專利名稱：：一種榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于十字花科蔬菜育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種新的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育、繁殖的方法。
背景技術(shù)：
：細(xì)胞質(zhì)雄性不育(簡稱CMS，下同)是油菜雜種優(yōu)勢最重要的途徑。目前國內(nèi)外已報(bào)道的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型很多，根據(jù)其來源不同可分為異源細(xì)胞質(zhì)雄性不育和同源細(xì)胞質(zhì)雄性不育兩大類在異源CMS中，最有利用價(jià)值并已開始商業(yè)化育種的有oguCMS、kosenaCMS和tourCMS；在同源CMS中，具有商業(yè)利用價(jià)值的主要是波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育系(PolCMS)。PolCMS是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)傅廷棟教授1972年發(fā)現(xiàn)的國際上第一個(gè)有實(shí)用價(jià)值的油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。資料顯示，1985-1994年期間，國際上有70％以上的油菜雜交種均由polCMS育成，它仍為當(dāng)前國內(nèi)甘藍(lán)型油菜雜種生產(chǎn)使用的主要不育細(xì)胞質(zhì)源。但PolCMS的主要不足是不育系因核背景而異存在不同程度的生態(tài)敏感性，通常在低溫或高溫條件下出現(xiàn)可育花粉，影響制種純度。napCMS更易受環(huán)境和溫度的影響，在雜種生產(chǎn)上的利用價(jià)值受到了限制。PolCMS不育源不僅在油菜雄性不育系的選育中被廣泛利用，而且還被廣泛地應(yīng)用到其它十字花科蔬菜作物雄性不育系的選育中?？鹿鹛m等(1992年)利用甘藍(lán)型油菜波里馬不育源為材料與大白菜多代轉(zhuǎn)育，獲得了異源胞質(zhì)白菜不育系CMS3411-7，其不育株率可達(dá)100％，不育度在95％以上，但其致命弱點(diǎn)是在不利的環(huán)境條件下會(huì)出現(xiàn)微量花粉和輕度蕾敗育現(xiàn)象(柯桂蘭等，大白菜異源胞質(zhì)雄性不育系CMS3411-7的選育及應(yīng)用[J]，園藝學(xué)報(bào)，1992，19(4)333-340)。有關(guān)蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的研究利用進(jìn)展，自O(shè)gura1968年發(fā)現(xiàn)OguCMS以來，國內(nèi)外學(xué)者對該不育材料進(jìn)行了大量的回交轉(zhuǎn)育。目前已轉(zhuǎn)育到油菜、甘藍(lán)、白菜、青花菜等十字花科作物中。但由于最初的OguCMS存在低溫苗期黃化、蜜腺不發(fā)達(dá)等問題，至今在生產(chǎn)中未得到推廣利用(張德雙等，大白菜CMS96細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的特點(diǎn)分析，華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2005，20(1)59-62)。芥菜為十字花科，蕓薹屬一兩年生草本植物。芥菜在我國栽培歷史悠久，多分布于中國長江以南各省，其類型和品種很多，主要有芥子菜、葉用芥菜、莖用芥菜、薹用芥菜、芽用芥菜、根用芥菜等。通常所說的芥菜一般指葉用芥菜。葉用芥菜有大葉芥菜、小葉芥菜、雪里紅、包心芥菜等，中國廣東地區(qū)以大葉芥菜、小葉芥菜最為常見。莖用芥菜主要指的是榨菜。到目前為止，尚無利用芥菜型不育胞質(zhì)選育榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育存在的缺陷，提出一種新的育性穩(wěn)定的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育方法，為榨菜雜種優(yōu)勢利用提供新的種質(zhì)資源。利用本發(fā)明選育的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的不育性穩(wěn)定、徹底和不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，培育新型的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料和蔬菜雜交種。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)一種榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育方法，選擇天然芥菜型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6-102A作母本，用保持系榨菜6-170作父本，雜交獲得F1，通過分子標(biāo)記輔助選擇和連續(xù)回交，得到遺傳穩(wěn)定的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系，繁殖該榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，得到所述的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS6-170。具體選育步驟如下(1)利用RFLP分子標(biāo)記方法對天然芥菜型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6-102A進(jìn)行遺傳分類，獲得油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料6-102A；(2)用步驟(1)得到的6-102A作母本，以保持系榨菜6-170作父本，雜交得到雜種F1；(2)對雜種F1進(jìn)行育性鑒定，用步驟(1)得到的F1植株為母本，以保持系榨菜6-170作父本，雜交得到BC1F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；(3)對BC1F1進(jìn)行育性鑒定，用步驟(2)得到的BC1F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系作母本，以保持系榨菜6-170作父本，得到BC2F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；(4)對BC2F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系進(jìn)行育性鑒定，用步驟(3)得到的BC2F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為母本，以保持系榨菜6-170作父本，雜交得到BC3F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；(5)對BC3F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系進(jìn)行育性鑒定，用步驟(4)得到的BC3F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系作母本，以保持系6-170作輪回親本連續(xù)回交5代，得到BC8榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS6-170。