專利名稱：一種鋅指蛋白dpzf基因敲除小鼠模型及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，更具體地涉及一種鋅指蛋白DPZF基因敲除 動(dòng)物模型的建立和功用。
背景技術(shù)：
鋅指蛋白是一類廣泛存在于動(dòng)植物及人類的DNA結(jié)合蛋白。由于其選擇性 地結(jié)合各種DNA和RNA序列的特性，它在基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、配子的 形成和胚胎發(fā)育等生命過程中起著十分重要的作用。自1985年開始，科學(xué)工 作者在這方面進(jìn)行了大量的研究.目前發(fā)現(xiàn)，研究的大多數(shù)鋅指蛋白是基因調(diào) 控因子.它們不僅可結(jié)合于DNA， RNA和DNA-RNA雜交體，還能與其他鋅指蛋 白結(jié)合，控制生物體中基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白的合成。
至今為止，已發(fā)現(xiàn)的鋅指結(jié)構(gòu)有10種，鋅指蛋白DPZF是和BCL-6同源的 POZ鋅指蛋白亞家族的新成員。目前，對(duì)鋅指蛋白DPZF的了解極其有限，也缺 乏必要的手段。
因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種鋅指蛋白DPZF基因敲除動(dòng)物模型，它可 為深入了解鋅指蛋白DPZF的生物學(xué)功能提供有效的研究途徑和方法，并由此
提供其應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種鋅指蛋白DPZF基因敲除動(dòng)物模型。 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述鋅指蛋白DPZF基因敲除動(dòng)物模型的用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種產(chǎn)生鋅指蛋白DPZF基因敲除非人哺乳動(dòng) 物模型的方法，它包括步驟
(i)提供一線性化的基因打靶載體構(gòu)建物，該構(gòu)建物從5'至3'依次含有 (a)DPZF打耙短臂、正選擇基因，(b)自殺基因，(c)DPZF打靶長(zhǎng)臂； (ii)通過體外轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、篩選與打靶載體發(fā)生同源重組 的陽性ES細(xì)胞克隆，經(jīng)顯微注射技術(shù)入非人哺乳動(dòng)物囊胚中；
(iii) 將步驟(ii)得到的囊胚植入假孕的非人哺乳動(dòng)物的子宮；
(iv) 產(chǎn)生鋅指蛋白DPZF基因敲除非人哺乳動(dòng)物模型。
在另一優(yōu)選例中，還包括步驟
(v) 對(duì)步驟(iv)獲得的鋅指蛋白DPZF基因敲除動(dòng)物進(jìn)行鑒定。
在另一優(yōu)選例中，還包括步驟
(vi) 使獲得的鋅指蛋白DPZF基因敲除動(dòng)物進(jìn)行交配建系，獲得子代。 在另一優(yōu)選例中，所述的正選擇基因是Neo、 hph、或gpt。 在另一優(yōu)選例中，所述的自殺基因是HSV-tk、胞嘧啶脫氨酶基因、或
VIV-TK。
在另一優(yōu)選例中，所述的非人哺乳動(dòng)物是小鼠、大鼠、兔或猴。 在另一優(yōu)選例中，所述的非人哺乳動(dòng)物是小鼠。 在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物基因刪除外顯子。 在另一優(yōu)選例中，所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物不含啟動(dòng)子。
在另一優(yōu)選例中，所產(chǎn)生的是鋅指蛋白DPZF編碼第91位至602位氨基酸缺
失的非人哺乳動(dòng)物。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種用上述方法產(chǎn)生的鋅指蛋白DPZF基因 敲除非人哺乳動(dòng)物模型。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種用上述方法產(chǎn)生的鋅指蛋白DPZF基因 敲除非人哺乳動(dòng)物模型的用途，所述的動(dòng)物模型可用于篩選(a)促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育， (b)促進(jìn)聽力，或(c)改善血糖代謝的藥物。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種鋅指蛋白DPZF的用途，它可用于制備治療 (a)促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育，(b)促進(jìn)聽力，或(c)改善血糖代謝的藥物。
