專利名稱：杜鵑蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過組織培養(yǎng)技術(shù)的植物再生方法，具體而言涉及杜鵑蘭的組織培養(yǎng)和快速繁殖的方法。
背景技術(shù)：
杜鵑蘭(Cremastra appendiculata Makino)，又名毛慈姑、算盤七等，屬蘭科杜鵑蘭屬藥用植物，因其假球莖含粘液及葡配甘露聚糖(由甘露糖與葡萄糖2∶1聚合而成)而入藥，其味甘微辛，性寒，有小毒，具有消腫化痰、解毒散結(jié)的功效。杜鵑蘭不僅是珍稀藥用植物，而且是我國三級(jí)珍稀瀕危野生保護(hù)植物。杜鵑蘭的生長對(duì)生態(tài)環(huán)境要求較嚴(yán)，其種子非常細(xì)小，無胚乳，以種子繁殖成功率極低；以其假球莖繁殖，繁殖系數(shù)也很低。長期以來杜鵑蘭主要依靠采集野生資源供藥用，人們爛挖亂采，造成資源枯竭。然而藥材市場對(duì)杜鵑蘭需求量大，因此杜鵑蘭的組織培養(yǎng)和快速繁殖已成為人們亟待解決的難題。
近年來，人們不斷研究杜鵑蘭的組培快繁方法，取得了一些進(jìn)展。目前已經(jīng)申請的發(fā)明專利技術(shù)方案有CN1623373號(hào)“杜鵑蘭離體培養(yǎng)與快速繁殖生物技術(shù)方法”。該方法通過杜鵑蘭離體培養(yǎng)和植株生長過程中必須的共生真菌的分離、培養(yǎng)與真菌提取物的制備，解決了杜鵑蘭原球莖的誘導(dǎo)、增殖、根芽分化及植株生長的問題，是一種杜鵑蘭人工繁殖的技術(shù)。但人們?nèi)匀辉谔剿?、研究更?shí)用的組培快繁技術(shù)，實(shí)現(xiàn)杜鵑蘭藥材的規(guī)?；凸S化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種杜鵑蘭的組培快繁方法，以解決杜鵑蘭繁殖困難和種苗缺乏的問題，促進(jìn)藥用植物杜鵑蘭的大量繁殖。
為達(dá)到上述目的，發(fā)明人提供的技術(shù)方案包括(1)采用杜鵑蘭蒴果種子和假球莖上的芽眼作為外植體，其中蒴果經(jīng)消毒后進(jìn)行種子無菌播種培養(yǎng)，萌發(fā)形成原球莖；假球莖芽眼經(jīng)消毒后進(jìn)行接種培養(yǎng)，獲得原球莖；(2)通過原球莖在培養(yǎng)基里的增殖，將其增殖3～7倍；(3)將增殖所得的原球莖分化成苗并促其生根，獲得完整的再生植株，即組培苗；(4)將所獲得的再生植株經(jīng)室溫和蛭石苗床或營養(yǎng)缽煉苗，獲得種苗；或?qū)⒃鲋车母鶢钋o直接栽種在蛭石苗床或營養(yǎng)缽中生根發(fā)芽得到種苗；將所得的種苗栽種到事先準(zhǔn)備就序的土壤中，并進(jìn)行栽培管理，得到人工栽培的藥用植物杜鵑蘭假球莖。
在第一步中，外植體的選擇、處理及原球莖的獲得技術(shù)是①用杜鵑蘭蒴果種子作為外植體，須先用70％的酒精棉球擦拭蒴果表面進(jìn)行消毒處理，再將蒴果蘸上95％酒精，燃燒滅菌；之后用無菌解剖刀剖開蒴果，將其中細(xì)小的種子均勻地撒播在附加0.5mg/L NAA(α-萘乙酸)的1/2MS固體培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基pH值為5.5～5.8，置于溫度25±2℃，全黑暗條件下培養(yǎng)半年，種子萌發(fā)形成白色小原球莖。②用假球莖上的芽眼作為外植體，須先將其上的泥土洗干凈，晾干，然后裝入三角瓶。在無菌條件下，用70％酒精倒入三角瓶對(duì)假球莖進(jìn)行消毒20s，接著用0.1％升汞液浸泡滅菌8min，再用無菌水清洗5次，每次2～3min；最后用無菌濾紙吸干水分，切取假球莖上的芽眼，接種于預(yù)先配制好的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)基pH 5.5～5.8，置于溫度25±2℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1500～2000lx條件下，約10d開始萌發(fā)，形成白色小原球莖。
