專利名稱：水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種水稻稻瘟病抗性基因Pi36的分離克隆與應用。
背景技術：
植物在生長的過程中，常常受到多種病原物的侵害，而植物則采取多種防御策略以保護自身，避免受其侵襲。植物中一個最重要的防御機理就是能夠識別專性致病微生物的存在并啟動自身的防御應答系統(tǒng)。植物對病原菌的識別由抗病基因所介導。因此，抗病基因產(chǎn)物結構的分析與研究，是了解植物抗病機制的基礎，對于植物病害的預防和控制也具有重要的指導意義。
迄今，已經(jīng)從3種單子葉植物和5種雙子葉植物中分離了40多個抗病基因。對這些抗病基因的結構和產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，雖然寄主植物不同，所拮抗的病原物也有真菌、細菌、病毒和線蟲等差異，但抗病基因的結構和產(chǎn)物卻有許多共同的結構特征，如C-端存在富亮氨酸重復序列(leucine-rich repeat，LRR)，N-端存在核苷酸結合位點(nucleotide binding site，NBS)，亮氨酸拉鏈(leucine zipper，LZ)，卷曲螺旋結構域(coiled-coil，CC)，跨膜結構域(transmembrane domain，TM)，蛋白激酶(protein kinase，PK)，以及果蠅Toll蛋白及哺乳動物白介素-1受體(Toll andinterleukin-1 receptor，TIR)等。根據(jù)它們所編碼蛋白的結構特征，可將抗病基因分為7類(Hammond-Kosack & Jones，1997；Dangl & Jones 2001；Iyer & McCouch2004)。
第一類，毒素還原酶類抗病基因。如玉米抗病基因Hm1，它是第1個被克隆的植物抗病基因，它負責對真菌Cochliobolus carbonum小種1的抗性。Hm1編碼的解毒酶能鈍化病原真菌所產(chǎn)生的HC毒素，而HC毒素是真菌C.carbonum小種1產(chǎn)生的致病因子，它決定該病菌只能感染玉米的某些基因型(Johal等，1992)。第二類，NBS-LRR類抗病基因。它們編碼的蛋白近N端為NBS，而近C端則由LRR組成。如RPS2(Bent等，1994)、RPM1(Grant等，1995)、I2(Simon等，1998)、RPP5(Parker等，1997)、N(Dodd等，2001)、L6(Lawrence等，1995)、Mla1(Zhou等，2001)、Mla6(Halterman等，2001)；水稻的抗病基因如Xa1(Yoshimura等，1998)、Pib(Wang等，1999)、Pita(Bryan等，2000)等。第三類，PK類抗病基因。如番茄Pto基因，其產(chǎn)物是一個位于細胞內的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，沒有LRR結構域(Martin等，1993)。第四類，LRR-TM類抗病基因。番茄抗葉霉病不同生理小種的基因Cf-2(Dixon等，1996)、Cf-4(Thomas等，1997)、Cf-5(Dixon等，1998)、Cf-9(Jones等，1994)，以及甜菜抗胞囊線蟲的基因Hs1ppro-1(Cai等，1997)等。第五類，LRR-TM-PK類抗病基因，以水稻抗白葉枯病基因Xa21(Song等，1995)為代表。第六類，以擬南芥的RPW8為代表，其編碼的蛋白僅含有完整的CC和NBS結構域(Xiao等，2001)。第七類，以水稻的xa5基因為代表，其編碼的蛋白為一個轉錄因子(TFIIAγ)(Iyer &McCouch，2004)。
編碼NBS-LRR類抗病蛋白的抗病基因是植物抗病基因中最大的一類抗病基因，根據(jù)NBS-LRR類抗病蛋白N末端的結構特點，又可將該類基因分為兩大類TIR-NBS-LRR(TNL)和CC-NBS-LRR(CNL)(Meyers等，1999；Pan等，2000；Cannon等，2002；Richly等，2002)。TNL類抗病基因主要發(fā)現(xiàn)在雙子葉植物，至今還沒在單子葉植物基因組中發(fā)現(xiàn)(Bai等，2002；Meyers等，2002)。目前在單子葉植物中鑒定到的抗病基因主要編碼CNL類抗病蛋白，雙子葉植物中也存在大量的CNL類抗病基因，相對而言，單子葉植物中的CNL類抗病基因比雙子葉植物中的更豐富多樣(Cannon等，2002)。
研究表明，NBS、CC、TIR結構域可能參與信號傳導(Hammond-Kosack &Jones 1997)，盡管這類R蛋白不具有內在的激酶活性，但NBS可以激活激酶或G蛋白，NBS具有結合ATP或GTP以及水解酶活性(Traut，1994)。TIR結構可能參與植物抗病防衛(wèi)反應下游的信號傳導(Jones，1994)。最近的證據(jù)表明，亞麻的L族多樣性選擇也發(fā)生在TIR區(qū)域，這個區(qū)域與相應的LRR區(qū)域共進化形成特異性(Luck等，2000)。LRR結構域的功能主要涉及到蛋白質-蛋白質和與配體的相互作用(Jones & Jones，1996；Kajava，1998)，據(jù)推測是抗病基因產(chǎn)物直接和病原菌無毒基因編碼的產(chǎn)物或間接產(chǎn)物相互作用的部位(Bent，1996；Baker等，1997)。Jia等(2000)通過酵母雙雜交證明AVR-Pita編碼的蛋白加工為一個176氨基酸的活性蛋白AVR-Pita176小種特異性的激發(fā)子，傳遞到植物細胞質特異地與Pita受體的LRD區(qū)域結合，從而激活細胞內Pita介導的防衛(wèi)反應。當Pita中的Ala變?yōu)镾er后Av-rPita176不能與LRD結合，因而表現(xiàn)感病。這一結果直接證明了LRR結構域可能就是病原菌識別的區(qū)域；Pita與AvrPita的互作第一次從分子水平驗證了水稻與稻瘟病菌的“基因對基因”關系。
水稻是世界上最重要的糧食作物之一，約有一半以上的人口以稻米為主食。由病原真菌Magnapothe grisea Barr.(無性態(tài)Pyricularia grisea Sacc.)引起的稻瘟病是對水稻生產(chǎn)危害最嚴重的病害之一，每年都造成嚴重的糧食損失。從環(huán)境保護與農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展的觀點來看，抗病品種的育成與利用是防治稻瘟病最安全有效的方法。但是，由于稻瘟病菌群體的多樣性及易變性，加之人們缺乏對抗性基因的有效利用，以及對抗性機理缺乏充分的了解，以致抗病品種的感病化問題不但沒有得到解決，反而因有效抗源基因的缺乏和抗病品種的短命化而成為育種學家最為棘手的問題。因此，發(fā)掘、鑒定和克隆抗病基因并合理地應用于抗病育種計劃已成為農(nóng)業(yè)科研中優(yōu)先解決的重要問題。
隨著分子生物學的快速發(fā)展，迄今，至少有80多個水稻稻瘟病主效抗性基因已經(jīng)被報道，其中60個已經(jīng)被分子定位。目前，除了水稻的第3染色體上還沒有被鑒定到稻瘟病主效抗性基因之外，其余的11條染色體上均被鑒定到有主效抗性基因位點，并且有的染色體上含有多個稻瘟病抗性位點，而且有些基因位點的抗性基因是成簇存在的。值得指出的是，在眾多被成功定位的抗性基因中，只有抗性基因Pib和Pita兩個抗性基因被成功地克隆，它們分別位于水稻的第2染色體和第12染色體上。本發(fā)明申請?zhí)岢鲋斑€沒有水稻第8染色體上稻瘟病抗性基因被克隆的報道。
克隆抗病基因是對水稻抗性機理研究的前提，揭示水稻抗稻瘟病的分子機理可以更好地控制和降低稻瘟病菌對水稻的危害。同時，對克隆的抗病基因的修飾和改造，可以人為地控制和增加植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。這些方面是采用常規(guī)植物育種和改良技術所不能達到的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是分離克隆水稻品種Q61中攜帶的一個稻瘟病抗性基因和包含調控這個基因的啟動子的DNA片段。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述稻瘟病抗性基因所編碼的蛋白質。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述含有上述抗性基因的載體。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述載體轉化的轉基因植物。
本發(fā)明的另一個目的是提供上述蛋白質在制備抗稻瘟病菌藥物中的應用。
本發(fā)明的進一步目的是提供上述抗性基因產(chǎn)生的分子標記及其在選育對稻瘟病具有抗病性的水稻中的應用。
本發(fā)明涉及分離和應用一種包含Pi36基因的DNA片段，該片段賦予植物對稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)所引起的病害產(chǎn)生特異性(?；?的抗病反應。這一發(fā)明適用于對所有對該病原菌敏感的植物。這些植物包括單子葉植物和雙子葉植物。其中，所述片段如序列表SEQ ID NO1所示，或者基本上相當于SEQ ID NO1所示的DNA序列，或者其功能相當于SEQ ID NO1所示序列的亞片段。該DNA序列編碼一種NBS-LRR類蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO2所列，結構如圖6所示。本發(fā)明所示的DNA片段在水稻的葉片組織呈組成型表達。
所分離、克隆的Pi36抗性基因編碼NBS-LRR蛋白。這種蛋白包含兩個主要的結構域NBS和LRR區(qū)域，其中NBS結構域含有保守的kinase 1aGMGGLGKTT，kinase 2aIVIDDIWDKP和kinase 3aGSKILVTTRK。而該蛋白的C-末端為13個LRR重復，其亮氨酸含量為17.0％。Pi36基因中編碼NBS或LRR的核苷酸片段可能具有獨立的功能。將Pi36基因中編碼不同結構域的片段與其他核酸片段重組，可構成嵌合基因或蛋白質，使之具有新的功能。對Pi36基因進行修飾或改造，可改變或增加基因的某種功能。例如，將該基因的LRR區(qū)域替換為其他抗性基因的結構域，或將該基因的NBS結構域進行定點突變，可能會導致基因抗性的喪失或基因的抗譜的改變。
本發(fā)明同樣包括將Pi36抗性基因的主要結構部分有效地連接上合適的調節(jié)序列所形成的嵌合基因，以及在基因組中包含這種基因的植物和這種植物的種子。如這種基因可以是天然的或是嵌合的。例如，將包含該基因的片段和一個組成型表達的啟動子連接，該啟動子可以在任何條件下和細胞發(fā)育的任何時期表達。這種組成型表達的啟動子包括花椰菜花葉病毒35S的啟動子等。另一方面，也可以將該基因和一個組織特異性表達的啟動子或發(fā)育時期特異性表達的啟動子或精確環(huán)境誘導的啟動子連接，這些啟動子稱之為誘導型啟動子。這樣，環(huán)境的改變，發(fā)育時期的不同都可以改變該基因的表達，同樣，也可以將該基因的表達限定在某一個組織內，使由該基因誘導的抗病反應得到人為的控制。其中環(huán)境條件包含病原菌的攻擊、厭氧條件和光等，組織和發(fā)育時期包括葉、果實、種子和花等。
