專利名稱：培育超氧化物歧化酶金絲小棗的方法及其專用生物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種培育超氧化物歧化酶金絲小棗的方法及其專用生物制劑。
背景技術(shù)：
金絲小棗是我國(guó)棗資源中品質(zhì)極其優(yōu)良的品種之一，國(guó)內(nèi)外享有較高的聲譽(yù)。據(jù)史料記載，濱州地區(qū)金絲小棗栽培始于商朝，盛于明清，已有三千多年的歷史，現(xiàn)年產(chǎn)鮮棗10萬(wàn)噸以上。金絲小棗外形美觀，果皮薄、鮮紅光亮，肉厚、核小、肉質(zhì)致密、多汁、脆甜味美、營(yíng)養(yǎng)豐富。它富含蛋白質(zhì)、脂肪，十九種氨基酸，多種礦物質(zhì)和維生素。其中Vc含量最高，每百克鮮棗果肉中含量高達(dá)380-600毫克，為“百果之冠”(但制成干品，其Vc含量損失97％以上)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為棗肉具有保護(hù)心臟，強(qiáng)健肌力，增加體重的功能，對(duì)冠心病、高血壓、神經(jīng)衰弱有特殊的食療作用，據(jù)近代藥理證實(shí)，棗中含有極豐富的生理活性物質(zhì)-環(huán)磷酸腺苷，該物質(zhì)參與體內(nèi)多種生理功能，可調(diào)節(jié)人體免疫系統(tǒng)，具有增強(qiáng)心肌收縮力，保護(hù)冠狀動(dòng)脈，降低膽固醇，抑制癌細(xì)胞增殖等作用。我國(guó)民間早就流傳著“五谷加小棗，賽過(guò)靈芝草”，“日食仨?xiàng)?，長(zhǎng)壽不老”的諺語(yǔ)，在國(guó)內(nèi)外已被列入“保健食品”行列。
SOD酶(超氧化物歧化酶)是生物重要保護(hù)酶之一，能增強(qiáng)機(jī)體抗逆能力，防衰老。專利號(hào)為93103774.3，發(fā)明名稱為“一種產(chǎn)生超氧化物歧化酶的芽孢桿菌及其生產(chǎn)方法”的中國(guó)發(fā)明專利中公開了一株芽孢桿菌，菌株保藏號(hào)為CGMCC 0175，該菌株具有較強(qiáng)的產(chǎn)生超氧化物歧化酶的能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種培育超氧化物歧化酶金絲小棗的方法及其專用生物制劑。
本發(fā)明提供的培育超氧化物歧化酶金絲小棗的專用生物制劑(金絲小棗專用SOD制劑)，包括活性成分和吸附劑，所述活性成分是2.5-3.5×1010cfu/g生物制劑的芽孢桿菌CGMCC No.0175。
所述吸附劑可為輕質(zhì)碳酸鈣、草炭或腐植酸。
所述輕質(zhì)碳酸鈣、草炭或腐植酸可為所述芽孢桿菌菌體重量的5-7倍。
所述輕質(zhì)碳酸鈣、草炭或腐植酸的細(xì)度可為0.08-0.1mm，優(yōu)選為0.09mm。
本發(fā)明提供的培育超氧化物歧化酶金絲小棗的方法，是向樹冠噴施上述培育超氧化物歧化酶金絲小棗的專用生物制劑。
在實(shí)際應(yīng)用中，所述向樹冠噴施上述培育超氧化物歧化酶金絲小棗的專用生物制劑的方法可為從花期開始，利用上述培育超氧化物歧化酶金絲小棗的專用生物制劑800-1200倍稀釋液對(duì)金絲小棗的樹冠進(jìn)行噴霧，每隔15-20天噴一次，共噴6次。
用本發(fā)明的培育超氧化物歧化酶金絲小棗的方法培育的金絲小棗也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明培育SOD金絲小棗的方法是將金絲小棗專用SOD制劑應(yīng)用在金絲小棗的生產(chǎn)過(guò)程中，結(jié)合金絲小棗的栽培管理，獲得的高含SOD酶的金絲小棗。SOD金絲小棗除了保持原有金絲小棗的優(yōu)良性狀，SOD含量明顯提高，具有增強(qiáng)人體免疫力和延緩衰老的功效。
本發(fā)明的金絲小棗專用SOD制劑通過(guò)植物有益內(nèi)生芽孢桿菌在金絲小棗樹體內(nèi)繁殖、轉(zhuǎn)移，提高金絲小棗體內(nèi)的SOD活性和含量。使用金絲小棗專用SOD制劑后，金絲小棗產(chǎn)生的SOD酶有較強(qiáng)的耐溫抗熱性和抗逆能力，在70℃條件下處理1小時(shí)，酶活為原酶活的80％以上；100℃條件下處理20分鐘，酶活為原酶活的70％以上；對(duì)臭氧、高溫高酸的耐性強(qiáng)；金絲小棗專用SOD制劑是由植物體內(nèi)有益內(nèi)生共生芽孢桿菌中制備而成，具有高度的安全性。因此，利用金絲小棗專用SOD制劑培育的金絲小棗保持了較高的SOD酶活，而且在深加工過(guò)程中仍可保持較高的SOD酶活。


圖1為SOD金絲小棗的栽培生產(chǎn)流程圖具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中的方法如無(wú)特別說(shuō)明，均為常規(guī)方法。
