專利名稱：一種具有殺線蟲(chóng)功能的菌劑及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有殺線蟲(chóng)功能的菌劑及其應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
植物寄生線蟲(chóng)是一種世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的植物病害，僅根結(jié)線蟲(chóng)已知種類達(dá)70多種，為害3000多種植物，每年造成的損失巨大。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，每年因線蟲(chóng)造成損失全球高達(dá)1000億美元。在我國(guó)，線蟲(chóng)主要危害煙草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋參等主要經(jīng)濟(jì)作物，成為發(fā)展這些作物的重要限制因子。據(jù)全國(guó)煙草病蟲(chóng)害防治信息中心不完全統(tǒng)計(jì)，僅云南省發(fā)病面積就達(dá)2.7萬(wàn)公傾，直接經(jīng)濟(jì)損失1.2億元，間接損失更為嚴(yán)重。黑龍江省僅大豆胞囊線蟲(chóng)每年造成的損失達(dá)8億元之多。松材線蟲(chóng)被稱為無(wú)煙森林火災(zāi)，在江蘇、浙江、廣東、山東、安徽、湖北、上海、臺(tái)灣、香港等部份地區(qū)嚴(yán)重發(fā)生，有向全國(guó)漫延的趨勢(shì)。在山東、廣東、海南和云南等蔬菜主產(chǎn)區(qū)，蔬菜根結(jié)線蟲(chóng)呈上升趨勢(shì)。更嚴(yán)重的是由于根結(jié)線蟲(chóng)侵染后，造成作物傷口，致使作物根部病害嚴(yán)重發(fā)生。云南的三七根腐就是典型例子?；瘜W(xué)殺線蟲(chóng)劑自上個(gè)世紀(jì)40年代發(fā)現(xiàn)以來(lái)，在線蟲(chóng)防治中發(fā)揮了重要作用。但是隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)現(xiàn)許多化學(xué)殺線蟲(chóng)劑均有副作用，造成環(huán)境污染，危害人體健康。相繼有不少被禁用或即將禁用。特別是植物寄生線蟲(chóng)發(fā)生于作物根部，由于土壤環(huán)境的特殊性，必須大劑量施用才能保證其防效。而大劑量化學(xué)農(nóng)藥對(duì)地下水污染非常嚴(yán)重。因此，研究開(kāi)發(fā)高效低毒低殘留殺線蟲(chóng)劑已經(jīng)是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中的重要課題。
經(jīng)文獻(xiàn)檢索，未見(jiàn)與本發(fā)明相同的公開(kāi)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過(guò)對(duì)一株具有產(chǎn)生酶而分解線蟲(chóng)功能的嗜麥芽窄食單胞菌研究，開(kāi)發(fā)生物殺線蟲(chóng)劑。
本發(fā)明篩選到的一株對(duì)植物寄生線蟲(chóng)具有很好殺蟲(chóng)功能的嗜麥芽窄食單胞菌(stenotrophomonas maltophilia)G6，G6菌株已保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2005年10月31日；保藏登記入冊(cè)的編號(hào)CGMCC No1522。
本發(fā)明stenotrophomonas maltiphilia G6菌株形態(tài)特征為微彎或直桿狀，典型的細(xì)胞長(zhǎng)2μm，寬0.5μm。在MBA平板上菌落灰色到綠色，圓形，隆起，濕潤(rùn)有光澤。G6菌株的殺線蟲(chóng)機(jī)制理為先形成粗蛋白分解線蟲(chóng)體壁，通過(guò)體壁侵入線蟲(chóng)體內(nèi)，最終將線蟲(chóng)全部分解。在整個(gè)殺線蟲(chóng)過(guò)程中，伴隨著產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶對(duì)線蟲(chóng)的作用。
stenotrophomonas maltophilia G6是發(fā)明人在開(kāi)展的食線蟲(chóng)菌物研究中，從大量樣品中分離獲得，發(fā)現(xiàn)其對(duì)線蟲(chóng)具極高的殺蟲(chóng)活性。將菌株純化并進(jìn)行多批次殺線蟲(chóng)活性試驗(yàn)后，委托云南大學(xué)微生物研究所對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，確定為嗜麥芽寡食(窄食)單胞菌stenotrophomonas maltophilia G6。
本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的擴(kuò)大培養(yǎng)G6菌株，提取殺線蟲(chóng)有效成分，進(jìn)行殺線蟲(chóng)藥效試驗(yàn)，確定其對(duì)線蟲(chóng)的作用。
G6培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)1、試管種培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為1-3％酵母浸膏、0.5-2％蛋白胨、1-4％葡萄糖、1.8-2％瓊脂、余下為水，pH7。將G6菌絲體接種到培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)2天，獲得試管種。