根據(jù)本發(fā)明提供的Pi36基因序列信息(SEQ ID NO1)，本領域技術人員可以通過以下方法容易地獲得與Pi36等同的基因(1)通過數(shù)據(jù)庫檢索獲得；(2)以Pi36基因片段為探針篩選水稻或其它植物的基因組文庫或cDNA文庫獲得；(3)根據(jù)Pi36基因序列信息設計寡核苷酸引物，用PCR擴增的方法從水稻或其它植物的基因組、mRNA和cDNA中獲??；(4)在Pi36基因序列的基礎上用基因工程方法改造獲得；(5)用化學合成的方法獲得該基因。
本發(fā)明提供的稻瘟病抗性基因Pi36具有重要的應用價值。應用之一是將所述的Pi36基因序列連接到任何一種植物轉化載體，用任何一種轉化方法將Pi36抗病基因導入水稻或其他植物細胞，可獲得表達所述基因的轉基因抗病品種，從而應用于生產(chǎn)。本發(fā)明所述的基因構建到植物轉化載體中，可以對所述基因或其調控序列適當修飾，也可以在其轉錄起始密碼子前用其它啟動子取代所述基因原有的啟動子，從而拓寬和增強植物對病原菌的抗性。
本發(fā)明提供的抗性基因的另一個應用是根據(jù)所述基因序列信息產(chǎn)生特異性的分子標記，包括但不限于SNP(單核苷酸多態(tài))、SSR(簡單序列重復多態(tài))、RFLP(限制性內切酶長度多態(tài))、CAP(切割擴增片段多態(tài))。用這些標記可鑒定水稻或其它植物的抗性基因型，用于分子標記輔助選擇育種，從而提高育種的選擇效率。
本發(fā)明具有如下有益效果將克隆的抗病基因轉入感病的植物，有助于產(chǎn)生新的抗病植物。特別是可以用轉化技術在植物中累加多個抗病基因，而不會產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術中伴隨出現(xiàn)的基因組中不良基因的連鎖問題，并且可以縮短育種時間?？共』虻目寺∈强朔鹘y(tǒng)育種中不能在植物種間轉移抗病基因的問題的前提。另外，本發(fā)明能夠進一步提供或應用利用上述DNA片段獲得的抗病的轉基因植株和相應的種子，以及用本發(fā)明的基因或基于該基因的重組體轉化的植株或由這類植株獲得的種子?？梢杂糜行噪s交的方式將本發(fā)明的基因轉入其他的植株。


圖1為水稻稻瘟病抗性基因Pi36的圖位克隆示意圖；圖2.為水稻稻瘟病抗性基因Pi36的高解析度遺傳圖譜和電子物理圖譜；圖3為水稻稻瘟病抗性基因Pi36的部分抗性轉化體的選擇標記潮霉素基因的PCR(3a)和Southern(3b)檢測結果圖；圖4為水稻稻瘟病抗性基因Pi36轉化植株的抗性鑒定圖；圖5為水稻稻瘟病抗性基因Pi36的基因結構圖；圖6為水稻稻瘟病抗性基因Pi36編碼的氨基酸多肽序列結構圖；圖7為水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其等位基因pi36表達特性的RT-PCR檢測圖；圖8為分子標記CRG3鑒定親本和感病植株的Pi36位點基因型結果圖；其中，圖2中A為Pi36位點的高解析度遺傳圖譜，水平線表示染色體區(qū)域，上方為標記/抗性基因，下方數(shù)字為標記間的遺傳距離(cM)；B為Pi36位點區(qū)域的BAC/PAC克隆電子重疊群，水平線表示BAC/PAC克隆，垂直線表示連鎖標記的著陸位置；C為Pi36位點的電子物理圖譜，括號內數(shù)字為各標記位點的重組體數(shù)，水平線表示基因組區(qū)域，下方數(shù)字為標記間的物理距離(kb)。
圖3中泳道1-8為抗性基因Pi36的轉化苗的潮霉素抗性基因的PCR擴增產(chǎn)物；泳道9為載體pCAMBIA1300質粒的潮霉素抗性基因的PCR產(chǎn)物；泳道10為受體Q1063的非轉化體；M為分子量標記DL2000；箭頭所指為Hpt基因的部分片段760bp。
圖5中綠色方盒表示抗性基因Pi36的外顯子，帶斜線的方盒分別為5’和3’非翻譯區(qū)，直線則表示內含子。
圖6中帶下劃線字母為組成推定NBS的6個區(qū)域；第590個氨基酸殘基反映了Pi36抗感等位基因間蛋白序列的差別，在感病等位基因pi36中均為天冬氨酸；下部分獨立列出的氨基酸殘基為C-末端LRR區(qū)域。
圖7中A為抗病品種Q61在接種前以及接種后6、12、24、48、72h的基因表達情況；actin為內參照；B為感病品種Q13，即LTH，在接種前以及接種后6、12、24、48、72h的基因表達情況；actin為內參照。
圖8中P1為抗病親本Q61；P2為感病親本愛知旭；S1-S5、S6和S7為F2感病植株，基因pi36pi36；R1為F2抗病植株，基因型為Pi36pi36；undigest2個親本酶切前的帶型；M分子量標記DL2000；箭頭所指為標記CRG3。
具體實施例方式
實施例1水稻稻瘟病抗性基因Pi36的遺傳分析及初步定位如圖1，本發(fā)明利用圖位克隆法克隆了抗性基因Pi36。首先，為了發(fā)掘和鑒定稻瘟病新抗性基因，對秈稻抗病品種Q61與粳稻感病品種愛知旭以及麗江新團黑谷(Lijiangxintuanheigu，LTH)2個雜交組合由來的F2群體(F2-1和F2-2)，接種對雙親品種表現(xiàn)分明的非親和性/親和性反應的菌株CHL39。結果表明，這2個F2群體中抗病植株與感病植株的分離比符合3∶1。由此推斷，Q61所表現(xiàn)的對接種菌株CHL39的抗性是由一對顯性基因控制的。
為了快速地確定主效抗性基因的染色體位置，構建了由40個抗病個體和580個感病個體組成的F2代作圖群體，并利用隨機擴增多態(tài)性DNA(randomamplified polymorphic DNA，RAPD)標記技術，結合基于混合群體分離分析法(bulked-segregant analysis，BSA)的隱性群體分析法(recessive-class analysis，RCA)，共篩選了1200個隨機引物，得到了3個多態(tài)性好的標記，BA1126550，BA253450和OPP091800。由于這3個標記均位于該位點的一側，并且BA1126550的重復性最好，所以，對該標記進行了克隆和測序。通過標記序列與測序品種日本晴的參考序列進行同源性比較，該標記被著陸到水稻第8染色體上。為了證實RAPD分析的結果，我們從公共數(shù)據(jù)庫中引用了4個序列標簽位點(sequencetagged site，STS)標記，S5014、C30376、E60275和C61344，以及3個微衛(wèi)星(simple sequence repeats，SSR)標記，RM8018，RM1374和RM5647，利用580株高度感病的F2個體進行了連鎖分析。結果表明，該抗性基因位點被定位在第8染色體的短臂上，標記RM8018-RM5647之間5.8cM的區(qū)域。由于該區(qū)域與第8染色體上已定位的4個稻瘟病抗性基因的位置不同，因此，將這個新基因命名為Pi36。
實施例2稻瘟病新抗性基因Pi36的精細定位及電子物理作圖為了精細地確定Pi36位點的位置，我們利用公共數(shù)據(jù)庫中的參考序列，開發(fā)了5個多態(tài)性的標記，1個STS標記R36STS2和4個候選抗性基因(candidateresistance gene，CRG)標記，CRG1、CRG2、CRG3和CRG4，并對580株高度感病的F2個體進行了連鎖分析。結果表明，Pi36位點被精細定位在CRG2-RM5647之間0.6cM的區(qū)域，并且與標記CRG3和CRG4完全共分離。為了構建該位點的物理圖譜，我們利用參考品種日本晴的細菌人工染色體(bacterialartificial chromosome，BAC)和P1介導的人工染色體(P1-derived artificialchromosome，PAC)克隆，通過生物信息學分析(bioinformatics analysis，BIA)，構建了該位點的電子物理圖譜。結果表明，Pi36位點被物理定位在大約17kb的區(qū)域內。
實施例3稻瘟病新抗性基因Pi36候選基因的預測注釋及序列分析為了確定Pi36的候選基因，我們利用日本晴的參考序列，通過3種基因預測軟件RiceGAAS(http//ricegaas.dna.affrc.go.jp)、Gramene(http//143.48.220.116/resources/)和Softberry的FGENESH(http//www.softberry.com)對目的基因區(qū)域進行了基因預測及注釋分析，初步確定了Pi36的候選抗性基因為Pi36-1、Pi36-2和Pi36-3，其中Pi36-3包括了Pi36-1和Pi36-2。因此，將Pi36-3通過以下的基因功能互補實驗確認其功能。
實施例4稻瘟病新抗性基因Pi36的轉化與轉化體的抗性鑒定利用長片段PCR(long-range PCR，LR-PCR)技術擴增了一個含Pi36的16.0kb的片段并將其克隆至雙元載體轉化體系pCAMBIA1300，導入了農(nóng)桿菌菌株EHA105。將高度感病品種Q1063成熟種子在誘導培養(yǎng)基上誘導愈傷組織。把含有目的基因轉化載體的EHA105在YM瓊脂培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)1天，收集在含有100μmol/L的乙酰丁香酮的MB液體培養(yǎng)基。將水稻愈傷組織浸入菌液20分鐘，吸干菌液后轉移到MB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉移愈傷組織至含有50mg/L潮霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每14天繼代1次，繼代2次?？剐院Y選后，轉入再生培養(yǎng)基分化出轉化苗，獲得了274株轉化體。
用CRG標記CRG3對轉化體進行了PCR-CAPS檢測。本實驗使用了2個引物，其中，引物CRG3F為gctagcaagcatggagttcgt-3’，引物CRG3R為3’-agcgggtaaggtagcataggt。PCR擴增的步驟為94℃預變性4min；接下來是30個循環(huán)，循環(huán)程序如下94℃變性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸2min；最后72℃延伸7min，溫度降到4℃即完成擴增。擴增產(chǎn)物用限制性內切酶HigfI進行酶切，體系為10×酶切緩沖液2μl，PCR產(chǎn)物8μl，限制性內切酶HinfI10U，補加雙蒸滅菌水至20μl。
同時，對轉化植株進行了潮霉素基因的PCR和Southern blot鑒定(圖3)。檢測結果證明目基因片段已經(jīng)導入這些轉化體?？剐澡b定結果顯示抗性基因Pi36在感病品種Q1063遺傳背景下表現(xiàn)了與抗性基因供體Q61相同的抗性，表明抗性基因Pi36已經(jīng)被成功地克隆了(圖4)。
實施例5Pi36基因的結構采用移步法對Pi36的DNA序列進行了測定。利用5’和3’RACE反應，獲得了Pi36的全長cDNA并對其進行了測序。序列表中的序列1和2分別是Pi36的DNA和cDNA序列。Pi36基因DNA長度為16.0kb，其全長cDNA為3963bp，含有一個3171bp的開放讀碼框，5’和3’非翻譯區(qū)分別為65bp和726bp。通過比較基因組DNA和cDNA，發(fā)現(xiàn)該基因的開放讀碼框含有4個內含子和5個外顯子，而3’非翻譯區(qū)含有1個內含子(圖5)。
實施例6Pi36抗性蛋白的結構Pi36基因編碼的蛋白序列如序列表中SEQ ID NO2所示。抗性基因Pi36編碼1個由1056個氨基酸殘基組成的蛋白多肽，分子量為120KD，等電點為6.61。利用COIL分析表明該蛋白多肽的第14-45個氨基酸殘基有95％的可能性為CC(coil-coil)結構域。Pi36蛋白屬于NBS-LRR蛋白，NBS結構域中保守的kinase 1a(GMGGLGKTT)位于該多肽的第206個氨基酸殘基；kinase2(IVIDDIWDKP)位于該多肽的第286個氨基酸殘基；kinase 3a(GSKILVTTRK)位于該多肽的第310個氨基酸殘基。而該蛋白的C-末端的581-921個氨基酸殘基為13個LRR重復，其亮氨酸含量為17.0％。
