專利名稱：冰草成熟胚組織培養(yǎng)再生方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種冰草成熟胚組織培養(yǎng)再生方法，尤其是涉及一種冰草成熟胚誘導(dǎo)再生植株的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
我國的草地是全國面積最大的綠地生態(tài)系統(tǒng)，但主要處于西北邊陲，大多屬于干旱和半干旱地區(qū)，生態(tài)環(huán)境脆弱。近幾十年來，由于過度放牧、不合理利用、濫墾濫伐等原因，致使草地‘三化’現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。而這些地區(qū)可供開發(fā)利用的土地資源十分豐富，可利用抗旱抗鹽堿性強(qiáng)的植物來改善這些地區(qū)的生態(tài)環(huán)境，提高土地利用率。由于大多數(shù)牧草生育周期較長(zhǎng)，性狀遺傳較為復(fù)雜，用常規(guī)育種方法培育新品種難度較大；造成了我國牧草生產(chǎn)品種數(shù)量少、品質(zhì)差，而且抗逆性水平程度均不高。如何能在短時(shí)間內(nèi)培育出適合我國不同地域的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗逆性及抗病蟲害特性優(yōu)異的新品種便成為牧草育種一個(gè)急待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可以有效提高冰草體細(xì)胞胚胎和芽發(fā)生頻率的冰草成熟胚組織培養(yǎng)再生方法。
本發(fā)明的目的由如下技術(shù)方案實(shí)施其包括有如下步驟，(1)種子的選取及處理；(2)將成熟胚接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，(3)將愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的成熟胚轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(4)挑選生長(zhǎng)狀態(tài)好的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)；(5)待分化出小苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根；a、所述種子的選取及處理選取有生活力的飽滿種子，將種子在室溫下用水浸泡后，剝?nèi)?nèi)外稃，放到含有1.0mg/L-4.0mg/L 2，4-D的溶液中浸泡1.5小時(shí)-3.0小時(shí)，再消毒處理；所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+0.1mol/L-0.5mol/L甘露醇+1mg/L-10mg/L 2，4-D+濃度為0.2％-1.5％AgNO3+質(zhì)量百分比為2％-10％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.55％-0.85％瓊脂，其中所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌，使出愈。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于可以促進(jìn)愈傷組織的器官發(fā)生與體細(xì)胞胚胎的發(fā)生，提高出愈率；促進(jìn)一些再生困難種芽的產(chǎn)生；增加外植體產(chǎn)生不定芽的數(shù)目及提高植株再生頻率。


圖1為成熟胚組織培養(yǎng)再生方法的工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1冰草成熟胚組織培養(yǎng)再生方法包括有如下步驟，(1)種子的選取及處理選取有生活力的飽滿種子，將種子在室溫下用水浸泡2～4h后，剝?nèi)?nèi)外稃，放到含有1.0mg/L 2，4-D的溶液中浸泡1個(gè)半小時(shí)，然后在超凈工作臺(tái)上用75％酒精消毒30s，無菌水沖洗至少3次后用0.2％升汞消毒5min，再用無菌水沖洗至少3次；置于鋪有濕無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，用解剖針從盾片處挑出盡量少帶胚乳的胚；在剝?nèi)∨邥r(shí)適當(dāng)將胚夾破，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每皿接種50粒成熟胚；(2)將成熟胚接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，26℃暗培養(yǎng)14天，其中愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+0.1mol/L甘露醇+1mg/L2，4-D+濃度為0.2％AgNO3+質(zhì)量百分比為2％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.55％瓊脂，其中所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌，使出愈。
(3)將愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的成熟胚轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天，繼代2～3次繼代培養(yǎng)基MS+0.2mol/L甘露醇+2.0mg/L 2，4-D+0.3mg/L水質(zhì)狀脫落酸ABA+質(zhì)量百分比為2％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.55％瓊脂，其中所述培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌；(4)挑選生長(zhǎng)狀態(tài)好的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)；其中分化培養(yǎng)基MS+3.0mg/L KT+1.0mg/L NAA+質(zhì)量百分比為2％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.55％瓊脂，其中所述培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌；培養(yǎng)條件為26℃下16h光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為3000～4000lx，每隔30天繼代一次。
(5)待分化出小苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根，其中生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/L NAA+質(zhì)量百分比為2％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.55％瓊脂，其中所述培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌。