在另一優(yōu)選例中，可以將鋅指蛋白DPZF及其所在的上、下游生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通 路作為治療生長(zhǎng)發(fā)育障礙、聽力障礙和肥胖、高血糖等疾病的藥物干預(yù)靶點(diǎn)。
據(jù)此，本發(fā)明提供了一種鋅指蛋白DPZF基因敲除動(dòng)物模型，有效地揭示 了鋅指蛋白DPZF的生物學(xué)功能，并由此提供了鋅指蛋白DPZF基因敲除動(dòng)物模 型及鋅指蛋白DPZF的用途。


圖1是鋅指蛋白DPZF基因打靶載體及其與基因組進(jìn)行同源重組的示意圖。 圖2顯示了鋅指蛋白DPZF基因敲除小鼠基因型Southern (DNA印跡雜交) 鑒定；
其中4、 5、 8、 ll表示DPZF基因敲除雜合子，3、 6、 7、 9、 10表示野生 型基因；
其中+/ —表示0 2 基因敲除雜合子，一/一表示DPZF基因敲除純合子。 圖3顯示了鋅指蛋白DPZF基因敲除小鼠生長(zhǎng)發(fā)育障礙的情況； 左邊為出生后3周的鋅指蛋白DPZF基因敲除小鼠，右邊為同齡的正常對(duì) 照小鼠。
圖4顯示了鋅指蛋白DPZF基因敲除小鼠對(duì)不同頻率的聲波刺激喪失反應(yīng) 的情況。
圖5顯示了鋅指蛋白DPZF在正常小鼠內(nèi)耳中表達(dá)的免疫組化染色結(jié)果。 圖6顯示了鋅指蛋白DPZF基因敲除小鼠低血糖的情況及其機(jī)理分析， 其中wt表示野生型小鼠，ko表示鋅指蛋白DPZF基因缺陷小鼠。 圖7是糖耐量實(shí)驗(yàn)顯示鋅指蛋白DPZF基因敲除小鼠葡萄糖清除能力增強(qiáng)。 其中0 2 + / +表示野生型，—/一表示DPZF基因缺陷型。
具體實(shí)施例方式
發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，建立了鋅指蛋白DPZF基因敲除小鼠模型， 通過對(duì)該模型的表型分析，意外地發(fā)現(xiàn)，鋅指蛋白DPZF基因敲除小鼠有生長(zhǎng) 發(fā)育障礙，聽力喪失，血糖水平顯著低下，胰島素水平低下葡萄糖清除能力增 強(qiáng)等情況發(fā)生，有效顯示了鋅指蛋白DPZF的生物學(xué)功能。
鋅指蛋白DPZF基因敲除動(dòng)物模型的建立
本發(fā)明通過本領(lǐng)域熟知的基因打靶技術(shù)建立鋅指蛋白DPZF基因敲除動(dòng)物模 型，可用于本發(fā)明的自殺基因沒有特別限制，可以選用本領(lǐng)域常規(guī)使用的各種 自殺基因。代表性的例子包括(但并不限于)hsv-TK、胞嘧啶脫氨酶(CD)、 VIV-TK等。
可用于本發(fā)明的正選擇基因沒有特別限制，可以選用本領(lǐng)域常規(guī)使用的各 種正選擇基因。代表性的例子包括(但并不限于)Neo、 hph、 、 gpt等。
本發(fā)明利用Cre重組酶將正選擇基因Neo最終從基因組中去除，避免其對(duì) 小鼠表型的可能影響。
鋅指蛋白DPZF基因敲除動(dòng)物模型
本發(fā)明所建立的鋅指蛋白DPZF基因敲除動(dòng)物模型中所敲除的可以是其基 因組結(jié)構(gòu)中任一段外顯子，優(yōu)選敲除編碼鋅指蛋白DPZF第91一602位氨基酸 的外顯子。
本發(fā)明的鋅指蛋白DPZF基因敲除基因長(zhǎng)度可以是l一20kb，優(yōu)選3 — 6kb， 更優(yōu)選3 — 4kb。
鋅指蛋白DPZF基因敲除動(dòng)物模型的用途
本發(fā)明提供的鋅指蛋白DPZF基因敲除動(dòng)物的表型分析顯示了生長(zhǎng)發(fā)育障 礙，聽力喪失和血糖代謝失穩(wěn)等狀況。
本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，利用該模型篩選促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的化合物，方法如下
(1) 在測(cè)試組中，給鋅指蛋白DPZF基因敲除動(dòng)物服用待篩選的候選物，并檢 測(cè)生長(zhǎng)發(fā)育情況；
(2) 若步驟(1)測(cè)試組中生長(zhǎng)發(fā)育情況的改善在統(tǒng)計(jì)學(xué)上高于(更優(yōu)選明顯高