數(shù)據(jù)庫比較分析發(fā)現(xiàn)編碼Pi36蛋白的核苷酸序列與大麥白粉病抗性基因Mla1和Mla6分別有40％和37％的同源性，與水稻稻瘟病抗性基因Pib、Pita和水稻白葉枯抗性基因Xa1分別具有30％、27％和24％的同源性。
實施例7Pi36基因的表達特性分析用RT-PCR對Pi36基因的表達模式進行了分析。從抗病品種Q61和感病品種LTH的葉片中提取總RNA，利用反轉錄試劑盒SuperScriptTMReverseTranscriptase II進行反轉錄cDNA第一條鏈的合成。RT-PCR引物為R36RT FCGAGCTGCTGAAGGAGAAGT；R36RT RAGCTCATCCCTTGGCTCATC。PCR反應為94℃預變性4min；接下來是35個循環(huán)，循環(huán)程序如下94℃變性30sec，56℃退火30sec，72℃延伸1.5min；最后72℃延伸7min，溫度降到4℃即完成擴增。
實驗結果表明，抗性品種和感病品種的接種前后的葉片組織的RNA反轉錄模板均能擴增出特異的片段，說明Pi36及其等位基因pi36均能在葉片組織中表達，即屬于組成型表達的基因(圖7)。
實施例8轉化Pi36基因產(chǎn)生的抗性品種的應用將Pi36基因克隆到植物轉化載體pCAMBIA1300，導入農(nóng)桿菌菌株EHA105，用于轉化感病的水稻品種，獲得了274株轉化植株。將轉化體產(chǎn)生的T1種子進行播種、萌發(fā)和接種鑒定，發(fā)現(xiàn)其中有35個轉化系(T1)表現(xiàn)抗性分離，而且轉化植株的抗性與Pi36基因共分離。這說明可以用Pi36基因轉化水稻感病品種，用于生產(chǎn)。
實施例9Pi36基因序列在分子標記輔助選擇育種中的應用利用本發(fā)明提供的Pi36基因序列信息可以產(chǎn)生分子標記，用于鑒定Pi36位點上具有的各種基因型即Pi36Pi36、Pi36pi36和pi36pi36的植株，可在分子標記輔助選擇育種過程中加以應用。
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其應用序列表SEQUENCE LISTING<110>華南農(nóng)業(yè)大學<120>水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其應用<130>
<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>14450<212>DNA<213>稻屬水稻(Orysa sativa L.)<220>
<221>5’UTR<222>(2489)..(2553)<220>
<221>exon<222>(2554)..(2972)<220>
<221>gene<222>(2554)..(11611)<220>
<221>Intron<222>(2973)..(3405)<220>
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<221>Intron<222>(10944)..(11067)<220>
<221>exon<222>(11068)..(11334)<220>
<221>Intron<222>(11335)..(11593)<220>
<221>exon<222>(11594)..(11611)<220>
<221>3’UTR<222>(11612)..(11780)<220>
<221>Intron<222>(11781)..(11903)<220>
<221>3’UTR<222>(11904)..(12459)<400>1
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其應用序列表cttcgacacg caaacgtgca cacagccacc tatcgtgacc tcctcagcct ccacgcatcc 60gtacgtcctc tagtgcagcc actaaactgt aagtccaagt tctaaattgt aaccgacttt120gtacatatat tcgatacaaa ctctaacaat atcttcacta accctatctt agccgaataa180caactaaaat tttttctatt caaacatagc taaaccatgg ttaacaaata caacaatcct240aacaaccaca taaggtaaca gttggaatcg aacgctatat tgttacaaca ctgatacatt300tgtcgtgcac aggtagcttg aaatttgcac aagtcacgaa tattgtcgtc aaacggagat360agaacaaatc ctgcaagaag ctctggtaca ctttaaaatg accgctctag tcctcaaaat420ccagagatct cctacaaagc aattttagga tacggctcgt ttaaattgta aaagatgtat480tgtgtaattt caacagactt gacgatgcac atgctgattt ttaagagctt accattgtcc540actttaatgc acctggacca cggtcggttt cacagttcgc cgcaccaacc ggttccggaa600ggtgagcgtg ctggctgctg agaagaaaaa tagcttccca acgtggcttc aattaggggg660tgtttaggag agagggactt accaaacacc cccttaatca acgtgtggct gtcttttcag720atgacccttt tcctaagccc tctctctcat ttttcacaag cacatttttc aaattgttaa780acggtgtatt tttttaaaaa aaaagtttat atactaaagt tgcttaaaaa attaaattaa840ttatttttta aaaaaatagc aaatgtttaa ttaattacgt tctattggac cgtttcggtt900ttcgtaggta ccatgcacct ccccatccga ctgtagcgaa catcttccca tccggctgta960gcgatcacac ccagagggtc tcatgtgacg cgttcgaggt ggagccaacg gcgtcttaca 1020agttgagtaa cttgagtgat aaacacagta ttgcctacca cgcgttttga aacttaatta 1080cacgtgtttt cgccctcttg ttatgttcat gctccaatgg aaacaaacaa atcggatata 1140acacttcaat cctgaggcag gattttgtat gcaaaatggt actatactca gataaatggc 1200tcatcaatta taatgatggg tttacaatta caaatgaaga tatttaagca acttaattta 1260ttcattctag ttgcataggt ctagaactcg ttgcatttgg agtgagatgg agtaaatatt 1320atttcacatt ttgtcaattc aaacatttac acgttttaat gttttttcga gaatggatgg 1380cgtgagctcc gataagagta ctataagatt ataaaccagc tataaacata ttttaagaaa 1440ataaaagagg agagataaga gcaacggatt ataaatttat agccagctgc agcatagact 1500ccaagataca tgtgtgtatg ataggtgaga tcaaacatta atcatatagt acatgtttat 1560agataactat tgtatgaatt gactttagaa gatttggagc caatagttga atatactact 1620cccttctttc caaattaatc atcatgtaag aataggtaca acagcagatt attagccagc 1680tataaacata ttttaatgag ataaaagatg agagagaaga gcagcaggct atagatctgt 1740agccagctat aacacggact ccaagacgca atgggtgtat gacatgtggg accatatatt 1800aatagtataa taagcaacta ttgtatgaat tggctattag atcggctata gatgaattgg 1860agctagtagt gggctatact agtaaacttg ctctaataga atttaaaatt tttcaaattg 1920gtcattatat aactgcatgg acacggattt catcggaata caattaatac agtatgagag 1980aatatgtgta tgctagggtg taattgacat gaggttttaa ttgagtatag gagaatgtgt 2040gtatgttgtc ttgattgatg tgatttaaat tgtcattggt cttggtgcat aaaattatac 2100tccctccgtt ccataatata aggcacaact atttttttta tgttccataa tataaggcat 2160acatgcatgt atacaattaa ttaggacatc ttctccatta aattattatt tttttaaatc 2220attcactctc aagatctcta aatttattgg atgcatgcat gtattatatt tattaggatg 2280
