)DNA和4.OpL片段2(Sacn)DNA，該連接在16。C進(jìn)行24小時(shí)以上。通過在65。C孵育15分鐘將酶滅活。由此獲得T6PP-RNAi基因(SEQIDNO.6)。在含2pgBSA、2jliL10x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、liuLPacl和1mLAscI的20jiL反應(yīng)混合物中消化T6PP-RNAi基因。消化在37'C進(jìn)行2小時(shí)。在含2jigBSA、2pL10x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液、1jliLPacl和ljiLAscl的20juL反應(yīng)混合物中消化ZmRabl7表達(dá)盒質(zhì)粒pNOV3232(圖9)(SEQIDNO.7)。用1%TAE瓊脂糖辨析T6PP-RNAi基因(Ascl/Pacl)和pN0V3232(Ascl/Pacl)的消化產(chǎn)物，提取1136bpT6PP-RNAi基因(Ascl/Pacl)和4262bppNOV3232(Ascl/Pacl)DNA條帶并回收DNA。用20pg糖原、0.3MCH2COONa(pH5.2)和2.5倍體積乙醇在-20t:將回收得到的DNA沉淀2個(gè)小時(shí)以上。微量離心回收DNA，70%乙醇洗滌，真空干燥并分別用5jiLddH20重懸。在含1|iL10xT4DNA連接酶緩沖液和1yLT4DNA連接酶(權(quán)單位/pL)的10jiL反應(yīng)物中連接4.0jLiLT6PP-RNAi基因(Ascl/Pacl)和4.OpLpNOV3232(Ascl/Pacl)，并在16。C進(jìn)行8個(gè)小時(shí)以上。將5.0juL連接混合物轉(zhuǎn)化至50jnLTop10感受態(tài)細(xì)胞。通過在含1jigBSA和1mLIOx限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液1的10yL反應(yīng)物中用1.OjuLKpnl消化2juL小量制備pRabl7-T6PP-RNAiDNA,鑒定pRabl7-T6PP-RNAi重組體。反應(yīng)在37'C進(jìn)行2小時(shí)，然后用1%TAE瓊脂糖辨析pRabl7-T6PP-RNAi(Kpnl)DNA。鑒定pRabl7-T6PP-RNAiDNA序列并將該構(gòu)建體稱為SEQIDNO.8。圖10示出pRabl7-T6PP-RMi表達(dá)盒圖i普。實(shí)施例4:經(jīng)修飾的Rabl7-T6PP-RNAi表達(dá)盒的構(gòu)建為提高特征性能，對玉米R(shí)abl7啟動(dòng)子序列進(jìn)行了修飾，以摻入完整的Rabl75，-UTR、玉米R(shí)abl7基因的笫一個(gè)內(nèi)含子和玉米R(shí)abl7第二個(gè)外顯子的約15個(gè)核苷酸。設(shè)計(jì)本發(fā)明的該經(jīng)修飾5，-調(diào)節(jié)序列來置換pNOV3240中的Rabl7啟動(dòng)子。為構(gòu)建修飾啟動(dòng)子而對Rabl75，-調(diào)控序列(SeqIDNo.7)進(jìn)行的具體改變?yōu)?1)將604位核苷酸"G"改為"C";(2)將665位核苷酸"A"改為"T";(3)將718位核苷酸"A"改為"T";(4)將748位核苷酸"A"改為"T"，以及(5)將783位核苷酸"G"改為"C"。最后，為有助于重組DNA過程，在Rabl7外顯子2的"...TCGGAGGAC"核苷酸之后加入Pacl和Ascl限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。如圖3所示，車載音頻設(shè)備10包括機(jī)箱12、調(diào)諧器102(參見圖8)、音頻輸出單元106(參見圖8)、箱體室14、箱體16、鎖機(jī)構(gòu)18(參見圖7)和機(jī)箱連接器20。如圖1所示，機(jī)箱12被設(shè)置在車體部件中，如位于乘客車廂2內(nèi)的汽車儀表盤2A或中控臺(tái)面板2B中。機(jī)箱12具有面向乘客車廂2的前面板。如圖8所示，車載音頻設(shè)備10包括主要部分，其包括調(diào)諧器102、控制器104、音頻輸出單元106、顯示單元108和控制臺(tái)110。調(diào)諧器102用于接收從無線電廣播站發(fā)送的AM和FM無線電廣播并輸出音頻信號(hào)。音頻輸出單元106處理一例如放大一通過控制器104提供的音頻信號(hào)，并將經(jīng)過處理的音頻信號(hào)提供給乘客車廂2中的揚(yáng)聲器120，從而促使揚(yáng)聲器120輸出對應(yīng)的聲學(xué)音頻聲音。具體地說，音頻輸出單元106通過控制器104連接到調(diào)諧器102和便攜式音頻設(shè)備50，并促使揚(yáng)聲器120根據(jù)來自調(diào)諧器102或便攜式音頻設(shè)備50的音頻信號(hào)輸出聲學(xué)的音頻聲音。當(dāng)便攜式音頻設(shè)備50的音頻信號(hào)輸出連接器5006可分離地與機(jī)箱連接器20連接時(shí)，控制器104和便攜式音頻設(shè)備50通過電纜20A相互電連接。音頻信號(hào)輸出連接器5006例如是耳機(jī)連接器，并且包括以左和右兩個(gè)聲道發(fā)送音頻信號(hào)的立體聲微型插孔。顯示單元108由控制器104控制以用字符、符號(hào)、圖標(biāo)或圖像顯示調(diào)諧器102和音頻輸出單元106的運(yùn)行狀態(tài)。運(yùn)行控制臺(tái)110以指示調(diào)諧器102和聲音輸出單元106運(yùn)行，并根據(jù)控制臺(tái)110的操作向控制器104提供控制信號(hào)?？刂破?04用于控制調(diào)諧器102、聲音輸出單元106、顯示單元108和控制臺(tái)110。如圖2和3所示，機(jī)箱12是矩形平行六面體的形狀。機(jī)箱12在其中容納各種插件板22，在這些插件板上安裝了調(diào)諧器102、控制器104和聲音輸出單元106的各種電子組件。性內(nèi)切核酸酶緩沖液4和5.0|iLAscl的50juL反應(yīng)物中對其進(jìn)行消化。反應(yīng)在37C進(jìn)行6小時(shí)以上，然后在70'C進(jìn)行20分鐘。用1.0%TAE瓊脂糖辨析1.OkbpRabl7-mod(Ascl)并切割下條帶。提取和回收DNA。用糖原載體對回收得到的pRabl7-mod(Ascl)DNA進(jìn)行乙醇沉淀。微量離心回收pRabl7-mod(Ascl)DNA片段，70%乙醇洗滌，真空干燥并用5juLddH20重懸。在含2pgBSA、2juL10x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液4和2jiLAscl的20yL反應(yīng)混合物中消化2jug小量制備的pNOV3240DNA。將反應(yīng)混合物在371C孵育6個(gè)小時(shí)以上，然后在70'C孵育20分鐘。然后將1jliL限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液4、1juLl單位/jLiL牛小腸堿性磷酸酶和8juLddH20加入反應(yīng)混合物并在37C賻育30分鐘。用1.0%TAE瓊脂糖辨析pN0V3240(AscI/CIP)腿并切割11kbp麗3240(AscI/CIP)條帶。提取和回收pN0V3240(AscI/CIP)DNA。用糖原載體對回收得到的pNOV3240(AscI/CIP)DNA進(jìn)4亍乙醇沉淀。微量離心回收pNOV3240(AscI/CIP)DNA，70%乙醇洗滌，真空干燥并用5pL(1犯20重懸。在含1yL10xT4DNA連接酶緩沖液和1juLT4DNA連接酶(400單位/pL)的10jnL連接混合物中連接4.OnLpRabl7-mod(Ascl)和4.OpLpNOV3240(AscI/CIP)。將連接混合物在16。C粹育8個(gè)小時(shí)以上。將5.0laL連接混合物轉(zhuǎn)化至50pLToplO感受態(tài)細(xì)胞中。通過在含ljugBSA和lpL恰當(dāng)?shù)?0x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液的10juL反應(yīng)物中用lpLSail消化小量制備的2juL修飾pN0V3240DNA,鑒定修飾pN0V3240重組體。消化在37"C進(jìn)行2小時(shí)，然后用1%TAE瓊脂糖辨析。對陽性的修飾pNOV3240重組體進(jìn)行測序。修飾Rabl7-T6PP-RNAi表達(dá)盒的核苷酸序列表示于SEQIDNO.18。實(shí)施例5:根癌土壤桿菌二元質(zhì)粒的構(gòu)建在含2jigBSA、2jnL10x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液1和2pLKpnl的20jliL反應(yīng)物中消化2ugpNOV2117(圖IIA)。反應(yīng)在37'C進(jìn)行6個(gè)小時(shí)以上，然后在70。C進(jìn)行20分鐘。加入1juL10x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液1、1nL1單位/mL牛小腸堿性磷酸酶(CIP)和8nLddH20，并在37'C孵育30分鐘。在含2jagBSA、2pL10x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液1和2jiLKpnl的20juL反應(yīng)物中消化2jiL小量制備的pRabl7-T6PP-RNAiDM。反應(yīng)在37TC進(jìn)行6個(gè)小時(shí)以上。用1.0y。TAE瓊脂糖辨析消化得到的質(zhì)粒DNA、pNOV2117(Kpnl/CIP)和pRabl7-T6PP-MAi(Kpnl)，并切割9.2kbpN0V2117(Kpnl/CIP)和2.5kbpRabl7-T6PP-RNAi(Kpnl)DNA條帶。提取pN0V2117(Kpnl/CIP)和pRabl7-T6PP-RNAi(Kpnl)DNA，然后用20pg糖原、0.3MCH2C00Na(pH5.2)和2.5倍體積乙醇在-20匸沉淀2個(gè)小時(shí)以上。微量離心回收p麗2117(Kpnl/CIP)和pRabl7-T6PP-RNAi(Kpnl)DNA片段，70%乙醇洗滌，真空干燥并用5pLd犯20分別重懸。在含1jiL10xT4冊A連接酶緩沖液和1jiLT4DM連接酶(400單位/"L)的10/iL反應(yīng)物中連接4.0yLp麗2117(Kpnl/CIP)和4.0pLpRabl7-T6PP-RNAi(Kpnl),并在16^C進(jìn)行8個(gè)小時(shí)以上。將5.0pL連接混合物轉(zhuǎn)化至50jliLToplO感受態(tài)細(xì)胞。通過在含lpgBSA和ljLiL10x限制性內(nèi)切核酸酶緩沖液1的10pL反應(yīng)物中用1.OjiLKpnl消化7.5jaL小量制備的pN0V2117-pRabl7-T6PP-RNAiDNA，鑒定pNOV2117-pRabl7-T6PP-RNAi重組體。反應(yīng)在37^C進(jìn)行2小時(shí)，然后用1%TAE瓊脂糖辨析pNOV2117-pRabl7-T6PP-RNAi(Kpnl)DNA產(chǎn)物。鑒定pN0V2117-pRabl7-T6PP-RNAi連接序列并將之命名為pNOV3240。圖IIB示出其圖譜。實(shí)施例6:玉米轉(zhuǎn)化熟知，并且與本發(fā)明相關(guān)的基因可與任何這些載體一起使用。載體的選擇取決于優(yōu)選的轉(zhuǎn)化技術(shù)和用于轉(zhuǎn)化的靶標(biāo)物種。對于某些扭標(biāo)物種，優(yōu)選不同的抗生素或除草劑選擇標(biāo)記。轉(zhuǎn)化中通常使用的選擇標(biāo)記包括賦予卡那霉素和相關(guān)抗生素抗性的"/^#基因(VieiraandMessing,1982;Bevanetal.，1983)、賦予除草劑膦絲菌素抗性的6ar基因(Whiteetal.，1990;Spenceretal.，1990)、賦予抗生素潮霉素抗性的力;力基因(BlochlingerandDiggelmann，1984)、在甘露糖的存在下可進(jìn)行陽性選擇的邁aW基因(MilesandGuest,1984;Bojsenetal.，1998)和賦予曱氨蝶呤抗性的必/>基因(BourouisandBruno，1983)和賦予草甘膦抗性的A戶57V基因(Shahetal.，1990;1993)。