實(shí)施例1、SOD金絲小棗的制備一、金絲小棗專用SOD制劑的制備1、菌株的發(fā)酵生產(chǎn)1)制備條件滅菌條件溫度121-125℃，壓力0.11-0.14Mpa，時(shí)間30min；培養(yǎng)條件溫度28-34℃，壓力0.05Mpa，通氣值1∶1，pH值7-7.5；放罐指標(biāo)含菌量≥70億 cfu/m1，芽孢形成≥70％，雜菌率≤0.3％。
2)菌種生產(chǎn)從芽孢桿菌CGMCC No.0175原菌種斜面上挑取少許在備用斜面試管內(nèi)劃線，置于28-30℃溫箱中培養(yǎng)24h，取出檢查，確認(rèn)無(wú)雜菌污染，菌體生長(zhǎng)整齊時(shí)，再繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，然后涂片、染色，并在油鏡下觀察，無(wú)雜菌污染，孢子整齊時(shí)，作為發(fā)酵生產(chǎn)的菌種。
3)發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵生產(chǎn)分種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)兩部分進(jìn)行，發(fā)酵液達(dá)到規(guī)定指標(biāo)時(shí)及時(shí)放罐。其中，種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)按照專利號(hào)為93103774.3的發(fā)明專利描述的方法進(jìn)行。
2、制備生物制劑1)添加吸附劑向得到的發(fā)酵液中投入重量為發(fā)酵液1/10的細(xì)度為0.09mm的輕質(zhì)碳酸鈣或草炭或腐植酸，然后機(jī)械攪拌3-6小時(shí)，使芽孢桿菌充分被載體吸附。
2)壓濾采用明流式或暗流式板扛壓濾機(jī)濾去多余水份。
3)干燥低溫干燥(不超過(guò)70℃)，使含水率≤5％。
4)粉碎用超細(xì)度粉碎機(jī)粉碎，細(xì)度要求為100％通過(guò)0.09mm孔徑篩，控制細(xì)度的目的是為防止使用時(shí)堵塞噴頭。
5)包裝得到SOD制劑為白色或灰色粉末，芽孢桿菌含量為3.0×1010cfu/g，含水率≤5％，細(xì)度為100％通過(guò)0.09mm篩。
二、SOD金絲小棗的培養(yǎng)SOD金絲小棗的制備步驟流程圖如圖1所示，具體步驟如下選擇結(jié)果樹，從花期開始，利用金絲小棗專用SOD制劑800-1200倍液對(duì)金絲小棗的樹冠進(jìn)行噴霧，每隔15-20天噴一次，共噴6次，金絲小棗樹結(jié)果后，摘下小棗，得到SOD金絲小棗。
金絲小棗專用SOD制劑可與殺蟲劑、殺菌劑(殺細(xì)菌劑除外)、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、葉面肥等混和使用，在噴施過(guò)程中可與其他栽培措施結(jié)合，不發(fā)生矛盾；在SOD金絲小棗培養(yǎng)過(guò)程中，除去金絲小棗專用SOD制劑的處理外，其他栽培措施仍可按照當(dāng)?shù)爻Ｄ攴e累總結(jié)形成的操作規(guī)程執(zhí)行。
實(shí)施例2、SOD金絲小棗的SOD酶活測(cè)定以清水代替金絲小棗專用SOD制劑、其他栽培管理措施與實(shí)施例1中制備SOD金絲小棗栽培管理一致的條件培養(yǎng)的金絲小棗為對(duì)照；測(cè)定SOD金絲小棗和對(duì)照金絲小棗的SOD酶活，SOD的測(cè)定方法采用NBT光化學(xué)法，具體如下1)設(shè)備752型分光光度計(jì)；臺(tái)式離心機(jī)；光照培養(yǎng)箱；冰箱；10ml小燒杯等。
2)試劑氯化硝基氮藍(lán)四唑(NBT)——上海前進(jìn)制劑廠生產(chǎn)L-甲硫氨酸(L-Met)——上?？颠_(dá)氨基酸廠生產(chǎn)乙二胺四乙酸(EDTA)——北京化工廠生產(chǎn)核黃素(VB2)——北京西中化工廠生產(chǎn)3)反應(yīng)液的配制NBT反應(yīng)液的制備配制pH7.8，50mmol/L的磷酸緩沖液1000ml，加入1.933mg的L-Met(L-甲硫氨酸)，待完全溶解后，放入45.8mg NBT(氯化硝基氮藍(lán)四唑)，0.47mg核黃素(配成0.47mg/ml溶液，吸取1ml加入)和29.0mgEDTA，溶液終濃度Met為13mmol/L；NBT為6.3×10-3mmol/L；核黃素為1.3×10-3mmol/L；EDTA為0.1mmol/L，置于棕色試劑瓶中，用黑布罩遮光，于4℃冰箱中可保存1個(gè)月。
4)材料的預(yù)處理金絲小棗果肉用研缽研碎，按照果肉∶50mM磷酸緩沖液＝1∶2的比例加入緩沖液，10000rpm離心10分鐘，取上清液進(jìn)行SOD酶活測(cè)定。