實(shí)施例2冰草成熟胚組織培養(yǎng)再生方法包括有如下步驟，(1)種子的選取及處理，選取有生活力的飽滿種子，將種子在室溫下用水浸泡2～4h后，剝?nèi)?nèi)外稃，放到含有3.0mg/L 2，4-D的溶液中浸泡3個(gè)小時(shí)，然后在超凈工作臺(tái)上用75％酒精消毒30s，無菌水沖洗至少3次后用30％的次氯酸鈉消毒45min左右，再用無菌水沖洗至少3次；置于鋪有濕無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，用刀片將含有胚的部分切下，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每皿接種50粒成熟胚；(2)將成熟胚接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，26℃暗培養(yǎng)14天，其中愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+0.5mol/L甘露醇+10mg/L2，4-D+濃度為1.5％AgNO3+質(zhì)量百分比為10％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.85％瓊脂，其中所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌，使出愈；(3)將愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的成熟胚轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天，繼代2～3次繼代培養(yǎng)基MS+0.2mol/L甘露醇+2.0mg/L2，4-D+0.6mg/L水質(zhì)狀脫落酸ABA+質(zhì)量百分比為10％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.85％瓊脂，其中所述培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌；(4)挑選生長(zhǎng)狀態(tài)好的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)；其中分化培養(yǎng)基MS+3.0mg/L KT+1.0mg/L NAA+質(zhì)量百分比為10％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.85％瓊脂，其中所述培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌；培養(yǎng)條件為26℃下16h光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為3000～4000lx，每隔30天繼代一次。
(5)待分化出小苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根，其中生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/L NAA+質(zhì)量百分比為10％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.85％瓊脂，其中所述培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌。
實(shí)施例3冰草成熟胚組織培養(yǎng)再生方法包括有如下步驟，(1)種子的選取及處理，選取有生活力的飽滿種子，將種子在室溫下用水浸泡2～4h后，剝?nèi)?nèi)外稃，放到含有2.0mg/L 2，4-D的溶液中浸泡2個(gè)小時(shí)，然后在超凈工作臺(tái)上用75％酒精消毒30s，無菌水沖洗至少3次后用50％的次氯酸鈉消毒25min左右，再用無菌水沖洗至少3次；置于鋪有濕無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，用解剖針從盾片處挑出盡量少帶胚乳的胚；在剝?nèi)∨邥r(shí)適當(dāng)將胚夾破，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，每皿接種50粒成熟胚；(2)將成熟胚接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，26℃暗培養(yǎng)14天，其中愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基+0.3mol/L甘露醇+5.5mg/L2，4-D+濃度為0.85％AgNO3+質(zhì)量百分比為3％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.7％瓊脂，其中所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌，使出愈；(3)將愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的成熟胚轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天，繼代2～3次繼代培養(yǎng)基MS+0.2mol/L甘露醇+2.0mg/L2，4-D+0.6mg/L水質(zhì)狀脫落酸ABA+質(zhì)量百分比為3％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.7％瓊脂，其中所述培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌；(4)挑選生長(zhǎng)狀態(tài)好的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)；其中分化培養(yǎng)基MS+3.0mg/L KT+1.0mg/L NAA+質(zhì)量百分比為3％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.7％瓊脂，其中所述培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌；培養(yǎng)條件為26℃下16h光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為3000～4000lx，每隔30天繼代一次。
(5)待分化出小苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根，其中生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.5mg/L NAA+質(zhì)量百分比為3％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.7％瓊脂，其中所述培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌。