很多載體可用于根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化。它們通常具有至少一個(gè)T-DM邊界序列(bordersequence)并包括載體如pBIN19等在內(nèi)(Bevan，1984)。適于土壤桿菌轉(zhuǎn)化的典型載體包括二元栽體pCIB200和pCIB2001以及二元載體pCIB10及其潮霉素選擇衍生物(參見例如Ligonetal.，1997)。其它載體可用于非根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化。不使用根癌土壤桿菌的轉(zhuǎn)化可使得所選擇的轉(zhuǎn)化載體不需要T-DM序列，因此除了使用例如上述的含有T-DM序列的載體之外，還可使用缺乏這些序列的載體。不依賴于土壤桿菌的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括通過粒子轟擊、原生質(zhì)體攝入(如PEG和電穿孔)和微注射的轉(zhuǎn)化。載體的選擇主要取決于對被轉(zhuǎn)化物種的優(yōu)選選擇。適于非土壤桿菌轉(zhuǎn)化的典型載體包括pCIB3064、pS0G19和pSOG35(參見例如Ligonetal.，1997)。一旦所研究DNA序列被克隆至表達(dá)系統(tǒng)中，就將其轉(zhuǎn)化至植物細(xì)胞中。植物轉(zhuǎn)化和再生的方法為本領(lǐng)域所熟知。例如，Ti質(zhì)粒載體以及直接的DNA攝入、脂質(zhì)體、電穿孔、微注射和微粒被用來送遞外源DM。另外，來自土壤桿菌屬的細(xì)菌可用來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。雙子葉植物轉(zhuǎn)化技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知，包括基于土壤桿菌的技術(shù)和不需要土壤桿菌的技術(shù)。非土壤桿菌技術(shù)涉及直接由原生質(zhì)體或細(xì)胞攝入外源性遺傳物質(zhì)。這可通過PEG介導(dǎo)的攝入或電穿孔介導(dǎo)的攝入、粒子轟擊介導(dǎo)的送遞或微注射完成。每種情況下，使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可使轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生為整株植物。大部分單子葉植物物種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)已常規(guī)化。優(yōu)選的技術(shù)包括使用PEG或電穿孔直接將基因轉(zhuǎn)移至原生質(zhì)體、使用粒子轟擊轉(zhuǎn)移至愈傷組織以及土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化操作得到的植物被培養(yǎng)、繁殖和養(yǎng)殖，以獲得具有所需特征的后代，并使用本領(lǐng)域已知的方法獲得具有所需特征的種子。一旦本發(fā)明的核酸序列被克隆至表達(dá)載體中，則將其轉(zhuǎn)化至植物細(xì)胞中?？梢远喾N本領(lǐng)域已知的方式將本發(fā)明的受體和靶標(biāo)表達(dá)盒引入植物細(xì)胞中。植物再生的方法也為本領(lǐng)域所熟知。例如，Ti質(zhì)粒載體以及通過電穿孔、微注射和微粒的直接DNA攝入被用來送遞外源DNA。另外，土壤桿菌屬的細(xì)菌可用來轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。下文描述了轉(zhuǎn)化雙子葉植物和單子葉植物的代表性技術(shù)以及代表性質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)。雙子葉植物轉(zhuǎn)化技術(shù)為本領(lǐng)域所熟知，包括基于土壤桿菌的技術(shù)和不需要土壤桿菌的技術(shù)。非土壤桿菌技術(shù)涉及直接由原生質(zhì)體或細(xì)胞攝入外源性遺傳物質(zhì)。這可通過PEG介導(dǎo)的攝入或電穿孔介導(dǎo)的攝入、粒子轟擊介導(dǎo)的送遞或微注射完成。這些技術(shù)的實(shí)例已有描述(Paszkowskietal，1984;Potrykusetal.，1985;Reichetal.，1986;Kleinetal.，1987)。每種情況下，使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可使轉(zhuǎn)化細(xì)胞再生為整抹植物。由于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化效率高并且可廣泛應(yīng)用至多種不同物種，因此它是轉(zhuǎn)化雙子葉植物的優(yōu)選技術(shù)。土壤桿菌轉(zhuǎn)化一般涉及將攜帶所研究外源DNA的二元載體(如pCIB200或pCIB2001)轉(zhuǎn)移至恰當(dāng)?shù)耐寥罈U菌菌林。這取決于宿主土壤桿菌菌株共存的Ti質(zhì)?；蛉旧w上攜帶的Vir基因的互補(bǔ)性(如適合pCIB200和pCIB2001的菌抹CIB542(Uknesetal.，1993))。通過使用攜帶重組二元栽體的大腸桿菌的三親林交配方法可實(shí)現(xiàn)將重組二元載體轉(zhuǎn)移至土壤桿菌，所述大腸桿菌為輔助性大腸桿菌菌株，它攜帶質(zhì)粒如pRK2013,能將重組二元載體轉(zhuǎn)移至靶土壤桿菌菌林。或者，通過DNA轉(zhuǎn)化可將重組二元載體轉(zhuǎn)化至土壤桿菌(H6fgenandWillmitzer，1988)。重組土壤桿菌轉(zhuǎn)化靶植物物種通常涉及將土壤桿菌與待轉(zhuǎn)化植物的外植體進(jìn)行共培養(yǎng)，并依照本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)化組織在含有抗生素、除草劑或其它化合物的選擇性培養(yǎng)基上再生，要設(shè)計(jì)存在于二元質(zhì)粒T-DM邊界之間的選擇性標(biāo)記來提供抗性。另一種用基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的方法涉及推動(dòng)惰性或生物活性顆粒進(jìn)入植物組織和細(xì)胞中。該技術(shù)由Sanford等人(1990;1991;1992)公開?？傮w而言，該方法涉及在有效穿透細(xì)胞的外表面并摻入其內(nèi)部的條件下推動(dòng)惰性或生物活性顆粒進(jìn)入細(xì)胞中。使用惰性顆粒時(shí)，通過用含所需基因的載體包被顆粒，可將載體引入細(xì)胞內(nèi)。或者，可用載體包裹靶細(xì)胞，由此通過顆粒的運(yùn)動(dòng)將載體引入細(xì)胞。也可推動(dòng)生物活性顆粒(如凍干酵母細(xì)胞、凍干細(xì)菌或噬菌體，每一個(gè)均含有待引入的DM)進(jìn)入植物細(xì)胞組織。大部分單子葉植物物種的轉(zhuǎn)化現(xiàn)已常規(guī)化。優(yōu)選的技術(shù)包括使用PEG或電穿孔直接將基因轉(zhuǎn)移至原生質(zhì)體以及使用粒子轟擊轉(zhuǎn)移至愈傷組織。轉(zhuǎn)化可用一類DNA或多類DNA(即共轉(zhuǎn)化)進(jìn)行，這兩種技術(shù)均適合用于本發(fā)明。共轉(zhuǎn)化具有的優(yōu)點(diǎn)是不必構(gòu)建完全的載體，并且形成的轉(zhuǎn)基因植物具有所研究基因和選擇性標(biāo)記的非伴性基因座這使得在后代中可除去選擇性標(biāo)記，應(yīng)該認(rèn)為這是所需要的。使用共轉(zhuǎn)化的一個(gè)缺點(diǎn)在于各類DNA整合進(jìn)入基因組的頻率不到100%(Schocheretal.1986)。幾項(xiàng)美國專利描述了自玉米的優(yōu)良近交系制備愈合組織和原生質(zhì)體、使用PEG或電穿孔轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體以及由轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體再生玉米植物的技術(shù)(Tomesetal.，1999;Duditsetal.，2001;Kozieletal.，2002)。Gordon-Kamm等人(1990)和Fromm等人(1990)已公開了使用粒子轟擊轉(zhuǎn)化A188-衍生玉米系的技術(shù)。另外，Koziel等人(1993，2002)描述了通過粒子轟擊轉(zhuǎn)化優(yōu)良近交系的技術(shù)。該技術(shù)使用自傳粉后14-15天的玉米穗切下的長1.5-2.5mm的未成熟玉米胚和PDS-l畫HeBiolistics轟擊裝置。水稻的轉(zhuǎn)化也可通過使用原生質(zhì)體或粒子轟擊的直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)進(jìn)行。已對原生質(zhì)體介導(dǎo)的粳型和扭型水稻轉(zhuǎn)化進(jìn)行了描述(Zhangetal.，1988;Shimamotoetal，1989;Dattaetal.，1990)。兩種類型也可使用粒子轟擊進(jìn)行常規(guī)轉(zhuǎn)化(Christouetal.，1991)。另外，Gobel和Nakakido(1993)描述了通過電穿孔轉(zhuǎn)化水稻的才支術(shù)。Horn等人(1989)描述了早熟禾亞科原生質(zhì)體(Pooideaeprotoplast)的形成、轉(zhuǎn)化和再生技術(shù)。這些技術(shù)可轉(zhuǎn)化鴨茅(Dactylis)和小麥。另外，Vasil等人(1992)描述了使用粒子轟擊C型永久再生的愈傷組織的細(xì)胞的小麥轉(zhuǎn)化，并且Vasil等人(1993)和Weeks等人(1993)也描述了使用未成熟胚和未成熟胚來源愈傷組織的粒子轟擊的小麥轉(zhuǎn)化。然而，優(yōu)選的小麥轉(zhuǎn)化技術(shù)涉及通過對未成熟胚進(jìn)行粒子轟擊所進(jìn)行的小麥轉(zhuǎn)化，并包括基因送遞前的高蔗糖或高麥芽糖步驟。轟擊之前，將0.75-1.0毫米胚接種至含3%蔗糖(MurashigeandSkoog，1962)和3mg/L2，4-D的MS培養(yǎng)基中，目的是誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，該過程在避光處進(jìn)行。在選定的轟擊之日，從誘導(dǎo)培養(yǎng)基中取出胚并置于滲壓劑上(誘導(dǎo)培養(yǎng)基中含有加入的所需濃度的蔗糖或麥芽糖，一般為15%)。使胚的胞質(zhì)皺縮2-3小時(shí)，然后對其進(jìn)行轟擊。盡管并不關(guān)鍵，但是每個(gè)靼培養(yǎng)板通常還是含有20個(gè)胚。使用標(biāo)準(zhǔn)方法將攜帶恰當(dāng)基因的質(zhì)粒(如pCIB3064或pSG35)沉積至微米級(jí)金顆粒上。使用DuPontBiolistics⑧氦裝置攻擊每個(gè)培養(yǎng)板的胚，爆破壓為~1000psi,使用標(biāo)準(zhǔn)80目篩。轟擊之后，將胚(依然在滲壓劑上)放回避光處恢復(fù)約24小時(shí)。將胚從滲壓劑中取出并放回誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，這些胚再生之前會(huì)在此處放置約1個(gè)月。然后將具有正在發(fā)育的胚發(fā)生愈傷組織的胚外植體轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基(MS+1mg/LNAA，5mg/LGA),所述再生培養(yǎng)基還含有恰當(dāng)?shù)倪x擇劑(對于pCIB3064為10mg/Lbasta,對于pSOG35為2mg/L曱氨蝶呤)。約一個(gè)月之后，將發(fā)育好的嫩芽轉(zhuǎn)移至較大的、被稱為"GA7s"的無菌容器中，該容器含有半強(qiáng)度MS、2%蔗糖和相同濃度的選擇劑。還描述了使用土壤桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物(參見HieiandKomari,1994;1997;和Negrottoetal.，2000，)上述文獻(xiàn)全部通過援引納入本文。使用電穿孔將質(zhì)粒pN0V3240引入根癌土壤桿菌。