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其應用序列表atccaaatta gaaaataata ataattgttt cttgaaaaag tggttgtacc ttatattttg 2340gaacatatgg agtatgatga ttaatttggg aaggagggag tattaaactt gctctaaccc 2400aattgtgaca agtccattaa ttaacctatc agctagtagg ctagtagttg cacatatata 2460caggagtgca atgtatctgc tcctacccag ctaccaaccc agcaatacca tccactcaac 2520tcaagtcaag tcaaccacag ctagctagca agc atg gag ttc gtc act ggg gcg 2574Met Glu Phe Val Thr Gly Ala1 5atg agt agc ctg atc ccc aag ctg ggc gag ctg ctg aag gag aag tac2622Met Ser Ser Leu Ile Pro Lys Leu Gly Glu Leu Leu Lys Glu Lys Tyr10 15 20aat ctg cag aag aac ata agg ggg aag atc gag tct ctc tcg gcg gag2670Asn Leu Gln Lys Asn Ile Arg Gly Lys Ile Glu Ser Leu Ser Ala Glu25 30 35ctc cgg cga gcg caa gcc gtc ctc cgc atg gtc ggc gag gtg cca caa2718Leu Arg Arg Ala Gln Ala Val Leu Arg Met Val Gly Glu Val Pro Gln40 45 50 55gac cag cag aac gag ctg gtg aag ctc tgg gcg agc gac ctc agg gag2766Asp Gln Gln Ash Glu Leu Val Lys Leu Trp Ala Ser Asp Leu Arg Glu60 65 70gcg tcc tac gac atg gag gat atc atc gac gcc ttc ttg gtt cat gtc2814Ala Ser Tyr Asp Met Glu Asp Ile Ile Asp Ala Phe Leu Val His Val75 80 85gac gac gat ggc ccc aag cca gcc gac cca cat gtg ctc agg cgc ctc2862Asp Asp Asp Gly Pro Lys Pro Ala Asp Pro His Val Leu Arg Arg Leu90 95 100ggc aag cag gtg aag aaa ctg ttc aag aag acc aag cat cgc gtc acc2910Gly Lys Gln Val Lys Lys Leu Phe Lys Lys Thr Lys His Arg Val Thr105 110 115atc gcg gac gca atc caa gaa atg gaa aag aag ctc ctg gag att gat2958Ile Ala Asp Ala Ile Gln Glu Met Glu Lys Lys Leu Leu Glu Ile Asp120 125 130 135gca agg cat ggc ag gtatggaaaa tatttactcc ctccgtccca aaaaaaattc3012Ala Arg His Gly Argaatttctaag tttccgtatc caacatttga ttgtccgtct tatatgaaat ttttctatga 3072ttagtatttt tattgttgtt agatgataaa acataaataa tactttatgc gtgcgtgatt 3132tatcttttta ttttttttat aattttttca aataagacgg acggtcaaac gttgaacacg 3192gaaacccaaa aattgagtta ttttaagacg aagggagtaa tatggaagaa atcttaataa 3252tatgttgtat tatattgcat tatattgatc tgtcatgagg tacatacata tatagtacga 3312gttatagctg atttatctca agaattctat ttcttgtagt cttacattcg tcatctcttg 3372atgttgtctc ttgactctca tctattacta cag a tac cca gtt gat aac ata 3424Tyr Pro Val Asp Asn Ile145gtt atc cct gca cgt ccg acg cct att gat cct cgc atc cta aat att3472Val Ile Pro Ala Arg Pro Thr Pro Ile Asp Pro Arg Ile Leu Ash Ile150 155 160gag aaa atg gca aac aat ctt gtt ggc att gat gag cca agg gat gag3520Glu Lys Met Ala Asn Asn Leu Val Gly Ile Asp Glu Pro Arg Asp Glu165 170 175ctt att aag atg ttg tca caa cat gag cgt gac aac aat ctt aat acg3568Leu Ile Lys Met Leu Ser Gln His Glu Arg Asp Asn Asn Leu Asn Thr
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其應用序列表180 185 190tcc aat agg aag aca aag ata gta tac gtc gtt gga atg ggt ggt ctg3616Ser Asn Arg Lys Thr Lys Ile Val Tyr Val Val Gly Met Gly Gly Leu195 200 205 210ggc aaa acc acc ctt gcc aca gca gta tat gag aag att aaa gtg ggt3664Gly Lys Thr Thr Leu Ala Thr Ala Val Tyr Glu Lys Ile Lys Val Gly215 220 225ttt cct ttg aat gct ttt gtt cca atc ggt caa aat cct aat atg aag3712Phe Pro Leu Asn Ala Phe Val Pro Ile Gly Gln Asn Pro Asn Met Lys230 235 240gca atc ttg tgg aac att ctt cat cgc ctt ggc tcg gag aag tac ctg3760Ala Ile Leu Trp Asn Ile Leu His Arg Leu Gly Ser Glu Lys Tyr Leu245 250 255aat tgt cca aat att gag atg ttg act gta cag gag ctc atc ggt gaa3808Asn Cys Pro Asn Ile Glu Met Leu Thr Val Gln Glu Leu Ile Gly Glu260 265 270ctc aag caa ttc atc aag gga aag ag gtatgaatat gacgacccac 3854Leu Lys Gln Phe Ile Lys Gly Lys Ser275 280caaatttgtt tttatatact acctcttttt cttaataaat cacgccattg acttttgaaa 3914taacgtttga ccttcaaaaa tttagtgtaa atatgctcaa gtataagtca taccttaaag 3974tttctttaat aataaaacaa gtcacaacaa aataaatagc atttatataa tttgtttgaa 4034tatgactaat ggttaaacgt catatcaaaa gtcaacatct tctgttagaa tacagaggga 4094gtatatgtcc ataacctatg ctaccttacc cgcttatgaa tgaatatttg cgctacacac 4154aatcatagtc ttaaagctat ttaatttgtc tttgcgcttg ctatttgaaa aaaaaatgat 4214gtacctcttt ttaatcgatc acagtaatag tccgggttta cccgttcttt aggctccact 4274tacatcatga gcaagctaaa aatcgtgatc aagatattaa acctaaaatg accttgatgt 4334cacctagagg ggtgtccatg gagcgactcc tcggacagcg aggagtggag acccctcccc 4394gagtttgaag attcagccag ggggttagca gtgcaagacg atagaaaaag ccaaacagag 4454aaaagatttg tggggcctga tctccccgcc aagcaaaagt caccagagtt tatacaggtt 4514caagccaccc ggaggtgtaa caccctactc ccgtgttggt tttgttgttt ttcttatatc 4574agcttagaac aagggatgcc tttttgggct acagacaaga agttctgatc caaaaaatcc 4634aactcttcat ccgtagcttg tccccttcct tttatagatc aaggatgggc tcacaattct 4694acaaatctac ttccttgtct tgtctatcag ctgtcttgtc aatgcctgtt ggttccctca 4754cacagtcttc gagtaaccca ctgacatttg aagcttgcat tgcccccaag cacccgggct 4814tctgtccgag acagctgggt cgtgccagca tgttcaccat gtggcgagtg gtgggcctgg 4874tgagacccga cctgcctgaa acagcaccac ggtttcgttt ctacccgttt ggctaaatca 4934ggcagcatgg ggcatgtgcg acacgtgtcc aagatgccac tggttctaat gactcagtga 4994tggtgccttg tccacatcct ttcagctcca gactagctgg ggctccccca taaacctgtt 5054taatttatgg cggagaggac tacttcacaa cagcccgtgg agcacgccca acaccccagc 5114tggtcctgag gtcgcgccct tgcacattta tggagatagt ttagctattc ttacacaagc 5174ttcttgaaga tatcttagat aatatctaat gtttcgacag agacattcct ccttaatcaa 5234gggacgtaac ctacatgcag acaaaggtga gcaagctaac aaggcaagca aaaggggata 5294tcggcaaaag tagttaatgg gttttcacaa acaacaacta aactactagt tgcaccaaat 5354