2、液體擴(kuò)大培養(yǎng)液體培養(yǎng)基配方為1-3％酵母粉、10-20％大豆餅粉、0.5-2％魚(yú)粉、1-4葡萄糖、余下為水，pH7。將試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝100ml，于30℃下?lián)u床培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間2天，轉(zhuǎn)速為220rpm。
3、提取殺線蟲(chóng)活性成份將發(fā)酵培養(yǎng)物于8000rpm/min離心20分鐘，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時(shí)，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清。用10mM的tris-HCl緩沖液(PH8.0)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于20倍的10mMtris-HCl緩沖液(PH8.0)中透析4次，每次3小時(shí)，即得殺線蟲(chóng)藥液。將藥液保存于4℃冰箱中待用。
G6殺線蟲(chóng)活性試驗(yàn)1、制備試驗(yàn)用藥劑按前述液體擴(kuò)大培養(yǎng)方法培養(yǎng)G6菌株，按前述提取殺線蟲(chóng)活性成份的方法制備試驗(yàn)用藥劑。
2、制備對(duì)照用藥劑對(duì)照1前述1制備試驗(yàn)用藥劑方法制備對(duì)照用藥劑，但培養(yǎng)基中不接入G6菌株。
對(duì)照2以清水作為對(duì)照。
對(duì)照3為了證明殺線蟲(chóng)有效成份是蛋白，將制備的供試藥劑煮沸滅活后作為對(duì)照。
2、制備試驗(yàn)用線蟲(chóng)(1)制備Panagrellus redivivus線蟲(chóng)將P.redivivus線蟲(chóng)接種于燕麥片培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)6天，凍于4℃冰箱備用。將所需線蟲(chóng)用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內(nèi)，加5ml無(wú)菌水洗滌，瞬時(shí)離心，棄上清，重復(fù)5次得到潔凈供試線蟲(chóng)。用無(wú)菌水將線蟲(chóng)稀釋為含量為15條/μl的線蟲(chóng)懸浮液。
(2)制備松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchus xylophilus)在100ml三角瓶中放入15g經(jīng)水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高壓滅菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培養(yǎng)5天。待菌絲鋪滿三角瓶后，接種經(jīng)0.25％次氯酸鈉表面消毒的松材線蟲(chóng)，28℃培養(yǎng)15至20天。用無(wú)菌水將線蟲(chóng)洗下，制成含量為15條/μl的線蟲(chóng)懸浮液。
3、試驗(yàn)方法(1)藥效試驗(yàn)方法取試驗(yàn)用藥劑200μl于1.5ml離心管中，加入活線蟲(chóng)150條，離心管平放，置于25℃下，Panagrellus redivivus線蟲(chóng)分別于12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)；松材線蟲(chóng)分別于24小時(shí)、48小時(shí)、60小時(shí)檢查計(jì)算線蟲(chóng)的死亡率。并在光學(xué)顯微鏡下觀察，觀察線蟲(chóng)體壁變化情況鑒定死亡的方法為在處理離心管中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分鐘后觀察，死蟲(chóng)僵直，活蟲(chóng)則卷曲或扭動(dòng)。
分別用3種對(duì)照藥劑，每處理重復(fù)三次。

4、試驗(yàn)結(jié)果表1 G6菌株對(duì)Panagrellus redivivus作用效果

表2 對(duì)松材線蟲(chóng)作用效果

結(jié)果表明，從G6菌株液體發(fā)酵產(chǎn)物中提取的試驗(yàn)用藥劑對(duì)Panagrellus redivivus線蟲(chóng)和松材線蟲(chóng)均具較好的殺蟲(chóng)效果，線蟲(chóng)的平均死亡率在95％以上。從處理線蟲(chóng)的變化來(lái)看，經(jīng)歷了從部份體壁溶解(圖2)到蟲(chóng)體全部溶解的過(guò)程(圖3)，說(shuō)明活性成份主要為分解線蟲(chóng)的酶類。而將同批提取的試驗(yàn)用藥劑經(jīng)過(guò)煮沸，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性后，其殺線蟲(chóng)活性非常小，且線蟲(chóng)體壁不出現(xiàn)溶解現(xiàn)象，這也證明了G6對(duì)線蟲(chóng)的活性成份主要為酶類。
本發(fā)明G6菌株主要作用成份是酶，對(duì)線蟲(chóng)特別是松材線蟲(chóng)具有顯著的毒殺作用。同時(shí)G6菌株在本發(fā)明培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)極快，具備了很好的應(yīng)用開(kāi)發(fā)前景。


圖1顯示處理線蟲(chóng)12小時(shí)被固定情況。
圖2顯示處理線蟲(chóng)24小時(shí)分解情況。
圖3顯示處理線蟲(chóng)36小時(shí)分解情況。
圖4顯示蟲(chóng)體保持完好的對(duì)照線蟲(chóng)。