轉(zhuǎn)化后的土壤桿菌細(xì)胞用來將Rabl7-T6PP-RNAi表達(dá)盒轉(zhuǎn)移至玉米(A188xHi11)基因組內(nèi)。通過在含甘露糖的培養(yǎng)基上再生，通過T-DM可鑒定陽性轉(zhuǎn)化體。得到了63個(gè)結(jié)果。其中Taqman分析鑒定了15個(gè)具有轉(zhuǎn)基因的單拷貝并且沒有超過邊界序列的結(jié)果?？赡艿那闆r下，TO植物自花授粉，否者它們由JHAF031授粉。實(shí)施例7:溫室生長條件將玉米種子種植到含有通用混合物(Universalmix)(SungrowHorticulture,PineBluff,AR)的2.5SVD盆(Classic600，~2加侖苗圃容器)中。通用混合物含有45%泥煤莒、45%樹皮、5%珍珠巖和5。/。蛭石。溫室玉米培育的環(huán)境條件一般是16小時(shí)每天(平均光強(qiáng)度為600/amolm—2s-2)，白天溫度為80-86。F，夜間溫度為70-76。F，并且相對濕度大于50%。將植物放在2"的平臺(tái)上以避免與溫室地面接觸。對植物進(jìn)行人工澆水，一直到需要灌溉時(shí)則將它們放在滴灌器上。灌溉方案是每隔一天4分鐘。植物用殺蟲劑常規(guī)處理來控制害蟲。實(shí)施例8:表達(dá)Rabl7-T6PP-RNAi的轉(zhuǎn)基因玉米的溫室內(nèi)評(píng)估溫室評(píng)估為受控水脅迫實(shí)驗(yàn)，它可對受水脅迫和未受水脅迫植物的胚珠活力進(jìn)行定量。來自未受脅迫植物的數(shù)據(jù)代表在理想條件下有可能形成種子的基因型。來自受水脅迫植物的數(shù)據(jù)可對開花之際由于干旱所引起的籽粒敗育進(jìn)行定量。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以預(yù)計(jì)耕地的性能。我們使用這個(gè)工具來選擇用于耕地評(píng)估的轉(zhuǎn)基因?qū)嵗?。如上所述種植自交植物的種子。Taqman分析用來區(qū)分后代半合子組(含Rabl7-T6PP-RNAi)和單性合子組(不含Rabl7-T6PP-RNAi)。將幼苗轉(zhuǎn)移至如上所述的600個(gè)盆，并使用標(biāo)準(zhǔn)溫室方法培育，一直到它們發(fā)育到V6生長期(Ritchieetal.，1997)。所有植物均用內(nèi)吸殺蟲劑Marathon處理來降低對害蟲的敏感性。使用鹽作為滲壓劑逐漸加強(qiáng)水脅迫(Nuccioetal.1998)。該鹽由摩爾比為10:1的氯化鈉/氯化鈞組成，并溶解在0.5xHoagland，s溶液中以防止鈉引起的對鉀攝入的破壞。每三天將灌溉器(irrigant)中的鹽濃度從50mM增加至100mM再增加至150mM,以給予植物適應(yīng)該鹽的時(shí)間。整個(gè)花期(一般為兩周)將植物維持在150mM鹽溶液，之后用水將盆徹底澆透，然后正常灌溉植物。與沒有接受到鹽的對照植物相比，這個(gè)過程一般會(huì)使籽粒形成減少40-60%。通過在第一片完全伸展的葉片中間位點(diǎn)采樣，通過溶質(zhì)勢對每抹植物適應(yīng)加強(qiáng)的水脅迫的能力進(jìn)行測量。收集三塊3/4英寸圓形葉片，并使用露點(diǎn)式蒸氣壓滲透壓計(jì)對它們的葉汁液溶質(zhì)勢進(jìn)行分析。150mM鹽處理之后三天在10:0Q-11:00AM對植物進(jìn)行釆樣。將葉汁液溶質(zhì)勢與土壤溶質(zhì)勢相比較，以確定植物適應(yīng)水脅迫的能力。一般而言，植物在適應(yīng)增強(qiáng)的水脅迫方面沒有差異。一般播種每種轉(zhuǎn)基因?qū)嵗?5-20個(gè)種子，以獲得7-10個(gè)單性合子個(gè)體和7-10個(gè)半合子個(gè)體。以由每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)的完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)排布植物。抽絲期前用授粉袋包裹正在發(fā)育的穗。記錄散粉期和抽絲期，并用供體花粉連續(xù)幾天對各個(gè)穗人工授粉2-3次。完成全部授粉之后除去授粉袋。授粉后30天收集穗并干燥4天，使水分含量為15%。剝?nèi)ニ?，對籽粒進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重。實(shí)施例9:溫室實(shí)驗(yàn)1就八種Rabl7-T6PP-RNAi實(shí)例在水脅迫下形成種子的能力對其進(jìn)行了研究。使每種植物(T0自交親本)的24個(gè)T1種子發(fā)芽。使用Taqman分析來確定每林幼苗中的結(jié)合性。留出純合子用于種子膨脹(seedbulking)。使用上述(實(shí)施例8)的溫室水脅迫方法分析半合子和單性合子。在本實(shí)驗(yàn)中，將非轉(zhuǎn)化A188植物作為基準(zhǔn)。圖12總結(jié)的籽粒形成數(shù)據(jù)表明每個(gè)實(shí)例都是獨(dú)特的。水脅迫方案某種程度上是很嚴(yán)重的，因?yàn)榛鶞?zhǔn)A188植物在籽粒形成中遭受到超過70%的減少?？傮w上，轉(zhuǎn)基因的存在提高了受水脅迫植物中的籽粒形成，全部轉(zhuǎn)基因?qū)嵗钠骄岣呗适?9%。具體而言，在實(shí)例81A10B中，半合子的籽粒形成是相應(yīng)單性合子的二倍。同時(shí)，實(shí)例78A18B的受水脅迫半合子形成的籽粒是單性合子的六倍。這些數(shù)據(jù)表明Rabl7-T6PP-RMi表達(dá)盒提高了玉米的籽粒形成。實(shí)施例10:溫室實(shí)驗(yàn)2就兩林Rabl7-T6PP-RNAi植物78A18B(13)和81A10B(10)在水脅迫條件下形成種子的能力對其進(jìn)行了研究。使每個(gè)實(shí)例(Tl自交親本)的96個(gè)T2種子發(fā)芽。使用Taqman分析來確定每林幼苗中的結(jié)合性。使用上述(實(shí)施例8)的溫室水脅迫方案分析半合子和單性合子。在本實(shí)驗(yàn)中，將81A10B(10)單性合子作為基準(zhǔn)。水脅迫方案是有效的，因?yàn)榛鶞?zhǔn)81Al0B(10)單性合子在籽粒形成中遭受到約45%的減少。總體上，轉(zhuǎn)基因的存在可減少灌溉良好的植物的籽粒形成。但是，轉(zhuǎn)基因?qū)κ芩{迫植物的籽粒形成影響很小或使其略有提高。實(shí)施例11:表達(dá)Rabl7-T6PP-RNAi的轉(zhuǎn)基因玉米的田間評(píng)估進(jìn)行田間評(píng)估來檢測種植者通常使用的條件下轉(zhuǎn)基因的性能。通用田地標(biāo)準(zhǔn)為一塊地四排，每排17.5英尺長，由2-3英尺小道間隔開，每排約40株植物。外排種植單性合子，內(nèi)排種植隔離的轉(zhuǎn)基因植物。將田分為充分澆灌處理區(qū)域和水脅迫處理區(qū)域，并使用滴灌對田間進(jìn)行澆灌。每個(gè)區(qū)域均有專用灌溉管道。為保持一致性，最遠(yuǎn)的那塊地距離灌溉管道不到100英尺。每個(gè)處理每個(gè)實(shí)例有三塊地(每個(gè)實(shí)例共六塊地)。種植完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)、距離灌溉管道不同距離的實(shí)例地。充分澆灌區(qū)域和水脅迫區(qū)域間隔16排(50英尺)。實(shí)例78A18B和實(shí)例81A10B的Tl純合種子與JHAF031回交兩次，并于2003年夏天將1:1隔離的種子種植在夏威夷。種植地點(diǎn)為灌溉充分的沙土，在夏天一般只有不到3"的降雨量。對嫩芽進(jìn)行Taqman分析以確定轉(zhuǎn)基因是否存在。通過這種方式，單性合子和半合子隨機(jī)分散在每塊地中。充分澆灌區(qū)域在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間以最佳方式灌溉。水脅迫區(qū)域以最佳方式澆灌，直到植物發(fā)育至V6，此時(shí)停止給水。90%抽絲后再對植物進(jìn)行最佳灌溉。記錄下施用至田間的水量和降雨量。植物過渡到繁殖發(fā)育期間，記錄每林植物的授粉期和抽絲期。通過監(jiān)控生理脅迫癥狀如葉發(fā)灰和巻曲等是否出現(xiàn)，還對響應(yīng)水分虧缺的植物進(jìn)行了記錄，并采集葉組織來測量溶質(zhì)勢。通過在第一片完全伸展的葉片中間位點(diǎn)采樣，通過溶質(zhì)勢對每株植物適應(yīng)加強(qiáng)的水脅迫的能力進(jìn)行測量。收集三塊3/4英寸圓形葉片，并使用露點(diǎn)式蒸氣壓滲透壓計(jì)分析它們的葉汁液溶質(zhì)勢。脅迫最大期間對水脅迫區(qū)域的植物進(jìn)行采樣。對水脅迫區(qū)域植物采樣之后幾天對充分澆灌區(qū)域的植物進(jìn)行采樣。采樣在8:00-10:00AM進(jìn)行。將每塊地的植物的葉汁液溶質(zhì)勢進(jìn)行比較來確定田間一致性。收集每林植物的穗并將其剝?nèi)?。對籽粒進(jìn)行計(jì)數(shù)和稱重。將來自半合子個(gè)體的數(shù)據(jù)與單性合子個(gè)體的相比較，以測量轉(zhuǎn)基因?qū)ψ蚜Ｐ纬傻挠绊?。兩個(gè)Rabl7-T6PP-RNAi實(shí)例的結(jié)果總結(jié)在圖14和15中。平均而言，水脅迫使單性合子A78A18B(圖14)個(gè)體的籽粒形成減少了47%，而在相同條件下半合子個(gè)體僅遭受30%產(chǎn)量下降。圖15示出A81A10B半合子個(gè)體較相應(yīng)單性合子遭受稍微大一點(diǎn)的干旱誘導(dǎo)產(chǎn)量下降(分別為30%和25%)。但是，該產(chǎn)量下降明顯地被轉(zhuǎn)基因提供的超過10%的產(chǎn)量增加所補(bǔ)償。本田間實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明Rabl7-T6PP-RNAi轉(zhuǎn)基因可有效穩(wěn)定受干旱脅迫玉米的籽粒形成。實(shí)施例12:Rabl7-T6PP-RNAi在其它植物品種中的應(yīng)用雙鏈RNA的基因沉默活性具有序列特異性。對植物、昆蟲、線蟲、哺乳動(dòng)物以及其它真核生物系統(tǒng)的研究表明，同源的21-23堿基序列足以引起基因沉默(WaterhouseandHelliwell，2003;McManusandSharp,2002)。21個(gè)堿基的長度要求是下限，并且有證據(jù)表明錯(cuò)配是可以容忍的(McManusandSharp,2002)?；诖?，清楚的是采用更長的模板可獲得更為有效的RNA介導(dǎo)的基因沉默(Thomasetal，2001)。另外，基因調(diào)節(jié)序列的確會(huì)跨越品種界限以預(yù)定方式起作用(參見例如NuccioandThomas,2000)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體可用來減少T6PP在其它植物品種中的表達(dá)。通過查詢公共和專有cDNA數(shù)據(jù)庫來鑒定其它植物品種中的T6PP編碼序列，從而確定了跨物種有效性。比對"命中結(jié)果"并將其用來形成圖2所述的疊連序列。鑒定了來自高粱、大麥、小麥、甘蔗和黑麥的T6PP同源物。對應(yīng)T6PP-RNAi片段的每個(gè)基因的序列片段通過比對(圖16)和相似性(圖17)進(jìn)行比較。通過比較發(fā)現(xiàn)圖3中的ZmT6PP-l氨基酸334-393由圖16所示ZmT6PP-lcDNA的核苷酸1-180編碼。結(jié)果表明本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建體在其它谷物品種中起著使T6PP沉默的作用。這表明不僅可將該構(gòu)建體用來提高玉米的環(huán)境脅迫耐性，還可將其用來提高其它重要的谷物作物的環(huán)境脅迫耐性。參考文獻(xiàn)AescMaaclier'K,A,，MWIer,J,,Boiler,T"WiemkeAA.(1999),PurificatioftofthtrehalaseGMTRE1fromSoybeannodulesandcloningofitscDNA.GMIK￡/isexpressedatalowlevelinmultipletissues,PkntPhysiol.119，489495,Atkbs》D.,Young,M"Uzzell，S.,Kelly,L"FiliateJ"Ckriach,W丄.