專(zhuān)利名稱(chēng)：采用低溫處理脫除菊花類(lèi)病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物的提純復(fù)壯和繁育，具體地說(shuō)是采用低溫處理脫除菊花類(lèi)病毒的方法。
背景技術(shù)：
菊花類(lèi)病毒為支原體病毒，該病毒高溫發(fā)作，染病菊花植株矮化、葉片局部褪綠或枯斑，病毒感染嚴(yán)重時(shí)葉片干枯、整株死亡，發(fā)病率達(dá)20-30％。熱處理加莖尖培養(yǎng)是目前脫除植物病毒最常用的方法，效果較好，但該方法在菊花脫毒方面存在很大的局限性，即一是不能脫除菊花類(lèi)病毒，二是熱處理易導(dǎo)致植株干枯、死亡。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種采用低溫處理脫除菊花類(lèi)病毒的方法。
本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是采用低溫處理脫除菊花類(lèi)病毒的方法，包括如下步驟(1)低溫處理將菊花進(jìn)行透光低溫培養(yǎng)，溫度為-2℃-3℃或4℃-6℃，取菊花剛萌動(dòng)的芽點(diǎn)、根蘗芽或頂芽；(2)消毒處理將步驟(1)中獲得的芽點(diǎn)、根蘗芽或頂芽洗凈后，消毒；(3)切取莖尖培養(yǎng)；(4)類(lèi)病毒檢測(cè)采用RT-PCR方法檢測(cè)待檢瓶苗，獲得脫除菊花類(lèi)病毒的菊花無(wú)性系。
(5)脫毒無(wú)性系菊花種苗的組培擴(kuò)繁。
本發(fā)明中各工藝步驟的工藝條件分別為步驟(1)中的低溫處理是在自然條件下越冬的菊花根茬上覆土3-5厘米，其上覆透光保溫遮蓋物，當(dāng)其根部地溫在-2℃-3℃范圍時(shí)，取菊花剛萌動(dòng)的芽點(diǎn)或根蘗芽。
因?yàn)榫栈ㄊ撬薷?lèi)多年生草本植物，在華北冬季地上植株部分死亡，翌年根部萌生新芽生長(zhǎng)，根據(jù)菊花宿根的特性，利用冬季自然低溫進(jìn)行處理。處理的時(shí)間因地區(qū)的不同而異，在華北地區(qū)為12月-2月份。
步驟(1)中的低溫處理還可以選用人工低溫處理，即選生長(zhǎng)健壯的菊花試管瓶苗置于透光的低溫培養(yǎng)箱中，在溫度為4℃-6℃條件下，進(jìn)行90-120天的低溫冷處理，然后取頂芽。
步驟(2)中的消毒處理是將步驟(1)獲得的芽點(diǎn)、根蘗芽或頂芽，用肥皂水洗凈，在超凈工作臺(tái)上依次用70％酒精表面滅菌10-20秒，0.1％升汞溶液滅菌1～3分鐘，再用無(wú)菌水沖洗3～5次，用滅菌濾紙吸凈芽體表面水分。
步驟(3)中切取莖尖培養(yǎng)是切取步驟(2)中所獲得的芽點(diǎn)、根蘗芽或頂芽的莖尖，接種于1/3MS+6-BA1.0mg/kg+IBA0.02mg/kg+蔗糖3％+瓊脂5g/L組成的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得待檢菊花組培無(wú)性系，培養(yǎng)基的pH為5.6-5.8，莖尖大小為0.2～0.4cm。其中6-BA為6-芐基氨基嘌呤，IBA為吲哚丁酸(下同)。
步驟(5)中脫毒無(wú)性系菊花種苗的組培擴(kuò)繁是將經(jīng)檢測(cè)脫病毒的菊花源源種，進(jìn)行分化增殖培養(yǎng)。其中脫毒無(wú)性系菊花種苗的組培擴(kuò)繁中分化培養(yǎng)基組成為MS+6-BA1.0mg/kg+NAA0.2mg/kg+蔗糖3％+瓊脂5％，其pH5.6-5.8，在分化培養(yǎng)基上25～30天繼代一次；待菊花瓶苗長(zhǎng)到3～4cm時(shí)進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA1.0mg/kg+蔗糖20g/L，其pH5.6-5.8，培養(yǎng)條件溫度25-28℃，光照2000-3000Lx；生根后煉苗20-30天移栽，獲得脫毒菊花種苗。其中NAA為萘乙酸(下同)。