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其應用序列表agcaaaactg gaggagtgag agagagagat accaccggga ttcttgcaaa ctgatatgtt 5414actgaatcta ctctccgttg aggagctcac aatgatatat atatatacat atatatatat 5474atatatacat atatatacat atacatatat atatacatac atatacatac atacatacat 5534acatacatac atacatacat atatacatac atacatacat acatacatac atacatacat 5594acatacatac atacatacat acatacatac atacatacat acatacatac atacatacat 5654acatacacac acacatacat acatacatac atacatacat acatacatat atatatacat 5714acatacatac atacatacat acatacatac atacatacat acatacatac atatatatac 5774atacatacat acatatatat atatacatac atacatatat gtatacatac atatatatat 5834aatgtttcga cactcttcgt tgtagaggaa tgtaaaactc acaaggagta aggtgtgccc 5894gggtcctagg acgaggccgg acataggcat acctcagttt atctcttaat catatgtctc 5954caccctccac cccttgtaga aagtgtgacc tatgaagatt aaggtaagcc caggacccag 6014gtcaaggccg tgtctgaggc aaaccttagc ttattcttct taagatgtat atcttgtagg 6074tctctacgct cgtctacgta ggacttacaa ggactaaggt gagcccgaga cccaggacaa 6134gacagggtcc gaggcatacc ttaggctaca ttcttaagat gtagatttta tacgtctcca 6194cactcctctt ctcagagcaa tgtgtgactt gtgcggacta aggtgagccc gagacccagg 6254ataaggccga gtctgaggca taccttagtt tattcccttt aagatgtaga tcttgtaggt 6314ctctacgctc ctctcaccga gtctgaggca cacgttacat tettaagatg tacttcagtg 6374gacctgggtc ccgaagcgga actaggccta ggaccaacct tattactcag agttttaagt 6434cgttgtactt ttgacatgca tcattccccc ttaatcaagg ggagtaacct acatgcagac 6494aaaggtgggc ccgggaccaa ccaaggtggg tccctagtga cataacccta tttttaagga 6554tggtttaagc atgccattta tcttatttat aattgttttg ctgggggaaa tgggtagcct 6614aattcccatt tcaccgacaa ggggggtaaa taagcgttta taacttttat gtaaatgtgg 6674aggctaaaca tttcagatat tccaaaatat ttttggatat tctaggatat tttcagatat 6734tccgaaaatc tcaggttttc gagcaagcta acaaggcaag caaaggggat atcggcaaaa 6794gtagttaatg ggtttgcaca aacaacgact aaactactag ctgcaccaaa tagcaaaact 6854agaggagtga gagagagaga taccaccgag attgttgcaa actgatatgt tactgaatct 6914acactccgtt gaggagttca caatgagcca agtcttttcc aaccctatcc tcgtgaagtt 6974gcataaatgc actcatcttt tcattaaggg tatctcttcc ctttcagagg tgagatctga 7034ccttcacaaa ctccctcggc acaccaccta caaatcgatg tctcgaggtc aactcctagc 7094cgtccaggta tcctcaacca ccaagagtta caaatgcaac aaagatttct tggggatgaa 7154tcgactgctc gacaaatctt cacgaaatca acaccaagca ctcaaataaa ctcaaatcaa 7214ccactcacac atacacgaaa tccgagatgg aagatcggtg gagagtaggg atggcaattt 7274gacccgattg tccgtttacc catgggtaaa aaccctaata gagttgggtt tgttctacat 7334ttagtatcca tgggtttctt attgggtcaa aacctgtacc caatgggcaa gcgggcatgg 7394gcatgggtac ccatgcccgc ttcgcccatt tacccgcgaa aaacaactga catgtgggcc 7454ctcaatcaac ttaatataaa aagcaccatc taattctagg gttttcttcc tttcctccac 7514agccgctact ccttctcttc ccctttcctc tacagctacc actcctcttc ctccacagac 7574
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其應用序列表catagccacc actccaggct gccaaggcgc caggctgaca cgggacagcc ggacgagagg 7634ggcgcgcaat tcgccaccac ctcccacctc cgctcgtcgc tggcggcccc accctccagc 7694cgacgacttt catagcggcc acgggggagg gggggcaacc aaggaagctg cgaccgccgt 7754cgccttctac cccgtctgcg ccgagctcct ctccaaccag tcgtcgatgt cctctagcca 7814tcggccgcca gcccgccaca ccttcctcca gtcgcgcctc ccacctccgg tcgccgccgc 7874ttcctccaga cgcgcctccc acctctggtt cccagatgtg acgggtaaac gggcatgcct 7934gcgggcacat ggcgcctacg ggggacgggc attggaagtg ctccttgccc atcatgtagt 7994aacgggcatg cccgcggaca tgaattacct cgcggacacg ggatgggtag tcactacccg 8054tgcccgttgt gcccgactgc catccctagt ggaaagtaag aagtgagagg gcaaggctca 8114aagtgaatct caaatcaaca caagcaaggg gcacaagaaa gcaatggagc gagcaatctt 8174gacttggggt ggagggggtt atttataacc acaacctcaa atctgattgt tggaggcaaa 8234tcaagattca actttttgaa aaattttgaa aaccattttt ggacaagtct gaaaaacaca 8294agaaagcaat ttcatttgag caaccatttt ccgaatttcc aaaaaaattt cggaattatt 8354ttcggaagtt gctacaatac ttttggaaat tccaaaaagt ataaattaca gcacaaactc 8414agcaaaaaaa aggaaaaata acatttcaga aattctgaaa atatttcgaa aaaatctgaa 8474atcaccagag agctttttca caaattttat cattttggaa attccaaaaa ccattttcgg 8534aaaattctag aaaacaccaa aagatgtgtt ggccaccgcc gtcacgtgag catgtcacat 8594ttgaactcat gacggaggag cacactgccc acttgtcagc gttatccctg tcactattct 8654agtgcaccac tggttcctag ctacaagacc gtcgtgccca cacattatcc aaaagcacat 8714gccaatgcat aggctaatga ataattaatt gcaatatctc acttttaatg catgtttatc 8774tctcttatct agattttctt cggcactaaa aattattgct ccttcacata taaaaagaaa 8834accacatctt attgatgact cgtaattttc agtgattggg gtgcttatac agttcttcta 8894ctattctagg t ttt tta tcg tta tag atg aca tat ggg ata agc cat cat 8944Phe Leu Ser Leu Met Thr Tyr Gly Ile Ser His His285 290 295ggc aaa tac tcg aaa gtg gtt tac aag ata atg att acg gaa gta aaa8992Gly Lys Tyr Ser Lys Val Val Tyr Lys Ile Met Ile Thr Glu Val Lys300 305 310tac ttg taa cta ctc gta aat ctg agg ttg caa caa tta tca gcg atg9040Tyr Leu Leu Leu Val Asn Leu Arg Leu Gln Gln Leu Ser Ala Met315 320 325tgt aca ata tga aac cac ttt ctc atg ata act cta aag aat tat tgt9088Cys Thr Ile Asn His Phe Leu Met Ile Thr Leu Lys Asn Tyr Cys330 335 340ata caa gaa ctg gta gtg aag gca aat ctc ttg aca gtt cat caa ctg9136Ile Gln Glu Leu Val Val Lys Ala Asn Leu Leu Thr Val His Gln Leu345 350 355agg cat gtg aca aga ttt tga aga aat gtg ctg gtg tgc cat tag cta9184Arg His Val Thr Arg Phe Arg Asn Val Leu Val Cys His Leu360 365 370tca tta cga tag cta gct tgt tgg cta gta gat cag gtc tgg act ggt9232Ser Leu Arg Leu Ala Cys Trp Leu Val Asp Gln Val Trp Thr Gly375 380 385ctg agg tgt aca gag cta ttg att ttg gag aag aag aca act atg aaa9280Leu Arg Cys Thr Glu Leu Leu Ile Leu Glu Lys Lys Thr Thr Met Lys390 395 400