在第二步中，原球莖的增殖技術(shù)是將獲得的白色小原球莖轉(zhuǎn)接到添加3.0～6.0mg/L6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)+NAA0.2mg/L+0.1％活性炭+2％白糖的B5固體增殖培養(yǎng)基，其pH值為5.5～5.8，置于溫度25±2℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1500～2000lx條件下培養(yǎng)，白色小原球莖逐漸變成綠色，形成叢生形的原球莖，球莖表面長滿白色的絨毛，同時(shí)部分莖節(jié)伸長形成根狀莖；40～50d后轉(zhuǎn)接繼代培養(yǎng)在相同的增殖培養(yǎng)基上，同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)，增殖倍數(shù)達(dá)到3～7倍。原球莖在加有激素的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3-4次后，將增殖的原球莖轉(zhuǎn)接到不加激素的培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行增殖培養(yǎng)。
在第三步中，根狀莖分化成苗及生根技術(shù)是將增殖得到的根狀莖分切成粒徑0.5～1.0cm大小，接種在附加2.0mg/L NAA+0.2％活性炭+2％白糖的MS固體分化培養(yǎng)基上，在光照條件下培養(yǎng)15～20d后，放置在溫度相同的全黑暗條件下培養(yǎng)，根狀莖基部產(chǎn)生增殖，其頂端及側(cè)端分化出白色的芽，再放在光照條件下培養(yǎng)，白色的芽逐漸長成綠色的小苗。將生長約1.0cm的小苗移入1/2MS+0.5mg/L NAA+0.2％活性炭+2％白糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其pH值為5.5～5.8。20d后，芽基生長出有白色絨毛的輻射狀小根，形成完整植株，即組培苗。
在第四步中，組培苗煉苗或根狀莖直接成苗技術(shù)是將根長1.0～2.0cm，苗高2.0cm以上的組培苗置于室溫條件下2～3d，然后揭去封口膜煉苗2～3d；之后取出瓶苗，用清水沖洗干凈附著在根部的培養(yǎng)基，栽種到準(zhǔn)備好的基質(zhì)蛭石中，用稀釋1000倍的多菌靈溶液澆淋透，1周后再澆水，成活后噴施少許營養(yǎng)液。增殖的根狀莖直接用清水沖洗干凈粘附的培養(yǎng)基，栽種于準(zhǔn)備好的基質(zhì)中，1月后萌芽生根，獲得種苗。
采用本發(fā)明方法對(duì)杜鵑蘭進(jìn)行組織培養(yǎng)和快速繁殖，有效地解決了杜鵑蘭繁殖困難和種苗缺乏的問題，為實(shí)現(xiàn)杜鵑蘭的規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)提供了可靠的技術(shù)保證。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明既可采用杜鵑蘭蒴果種子為外植體萌發(fā)形成原球莖，也可采用假球莖上的芽眼作為外植體培養(yǎng)原球莖進(jìn)行繁殖；而且將根狀莖直接移栽在蛭石苗床或營養(yǎng)缽發(fā)芽生根成苗，具有簡化培養(yǎng)程序、縮短培養(yǎng)時(shí)間，生產(chǎn)周期短，成本低，質(zhì)量好的優(yōu)點(diǎn)。


附圖為本發(fā)明的杜鵑蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法工藝流程示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1采用杜鵑蘭蒴果種子作為外植體，在超凈工作臺(tái)上，先用70％的酒精棉球擦拭蒴果表面進(jìn)行消毒處理，再將蒴果蘸上酒精，燃燒滅菌；后用無菌解剖刀剖開蒴果，將其中細(xì)小的種子均勻地撒播在附加0.5mg/LNAA的1/2MS固體培養(yǎng)基表面，培養(yǎng)基pH值為5.5～5.8，置于溫度25±2℃，全黑暗條件下培養(yǎng)半年，種子萌發(fā)形成白色小原球莖。將此小原球莖轉(zhuǎn)移到添加3.0～6.0mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+0.1％活性炭+2％白糖的B5固體增殖培養(yǎng)基，pH 5.5～5.8，置于溫度25±2℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1500～2000lx條件下，白色小原球莖逐漸變成綠色，形成叢生形的原球莖，球莖表面長滿白色的絨毛，同時(shí)部分莖節(jié)伸長形成根狀莖。40～50d后轉(zhuǎn)接繼代培養(yǎng)在相同的增殖培養(yǎng)基上，在同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)，增殖倍數(shù)達(dá)到3～7倍。