5)測(cè)定方法吸取30μl樣品，放入10ml透明玻璃小燒杯中，加入3mlNBT反應(yīng)液，混勻，在28℃SOD光化反應(yīng)室中，2×15W日光燈光照20分鐘(光照為4000勒克司)，在560nm處測(cè)定吸光度，以NBT反應(yīng)液作空白對(duì)照，每組設(shè)3次重復(fù)，整個(gè)測(cè)定過(guò)程除光化反應(yīng)外，均在避光或弱光條件下進(jìn)行。同時(shí)測(cè)試過(guò)程中以美國(guó)″Sigma″公司、上海寶安公司的標(biāo)準(zhǔn)酶和貴州老來(lái)福藥業(yè)公司生產(chǎn)的SOD口服液作為測(cè)試對(duì)照。
6)計(jì)算SOD酶活(IU/g)＝(OD對(duì)照-OD樣品)/(1/2OD對(duì)照)×稀釋倍數(shù)金絲小棗中SOD酶活測(cè)定結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明，SOD金絲小棗中SOD酶活顯著高于普通金絲小棗，且在a＝0.05水平差異顯著，酶活提高70.2％。說(shuō)明通過(guò)該項(xiàng)技術(shù)可以生產(chǎn)出具有高SOD酶活的SOD保健金絲小棗。
表1.SOD金絲小棗的SOD活性測(cè)定

注A和B是方差分析差異的表示方法，表示SOD金絲小棗與對(duì)照普通金絲小棗的SOD酶活差異顯著。
實(shí)施例3、SOD金絲小棗中SOD的耐熱性測(cè)定以清水代替金絲小棗專用SOD制劑、其他栽培管理措施與實(shí)施例1中制備SOD金絲小棗栽培管理一致的條件培養(yǎng)的金絲小棗為對(duì)照；用實(shí)施例2的SOD酶活性測(cè)定方法，測(cè)定在100℃中保持20分鐘的實(shí)施例1制備的SOD金絲小棗和對(duì)照金絲小棗的SOD酶活性，結(jié)果見表2。
由表2可知，經(jīng)過(guò)熱處理后，SOD金絲小棗中仍保持較高的SOD酶活，但對(duì)照含有的SOD酶活極低。說(shuō)明通過(guò)該項(xiàng)技術(shù)生產(chǎn)的SOD金絲小棗，適于在常溫下保存和進(jìn)行深加工，仍能保持較高的SOD活性。
表2.SOD金絲小棗中SOD的抗熱性測(cè)定

注A和B是方差分析差異的表示方法，表示SOD金絲小棗與對(duì)照普通金絲小棗的SOD酶活差異顯著。
權(quán)利要求
1.一種培育超氧化物歧化酶金絲小棗的專用生物制劑，包括活性成分和吸附劑，所述活性成分是2.5-3.5×1010cfu/g生物制劑的芽孢桿菌CGMCC No.0175。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的培育超氧化物歧化酶金絲小棗的專用生物制劑，其特征在于所述吸附劑為輕質(zhì)碳酸鈣、草炭或腐植酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的培育超氧化物歧化酶金絲小棗的專用生物制劑，其特征在于所述輕質(zhì)碳酸鈣、草炭或腐植酸的顆粒細(xì)度為0.08-0.1mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培育超氧化物歧化酶金絲小棗的專用生物制劑，其特征在于所述輕質(zhì)碳酸鈣、草炭或腐植酸的顆粒細(xì)度為0.09mm。
5.一種培育超氧化物歧化酶金絲小棗的方法，是向樹冠噴施權(quán)利要求1-4中任一所述的培育超氧化物歧化酶金絲小棗的專用生物制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述向樹冠噴施權(quán)利要求1-4中任一所述的培育超氧化物歧化酶金絲小棗的專用生物制劑的方法為從花期開始，利用權(quán)利要求1-4中任一所述的培育超氧化物歧化酶金絲小棗的專用生物制劑的800-1200倍稀釋液對(duì)金絲小棗的樹冠進(jìn)行噴霧，每隔15-20天噴一次，共噴6次。
7.用權(quán)利要求5或6所述的方法培育得到的金絲小棗果實(shí)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種培育超氧化物歧化酶金絲小棗的方法及其專用生物制劑。該培育金絲小棗專用SOD制劑，包括活性成分和吸附劑，所述活性成分是2.5－3.5×10
文檔編號(hào)A01G7/06GK1807590SQ20061000011
公開日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2006年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月4日
發(fā)明者王 琦, 趙國(guó)防, 張金海, 王峰, 梅汝鴻 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)