本發(fā)明所取得的技術(shù)進(jìn)步在于采用低溫對(duì)菊花進(jìn)行處理，結(jié)合莖尖培養(yǎng)，能夠有效地脫除菊花類(lèi)病毒，其工藝方法簡(jiǎn)單、易行，且效果較好。且對(duì)于脫除其他植物類(lèi)病毒研究具有一定的指導(dǎo)和參考價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述實(shí)施例1
采用低溫處理脫除菊花類(lèi)病毒的方法，包括如下步驟(1)低溫處理在自然條件下越冬的菊花根茬上覆土3-5厘米，其上覆塑料小拱棚，當(dāng)其根部地溫在-2℃-3℃范圍時(shí)，取菊花剛萌動(dòng)的芽點(diǎn)或根蘗芽。；(2)消毒處理將步驟(1)獲得的芽點(diǎn)、根蘗芽或頂芽，用肥皂水洗凈，在超凈工作臺(tái)上依次用70％酒精表面滅菌10-20秒，0.1％升汞溶液滅菌1～3分鐘，再用無(wú)菌水沖洗3～5次，用滅菌濾紙吸凈芽體表面水分。；(3)切取莖尖培養(yǎng)切取步驟(2)中所獲得的芽點(diǎn)、根蘗芽或頂芽的莖尖，接種于1/3MS+6-BA1.0mg/kg+IBA0.02mg/kg+蔗糖3％+瓊脂5g/L組成的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得待檢菊花組培無(wú)性系，培養(yǎng)基的pH為5.6-5.8，莖尖大小為0.2～0.4cm。
(4)類(lèi)病毒檢測(cè)采用RT-PCR方法檢測(cè)待檢瓶苗，獲得脫除菊花類(lèi)病毒的菊花無(wú)性系。
(5)脫毒無(wú)性系菊花種苗的組培擴(kuò)繁將步驟(5)中脫毒無(wú)性系菊花種苗的組培擴(kuò)繁是將經(jīng)檢測(cè)脫病毒的菊花源源種，進(jìn)行分化增殖培養(yǎng)。其中分化培養(yǎng)基組成為MS+6-BA1.0mg/kg+NAA0.2mg/kg+蔗糖3％+瓊脂5％，其pH5.6-5.8，在分化培養(yǎng)基上25～30天繼代一次；待菊花瓶苗長(zhǎng)到3～4cm時(shí)進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA1.0mg/kg+蔗糖20g/L，其pH5.6-5.8，培養(yǎng)條件溫度25-28℃，光照2000-3000Lx；生根后煉苗20-30天移栽，獲得脫毒菊花種苗。
實(shí)施例2本實(shí)施例中的步驟(1)低溫處理是選生長(zhǎng)健壯的菊花試管瓶苗置于透光的低溫培養(yǎng)箱中，在溫度為4℃-6℃條件下，進(jìn)行90-120天的低溫冷處理，然后取頂芽。其余步驟同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1.采用低溫處理脫除菊花類(lèi)病毒的方法，其特征在于包括如下工藝步驟(1)低溫處理將菊花進(jìn)行透光低溫培養(yǎng)，溫度為-2℃-3℃或4℃-6℃，取菊花剛萌動(dòng)的芽點(diǎn)、根蘗芽或頂芽；(2)消毒處理將步驟(1)中獲得的芽點(diǎn)、根蘗芽或頂芽洗凈后，消毒；(3)切取莖尖培養(yǎng)；(4)類(lèi)病毒檢測(cè)采用RT-PCR方法檢測(cè)待檢瓶苗，獲得脫除菊花類(lèi)病毒的菊花無(wú)性系。(5)脫毒無(wú)性系菊花種苗的組培擴(kuò)繁。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用低溫處理脫除菊花類(lèi)病毒的方法，其特征在于所述的步驟(1)中的低溫處理是在自然條件下越冬的菊花根茬上覆土3-5厘米，其上覆透光保溫遮蓋物，當(dāng)其根部地溫在-2℃-3℃范圍時(shí)，取菊花剛萌動(dòng)的芽點(diǎn)或根蘗芽。