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其應用序列表tgg caa ata cta aaa gga tat tgt ctt tta gct act acg atc tgc ctt9328Trp Gln Ile Leu Lys Gly Tyr Cys Leu Leu Ala Thr Thr Ile Cys Leu405 410 415cac att taa aga att gtt tgc tct atc taa gca tgt ttc cag aag att9376His Ile Arg Ile Val Cys Set Ile Ala Cys Phe Gln Lys Ile420 425 430ata aaa ttg aca aaa atc att tga tat gga tgt gga tag ctg aag gtt9424Ile Lys Leu Thr Lys Ile Ile Tyr Gly Cys Gly Leu Lys Val435 440 445ttg tcc ctg aga aac aaa aca caa att tag gat tat atg agc ttg ggg9472Leu Ser Leu Arg Asn Lys Thr Gln Ile Asp Tyr Met Ser Leu Gly450 455 460aga gtt act tca atg agc tga taa ata gaa gca tga tcc agc caa ttg9520Arg Val Thr Ser Met Ser Ile Glu Ala Ser Ser Gln Leu465 470aga atg aat ttt ttg ggt gta tag aag gtt tgt cgt gtt cca tga tat9568Arg Met Asn Phe Leu Gly Val Lys Val Cys Arg Val Pro Tyr475 480485ggt gct cga tct agc tcg ttc att gac aag tga aca aaa ctt tgt cac9616Gly Ala Arg Ser Ser Ser Phe Ile Asp Lys Thr Lys Leu Cys His490 495 500tgt att gga taa cga tga gca acg gaa acc tga aag cac caa tgc tcg9664Cys Ile Gly Arg Ala Thr Glu Thr Lys His Gln Cys Ser505 510 515tag gtt ggc cct gca ccg tac gag tat cac gag cta tcg att tgt taa9712Val Gly Pro Ala Pro Tyr Glu Tyr His Glu Leu Ser Ile Cys520 525 530tat gga tat gaa gaa agt gag gtc att tgt tgc cac tga gtg caa taa9760Tyr Gly Tyr Glu Glu Ser Glu Val Ile Cys Cys His Val Gln535 540tgg caa taa tag tgt ggc acc acc aag gtt cca agt ttt acg tgt gtt9808Trp Gln Cys Gly Thr Thr Lys Val Pro Ser Phe Thr Cys Val545 550 555gtc ctt gga caa atg taa tgg tat gga gga tta tta cat aga aag tat9856Val Leu Gly Gln Met Trp Tyr Gly Gly Leu Leu His Arg Lys Tyr560 565 570ttt gca gta tgc tgg aag gct ggg tca cct gag gtg cct cca gct ttc9904Phe Ala Val Cys Trp Lys Ala Gly Ser Pro Glu Val Pro Pro Ala Phe575 580 585ctc aca cac aga gtt tca tag gct ccc taa aga att agg aga tct caa9952Leu Thr His Arg Val Ser Ala Pro Arg Ile Arg Arg Ser Gln590 595 600gtt tct aa aaat act gga ctt ggg tga ttg tgg cgg tac aat aga aga10000Val Ser Lys Asn Thr Gly Leu Gly Leu Trp Arg Tyr Asn Arg Arg605 610 615gct gcc gga gga gtt ggg tct cct gac aca ttt gtt gtg tct acg tat10048Ala Ala Gly Gly Val Gly Ser Pro Asp Thr Phe Val Val Ser Thr Tyr620 625 630tcc tcg cag att gga gat gtt gcc agc tgg ttt gat cgg aaa act gac10096Ser Ser Gln Ile Gly Asp Val Ala Ser Trp Phe Asp Arg Lys Thr Asp635 640 645 650atc gct gca aga gct atg cat aag tct tat cga aga ggt cgc tgt aag10144Ile Ala Ala Arg Ala Met His Lys Ser Tyr Arg Arg Gly Arg Cys Lys655 660 665gca ctt tgt gca gga gtt ggg caa cct cag aga act gag ggt gct cta10192Ala Leu Cys Ala Gly Val Gly Gln Pro Gln Arg Thr Glu Gly Ala Leu
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其應用序列表670 675 680tgc caa aat tta tat agg gct gaa aga tga gag cat gca gag aga ttt10240Cys Gln Asn Leu Tyr Arg Ala Glu Arg Glu His Ala Glu Arg Phe685 690 695tct aca gtc ctt agg ctg tct aca taa ggt cca cac tat gaa tat ata10288Ser Thr Val Leu Arg Leu Ser Thr Gly Pro His Tyr Glu Tyr Ile700 705 710tag cat tga agt aag gga atg cac cag acc aga tgc agc agg ttc tgt10336His Ser Lys Gly Met His Gln Thr Arg Cys Ser Arg Phe Cys715 720 725gtc ctg tcc tcg gct ctg gca gct gtc att gcc atg cat caa gtt ttt10384Val Leu Ser Ser Ala Leu Ala Ala Val Ile Ala Met His Gln Val Phe730 735 740tag cct acc tgt gtg gat taa ctc atc aac tct tgg ttg cct ctc gca10432Pro Thr Cys Val Asp Leu Ile Asn Ser Trp Leu Pro Leu Ala745 750 755tct aga cgt gaa agt aca ggt tgt gag aga gca gga cat gga aac cct10480Ser Arg Arg Glu Ser Thr Gly Cys Glu Arg Ala Gly His Gly Asn Pro760 765 770tgg aag gct ccc aat gct ctg tta cct caa att gga ttc cca ata tac10528Trp Lys Ala Pro Asn Ala Leu Leu Pro Gln Ile Gly Phe Pro Ile Tyr775 780 785cag gct aat aag cat taa gaa gcc tgc tga tga tgg cta ctt cca aaa10576Gln Ala Asn Lys His Glu Ala Cys Trp Leu Leu Pro Lys790 795 800att gag att ctt taa aac tcc tca ttc att tgt ccg gtt tga tct tca10624Ile Glu Ile Leu Asn Ser Ser Phe Ile Cys Pro Val Ser Ser805 810 815tgg ttg cga gtc cag cag tgg agc atc tag ctt cat gcc aag act tga10672Trp Leu Arg Val Gln Gln Trp Ser Ile Leu His Ala Lys Thr820 825aca cat tga att cag tgt cga tgt tcg gtt cct aaa aga tgc agc aga10720Thr His Ile Gln Cys Arg Cys Ser Val Pro Lys Arg Cys Ser Arg830 835 840cct gca tgc tgg tct taa caa cct gct tgc agg ctt caa tga ctt tgg10768Pro Ala Cys Trp Ser Gln Pro Ala Cys Arg Leu Gln Leu Trp845 850 855aag aac ttc gct caa gag tgt cga cgc tag gat cca ctg caa gga tgc10816Lys Asn Phe Ala Gln Glu Cys Arg Arg Asp Pro Leu Gln Gly Cys860 865 870cct tgc tgc gga ggt gca gga agc cga ggt ggc att ggc aaa tgc agc10864Pro Cys Cys Gly Gly Ala Gly Ser Arg Gly Gly Ile Gly Lys Cys Ser875 880 885aca cgg cca tcc caa ccg tcc agt cct tcg aac tga tat ggc ata tga10912Thr Arg Pro Ser Gln Pro Ser Ser Pro Ser Asn Tyr Gly Ile890 895 900gag gat gat gcg ctc acc tga tga cga taa g gtacgtgtat gcacagtacg10963Glu Asp Asp Ala Leu Thr Arg905 910taatgtactt agatcatttc aatcgatttt ccttatgctg gttttctgcc tacatatata 11023aaatctgatc ttaattattt cttgtgctta tatatatttt tcag cc aac aag ctg 11078Ala Asn Lys Leugtc cga tca aaa att ttt tga gat aca tgt cta tcc gtc gtc gaa tga11126Val Arg Ser Lys Ile Phe Asp Thr Cys Leu Ser Val Val Glu915 920 925