(1995).Theexpressionofantlsenssandribozymege加staxgetliigcitoexocortisviroidintransgenicplants.J*,Gen.Viral.76，1781-1790,Atkins,D.G,，Gerlach，W,L.，Young,M丄(2002),Ribozymetracleicacidsandmethodsofusethereofforcontrollingviralpa&ogens.U.S.Patent6,451,603,FiledMarch2，1995,is犯edSept,17，2002.Barttey,G,E.，Viit鄉(xiāng)ei、P,V"BacotK,O,,Scoln汰，P,A,(1992》.Atomatog斑eexpresseddaringfruitripeningencodesanenginesofthecarotenoidM加ynfhesispathway,5",Biol.Oiem.267，5036-5039.Batzer，M人，Carltca^J.E，，Deinii^er,P丄，EnbancedevolutionaryPCRusingoHgoimckotideswithinosineatthe3'-tenninus.kucl.AddsRes,19,5081,Bev叫M,"W.,Raveli,RJB,，GhiltoAM.-D,(1983)Achimaericantibioticresi欲ancegeneasaselectablemarkerforp!antcelltr咖fonnatitHLNature.304,184487,Bevan，M.(1984).BinaryJgro&jcten'w戰(zhàn)vectorsforplaattransfbimation,NcLAcidsRes.12,8711-8721,Bird,C.R,，Ray,J.A.，F(xiàn)letcher,J,D.>Boniw吼J.M.,B喊A,M.，Teuiiores,C,，Blaiti,I"Bramley,P,M.(1991),UsingantisenseRNAtostudyge加&nction:inhibitionofcaroteaoi<Jbiosyntkesisintoisgenictomatoes.Bio/Technol.9,635-639,Bi虹quez,M,A"Santos,R，F(xiàn)bires，C.-L.,Marti加z-Zapater，J,M"Salinas,J.，Oancedo,C.(1998).Isolationandmolecularcharacterizationofthe爿n1&id0j3arisIPS/gene,encodingtrehalose-6-pliosplmtesynthase.PlantJ,13,685-689.Blodilinger,K*,Diggehnam，H,(1984).Hygra邊ycinBphosphotransferaseasasdwtat)3temarkerforDNAtransferexperiments鄰ithhighereucaryoticcells,Mol.Cell,Biol.4,2929-2931.Bpjsen,K.，Donaldson^1"Haldrop,A.,Joersboe,M"Kreiberg,ID',Nielsen,J,,Okkels，F(xiàn),T.，Pet貧s節(jié),SX1(1998),Mannoseorxylosebasedpositiveselection.U.S.P^.No,5,767,378,Bourouis,M.,Bruno,J.(1983).Vectorscontainingaprokaryoticdihydrofolater血otasegenetransformDw鄉(xiāng)她ceUstomethotrexa4e-微istance.E^OJ,2，1099-1104,Brands,A.,Ho，T.H.D.(2002),Fanctkmofrplantstress-inducedgene,HVA22.Syntheticenhancementscreenwithitsyeasthomologrevealsitsroleinvesiculartraffic.Plantf"hysiol.130，1121-1131,Brussl叫J，A"Karliii-Ne咖咖，G,A.，Huang,L，Tobin，E.M.(朋3).AnArabidopsismutantwithareduced〗evelofcab140RNAisare卯ltofcosuppressioiLPlantCell.S,667-677,CaMichM.X，Greenland,AJ.，RMde逸K.V.,Schuch，W.W.，To邁sett，A,B,(2003).DNAconstructs肌<1plantskiccoporatiiigthem,U,S,Pat,No.6,605,754.Carthew，R.W.(2001),Genesiiencing!>ydouWe-stondedRNA.CurrentOpin.Ce〗lBiol13，Christcm,P"Ford,T.L.，Kofroi;M.(1991),Productionoftraasgeuicrice雄'vaL.〉plantsfromagro加micallyimportantIndicaandJ叩onicavarietiesviaelectricdischargeparticleacceleratkmofexogenousDNAintoimEat咖zygoticembryos.Bio/Tectaol.9，ChuajK-H.，Aoyam^T.(2000),ChemicalinduciblepromotertKedtoobtaintransgenicplantswithasitentmarker,U.S.P站,No,6,063,985.Datta^SX,Peterhans，A.，Datta，K.，Potrykus，LGeneticallyengineeredfertUeIndicaricerecoveredfromprotoplasts.Bio/TedmoL8，735>740.De-Feyter，R,，Young,M"Schroeder,K，Deonis,B,S"GetiaclisW，(1996),Aribc^ymegeneandanantisensegeneareequallyeffectiveinconferringesistaacetotoi)^comosaicvirusonfransgenictobacco,Mol.deal.Genet.2S0，329-338.Dudits，D.，MorocAS.，Nem我J"Do叫<3.(2001).Zeamays(L.)withcapabilityoflongtecm，highlye傷cie加plantregenerationfeehidingfertileteansgenicmaizeplantshavingaheterologousgene,andtheirpreparation,U.S.Pat.No.6,284,945.Eastaon4P丄，vanDijken,A丄H.，Spidman，M"Kerr,A.,Tissier,A.F.,Dickinson,H.G"Jones,Smeekens,S,C"Graham,LA.(2002).phosphatesynthase1whichcatalysesthefaststepintrehalosesynthesis,isessentialforJraWrfo/wiyembryoffiaturaticm.PlantJ.29，225-235,EastoondjP丄，GrahamjI,丸(2003),Trehalosemetabolism:aregulatoryrolefortrehalose-6-phosphatesyatliaseCra:ent6pin.RantBiol,6,231-235.Eastmond,P丄,Li,Y,，Graham^I.A.(2O03),Isaregulatorofsugar鵬tabolisminpl她？J.Exp,Botany.54'533-537.EIbashir，SM.,Harf)orth,J.,Lendec風(fēng)W"Yalcin,A.，職er,K"TuscW，T.(2001).Duplexes<rf2i-皿deotideRNAsmediateHl^Ainterferenceincultoredmammaliancells-Nature.411,494498.Fire,A.,Xu,S.,Montgomery,M.iC，Kostas,S,A,,Driver,S,E"MeUo，C,C.(1998),PotentandspecificgeneticinterferencebydoublestrandedRNAiaCaenorhabditiselegans.Nature.391,艦-811,Fraak-Kameneteldi，M，D.，Miridn,S.M.(1995),TriplexDNAstructures.AitnuR饑Biochem.64,65-95.Fromm,M,E.，Morris^F,,Anustrong'C"Williams,R>Thom肪，J.,Klein,T.M.(1990).Inheritanceandexpressionofchimericgenesintheprogenyoftransgenicmaizeplants,Bio/Teclinol,8，833-S39.Gar&A.EL，Kim,J,-IL，OweasT.G"R,alaAP,,CM，Y.D,，KjocM叫L,V.,andWu，RJ.(2002).Trehaloseaccumulationinricep!antsconfershij^bitolerancelevelstodifferentabiotic,stresses,Proe.Natl,Acad.Sd.USA.訴，158訴45卯3,Gobd,E,，NakaMdo,F,(1993).Transfe加atioiiofmo加cotcells.WO93/21335,Goddi扭，O丄M.，Verwoeid，T.C.,VoogdB.,Krutwagen,ELW.H,H,，deGraaf,P.T,H，M.，Pods,J"vanDun,K，P咖tein,A.S,，Damm,B,Pen,J.(1997).IohiWtkmoftrefcJ幼eactivityenhancestrehaloseacoimiriaticaiintransgenicplants,-lantPhysiol-113,181-190,God<Hjn,O丄M,Pen,J,，Smeekens,J.C.M.,Sinits，MT.(2003),Regulatingmetabolismbymodi^iagtheleveloftreJhaJose-6-phosphatebyinHbitingendogenoustrehalasekvds.ILS.PatApplication20030177531,Goddijn，O丄M.，Pen,J"Smeekens，J.CM,,(2004》Regulatingmetabolismbyraodi^ingthelevdoftrehalose^6匿phosphate.U.S.PatApplication20040093641.Gordon-Kamm，W,J"Spencr，T.M.，Mang咖'M.L,Adams,T,IL，Dakes，JLJT,，Start,W.G"O"Brien,J.V.,Chamber^S.A,,Adams,W.R.Jr，Willetts,N.G.,Rice,T.B,,Mackey,C.J"Krueger,R,W"Klausd^A.P"Lemaax，P,G.(1990).TrattsformatkmofMaizeCellsandRegenerationofFertileTransgenicPlants,PlantCell.2,603-618.Goto,F"Yashih叫T"Shigemoto,N"Toki，S.，Takai，F(xiàn).(l卿).Ironfortificationofriceseedbythesoybeanferritingene.Nat.Biotechnol.7，282-286.Gray,I,Kctr^S.，ShaWser,J"Sclmch，W"Griersoa,D.(1992),Molecularbiok)gyoffruitripeninganditsmanipuktioiiwithantis咖egenes.PlantMol,Biol.19，砂87.Gri改son，D,,Fray,R,G,,HamiltonAJ*,Smith,C.J.S"Watson,C.F"(1991)Doesco-suppressionofsensegasestotransgenicplantsinvolveantis咖eRNATrendsBiotech.9,122-123,Gri曲ok，A.，Pasqukiel1i,A.E.