實(shí)施例4本發(fā)明和現(xiàn)有技術(shù)成熟胚誘導(dǎo)再生植株的培養(yǎng)的對(duì)比1.1實(shí)驗(yàn)材料(1)、本試驗(yàn)選用多年生冰草的4個(gè)品種的成熟種子為供試材料。按實(shí)施例1，實(shí)施例2，實(shí)施例3的冰草成熟胚組織培養(yǎng)再生方法培養(yǎng)，待分化出小苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根之后進(jìn)行結(jié)果分析。
(2)、同時(shí)選取有生活力的飽滿種子，如實(shí)施例1的方法處理，之后再在如下的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。
將成熟胚接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，26℃暗培養(yǎng)14天，然后轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)20天，繼代2～3次。挑選生長(zhǎng)狀態(tài)好的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化，培養(yǎng)條件為26℃下16h光照培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為3000～4000lx，每隔30天繼代一次。待分化出小苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根。
其中愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+甘露醇0.2mol/L+2，4-D2.0mg/L+質(zhì)量百分比為3％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.7％瓊脂，其中所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌；繼代培養(yǎng)基MS+甘露醇0.2mol/L+2，4-D 2.0mg/L+6BA0.3mg/L+質(zhì)量百分比為3％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.7％瓊脂，其中所述培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌；分化培養(yǎng)基MS+KT 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+質(zhì)量百分比為3％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.7％瓊脂，其中所述培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌；生根培養(yǎng)基1/2MS+NAA 0.5mg/L+質(zhì)量百分比為3％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.7％瓊脂，其中培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌；按實(shí)施例1的方法培養(yǎng)，待分化出小苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根之后進(jìn)行結(jié)果分析。
2、兩種方法對(duì)冰草組培再生的影響(如下表)

從表中可以看出，把4種冰草接種在不同的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，出愈率存在著較大差異，本發(fā)明的出愈率比現(xiàn)有技術(shù)的出愈率平均高出11.6％，從而使分化率也相應(yīng)的提高了13％。
3、原因AgNO3的作用可以促進(jìn)愈傷組織的器官發(fā)生與體細(xì)胞胚胎的發(fā)生，提高出愈率；促進(jìn)一些再生困難種芽的產(chǎn)生；增加外植體產(chǎn)生不定芽的數(shù)目及提高植株再生頻率。
作用機(jī)制AgNO3能競(jìng)爭(zhēng)性地作用于乙烯作用部位，從而抑制乙烯活性(乙烯合成量與芽分化能力呈負(fù)相關(guān)，乙烯不但抑制外植體芽分化，也抑制了再生苗的生長(zhǎng))，促進(jìn)植物器官發(fā)生和體細(xì)胞胚胎發(fā)生。Ag+的存在使乙烯不能干擾多胺的合成，AgNO3通過促進(jìn)多胺的合成提高體細(xì)胞胚胎和芽發(fā)生的頻率。
權(quán)利要求
1.冰草成熟胚組織培養(yǎng)再生方法，其包括有如下步驟，(1)種子的選取及處理，(2)將成熟胚接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，(3)將愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)的成熟胚轉(zhuǎn)入繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(4)挑選生長(zhǎng)狀態(tài)好的愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)；(5)待分化出小苗后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中生根；其特征在于a、所述種子的選取及處理選取有生活力的飽滿種子，將種子在室溫下用水浸泡后，剝?nèi)?nèi)外稃，放到含有1.0mg/L-4.0mg/L2，4-D的溶液中浸泡1.5小時(shí)-3.0小時(shí)，再消毒處理；b、所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS基本培養(yǎng)基+0.1mol/L-0.5mol/L甘露醇+1mg/L-10mg/L2，4-D+濃度為0.2％-1.5％AgNO3+質(zhì)量百分比為2％-10％的蔗糖+質(zhì)量百分比0.55％-0.85％瓊脂，其中所述愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的pH值5.8～6.0，常規(guī)方法高壓滅菌，使出愈。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種冰草成熟胚組織培養(yǎng)再生方法，在種子的選取及處理過程中；將剝?nèi)?nèi)外稃的飽滿種子，放到含有1.0mg/L－4.0mg/L 2，4－D的溶液中浸泡1.5小時(shí)－3.0小時(shí)，再消毒處理；將成熟胚接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其中愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基增加了AgNO
文檔編號(hào)A01C1/00GK1820583SQ20061000849
公開日2006年8月23日 申請(qǐng)日期2006年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月28日
發(fā)明者米福貴, 云錦鳳, 霍秀文, 露曉平, 徐春波, 魏建華, 王宏枝, 李瑞芬, 張輝, 劉娟, 王桂花 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)