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用低溫處理脫除菊花類(lèi)病毒的方法，其特征在于所述的步驟(1)中的低溫處理是選生長(zhǎng)健壯的菊花試管瓶苗置于透光的低溫培養(yǎng)箱中，在溫度為4℃-6℃條件下，進(jìn)行90-120天的低溫冷處理，然后取頂芽。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3所述的采用低溫處理脫除菊花類(lèi)病毒的方法，其特征在于所述的步驟(2)中的消毒處理是將步驟(1)獲得的芽點(diǎn)、根蘗芽或頂芽，用肥皂水洗凈，在超凈工作臺(tái)上依次用70％酒精表面滅菌10-20秒，0.1％升汞溶液滅菌1～3分鐘，再用無(wú)菌水沖洗3～5次，用滅菌濾紙吸凈芽體表面水分。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用低溫處理脫除菊花類(lèi)病毒的方法，其特征在于所述的步驟(3)中切取莖尖培養(yǎng)是切取步驟(2)中所獲得的芽點(diǎn)、根蘗芽或頂芽的莖尖，接種于1/3MS+6-BA1.0mg/kg+IBA0.02mg/kg+蔗糖3％+瓊脂5g/L組成的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，獲得待檢菊花組培無(wú)性系，培養(yǎng)基的pH為5.6-5.8，莖尖大小為0.2～0.4cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用低溫處理脫除菊花類(lèi)病毒的方法，其特征在于所述的步驟(5)中脫毒無(wú)性系菊花種苗的組培擴(kuò)繁是將經(jīng)檢測(cè)脫病毒的菊花源源種，進(jìn)行分化增殖培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用低溫處理脫除菊花類(lèi)病毒的方法，其特征在于所述的步驟(5)中脫毒無(wú)性系菊花種苗的組培擴(kuò)繁中分化培養(yǎng)基組成為MS+6-BA1.0mg/kg+NAA0.2mg/kg+蔗糖3％+瓊脂5％，其pH5.6-5.8，在分化培養(yǎng)基上25～30天繼代一次；待菊花瓶苗長(zhǎng)到3～4cm時(shí)進(jìn)行生根培養(yǎng)，生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA1.0mg/kg+蔗糖20g/L，其pH5.6-5.8，培養(yǎng)條件溫度25-28℃，光照2000-3000Lx；生根后煉苗20-30天移栽，獲得脫毒菊花種苗。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物的提純復(fù)壯和繁育，具體地說(shuō)是采用低溫處理脫除菊花類(lèi)病毒的方法。包括低溫處理、消毒處理、切取莖尖培養(yǎng)、類(lèi)病毒檢測(cè)、脫毒無(wú)性系菊花種苗的組培擴(kuò)繁等工藝步驟。本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的熱處理加莖尖培養(yǎng)脫除植物病毒的方法不能脫除菊花類(lèi)病毒、易導(dǎo)致植株干枯、死亡的問(wèn)題，能夠有效地脫除菊花類(lèi)病毒，其工藝方法簡(jiǎn)單、易行，且效果較好的特點(diǎn)。該方法對(duì)于脫除其他植物類(lèi)病毒研究具有一定的指導(dǎo)和參考價(jià)值。
文檔編號(hào)A01G7/00GK1926965SQ20061004834
公開(kāi)日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2006年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月26日
發(fā)明者謝曉亮, 田偉, 周巧梅, 吳志明, 劉銘, 溫春秀 申請(qǐng)人:河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所