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其應用序列表cca tca tcg tta cct tag cta cct ccg gtt gtt gaa gaa gcc acg cct11174Pro Ser Ser Leu Pro Leu Pro Pro Val Val Glu Glu Ala Thr Pro930 935 940gga gaa gct tat agt caa cat ata tgt gtc caa gga tgg tat ggt tgg11222Gly Glu Ala Tyr Ser Gln His Ile Cys Val Gln Gly Trp Tyr Gly Trp945 950 955gga tgt gga tga agc tgt ggc agc tgc gag gaa cgt agt cga cca tca11270Gly Cys Gly Ser Cys Gly Ser Cys Glu Glu Arg Ser Arg Pro Ser960 965 970tat caa cca tcc aac act tga gat aaa tag aat gga aga aag tat ttc11318Tyr Gln Pro Ser Asn Thr Asp Lys Asn Gly Arg Lys Tyr Phe975 980 985tga cca aca tca aca g gcaagatata tctctcttct tgagctcgtc cccaatattg 11374Pro Thr Ser Thr990tactacagag aaacccagtt aatttgtaac accaaccatc acattctgaa tcatgtttgc 11434cttttaattg tttttatgca tactctacat gagagtgcta tatatatttt gtttcacttg 11494cagttgctca tagtcatttc acaagataca tatgcatggt ggtagactgc taaaactata 11554gttcatccta acatagcatt attttttgac tgtttctag gt ccc tga aaa taa 11607Gly Pro Lys995ttg a gtggcaagct gttcatttga aggttaagat tggcacagtg atggcacaat 11661Leuattaatgaat ccgagccaga ctagacggga agctgtcata gcattgacta atctgtaatc 11721cgatttcaaa atgcaggata ttcggatcaa tttcctcata tgtcgtctac tcttttactg 11781taagtatgac actttatctt ttatctcatt tatgtatctt tcgtaagtgg cacagtaata 11841aggtgacatc ccattgttat tcccacacgt ttgtaaccaa attctttaat aattgagtgc 11901agttctggtg catgtttgat tctctgcatt tggtccaagc agaggttaca gcacattatc 11961aacggagaaa ataactgaaa aaaggtgatg ataaacagaa tattatgggt gctgtagcat 12021aattgactct gcacctgatc accctcctca tgggttggta agcacaacag cttgccatct 12081tattgctgta caatcttttg tgaatgatga taggtgtaat tggatatgtg tgctggagaa 12141aaaatgctca atccaagtga caaattgcgc acttgttttg atctttaatt ccctttcaga 12201gtgatctact ctaaggacaa tcttggatca cccttggatg aaaaacttaa ggattggatg 12261ttggacattt tacctttgat aggcctaaaa acttcatgta tatattatat ccaaactaga 12321ggttataagt gtgttttggc tatgtgcatc atagctatgc aaatgccggg agtatgctca 12381acatagttgt atcgcctcat tgtaattgac tgcgttcaat aaaatcttcc attatctaaa 12441aaatggaaag cttcaatcca ccaacagagt catggccaca tgattccctc attggacacc 12501gaaagattca aagaaagcag acttcaggct gtaaaattgt ttgtgaaaac cttcatgttg 12561catgaatgca agagtgacct tgaatatgtt gcttaatttt tcagattatg tgtttcacat 12621tttctaattt agtatactgt gaagtttgcg ggggaatgta tagatttagt tgatgaattc 12681agtagagcaa acacaaagta caggtacaaa acaataacat gatgggattc agatctcaga 12741aggtgcacag attcgtaact gtgaacctac agaggcacaa tgcaacaaca ggtcaccaaa 12801taatatctca actgagtaac aactaaaaat cattttactt gaacaacttg cccaaataga 12861
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其應用序列表gtcatcaaaa ggagaaataa caacttgccc aagaataaga aaatctgatc caccttaaga 12921tgaccaccct agtcatcaaa atccacatca cttacaaaac agatttagga tcataaccat 12981caacaacttc aataacgtaa ctggtggcct aggttgtaaa agaaaacatt gaaatatgag 13041tcatggaatt ccaattcaaa agacttgagt gtgcaaatgc tgaaattaag atgctcaaca 13101ttctcagcca ttttggggat ggattttgat ttgagggaga ggattaataa tggaaaataa 13161gatcttcaca atgatgtgga ctcttctatc gccttgtggg caaatgattt tgattttcct 13221atgcttttca cagttaactg ctgccctgtt ccttcgcatg tgggatctaa atctgcagta 13281gcatttgcag aattggtgtc gtgatcatag gcataagctc catgctggta aaatgaacaa 13341ggaaacagtt aaactcaatt catgagaaga aaagaaacag caatgtggag agggggagat 13401ataccgaacc ttgacaagat gcagggaaag tttctctatg ttaggtgagt gccgaagcaa 13461gtacagtagt ggatagcagc catcactaaa aaaccactca ccaagtgcca aactcgttag 13521attgctgaat atcccacacc ttggaagatc acgtagtaat accttttgga ccacctgccc 13581acaagtttta aactccaaag atgttaaaga taggaatata taaacaacaa ataagagcaa 13641ttgtaattta aagcatttag cttacatctt cgtagataga tgaagacatc aagtgcaatc 13701ttgcagcgtt tgaaagagca ctgagaatag tgcagtcaac atcagaatgt ccaaaagaga 13761acctattaag ggtaaactga agctgattcc actgatgata tgtctaggag ccgaagattt 13821ctgtttgcaa tctcctctac atgcaggcag ataaggtttg gcatatttat cacaagatgc 13881tgaaaacctt ctgggtcatc ttgagttcta tctgcagctg taatggtcag aatcttcaat 13941gtagcagagc aaaacatggt ggccttgatg gcacaatgtc tcaactccag atgcagtagc 14001tccgggcaac cagaaaagag tttctcgaca aaacggttat caatagaaaa tttgcaaagg 14061tatacactct tcaagtgcaa ggaagtgaag gggacaggat atccatctac agaaaggagc 14121ttgccatcac aataattgag tatgccgaga gttttaacgt tgcacctaag ggcatggcag 14181acccatggat ggatgtcaga ataatcaagg gaatcatcag agctgtcata ggaggtatgg 14241atacagaaca tatccaacag ggcacagctg cgctgcagga gcaaattgtc aacaaacttc 14301ttaaaatgtt tcactgtaat gaagttgcac gaatcaacat tgaggtatcc cacagatgcc 14361cagacgttct gccacctccg agatagcaca caagtctgca cagcctcctt cgctgttagg 14421aatgtcatga catggtgcaa aagttcgtc14450<210>2<211>1056<212>NBS-LRR<213>稻屬水稻(Orysa sativa L.)<400>2Met Glu Phe Val Thr Gly Ala Met Ser Ser Leu Ile Pro Lys Leu5 10 15Gly Glu Leu Leu Lys Glu Lys Tyr Asn Leu Gln Lys Asn Ile Arg20 25 30Gly Lys Ile Glu Ser Leu Ser Ala Glu Leu Arg Arg Ala Gln Ala35 40 45Val Leu Arg Met Val Gly Glu Val Pro Gln Asp Gln Gln Asn Glu50 55 60Leu Val Lys Leu Trp Ala Ser Asp Leu Arg Glu Ala Ser Tyr Asp