，Conte,D.,Ii,N"Parrisli,S"取kBail!k，D,L"Fire,A"Rttvlaa^G,，Mello,CM.(2,),Gnes肌dmechanismsrelatedtoRNAintaferenceregulateexpressionofthesmalltemporalRNAsthatcontrolCetegaradevdopmentaitiming.Cell,106，23-34,Hid，Y,,Ko邊ariT.(l卯4).Methodfortransfomaiiigmonocotyledons.WO94/00977.Hiei，Y"Komari,T.(1997).Methodforteansfo加iiignumoco^yledoiis.IXS,PatNo.5，5916〗6.Hoeke咖，A.，P叫J.,Does,M,P,，VanDenE，z叫P.J.M.(l鄉(xiāng)).Productionoftrehaloseinplants,U.S.Pat,No.5,925，S04.股fgen,1，柳3mitzer,L(l鄉(xiāng))，Storageofeomp改entceilsforAgrobacteriumtransforma&iL他cl.Ac"sRes-16，9877.Hobnstro取-O.,MantylE.,Welin，B.,Mandal^A>,Palva,T.E.，Tiamela，O.E,,LondesboTOu魄J.(1996),Droughttokraneeintobacco.Nature.379，683-684,Horn,M.E,，Hacms,C,T.,Shillito,R.D,(l鄉(xiāng)).Reg節(jié)etatkwivonGramineen-HianzenausderUnterfamiliePooideaeau紹ehencvonProtoplasten,EP0332581,FiiedMar.8,19幼》issuedMar.2,l卿.Hutv&gner,G"Zamore，PJD,(2002),RNAi:natureabhorsadouble-stand,Cun:,Opin.Genet,Dev.12，225-232.Msi加i,M,,XiongjL.,Lee,H"Stevenson，B"Zlm,J.K.(i9訴)，HOSl，ageneticlocusinvolvedincold-responsivegeneexpressioninAraibidopsis.Plantdell.1ft,1151-1161.Jagb-Ottoseo,KJL，Gilmonr，SJ.ZarkajD.G"Sdhaberiberger，O.,Thomask>wMJF.(l卿).ArabidopsisCBF1overexpressioninducesCORgenesandenhancesfreezingtokraace.Science.280，104-106,Jang，L-C"Oh,S,-J.,Seo，J.-S,，Ok^W.-B.，Son&S丄，Kim,C.BL,Kim,Y.S.,Seo,H.-S.,Choi,Y.D.,Nahm，B.a,andKim,J.-K,(20<B).ExpressionofabifimctionalftisionoftheEscherichiacoligenesfortrehalose-6-phosphatesynthase加dtrehatose-6"phosphatepho邵hataseintransgenicriceplanteincreasestrehaloseaccuimilaikmandabioticstresstoler咖ewithoutstortinggrowti,MartPhiysiol,131516-524,Jcmes，瓜G,,ShtemakOTvL"Carlandjp.，Englisl^J.Scoflel4S.R"Bytiop，GJ"Hards叫IC(H992),Effectivevectorefortr咖fo加aticHi,expressionofheterologousgenes,孤iassayingtran印osonexcisionintransgenicplants,"Tr邸sgedcRes,1,285-297.Jorgens叫R.A.，Cluster,P,D,,English,Que,Q,，NapoH，C.A,(1996).Chalconsesynthaseeo鄉(xiāng)pTession沐e(cuò)notypesinpetuniafkwers:comparisono￡sensevs.anti鄉(xiāng)secons加ctsandsingie—oc^pyvs.coiri|>lexT-DNAsequoioes.PlantJVloLBiol,31,957-973,Kaasea,I,，F(xiàn)alkenberg,P.，Styrvold，O,B,,Stram，AJt.《1992).Molecularctoningandphysicaltn卿ingoftheostBAgenes,whichencode&eosmoregulatorypathwayof勘die/"/cAtocoZi:evid節(jié)cethattranscriptioiiisactivatedbyK^tF(AppR).3",Bacteriol,174,g89-跳Kay,Ch叫A，Daly，M"McBierson^工(1987),DupticationofCaMV35SPromotersequencescreatesastrongenhancerforgeaes.Science.236,1299-1302.Ki認(rèn)selbach,T.A,(1999).TheStructureandReproductionofCom>50&Anniversary腿tion.ColdSpringHarborLaboratoryPress.ColdSpringHarbor,NewYork,P群，51-63.Kl取K.N.，Cheong,Y,H"Grant,JJ.，Pandey，G.K,,L翻，S.(2003;|,CIPK3，acalci職sensor-associatedproteiakinasethatregulatesabsciskacidandcoldsignaltraiisductiQiikiAiaWdopsis,PlantCdl.15,411-423.Klein,TM.,Wolf,B,D,，Wu^R:，Sanford，J,C,,(19S7),Higli-velocitymicroprojectilesfordeHveringnucleicacidsintoMvingcells,'Nature.327，70"73,Krartzon,D,S.,Thompson^G.A.,Radke，S.E,，Johnson,W且,Knau^V.C.，Kridle，J.d(1992),'ModificationofBr肪sicaseeddibyantiseaseexpr^sionofastearoyl-acylcarrierproteindesaturasegeaie.Proc,NatLAc近SdLUSA.89,2624-2628.Koziel,M.G,,Beian4G.L,Bowman,C"Canmi，NJB.,Crenshaw,R，Cross!肌4L，Dawson,I"Desai，N.，班l(xiāng)l，M,,K^dwell,S,(l柳)，F(xiàn)ieMperformanceofelitetransgenicmaizeplantsexpressingan'taseoticidalproteinderivedfromBadlustlraringieEsis,Bio/Teclmol.11,19冬200,Koziel，M-G.etal.(2002).Meiiodofproducingtransgenicmdzeusingdirecttransforaiation■of.co:mmercMyimportantg咖types.U.S.Pat,No,6，鄉(xiāng),船，Kridl,J'C.，Knauf，V.C.(1995).Seed-speoiflctranscriptionalregulation.U.S,Pat,No,5,420,034.Kuelm^C"Hajirezaei,MJL，F(xiàn)eraie,A,R"Roes咖r-Tiraali，U.,Czechowski，T"Himer,B.，F(xiàn)rom'mer，W.B.(2003).ThesucrosetransporterStSUTllocalizestosieveelranDtsispotatotoberphlo咖andinfluencestuberphysiologyanddevelopmentPlantPhysiol,131，102-113.Kull,B.，Sakmini,F.，RoMe，W.(1995).Geneticmgineeringofpotatostarclkco呵ositiotuinhibitionofamylosebiosynthesisin加bersfromtransgodcpotatolinesbytheexpressionofantisensesequ節(jié)eesofthegeaefoigrmrale-bouiidstarchsynthase.J.Genet.Breed49，67-76.Laporte，M.M,，Galag肌,J'丸，Prasc:h,A,L"V逝derveer,P,J"H咖叫D,T.，Shewm^cer，cJcSharkey,T.B,(2001),Pro咖terstrengttiandtissuespecificityeffectsongrowthofto認(rèn)toplantstransfoimedwithmaizesucrosepliosphatesynthase.Planta.212，817-822,Lebel，E,G"Heifetz,P,B,，Goff,S,A.(2004).Expressioioftrehalose"6-pho鄰hatesya也蹈einpl節(jié)tp!astids.U.S.PatNo.6,686,516.!^e，Y,S"Nakahar^K"Ph咖，J.W.，KinijK>，He,Z,,SOTthdmer,B.J,,Carttiew,R.W,(2004).DistiaolRo!銘fbri>asojoA&!Dic從-landDicer-2inthedRNA/miRNAsilencingpathways.Cell.117，69-81.Lessard，P,A.,KulaveerasingamiH,，YorkGJV1"StrongjA.,Sii^key,A丄(2002).Manipulatinggene級(jí)presskraforthemetabolicengineeringofplants.Metab.Eng.4，67-79,Leym叫B,,VanDijck，.P"Thevelein，J.M.(2001).Animexpected!plethoraoftrehaloseWosyntfeesisgenesin《/w〖!*a，w.TrendsPlarrtSci,g，Lig節(jié)，J.M"扭1LD,S,，Ryals，J.A"Lam，S.T,，Hammo:,P.E,(2997),Genes&rtilesynthesisofaiitip幽genicsub幼ances.U.S.PatNo.5鄉(xiāng),949'Liti，Q"Kasuga^M"Sakuma，Y,，Abe,H,,Miura^S"Yamagudii-Shinoz:akijK.,SMiiozaki,IC(1998).Twotratiscriptkmfectots，DREB1andDREB2，with幼EREBWAP2DNA■bindingdomainseparatedtwocellularsignaltransdwtionpathwaysidrought-andiow-temperatore-respcmsivegeneexpression,respectively,inArabidopsis.PlantCell10，13911406.Lorxdesborough,J"Twm啦O.,Holmstrom*K--O,M組tylg,E.，WeMn,B"Mandai，A,Palva，T.E.(2000),Transgenic;plantsprodrotegtrehalose.U,S,PatNo.6,130,368.Mateke,M.A"Aufea重z，W,,Kamio，T"Mette，M.F,，Matzke，AJ.(2CK)2),Honiotogy-d鄰endentgenesilencingandhostdefeaseinplants.Adv.Genet.46，235-^75,McManus,M,T"Sh邵,P,A.(2002).GenesilenciBginmammalsfcysmallinterferingKNAs.NatureRev*Genet,3，737-747，MelitaH,A"Cassol,T,，Li，N,，AH,R,Hand^A.IC,,Mattoo，人K.