于)對(duì)照組(未服用候選物組)中生長(zhǎng)發(fā)育情況，就表明該候選物是可促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā) 育的化合物。
本發(fā)明的另一優(yōu)選例中，利用該模型篩選促進(jìn)聽力的化合物，方法同篩選促 進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的化合物的類似。
本發(fā)明的再一優(yōu)選例中，利用該模型篩選改善血糖代謝的化合物，方法同篩 選促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育的化合物的類似。
本發(fā)明揭示了鋅指蛋白DPZF的生物學(xué)功能，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中提供了 一種制備治療生長(zhǎng)發(fā)育障礙疾病的藥物的方法，就是加入治療有效量的鋅指蛋白 DPZF及藥學(xué)上可接受的載體?？梢灾瞥筛鞣N劑型，包括(但不限于)片劑、膠 囊、注射劑等。
本發(fā)明的另一優(yōu)選例中提供了一種制備治療聽力障礙疾病的藥物的方法，就 是加入治療有效量的鋅指蛋白DPZF及藥學(xué)上可接受的載體?？梢灾瞥筛鞣N劑型， 包括(但不限于)片劑、膠囊、注射劑等。
本發(fā)明的再一優(yōu)選例中提供了一種制備治療血糖代謝疾病的藥物的方法，就
是加入治療有效量的鋅指蛋白DPZF及藥學(xué)上可接受的載體?？梢灾瞥筛鞣N劑型，
包括(但不限于)片劑、膠囊、注射劑等。 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于
1. 首次建立了鋅指蛋白DPZF基因敲除動(dòng)物；
2. 首次利用該模型揭示了鋅指蛋白DPZF的生物學(xué)功能，可以將鋅指蛋白 DPZF及其上、下游生物傳導(dǎo)通路作為藥物治療生長(zhǎng)發(fā)育障礙、聽力障礙、或/ 和血糖代謝疾病等的作用靶點(diǎn)；
3. 運(yùn)用該模型有效地進(jìn)行針對(duì)性的藥物篩選。
下面將結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于 說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn) 方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照 制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。
除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟 悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于 本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
實(shí)施例l
建立鋅指蛋白基因敲除模型
1、 通過構(gòu)建基因打靶載體，見圖1;
2、 將上述載體轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞(ES)，篩選同源重組的ES克??；
3、 將步驟(3)獲得的同源重組的ES細(xì)胞行囊胚注射后、植入假孕小鼠
子宮，得到嵌合小鼠；
5、嵌合小鼠進(jìn)一步交配后得到鋅指蛋白DPZF的基因敲除小鼠，其基因型 經(jīng)Southern印跡雜交鑒定，見圖2， DPZF蛋白缺失經(jīng)Western免疫印跡和免 疫組化分析確認(rèn)。
實(shí)施例2
鋅指蛋白基因敲除敲除小鼠的表型分析1
實(shí)施例1獲得的DPZF基因缺陷小鼠出生時(shí)無明顯異常，出生后一周表現(xiàn) 出明顯的生長(zhǎng)發(fā)育障礙，體重是正常小鼠的50%左右，見圖3。
結(jié)果顯示大部分小鼠出生后3周死亡，其余小鼠存活時(shí)間不超過5個(gè)月。
實(shí)施例3
鋅指蛋白基因敲除小鼠的表型分析2
實(shí)施例1獲得的DPZF基因缺陷小鼠聽力完全喪失，見圖4。 免疫組化分析結(jié)果顯示，DPZF在正常小鼠的內(nèi)耳細(xì)胞中特異表達(dá)(見圖5)， 提示DPZF為小鼠聽力發(fā)育所必需。
實(shí)施例4
鋅指蛋白基因敲除敲除小鼠的表型分析3
實(shí)施例1獲得的DPZF基因缺陷小鼠異常消瘦，見圖3，血糖水平顯著低下， 進(jìn)一步分析其肝糖原水平基本正常，血清胰高血糖素水平正常、胰島素水平低 下(見圖6、 7)，葡萄糖耐量試驗(yàn)顯示其對(duì)血清葡萄糖的清除能力增強(qiáng)。