具體實(shí)施例方式以下是本發(fā)明的實(shí)施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實(shí)施例一將stenotrophomonas maltophilia G6菌體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為2％酵母浸膏、1.5％蛋白胨、2％葡萄糖、1.8％瓊脂、余下為水，pH為7。將G6菌絲體接種到培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)2天，獲得試管種。
將試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中(每瓶裝100ml)，液體培養(yǎng)基配方為2％酵母粉、15％大豆餅粉、1％魚(yú)粉、3％葡萄糖、余下為水，pH7。于30℃下?lián)u床培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間2天，轉(zhuǎn)速為220rpm。
將發(fā)酵培養(yǎng)物于8000rpm/min離心20分鐘，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時(shí)，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清。用10mM的tris-hcl(pH8.0)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于20倍的10mMtris-hcl(pH8.0)中透析4次，即得殺線蟲(chóng)藥液。
實(shí)施例二基本同實(shí)施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為3％酵母粉、10％大豆餅粉、2％魚(yú)粉、1％葡萄糖、余下為水。
實(shí)施例三基本同實(shí)施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為1％酵母粉、20％大豆餅粉、0.5％魚(yú)粉、4％葡萄糖、余下為水。
權(quán)利要求
1.一種具有殺線蟲(chóng)功能的菌劑，由生產(chǎn)菌株經(jīng)試管種培養(yǎng)、液體擴(kuò)大培養(yǎng)及提取殺線蟲(chóng)活性成份工序后得到，其特征在于該菌劑由如下步驟得到a.生產(chǎn)菌株為嗜麥芽窄食單胞菌(stenotrophomonas maltophilia)G6，該菌株已于2005年10月31日保藏在中國(guó)微生物菌種管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏登記入冊(cè)的編號(hào)CGMCC No1522；b.試管種培養(yǎng)將G6菌絲體接種到配方為1-3％酵母浸膏、0.5-2％蛋白胨、1-4％葡萄糖、1.8-2％瓊脂、余下為水，pH7的培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)2天，獲得試管種；c.液體培養(yǎng)將試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝100ml，于30℃下?lián)u床培養(yǎng)培養(yǎng)時(shí)間2天，轉(zhuǎn)速為220rpm；液體培養(yǎng)基配為1-3％酵母粉、10-20％大豆餅粉、0.5-2％魚(yú)粉、1-4％葡萄糖、余下為水，pH7；d.提取殺線蟲(chóng)活性成份將發(fā)酵培養(yǎng)物于8000rpm/min離心20分鐘，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時(shí)，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清，用10mM的tris-HCl緩沖液重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋于20倍的10mMtris-HCl緩沖液中透析4次，每次3小時(shí)，即得殺線蟲(chóng)藥液。
2.權(quán)利要求1所述的菌劑的應(yīng)用，其特征在于該菌劑對(duì)Panagrellus redivivus線蟲(chóng)和松材線蟲(chóng)具有毒殺作用，可應(yīng)用于植物寄生線蟲(chóng)的生物防治。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有殺線蟲(chóng)功能的菌劑及其應(yīng)用，屬微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明菌劑由生產(chǎn)菌株經(jīng)試管種培養(yǎng)、液體擴(kuò)大培養(yǎng)及提取殺線蟲(chóng)活性成分工序后得到，其生產(chǎn)菌株為嗜麥芽窄食單胞菌stenotrophomonas maltophilia G6，G6菌株已保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2005年10月31日；保藏登記入冊(cè)的編號(hào)CGMCC No1522。G6菌株的主要作用機(jī)理是通過(guò)產(chǎn)生酶，分解線蟲(chóng)體壁，從而對(duì)線蟲(chóng)特別是松材線蟲(chóng)產(chǎn)生顯著的毒殺作用，可制備為生物殺線劑。本發(fā)明產(chǎn)品對(duì)松材線蟲(chóng)具有毒力高的突出優(yōu)點(diǎn)，具有較好的潛在應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01P5/00GK1806554SQ20061001068
公開(kāi)日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2006年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月14日
發(fā)明者張克勤, 劉軍偉, 周薇 申請(qǐng)人:云南大學(xué)