(2002),Engineeredpolyamineaccumulatkmhitomatomhancesphytomrtrientcontent,juiceqii^ity,andvinel泡,Nat,BiotedmoL20,613-618.Miles,J,S"Gttest，JiL(1984).Nucleotidesequenceandtranscriptionalstartpointofthephosphomamiose!isomerasegane(manA)of總c力ertc射ac成Gene.32，625-631.Moreno-Fcmseca^L.P.，Covamibias,A.A.(2001).DovaBtre咖DNAsequencesarerequiredtoiiKKiuktegeneexpressdonin微po加etodehydration,PkntMol,Bio!.45,501-515,Mttiter,J,,Aeschbacher,R,A"Wingler,A"Boiler,T,mdWieraken,A>(2001).Trelialose幼dtretel站etoArabidopsis,PlantPhysioJL10S6-1093.MurasMge,T,&Skoog,F.(1962),Arevkedmedkmforrapidgrowthandbio邸s旌yswithtobaccotissueculturesPhysiologiaPlaiitaruni.15,473497.N邵oli,C.,LemieMx，C.,Jo堪eosea，lt，(1990).intaxiuclioiaofachimericchateonesynthasegeneintopetaaiaresultsinreversibleco-suppressionofhomol卿朋genesintrans.PlantCell.2,279-2紗.Negrotto,D,,J"oltey，M.,Be改，S.,"WmcKAJl,，Hansen,G.(2000),TheuseofphosphomaDnose-isoni鄉(xiāng)您asasdectaWemarkertorecoverfaaasgeoicmaizeplants(ZeamaysL.)viaAgrobaGteriumtr幼sformatioiLFtoCellR邵，19,7訴-幼3.No,E.G,,Zhou,Y,，Loopstra,C.A.(2000).Ssqueaces邵stearaanddowisteamoftwoxylena-specificpinegenesiiifi加ncetheirexpressbii.PlantSci.艾60，77-86.N,io，M,L.，Rus威，B丄,，Nolte,KD,，Ratfaliiasab^atM，B.,Gage,D.A.,Hanson,D,A.(1998),Theendogenouscholinesimplylimitsglycinebetainesynthesisintransgenictobaccoexpressingcholinemo加oxygenase,PlantJ,16,487-4%.Nuccio,M.L,,Thomas，T丄，(2000),SeedspecificpromotersbasedonArabidopsfegera切.U.S.P汰No.6,100,450.Nylander,M.，Sw鵬oiijJ.,Palva,E,T"Wdii^B.V.<2001).Stress-inducedaccraralatioiiandtissue"SpecificbcalizatianofdehydrinsinAiabidopsisthaliaaa.PferatMol.Biol,45,263-279.Ode仏J.T.,Nagy，F(xiàn),,Chua,N.匿H.(i訴5).IdentificationofDNAsequencereq\iiredfortheactivityoffliecauliflowermosaicvirus35Spromoter.Nature.313,810-812,P姐gjP.P.,Pniitt，R.E.,Meyerowitz,E.M,(徹8).MoHecularckming,genomicorganization,expressionandevolutiwiof12SseedstorageproteingeoesofArabkbpsisthaHaoa.PlatMoLBbi,U，805-820,Pasztowski,J"Shillito,D,,Saul，M.,Maada^V.，Hoh%T.，Hoh^B.,Potrykas，I,(1984)，Directg咖transfertop,.EMBOJ,3,2717-2722.Mon-Smits,E.A,H,，Terry,N，Sears,T.，Kim,H.,ZayedA,，H簡g,S,B"vanDu^K.，Voogd,E.,Verwoerd，T，C.，Krutwagen,R.WiJ,H.,Godd扭，O丄M.(1998),Trehaloseproducingtransgenictobaccoplantsshowimprovedgrow^iperfonnanceunderdrougjitstress.J.PlantPhysioL152，525-532,Potrykus，I.,Pas2ko稀ki,I,Saul,M,W,，Petmska^J"Shillito,R,D.(1985).Molecukrandg斑eralgeneticsofahybridforeigngeneintroducedintotobaccobydirectgenetransfer.MoLGen.Oen汰199,i必陽177.Ranodia*P"McNeil,S,D.，Ziemak，Wt.J.,14，C"Tarczynski,M,C"andHansoa，A.D.(2001).fheS-metfeyhnethioninscyctein孤gio印enns:ubiquity,antiquityandactivity.PlantJ.575-584,Reich,T丄,fyer，V.N.,Miki,'B丄，(l訴6).E迅eienttrajis&imatioiiofalfalfaprotoplastsbytheititeairaclearmicroinjectionofTiplasriiids.Bio/Technol.4，1001-1004,Reinhar^B工，Weinsteta,E,J,，Rhoades，M,W,,Bartd，B,，BarteLD.P.(2002),MicroRHAsinplants.Genestev.16，Ritehie^S,W.,Hanway,J丄，B節(jié)so"G.O.(1997).HowaComPlantDevelops.SpecialR鄰ortNo.48,IowaStateUniversityofScienceandTechnologyCooperativeExteiisionService.Ames,Iowa,Romero,C,，3Bdles，J.M，VayaJ丄,,Serrano,R-,Culianez-MaciajF.A.(1997),Expressionoftheyeasttrehalose~6-phospliatesynthasegeneintoasgenictobaccopknts:pleotropicph咖typesincludedrcm^ittokrancs.Planta.201，293-297.Rontekt，D.,Die認(rèn)e-Noubhani，M.，Dufourc,EJ"Raymond,P,，Rolin，D.(2002b).Themetabolicarchitectureofplantcels.Stabilityofqmtraltnetabotismandilexibilityofanabolicpathwaysduringthegrowthcycleoftomatocells.J.Bioi.Cheai,277，42948"43吞60.Rothstein,S丄，DiMaio，J"Strand,M"Rice,D,(1987).StebteandheritableinhibitionoftheexpressionofnopalinesynthaseintobaccoexpressingantisenseRNA.Proc,Nafl.Acad-SeLUSA.84,8439-8443.SanfordjJ.C,，Wolf,E,D.，AB瑪N.K.(1990),Methodfortransportingsubstancesintolivingcelisandtissue:andapparatustherefor.U.S.Pat.No,4，945，05(KSanford,JT.C.，"Wolf;E,D,，Allen,NJC(1991),!Methodfbrtransportiiigsubstacoesintolivingcellsandtissuesandapparatustherefor.U.S.Pat.No,5,036,006.SanfordjJ.C.，Wolf,E,D"Allen^N.K.(1992).Mettiodfortransportingsubstancesintolivingcellsandtissues,U,S.Pat.No,5,100,792.Schoch汰，RJ"S腿ito,R-D"Sax4M.W,,Paszlc麵ld,J,,Potrykus,L(1986),Co-transformationofunlinkedforei辟genesintoplaixtefaydirectg節(jié)etransfer.Bio/teclmol.4，i093-1096,Seymour,J,R，Kurzrocfc,F^eirefchjE丄，Estey,E,H.(1993).Down-regulatioixoftwonon-honxologoiisendogenoustomatogeneswithasinglecfaimaeric郷segeneconstructPlantMol.Biol.23，1-9,Shah,D.M,，Rogers,S.G.，Horscb,ILB"Fraley,R.T.(19卯).Glyphosate-resistairtplants,U.S,Pat.No.4,線835.Siiah，DM.,Rogers,S,G"Horsch,R.B"Brafey，R.T.(1993).Glypho幼te-resistantplants,U,S.Pat.No,5，188,642.Sh叫"W.,Goraez-Cadenas,A.,Roittly,E丄.，Ho,T.HD"Skranonds，J.A,,Gulidc，P丄(2<X)i).Thesaltstress-inducibleproteinkinaseg咖，EsM7,fiom(hesalt-tokraatwheatgrassZfO/j/kj^w欲e〖o(jì)rag她附isinvolvedinplanthonn鵬sigoa化g.PlantPhysioL125,3429-1441,Shewmaker，C，K^KiMl,J.C.,扭att，W,R^，Knaaf,V,(1992),Anti-senseregulationofgeneexpressioninplantcells,U.S,Pat.No.5,107,065.Shiraada,EL,Tada，Y.,Kawasaki,T"Fujim戮T.(1993).Antis咖eregulationoftiiericew鄉(xiāng)geneexpressionusingaPCRamplifiedftagm從tofthericegenomereducestheamylosecontentingrainstardi.Tlieor.Appl,G節(jié)汰86，磁-672.Shimamoto,K"Terada，Izaw&,T.,Fujimoto，H,Fertilettansgedcriceplaateiegenoratedfromtr咖formsdprotoplasts.Nature.338,274-277.-SMas，A.R.,邁boroug!i,1LM,(i柳)，PlantgeneencodingacetylcoenzymeacarboxylasebiotincarboxylcarrierproteiiLU.S.Pat,No,6,150,586.Smith,CJ,S.，Watson^C.F.，Ray,J.,BIrJ,CJR.,Morris,P.C.，Sdiuch^W.，GrfersotuD.(l卿》Antis節(jié)seRNAinMbitionofpolygalacturonasegeneexpressionintransgenictomatoes.Nature.334，724-726,Sukh昭iiwHK.，Hasler,J.M,，Pet吼J.K"Stricklaad,J.A,，F(xiàn)olkerts，0,(2004).Antibody-mediateddowti-regutetionofplantproteins,U.S.Pat*No,6J67,742,Thomas,C,L"Jones,L"Bauko邊be，D,C,,!Maule,AJ.