結(jié)果顯示鋅指蛋白DPZF在維持機(jī)體血糖代謝的穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用以限定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù) 內(nèi)容范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)內(nèi)容是廣義地定義于申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍中，任 何他人完成的技術(shù)實(shí)體或方法，若是與申請(qǐng)的權(quán)利要求范圍所定義的完全相 同，也或是一種等效的變更，均將被視為涵蓋于該權(quán)利要求范圍之中。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生鋅指蛋白DPZF基因敲除非人哺乳動(dòng)物模型的方法，其特征在于，它包括步驟(i)提供一線性化的基因打靶載體構(gòu)建物，該構(gòu)建物從5’至3’依次含有(a)DPZF打靶短臂、正選擇基因，(b)自殺基因，(c)DPZF打靶長(zhǎng)臂；(ii)通過體外轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、篩選與打靶載體發(fā)生同源重組的陽性ES細(xì)胞克隆，經(jīng)顯微注射技術(shù)入非人哺乳動(dòng)物囊胚中；(iii)將步驟(ii)得到的囊胚植入假孕的非人哺乳動(dòng)物的子宮；(iv)產(chǎn)生鋅指蛋白DPZF基因敲除非人哺乳動(dòng)物模型。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的正選擇基因是Neo、 hph、 或gpt。
3. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的自殺基因是HSV-tk、胞 嘧啶脫氨酶基因、或VIV-TK。
4. 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳動(dòng)物是小鼠、 大鼠、兔或猴。
5. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的非人哺乳動(dòng)物是小鼠。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的轉(zhuǎn)基因構(gòu)建物基因刪 除外顯子。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，產(chǎn)生鋅指蛋白DPZF編碼第91 位至602位氨基酸缺失的非人哺乳動(dòng)物。
8. —種用權(quán)利要求l一6任一所述的方法產(chǎn)生的鋅指蛋白DPZF基因敲除非 人哺乳動(dòng)物模型。
9. 一種用權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的鋅指蛋白DPZF基因敲 除非人哺乳動(dòng)物模型的用途，其特征在于，所述的動(dòng)物模型用于篩選(a)促進(jìn)生 長(zhǎng)發(fā)育，(b)促進(jìn)聽力，或(c)改善血糖代謝的藥物。
10. —種鋅指蛋白DPZF的用途，其特征在于，用于制備治療(a)促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā) 育，(b)促進(jìn)聽力，或(c)改善血糖代謝的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種鋅指蛋白DPZF基因敲除非人哺乳動(dòng)物模型及其制備方法，本發(fā)明還公開了利用所述的鋅指蛋白DPZF基因敲除非人哺乳動(dòng)物模型篩選促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育、改善聽力和血糖代謝的化合物的方法，以及將DPZF及其所在的上、下游生物信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為藥物干預(yù)靶點(diǎn)治療生長(zhǎng)發(fā)育障礙、聽力障礙和肥胖、高血糖等疾病的用途。
文檔編號(hào)A01K67/027GK101096684SQ200610028218
公開日2008年1月2日 申請(qǐng)日期2006年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月27日
發(fā)明者章衛(wèi)平 申請(qǐng)人:章衛(wèi)平