將上述育種得到的包心芥菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系在秋播或夏播隔離條件下進(jìn)行繁殖，即得到本發(fā)明所稱的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS6-170。本發(fā)明的積極效果是1、本發(fā)明的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的不育性十分穩(wěn)定和徹底，該不育系不受環(huán)境影響，在中國甘肅蘭州和湖北武漢連續(xù)五年10代種植并進(jìn)行育性鑒定表明，其育性均表現(xiàn)0級(jí)。不育株率和不育度均為100％。2、本發(fā)明的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系沒有任何死蕾和苗期黃化等現(xiàn)象。3、本發(fā)明的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為榨菜雜種優(yōu)勢提供了新的育種途徑和方法。圖1是本發(fā)明技術(shù)流程圖；圖2是芥菜型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6-102A，6-102B的花藥發(fā)育細(xì)胞學(xué)觀察圖和RFLP分子雜交圖譜圖中A是芥菜型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6-102A和6-102B的花藥的石蠟切片圖；B和C是RFLP分子標(biāo)記多態(tài)性分析(其中B使用的探針為atp6，C使用的探針為atp9)，圖2中B和C的第2個(gè)泳道是本發(fā)明的芥菜型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6-102A。圖3是本發(fā)明選育的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS6-170花器官表型和開花期圖圖中A為不育系CMS6-170花器官圖；B和C分別表示榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS6-170和保持系6-170的花期圖；圖4榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS6-170和保持系6-170的葉片和田間表型對比圖中A是榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS6-170(圖左)和保持系6-170(圖右)的葉片對比；B和C是榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS6-170和保持系6-170植株的田間對比。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育一、對本發(fā)明所用到的芥菜型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6-102A進(jìn)行遺傳分類，其步驟如下1、恢保關(guān)系的測定(1)通過恢保關(guān)系的測定，對芥菜型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系進(jìn)行了正確的遺傳分類，確定編號(hào)為6-102A的材料為新的細(xì)胞質(zhì)雄性不育胞質(zhì)類型。(2)通過恢保關(guān)系的測定(見傅廷棟，《雜交油菜的育種與利用》，湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2000年版所介紹的方法)，分別選取39個(gè)甘藍(lán)型和芥菜型油菜品種或品系分別與polCMS；oguCMS，tourCMS，napCMS，6-102A進(jìn)行測交，其恢保關(guān)系測定結(jié)果如表1所示。表1幾種油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系之間的恢保關(guān)系測定說明1、CMS為細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的英文縮寫，表1中英文字母含義S表示細(xì)胞質(zhì)雄性不育，F(xiàn)表示細(xì)胞質(zhì)雄性可育)；2、上述測定材料5900至棚71-1均分別來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)油菜育種研究室。(3)對獲得的F1進(jìn)行育性調(diào)查，結(jié)果表明，6-102A與其它幾類不育系的恢保關(guān)系不同。2、花藥發(fā)育的顯微鏡觀察取6-102A的花蕾制作石臘切片(參照余風(fēng)群等，甘藍(lán)型油菜幾個(gè)品種花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)研究，中國油料，1988，(4)23-25)，顯微結(jié)構(gòu)觀察表明本發(fā)明的芥菜型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6-102A的花藥發(fā)育的敗育時(shí)期為雄蕊原基分化時(shí)期，其主要特點(diǎn)是雄蕊原基偏離正常的分化軌道，形成花瓣原基，不形成花藥，著生雄蕊的位置長出小花瓣，敗育時(shí)期和方式與現(xiàn)有報(bào)道的油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育不同。