(2001).Sizeconstodntsfortargetingpost-transcriptionalgenesil級(jí)cittgand&rRNA-directedmethyiaticmha^敘"Aa加JiswusingapotatovirusXvectoi1,PlantJ.25,417-425,Tijsteman,M.,Ketthig，R,R,Master^RH,A,(2002).ThegeneticsofKNAsilencing,Ann,Rev.Gen汰36，489-519.Tomes,D.T.,Wdssinger，A.,Sanf加d，J.C.，KIdn，T.M.(l卿)，Stabletr咖formatkaiofplantcells.U.S.Pat,No,5,990,387,U我T.,Piscata鄰ay,N.J"Waverc喊Ward,ICSher,N"Ketudat，M.，Schmidt,RJ"Messtag,J.(1992),Mutati鵬ofthe22-and27-kDzekipromotersaffecttr咖activationbytheopaque-2protein,PkntCell4,701-709.l)toes,S"Diiielier，S"Friedricli,L.,Negrotto，D,,Williams,S,'Tho加psoa-TaylcHc,H"Potter,S.，Ward,E.，SLyals，J.(1993).Regulationofpathogenesis-reiatedprotdn-lageneexpressionintobacco.PiantCell,S,159-169.vanderKrol，A.It，Lenting,PJB,'Veenstra，J"vanderM鄉(xiāng)，LM,，Koes,Gerats，A,G,M"Mol，J.N,M.,Sultje，A,R.(198S),Anamti-sensechakonesynthasegeneintr咖genioplantsinhibitsflowerpigmeatation.Nature.333,糊-柳.VasAV"Castro,AM.,Rro纖,M.E.,Vasil，IJL(1992).H統(tǒng)bicideresistantfertiletransgenicwheatplantsobtainedbymicroprojectilebombardmentofregenerableembryogenkcalhis.Bio/T;haol.10，66^-674.Vasil,V.,Srivastavf^V"Castm。，A.M.,Frorom,M.E"Vasil,(1993).Rapidproductioaoftraasgenicwheatpfentsbydirectbombardmeiitofculturedimmatureembryos.Bio/Technol.11，1553-1558.Vauchere^ii,Palauqui,J.，G.,E〗may^T<Moffatt'B.(1995).Molecularandgeneticanalysisofnitritereductaseco-suppiessioniotransgenictobaccoplants.Mol.GeaGenet,248,311-317.Veluthwn!ji,K.sMdxadevan,S.，Maheshwai，R,(1981).TrehalosetoxicityinCkscatoPlsn餘ysiol.68，1369-1374.VidraJ,，Messing*J.(1訴2),ThepUCplasinids^anM13啤7-derivedsystem&rinsertionmutagenesisandsequencingwithsyntheticimiv鵬alprimers.Gene19，259-268,Vikrddlt,J,,Goday，A-，F(xiàn)reire，M.A>，TorrentM..，Martinez,M.C.,Torne,J,M,andP紹es,M,(l柳)，Genesequence,developmeatalexpression,andproteinpho呼horyMonofRAB-17inmaize.PtentMol.Biol14，423432,ViianMl，J.，Mwidy,Stilling,B,，Leroux,B,,Pl^M.，F(xiàn)reyssiaet,G.，PagSs'M.(1991).RegulationofthemaizeraW7genepromoterintransgeuicheterologoiissystems.PlantMo菱.Biol.H，訴5-鄉(xiāng)，Vogd,G.,Aeschbacher,H.A,，Mailer,J"Bolter,T,抑dWiemken^A.(1998),Tiehalose<6-phosphatephosphatasesfromArabidopsisthaliaaa:identificationi>yfractionalcomplementatkwioftheyeast1ps2mutant.HantJ.13，673-683.Vogd,G.，F(xiàn)eihn,0"Jean-Richard-dit-Bressel'L,,Boiler,T.，Wiemk吼A"Aeschbacher,R.A.，Wingler,A,(2001),Trehalosemetabolismin爿m秘印他occurrenceoftrehaloseandmolecu〗arcloningandcharacterizationo￡trehaiose-6-pliosphatesynthasehomologues.J.B鄰.Botoy,S2，1817-1S26.Wang,J.T"Gou!4J".H"Padmanabhaii，V.,Newton,R丄(2002).Analysisandlocalizationofthewater-deficitstess-indncectgene(ip3).J.Plant6rowfliReg21，柳-478,WaterhoBse，Pitl，Wang,M,-JB,(2002),IVIethodsforobtainingmodifiedphenotyp^inpl她.U,S,Pat.No.M23，SS5,W扭erhousei，P,M.andHdliwdl,CA.(200》.ExploringplantgenomesbyKNA-iaducedgenesilencing.NatureRev,G咖t.4，29-38,Weeksal,(1993).RapidProductkmofMultiplefi1dq3您dentLinesofFertUeTransgenicWheat(2V故cMWaesft'vaw),PlratPhj^iol.102，1077-1084.Wdmkeii，A.(1990).Trehaloseinyeas^stressprotectantratherdmnreservecarbohydrate.AntV油L柳wechoekJ.Gen.MicrobioL58，205-217.Win^br,A-(2002).Theftmctionoftrehalosebiosynthesisinplants.Phytochem,60'437-Yama砂chi-ShiaozaJd,K.，Shinozald，(1993a).ltieplanthonncmeabscisicaddtnediatesthednra幼t-indticedexpressionbutnottheseed-specificexpressionofrd22，ag加eresponsivetodehydrationstressinArabidopsistiialian^MoLGen.Genet238,17-25.Yama^achi-ShinozaM，K.，Shinozald,iC(1993b).ArabidopsisDNAencodingtwodesiccation-responsiverd29genes.PlantPhysiol.101，1119-U20.YittjZ,,Zhao，Y"L加，3D.，Zhang,H>(2002).feolatingthepromoterofastess-ind加edgeneencodingbeta，.加aldehydedehydrogenasefio加flxehalqphyte爿/njtecc幼fra/os!'cnficaHjiiLBioctdm.Biophys,Acta.1577，452456.Yoshiba,Y"(1995),CorrelationbetweentheinductionofageneforDELTA-l-pyrro!ke-5~carboxyiatesyntfaet蹈eandtheaccumulatioaofprolineinArabidopsisthalianaunderosmoticstress.PlantJ.7,751-760.a幼g，H.M.,Yang,汰，R喊E.L.，Goids，T丄，Davis,A.S"Mulligan,B丄，Cocking,E,C,Davey，Mil,(198S).Transgenicriceplantsproducedfcyelectroporation-mediatedplasmiduptakeintoprotoplasts,H肌tCellRep,7,379-384,Zhang,C,S.，Lu^Q.,Venna^D.P,S,(1997).CharacterizationofDELTA-l-pyirolioe-5-earboxylatesynthetasegenepromoterintransgenkArabMopsisthaliaaasubjectedtowaterstress.PlantSci,m,SI-狄Zinselmeier，C.，Westgate，M.B.，Sclmssler,J.R.，3o加s，R.J,(l鄉(xiāng)a).Lowwaterpotentialdisruptscarbohydratemetabolisminmaize(Zeo加aj^L,)ovaries.PlantPhysiol,107，385-391.Zinselmei級(jí)，C,，Lauer，MJ.，Boyer，J.S.(1995b).Revelingdrought-inducedlossesingrainyield:sacrosemaintainsembryogrowthinmaize.CropSci.3S，1390-1400.Zinsdmeier,C"Byeong-Ryong，丄,Boyer,J.S.(1995b),Starchandthecontrolofkemdmirriberiiimabe效tlowwaterpotentials.PlantFhysbl.131，25-25,權(quán)利要求1.一種分離的DNA分子，包含編碼核酸的多核苷酸，所述多核苷酸有效連接至在營養(yǎng)組織中可被脅迫誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其中所述核酸能下調(diào)T6PP基因。2.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述多核苷酸表示于SEQIDNO6。3.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO6的至少約21個(gè)連續(xù)堿JJ^。4.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述多核苷酸位于相對于所述啟動(dòng)子的有義方向。5.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述多核苷酸位于相對于所述啟動(dòng)子的反義方向。6.權(quán)利要求3的DNA分子，其中所述多核苷酸為所述21個(gè)連續(xù)堿基對的互補(bǔ)堿基。7.權(quán)利要求3的DNA分子，其中所述多核苷酸位于相對于所述啟動(dòng)子的有義方向。8.權(quán)利要求3的DNA分子，其中所述多核苷酸置于相對于所述啟動(dòng)子的反義方向。9.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述啟動(dòng)子來源于Rabl7基因的5，區(qū)域，并在植物中展現(xiàn)啟動(dòng)子活性。10.權(quán)利要求1的冊A分子，其中所述DNA分子還包含來源于Rabl7基因的3，區(qū)域，并在植物中展現(xiàn)出終止子活性。11.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述啟動(dòng)子包含DM的約100-1649個(gè)連續(xù)核苷酸，其中所述DM的連續(xù)核苷酸與具有序列SEQIDNO.42的DNA的約100至1649個(gè)連續(xù)核苷酸具有85°/。