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其應用序列表65 70 75Met Glu Asp Ile Ile Asp Ala Phe Leu Val His Val Asp Asp Asp80 85 90Gly Pro Lys Pro Ala Asp Pro His Val Leu Arg Arg Leu Gly Lys95 100 105Gln Val Lys Lys Leu Phe Lys Lys Thr Lys His Arg Val Thr Ile110 115 120Ala Asp Ala Ile Gln 6lu Met Glu Lys Lys Leu Leu Glu Ile Asp125 130 135Ala Arg His Gly Arg Tyr Pro Val Asp Asn Ile Val Ile Pro Ala140 145 150Arg Pro Thr Pro Ile Asp Pro Arg Ile Leu Asn Ile Glu Lys Met155 160 165Ala Asn Asn Leu Val Gly Ile Asp Glu Pro Arg Asp Glu Leu Ile170 175 180Lys Met Leu Ser Gln His Glu Arg Asp Asn Asn Leu Asn Thr Ser185 190 195Asn Arg Lys Thr Lys Ile Val Tyr Val Val Gly Met Gly Gly Leu200 205 210Gly Lys Thr Thr Leu Ala Thr Ala Val Tyr Glu Lys Ile Lys Val215 220 225Gly Phe Pro Leu Asn Ala Phe Val Pro Ile Gly Gln Asn Pro Asn230 235 240Met Lys Ala Ile Leu Trp Asn Ile Leu His Arg Leu Gly Ser Glu245 250 255Lys Tyr Leu Asn Cys Pro Asn Ile Glu Met Leu Thr Val Gln Glu260 265 270Leu Ile Gly Glu Leu Lys Gln Phe Ile Lys Gly Lys Arg Phe Phe275 280 285Ile Val Ile Asp Asp Ile Trp Asp Lys Pro Ser Trp Gln Ile Leu290 295 300Glu Ser Gly Leu Gln Asp Asn Asp Tyr Gly Ser Lys Ile Leu Val305 310 315Thr Thr Arg Lys Ser Glu Val Ala Thr Ile Ile Ser Asp Val Tyr320 325 330Asn Met Lys Pro Leu Ser His Asp Asn Ser Lys Glu Leu Leu Tyr335 340 345Thr Arg Thr Gly Ser Glu Gly Lys Ser Leu Asp Ser Ser Ser Thr350 355 360Glu Ala Cys Asp Lys Ile Leu Lys Lys Cys Ala Gly Val Pro Leu365 370 375Ala Ile Ile Thr Ile Ala Ser Leu Leu Ala Ser Arg Ser Gly Leu380 385 390Asp Trp Ser Glu Val Tyr Arg Ala Ile Asp Phe Gly Glu Glu Asp395 400 405Asn Tyr Glu Met Ala Asn Thr Lys Arg Ile Leu Ser Phe Ser Tyr410 415 420Tyr Asp Leu Pro Ser His Leu Lys Asn Cys Leu Leu Tyr Leu Ser425 430 435Met Phe Pro Glu Asp Tyr Lys Ile Asp Lys Asn His Leu Ile Trp440 445 450Met Trp Ile Ala Glu Gly Phe Val Pro Glu Lys Gln Asn Thr Asn455 460 465Leu Gly Leu Tyr Glu Leu Gly Glu Ser Tyr Phe Asn Glu Leu IIe470 475 480Asn Arg Ser Met Ile Gln Pro Ile Glu Asn Glu Phe Phe Gly Cys485 490 495Ile Glu Gly Cys Arg Val His Asp Met Val Leu Asp Leu Ala Arg500 505 510Ser Leu Thr Ser Glu Gln Asn Phe Val Thr Val Leu Asp Asn Asp515 520 525Glu Gln Arg Lys Pro Glu Ser Thr Asn Ala Arg Arg Leu Ala Leu530 535 540His Arg Thr Ser Ile Thr Ser Tyr Arg Phe Val Asn Met Asp Met545 550 555Lys Lys Val Arg Ser Phe Val Ala Thr Glu Cys Asn Asn Gly Asn560 565 570Asn Ser Val Ala Pro Pro Arg Phe Gln Val Leu Arg Val Leu Ser575 580 585Leu Asp Lys Cys Ser Gly Met Glu Asp Tyr Tyr Ile Glu Ser Ile590 595 600Leu Gln Tyr Ala Gly Arg Leu Gly His Leu Arg Cys Leu Gln Leu605 610 615Ser Ser His Thr Glu Phe His Arg Leu Pro Lys Glu Leu Gly Asp620 625 630
水稻稻瘟病抗性基因Pi36及其應用序列表Leu Lys Phe Leu Lys Ile Leu Asp Leu Gly Asp Cys Gly Gly Thr635 640 645Ile Glu Glu Leu Pro Glu Glu Leu Gly Leu Leu Thr His Leu Leu650 655 660Cys Leu Arg Ile Pro Arg Arg Leu Glu Met Leu Pro Ala Gly Leu665 670 675Ile Gly Lys Leu Thr Ser Leu Gln Glu Leu Cys Ile Ser Leu Ile680 685 690Glu Glu Val Ala Val Arg His Phe Val Gln Glu Leu Gly Asn Leu695 700 705Arg Glu Leu Arg Val Leu Tyr Ala Lys Ile Tyr Ile Gly Leu Lys710 715 720Asp Glu Ser Met Gln Arg Asp Phe Leu Gln Ser Leu Gly Cys Leu725 730 735His Lys Val His Thr Met Asn Ile Tyr Ser Ile Glu Val Arg Glu740 745 750Cys Thr Arg Pro Asp Ala Ala Gly Ser Val Ser Cys Pro Arg Leu755 760 765Trp Gln Leu Ser Leu Pro Cys Ile Lys Phe Phe Ser Leu Pro Val770 775 780Trp Ile Asn Ser Ser Thr Leu Gly Cys Leu Ser His Leu Asp Val785 790 795Lys Val Gln Val Val Arg Glu Gln Asp Met Glu Thr Leu Gly Arg800 805 810Leu Pro Met Leu Cys Tyr Leu Lys Leu Asp Ser Gln Tyr Thr Arg815 820 825Leu Ile Ser Ile Lys Lys Pro Ala Asp Asp Gly Tyr Phe Gln Lys830 835 840Leu Arg Phe Phe Lys Thr Pro His Ser Phe Val Arg Phe Asp Leu845 850 855His Gly Cys Glu Ser Ser Ser Gly Ala Ser Ser Phe Met Pro Arg860 865 870Leu Glu His Ile Glu Phe Ser Val Asp Val Arg Phe Leu Lys Asp875 880 885Ala Ala Asp Leu His Ala Gly Leu Asn Asn Leu Leu Ala Gly Phe890 895 900Asn Asp Phe Gly Arg Thr Ser Leu Lys Ser Val Asp Ala Arg Ile905 910 915His Cys Lys Asp Ala Leu Ala Ala Glu Val Gln Glu Ala Glu Val920 925 930Ala Leu Ala Asn Ala Ala His Gly His Pro Asn Arg Pro Val Leu935 940 945Arg Thr Asp Met Ala Tyr Glu Arg Met Met Arg Ser Pro Asp Asp950 955 960Asp Lys Pro Thr Ser Trp Ser Asp Gln Lys Phe Phe Glu Val His965 970 975Val Tyr Pro Ser Ser Asn Asp His His Arg Tyr Leu Ser Tyr Leu980 985 990Arg Leu Leu Lys Lys Pro Arg Leu Glu Lys Leu Ile Val Asn Ile99510001005Tyr Val Ser Lys Asp Gly Met Val Gly Asp Val Asp Glu Ala Val101010151020Ala Ala Ala Arg Asn Val Val Asp His His Ile Asn His Pro Thr102510301035Leu Glu Ile Asn Arg Met Glu Glu Ser Ile Ser Asp Gln His Gln104010451050Gln Val Pro Glu Asn Asn105權利要求
1.一種水稻稻瘟病抗性基因Pi36編碼的蛋白質，其特征是其氨基酸序列如SEQ ID NO2所示，或該序列替換、缺失、或添加一個或幾個氨基酸殘基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。
2.根據(jù)權利要求1所述的蛋白質，其特征是氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
3.編碼權利要求1所述蛋白質的水稻稻瘟病抗性基因Pi36的核苷酸序列。
4.根據(jù)權利要求3所述的水稻稻瘟病抗性基因Pi36，其核苷酸序列如SEQID NO1所示。
5.一種含有權利要求3或4所述基因的載體。
6.權利要求5所述載體轉化的轉基因植物。
7.權利要求3或4所述基因產(chǎn)生的分子標記。
8.權利要求1或2所述蛋白質在制備抗稻瘟病菌藥物中的應用。
9.權利要求7所述分子標記在選育對稻瘟病具有抗病性的水稻中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一個水稻新抗性基因Pi36的核苷酸序列及其編碼的氨基酸多肽序列與應用。該基因屬于nonTIR－NBS－LRR抗性基因家族的成員，為一個組成型表達的基因。本發(fā)明還涉及了用該基因轉化水稻或其它植物培育抗病品種以及根據(jù)該基因序列產(chǎn)生的分子標記在育種中的應用。
文檔編號A01N65/00GK1821406SQ200610034048
公開日2006年8月23日 申請日期2006年3月6日 優(yōu)先權日2006年3月6日
發(fā)明者潘慶華, 王玲, 林菲, 劉新瓊 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學