將增殖得到的原球莖分切成粒徑0.5～1.0cm大小，接種在附加2.0mg/L NAA+0.2％活性炭+2％白糖的MS固體分化培養(yǎng)基上，在光照條件下培養(yǎng)15～20d后，放置在溫度相同的全黑暗條件下培養(yǎng)，根狀莖基部產(chǎn)生增殖，其頂端及側(cè)端分化出白色的芽，再放在光照條件下培養(yǎng)，白色的芽逐漸長成綠色的苗；將生長約1.0cm的組培苗移入1/2MS+0.5mg/LNAA+0.2％活性炭+2％白糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其pH值為5.5～5.8。20d后，芽基生長出有白色絨毛的輻射狀小根，生根率100％。將根長1.0～2.0cm，苗高2.0cm以上的組培苗帶瓶置于室溫?zé)捗?～3d，然后揭去封口膜2～3d；之后取出瓶苗，用清水沖洗干凈附著在根部的培養(yǎng)基，栽種到準(zhǔn)備好的基質(zhì)之中，用稀釋1000倍的多菌靈溶液澆淋透，1周后再澆水，成活后噴施少許營養(yǎng)液。增殖的根狀莖直接用清水沖洗干凈粘附的培養(yǎng)基，栽種于準(zhǔn)備好的基質(zhì)中，1月后萌芽生根成苗。經(jīng)過煉苗20～30d后，從營養(yǎng)缽中取出苗，將根部的蛭石除凈，雨后栽種到準(zhǔn)備好的土中，用黑色遮陽網(wǎng)遮蔭；生長期追施有機(jī)復(fù)合肥2次，并進(jìn)行澆水和除草等管理，得到人工栽培的藥用植物杜鵑蘭假球莖。
實(shí)施例2采用杜鵑蘭假球莖上的芽眼作為外植體，先用清水將其上的泥土沖洗干凈，晾干，然后裝入三角瓶，在無菌條件下，用70％的酒精倒入三角瓶對(duì)假球莖進(jìn)行消毒20s，接著用0.1％升汞液浸泡滅菌8min，再用無菌水清洗5次，每次3min；最后用無菌濾紙吸干水分，切取假球莖上的芽眼，接種于預(yù)先配制好的MS培養(yǎng)基，培養(yǎng)基pH值為5.5～5.8，置于溫度25±2℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1500～2000lx條件下，約10d開始萌發(fā)，形成白色小原球莖。將此原球莖在30d后轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)，獲得叢生形的原球莖，球莖表面長滿白色的絨毛，部分莖節(jié)伸長形成根狀莖；40～50d后轉(zhuǎn)接繼代培養(yǎng)在相同的增殖培養(yǎng)基上，在同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)，增殖倍數(shù)達(dá)到3～7倍。增殖后的培養(yǎng)方法同實(shí)施例1。
權(quán)利要求
1 一種杜鵑蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于該方法包括(1)采用杜鵑蘭蒴果種子和假球莖上的芽眼作為外植體，其中蒴果經(jīng)消毒后進(jìn)行種子無菌播種培養(yǎng)，萌發(fā)形成原球莖；假球莖芽眼經(jīng)消毒后進(jìn)行接種培養(yǎng)，獲得原球莖；(2)通過原球莖在培養(yǎng)基里的增殖，將其增殖3～7倍；(3)將增殖所得的原球莖分化成苗并促其生根，獲得完整的再生植株，即組培苗；(4)將所獲得的再生植株經(jīng)室溫和蛭石苗床或營養(yǎng)缽煉苗，獲得種苗；或?qū)⒃鲋车母鶢钋o直接栽種在蛭石苗床或營養(yǎng)缽中生根發(fā)芽得到種苗；將所得的種苗栽種到事先準(zhǔn)備就序的土壤中，并進(jìn)行栽培管理，得到人工栽培的藥用植物杜鵑蘭假球莖。
2 按照權(quán)利要求1所述杜鵑蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于第一步中，外植體的選擇、處理及原球莖的獲得技術(shù)是①用杜鵑蘭蒴果種子作為外植體，在超凈工作臺(tái)上，須先用酒精棉球擦拭蒴果表面進(jìn)行消毒處理，再將蒴果蘸上酒精，燃燒滅菌；之后用無菌解剖刀剖開蒴果，將其中細(xì)小的種子均勻地撒播在附加0.5mg/L NAA的1/2MS固體培養(yǎng)基表面，置于溫度25±2℃，全黑暗條件下培養(yǎng)半年，種子萌發(fā)形成白色小原球莖。②用假球莖上的芽眼作為外植體，須先將其上的泥土洗干凈，晾干，然后裝入三角瓶。在無菌條件下，用酒精倒入三角瓶對(duì)假球莖進(jìn)行消毒20s，接著用升汞液浸泡滅菌8min，再用無菌水清洗5次，每次3min；最后用無菌濾紙吸干水分，切取假球莖上的芽眼，接種于預(yù)先配制好的MS培養(yǎng)基上，置于溫度25±2℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1500～2000lx條件下，約10d開始萌發(fā)，形成白色小原球莖。