至100°/。同一性。12.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述核酸能形成雙鏈RNA。13.權(quán)利要求l的多核苷酸，其中所述核酸包含共抑制型RNA。14.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所迷核酸包含催化性RNA。15.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述核酸能形成三鏈核酸。16.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述啟動(dòng)子還在種子組織中表達(dá)。17.—種植物細(xì)胞，包含權(quán)利要求1的DNA分子。18.—種轉(zhuǎn)基因植物或其一部分，包含權(quán)利要求17的植物細(xì)胞。19.權(quán)利要求17的植物細(xì)胞，其中權(quán)利要求1的所述的核苷^列包含SEQIDNO.6的至少約21個(gè)連續(xù)>^對。20.權(quán)利要求18的轉(zhuǎn)基因植物或其一部分，其中權(quán)利要求l的所述多核苷酸包含SEQIDNO.6的至少約21個(gè)連續(xù)堿基對。21.權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物為單子葉植物。22.權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物為大麥、水稻、玉米、小麥、高粱、甘蔗或黑麥。23.權(quán)利要求l的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物為玉米植物。24.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述核酸在種子組織中表達(dá)。25.權(quán)利要求1的DNA分子，其中所述DNA分子表示于SEQIDNO.8或SEQIDNO.18。26.權(quán)利要求1的DM分子，其中所述啟動(dòng)子還在所述轉(zhuǎn)基因植物的籽粒中發(fā)育表達(dá)。27.—種分離的DNA分子，包含編碼核酸的多核苷酸，所述多核苷酸有效連接至在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，并編碼能下調(diào)TPP基因的TPP蛋白或抗體。28.權(quán)利要求27的分離的DNA分子，其中所述啟動(dòng)子在種子組織中表達(dá)。29.—種分離的DNA分子，包含編碼RNAi的多核苷酸，所述多核苷酸有效連接至在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其中所述MAi能下調(diào)T6PP基因的表達(dá)。30.權(quán)利要求29的DNA分子，其中所述多核苷酸表示于SEQIDNO.6。31.權(quán)利要求30的DNA分子，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO.6的至少約21個(gè)連續(xù)g對。32.權(quán)利要求31的DNA分子，其中所述多核苷酸為所述21個(gè)連續(xù)堿基對的互補(bǔ)堿基。33.權(quán)利要求29的DNA分子，其中所述啟動(dòng)子來源于Rabl7基因的5，區(qū)域，并在植物中展現(xiàn)出啟動(dòng)子活性。34.權(quán)利要求29的DNA分子，其中所述DNA分子包含來源于Rabl7基因的3，區(qū)域，并在植物中展現(xiàn)出終止子活性。35.權(quán)利要求29的DNA分子，其中所述啟動(dòng)子包含DNA的約100-1649個(gè)連續(xù)核苷酸，其中所述DNA的連續(xù)核苷酸與具有序列SEQIDNO.42的DM的約100至1649個(gè)連續(xù)核苷酸具有85%至100%同一性。36.—種植物細(xì)胞，包含權(quán)利要求29的DNA分子。37.—種轉(zhuǎn)基因植物或其一部分，包含權(quán)利要求36的植物細(xì)胞。38.權(quán)利要求36的植物細(xì)胞，其中權(quán)利要求29的所述多核苷酸包含SEQIDNO.1的至少約21個(gè)連續(xù)威基對。39.權(quán)利要求37的轉(zhuǎn)基因植物或其一部分，其中權(quán)利要求29的所述多核苷酸包含SEQIDNO.6的至少約21個(gè)連續(xù)4^對。40.權(quán)利要求39的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物為單子葉植物。41.權(quán)利要求39的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物為大麥、水稻、玉米、小麥、高粱、甘蔗或黑麥。42.權(quán)利要求29的DNA分子，其中所述DNA分子表示于SEQIDNO.8或SEQIDNO.18。43.—種提高植物的籽粒中淀粉含量的方法，包括如下步驟a)用權(quán)利要求1所述DM分子轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；b)由所述植物細(xì)胞形成植物；c)在所述植物繁殖期間面臨干旱條件時(shí)，誘導(dǎo)權(quán)利要求1的所述核^列在所述植物的營養(yǎng)組織中表達(dá)；以及d)所述轉(zhuǎn)基因植物和不含所述DM分子的同源植物在基本相同的干旱條件下生長時(shí)，與所述同源植物的籽粒中的淀粉含量相比，提高籽粒中的淀粉含量。44.權(quán)利要求43的提高植物的籽粒中淀粉含量的方法，其中所述啟動(dòng)子相對于所述植物種類是內(nèi)源性的。45.權(quán)利要求43的提高植物的籽粒中淀粉含量的方法，其中所述啟動(dòng)子包含Rabl7基因的5'非編碼調(diào)節(jié)區(qū)。46.權(quán)利要求45的提高植物的籽粒中淀粉含量的方法，其中所述核酸序列還包含Rabl7基因的3，終止子非編碼區(qū)。47.—種轉(zhuǎn)基因植物，由權(quán)利要求43的方法制備得到。48.轉(zhuǎn)基因種子，來源于權(quán)利要求47的植物。49.一種雙鏈短干擾核酸(siRNA)分子，它在植物的營養(yǎng)組織中下調(diào)T6PP基因的表達(dá)，其中所述siRNA分子包含至少約21個(gè)>5^對。50.權(quán)利要求49的siRNA分子，其中所述雙鏈siRNA分子的一條鏈包含與T6PP基因或其一部分的核苦酸序列基本相似的核苷酸序列，其中所述雙鏈siRNA分子的另一條鏈包含與所述第一條鏈的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。51.權(quán)利要求49的siRNA分子，其中所述siRNA分子由SEQIDNO.6的至少約21個(gè)連續(xù)M對編碼。52.權(quán)利要求49的siRNA分子，其中所述siRNA分子包含核糖核苷酸。53.—種分離的DM分子，包含編碼核酸的多核苷酸，所述多核苷酸有效連接至在營養(yǎng)組織中受干旱誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，其中所述核酸能下調(diào)T6PP基因。54.權(quán)利要求53的DNA分子，其中所述多核苷酸表示于SEQIDNO.6。55.權(quán)利要求53的DNA分子，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO.6的至少約21個(gè)連續(xù)g對。56.權(quán)利要求53的DNA分子，其中所述多核苷酸位于相對于所述啟動(dòng)子的有義方向。57.權(quán)利要求53的DNA分子，其中所述多核苷酸位于相對于啟動(dòng)子的反義方向。58.權(quán)利要求53的DNA分子，其中所述多核苷酸為所述21個(gè)連續(xù)堿基對的互補(bǔ)序列。59.權(quán)利要求53的DNA分子，其中所述多核苷酸位于相對于所述啟動(dòng)子的有義方向。60.權(quán)利要求53的DNA分子，其中所述多核苷酸位于相對于所述啟動(dòng)子的反義方向。61.權(quán)利要求53的DNA分子，其中所述啟動(dòng)子來源于Rabl7基因的5，區(qū)域，并在植物中展現(xiàn)出啟動(dòng)子活性。62.權(quán)利要求53的DNA分子，其中所述DNA分子還包含來源于Rabl7基因的3，區(qū)域，并在植物中展現(xiàn)出終止子活性。63.權(quán)利要求53的DM分子，其中所述啟動(dòng)子包含DNA的約100-1649個(gè)連續(xù)核苷酸，其中所述DM的連續(xù)核苷酸與具有序列SEQIDNO.42的DNA的約100至1649個(gè)連續(xù)核苷酸具有85%至100%同一性。64.權(quán)利要求53的DNA分子，其中所述核酸能形成雙鏈RNA。65.權(quán)利要求53的DNA分子，其中所述多核苦酸含有共抑制型RNA。66.權(quán)利要求53的DM分子，其中所述多核苷酸包含催化性RNA。67.權(quán)利要求53的DNA分子，其中所述多核苷酸能形成三鏈核酸。68.權(quán)利要求53的DNA分子，其中所述啟動(dòng)子還在種子組織中表達(dá)。69.—種植物細(xì)胞，包含權(quán)利要求53的DNA分子。70.—種轉(zhuǎn)基因植物或其一部分，包含權(quán)利要求69的植物細(xì)胞。71.權(quán)利要求69的植物細(xì)胞，其中權(quán)利要求53的所述多核苷酸包含SEQIDNO.6的至少約21個(gè)連續(xù)堿基對。72.權(quán)利要求70所述的轉(zhuǎn)基因植物或其一部分，其中權(quán)利要求53的所述多核苷酸包含SEQIDNO.6的至少約21個(gè)連續(xù)g對。73.權(quán)利要求70的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物為單子葉植物。74.權(quán)利要求70的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物為大麥、7jc稻、玉米、小麥、高粱、甘蔗或黑麥。75.權(quán)利要求70的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述植物為玉米植物。76.權(quán)利要求53的DNA分子，其中所述核酸在種子組織中表達(dá)。77.權(quán)利要求53的DNA分子，其中所述DNA分子表示于SEQIDNO.8或SEQIDNO.18.78.—種提高植物的籽粒中淀粉含量的方法，包括如下步驟a)獲得含有權(quán)利要求1的所述DNA分子的植物；b)干旱條件下種植所述植物；c)在所述植物繁殖期間面臨干旱條件時(shí)，誘導(dǎo)權(quán)利要求1的所述核M列在所述植物的營養(yǎng)組織中表達(dá)；以及d)所述植物和不含所述DNA分子的同源植物在基^M目同的干早條件下生長時(shí)，與所述同源植物的籽粒中的淀粉含量相比，提高所述植物的籽粒中的淀粉含量。79.—種分離的DNA分子，包含編碼核酸的多核苷酸，所述多核苷酸有效連接至在植物的營養(yǎng)組織中受脅迫誘導(dǎo)并在所述植物的籽粒中發(fā)育表達(dá)的啟動(dòng)子，其中所述核酸能下調(diào)T6PP基因。全文摘要本發(fā)明涉及包含分離DNA分子的轉(zhuǎn)基因植物，所述分離DNA分子包含編碼能下調(diào)內(nèi)源性T6PP基因的核酸的多核苷酸，其中所述多核苷酸受控于受脅迫誘導(dǎo)并主要在營養(yǎng)組織中表達(dá)的啟動(dòng)子。該啟動(dòng)子還在正在成熟的籽粒中發(fā)育表達(dá)。多核苷酸的表達(dá)使得植物在遭受環(huán)境脅迫如水分虧缺時(shí)可提供更多的碳來發(fā)育小花/籽粒。因此，本發(fā)明的DNA分子可使得更多光合產(chǎn)物被指引至正在發(fā)育的胚珠/胚，從而在遭遇階段性脅迫的生長環(huán)境中產(chǎn)生穩(wěn)定產(chǎn)量。文檔編號(hào)A01H5/10GK101115385SQ200580047716公開日2008年1月30日申請日期2005年11月28日優(yōu)先權(quán)日2004年12月3日發(fā)明者M(jìn)·L·拉格里米尼,M·努奇奧,N·斯普林格申請人:先正達(dá)參股股份有限公司