3、RFLP分子標(biāo)記分析(1)從天然芥菜型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6-102A(芥菜型油菜)、保持系6-102B(芥菜型油菜)、polCMS(甘藍(lán)型油菜)、oguCMS(甘藍(lán)型油菜)、tourCMS(甘藍(lán)型油菜)、napCMS(甘藍(lán)型油菜)共六種油菜材料中分別提取基因組DNA，參照CTAB法(murrayandthompson，1980)提取基因組總DNA，具體步驟如下A、加2％CTAB提取液(Cetyltriethylammoniumbromide)到25ml，65℃加熱1hr，輕搖，冷卻至室溫。B、加等體積的氯仿/異戊醇(24∶1)，輕輕混合，混勻，至下層為深綠色，靜置10分鐘；C、將B步驟的混合液離心，3000rpm，13~20分鐘；D、取上清，盡可能倒出上清；E、加入1/10體積的10％CTAB提取液，65℃加熱10分鐘；F、加入25ml氯仿/異戊醇(24∶1)，純化，3000rpm，12分鐘；G、加1倍體積的異丙醇沉淀DNA，在-20℃條件下放置20min；H、用76％的乙醇洗洗滌DNA2~3次(3200rpm，離心8分鐘)；I、加TE200μl溶解，4℃過夜，待DNA溶解后，用RNase酶處理所得的DNA溶液(37℃加熱1小時(shí))，檢測DNA濃度及質(zhì)量。(2)制備七種線粒體探針(詳見表2)表2幾種用于Southern雜交分析的線粒體探針<tablesid="table2"num="002"><tablewidth="800">基因插入片段克隆位點(diǎn)來源選擇標(biāo)記atp62.7KbHindIII玉米Ampratp92.2KbXbaI玉米AmpratpA4.2KbHindIII玉米AmprcoxI4.5KbBamHI小麥AmprcoxII1.7KbKpnI/BamHI小麥AmprOrf2220.66KbEcoRI油菜Ampr</table></tables>(3)用限制性內(nèi)切酶EcoRIEcoRV、HindIII、BamHI、PstI對上述六種作物材料的基因組DNA進(jìn)行酶切(4)進(jìn)行Southern雜交(操作步驟參考sambrook，J，等著；《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，北京，科學(xué)出版社，2002年)。a.預(yù)雜交將尼龍膜放入雜交袋或雜交管中，加入雜交液(配方見下)，趕氣泡，封口，放入65℃的雜交箱中，＞3hrs，雜交液浸沒膜。一般地，12hrs。b.標(biāo)記探針反應(yīng)體系1-2blots(19.5×9.5cm2)DNA100ngDNTP2.0μlRandomprimer5.0μlKlenow(1u/μl)1μlα-dCTP*3.0μl加水至17.0μl具體步驟是將探針DNA變性(100℃，10min)-變性探針置于冰浴-按反應(yīng)體系加入反應(yīng)混合液于變性DNA中-再在同位素操作臺(tái)上，加入32P標(biāo)記的dNTP(α-32PdCTP*，α-32P-dCTP)(放射性比活＞3000Ci/mmol)-30℃溫育2小時(shí)以上。c.雜交將標(biāo)記好的探針，補(bǔ)加300μl雜交液100℃變性(或者0.4NNaOH變性)，加入雜交袋(盒)中(忌直接加于膜上)，雜交前作標(biāo)記效率測定。＞25%以上可以往下做雜交。過夜雜交。雜交效率受雜交速率及雜交穩(wěn)定性影響。d.洗膜按照從低嚴(yán)謹(jǐn)度到高嚴(yán)謹(jǐn)度洗膜。1×SSC/0.1％SDS洗膜兩次(冷5min，熱65℃，15min)→0.5×SSC/0.1％SDS熱洗65℃，15min。e.包膜膜從洗膜液中撈出，在濾紙上涼干，膜表面無可見水膜為止(忌太干，以防探針難以洗脫，影響再次使用)用保鮮膜包膜，壓片，置-20℃或-70℃，依據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱進(jìn)行曝光(3-7天)f.沖洗X-光片在暗室紅燈下取出X-光片，置入顯影液中至雜交帶顯現(xiàn)出來(顯影時(shí)間依據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱及曝光時(shí)間長短可由幾秒鐘到2分鐘)，轉(zhuǎn)入清水中漂洗，然后放入定影液中定影至清亮(約10分鐘)。自來水沖洗干凈后，晾干，讀片。雜交緩沖液SouthernBlotHybridizationBuffer(Saghai’sLab)終濃度.原液體積.5×SSC20×250ml50mMPB(pH6.8)0.5M100ml5×Denhardt’s50×100ml2.5mMEDTA(pH8.0)0.5M5ml100μg/mlssDNA5mg/ml20ml0.4％SDS20％20mlDextransulfate50gddH2Oto1000ml20×SSCNaCl175.3g701.2gNa3Citrate88.2g352.8gdH2Oto1000ml4000ml(5)RFLP結(jié)果分析結(jié)果表明探針orf222、atp6、atp9、Orf263-atp6檢測結(jié)果表明二十八種線粒體探針/酶組合中，有十二種探針/酶組合檢測到多態(tài)性，證明本發(fā)明得到的芥菜型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6-102A與PolCMS、NapCMS、oguCMS、tourCMS在線粒體DNA水平是完全不同的，即為不同的細(xì)胞質(zhì)類型。雜交結(jié)果如圖2所示，不育系6-102A與其它五類細(xì)胞質(zhì)的mtDNA雜交圖譜完全不一樣，表現(xiàn)出明顯的多態(tài)性。同時(shí)，四個(gè)線粒體基因的十二種組合也檢測到6-102A和6-102B的mtDNA帶型存在明顯的多態(tài)性，表現(xiàn)為雜交帶的數(shù)目和位置不同，只有orf222/EcoRI存在帶型有無的差異。二、榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育步驟如下(1)用所述的天然芥菜型雄性不育株6-102A(參見中國發(fā)明專利申請?zhí)?00510086942.7，該種子已于2005年11月12日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)為CCTCCNOP200504))作母本，以保持系榨菜常規(guī)品種6-170(該育種材料的種子已于申請日前公開銷售)作父本，雜交得到雜種F1；(2)對雜種F1進(jìn)行育性鑒定，用步驟(1)得到的F1植株為母本，以榨菜常規(guī)品種6-170(保持系)作父本，雜交得到BC1F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS。(3)對BC1F1進(jìn)行育性鑒定，用步驟(2)得到的BC1F1CMS作母本，以榨菜常規(guī)品種6-170(保持系)作父本，得到BC2F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；(4)對BC2F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系進(jìn)行育性鑒定，用步驟(3)得到的BC2F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為母本，以榨菜常規(guī)品種6-170(保持系)作父本，雜交得到BC3F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；(5)對BC3F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系進(jìn)行育性鑒定；用步驟(4)得到的BC3F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系作母本，以保持系6-170作輪回親本連續(xù)回交六代，得到BC8榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS6-170。榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系繁殖步驟是在中國湖北武漢用種子秋播(例如每年的9月)或中國甘肅蘭州夏播(例如每年的5月)隔離條件下，按父本∶母本行比為2∶4的種植比例繁殖榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，其他栽培條件同普通不育系的繁殖。本發(fā)明的積極效果是表3榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS6-170與PolCMS、6-102A的表型比較權(quán)利要求1.一種榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的選育方法，其特征在于，選擇天然芥菜型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6-102A作母本，用保持系榨菜6-170作父本，雜交獲得F1，通過分子標(biāo)記輔助選擇和連續(xù)回交，得到遺傳穩(wěn)定的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和保持系，繁殖該榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系，得到所述的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS6-170。2.根據(jù)權(quán)利1所述的方法，其步驟包括(1)利用RFLP分子標(biāo)記方法對天然芥菜型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6-102A進(jìn)行遺傳分類，獲得油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料6-102A；(2)用步驟(1)得到的6-102A作母本，以保持系榨菜6-170作父本，雜交得到雜種F1；(2)對雜種F1進(jìn)行育性鑒定，用步驟(1)得到的F1植株為母本，以保持系榨菜6-170作父本，雜交得到BC1F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；(3)對BC1F1進(jìn)行育性鑒定，用步驟(2)得到的BC1F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系作母本，以保持系榨菜6-170作父本，得到BC2F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；(4)對BC2F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系進(jìn)行育性鑒定，用步驟(3)得到的BC2F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系為母本，以保持系榨菜6-170作父本，雜交得到BC3F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；(5)對BC3F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系進(jìn)行育性鑒定，用步驟(4)得到的BC3F1細(xì)胞質(zhì)雄性不育系作母本，以保持系6-170作輪回親本連續(xù)回交5代，得到BC8榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS6-170。3.根據(jù)權(quán)利要求1-或2所述的方法，其特征在于，在秋播或夏播隔離條件下繁殖所述的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS6-170。全文摘要本發(fā)明屬于十字花科蔬菜育種
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地，本發(fā)明屬于一種榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系選育方法的發(fā)明。本發(fā)明的技術(shù)特征在于，選擇天然芥菜型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6－102A為母本，用優(yōu)良榨菜6－170作保持系，通過連續(xù)回交和分子標(biāo)記輔助選擇，得到遺傳穩(wěn)定的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系CMS6－170，繁殖該不育系得到可供生產(chǎn)利用的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系。該榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系的不育胞質(zhì)類型與6－102A相同，與波里馬細(xì)胞質(zhì)雄性不育(polCMS)、蘿卜細(xì)胞質(zhì)雄性不育(OguCMS)、tourCMS、napCMS等細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型均不相同，是一種新的細(xì)胞質(zhì)雄性不育類型，其不育度和不育株率均為100％，且不受環(huán)境和遺傳背景的影響。本發(fā)明的榨菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系可用于蔬菜雜種優(yōu)勢育種。文檔編號(hào)A01H1/04GK1849879SQ20061001210公開日2006年10月25日申請日期2006年6月5日優(yōu)先權(quán)日2006年6月5日發(fā)明者傅廷棟,萬正杰,涂金星,馬朝芝,李興華,易斌,文靜申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)