3 按照權(quán)利要求1所述杜鵑蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于第二步中，原球莖在培養(yǎng)基里的增殖技術(shù)是將獲得的白色小原球莖轉(zhuǎn)接到添加6-BA 3.0～6.0mg/L+NAA 0.2mg/L+0.1％活性炭+2％白糖的B5固體增殖培養(yǎng)基，置于25±2℃，光照時(shí)間12h/d，光照強(qiáng)度1500～2000lx條件下培養(yǎng)，白色小原球莖形成綠色叢生形的原球莖，球莖表面長滿白色絨毛，同時(shí)部分莖節(jié)伸長形成根狀莖；40～50d后轉(zhuǎn)接繼代培養(yǎng)在相同的增殖培養(yǎng)基上，同等條件下繼續(xù)培養(yǎng)，增殖倍數(shù)達(dá)到3～7倍。原球莖在加有激素的培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)3-4次后，將增殖的原球莖轉(zhuǎn)接到不加激素的培養(yǎng)基上繼續(xù)進(jìn)行增殖培養(yǎng)。
4 按照權(quán)利要求1所述杜鵑蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于第三步中，根狀莖分化成苗及生根技術(shù)是將增殖得到的根狀莖分切成粒徑0.5～1.0cm大小，接種在附加2.0mg/L NAA+0.2％活性炭+2％白糖的MS固體分化培養(yǎng)基上，在光照條件下培養(yǎng)15～20d后，放置在溫度相同的全黑暗條件下培養(yǎng)，根狀莖基部產(chǎn)生增殖，其頂端及側(cè)端分化出白色的芽，再放在光照條件下培養(yǎng)，白色的芽逐漸長成綠色的小苗。將生長約1.0cm的小苗移入1/2MS+0.5mg/LNAA+0.2％活性炭+2％白糖的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，其pH值為5.5～5.8。20d后，芽基生長出有白色絨毛的輻射狀小根，形成完整植株，即組培苗。
5按照權(quán)利要求1所述杜鵑蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于第四步中，組培苗煉苗或根狀莖直接成苗技術(shù)是將根長1.0～2.0cm，苗高2.0cm以上的組培苗帶瓶置于室溫?zé)捗?～3d，然后揭去封口膜2～3d；之后取出瓶苗，用清水沖洗干凈附著在根部的培養(yǎng)基，栽種到準(zhǔn)備好的基質(zhì)中，用多菌靈溶液澆淋透，1周后再澆水，成活后噴施少許營養(yǎng)液。增殖的根狀莖不通過分化成苗階段，直接用清水沖洗干凈粘附的培養(yǎng)基，栽種于準(zhǔn)備好的基質(zhì)中，1月后萌芽生根，獲得種苗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種杜鵑蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，該方法包括(1)采用杜鵑蘭蒴果種子和假球莖上的芽眼作為外植體，其中蒴果種子進(jìn)行無菌播種培養(yǎng)，萌發(fā)形成原球莖；假球莖芽眼經(jīng)消毒后進(jìn)行接種培養(yǎng)，獲得原球莖；(2)通過原球莖在培養(yǎng)基里的增殖，將其增殖3～7倍；(3)將增殖所得的原球莖分化成苗并促其生根，獲得完整的再生植株；(4)將再生植株栽種在蛭石苗床或營養(yǎng)缽生長、過渡?；?qū)⒃鲋车母鶢钋o直接栽種在蛭石里生根發(fā)芽得到種苗。將種苗栽種到準(zhǔn)備就序的土壤中，并進(jìn)行栽培管理，得到人工栽培的杜鵑蘭假球莖。采用本方法對(duì)杜鵑蘭進(jìn)行種苗繁殖，有效地解決了杜鵑蘭繁殖困難和種苗缺乏的問題，可實(shí)現(xiàn)杜鵑蘭的規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01G7/00GK1817110SQ200610050919
公開日2006年8月16日 申請日期2006年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月18日
發(fā)明者毛堂芬, 劉作易, 朱國勝, 黃永會(huì) 申請人:貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所