專利名稱：對(duì)根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對(duì)根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株及其用途。
背景技術(shù)：
果樹細(xì)菌性根癌病菌(Agrobacterium tumefaciens)引起根癌病分布于世界各地。DeCleene和DeLey曾報(bào)道根癌農(nóng)桿菌可侵染93個(gè)科331屬643中的雙子葉植物及少數(shù)裸子植物。1980年Kennedy報(bào)道美國(guó)由原核植物病原菌所造成的作物損失中，果樹和葡萄的根癌病排列為最重要。我國(guó)的葡萄根癌病在北方地區(qū)13個(gè)省均有不同程度發(fā)生，櫻桃根癌病在山東、大連、河北等地發(fā)生嚴(yán)重，桃樹根癌病在江蘇、浙江、福建及上海郊區(qū)普遍發(fā)生，嚴(yán)重的果園植株發(fā)病率為90％以上。
根癌病對(duì)果樹的危害極大是一種世界性病害，直接影響了果樹產(chǎn)品的生產(chǎn)，從而影響了農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。因此，對(duì)此病的防治引起了世界各國(guó)的關(guān)注，鑒于化學(xué)農(nóng)藥對(duì)環(huán)境的污染和生態(tài)平衡的破壞，植物根癌病的生物防治得到了重視，國(guó)際上主要應(yīng)用細(xì)菌在其代謝過程中產(chǎn)生的細(xì)菌素來對(duì)根癌農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)起到預(yù)防和抑制的作用，但其菌株主要是選取不致病的發(fā)根土壤桿菌K84菌株，K84菌株在根癌病的防治中的作用是防非治，是作為一種預(yù)防措施使用，并且不能防治所有根癌病，只對(duì)含胭脂堿Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌才有效果。雖然分離出的另外一些無致病性的土壤桿菌，如根癌土壤桿菌J73、根癌土壤桿菌D286等能彌補(bǔ)K84菌株之不足，但生防細(xì)菌不耐旱，壽命短，必須貯藏和隨制隨用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述缺點(diǎn)而提供的一種對(duì)根癌農(nóng)桿菌T-37有抑制作用的拮抗真菌黑曲霉菌株。
本發(fā)明的另一目的在于提供該對(duì)根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株在抑制根癌農(nóng)桿菌方面的用途。
對(duì)根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)，其形態(tài)特征xi菌株在查氏(Czapck)培養(yǎng)基上，26℃，培養(yǎng)10天，菌落直徑為4.0cm，菌落表面近碳黑色，孢子頭密集著生，除菌落邊緣沒有分生孢子外，整個(gè)菌落都布滿了分生孢子結(jié)構(gòu)，菌落背面無色，不分泌色素，氣生菌絲發(fā)達(dá)，從氣生菌絲分化出的分生孢子梗由特化的足細(xì)胞長(zhǎng)出，頂端膨大成球形，表面著生兩層分生孢子小梗，次生小梗上著生成串的分生孢子。分生孢子頭為黑色，球形，放射狀，直徑72-220μm；分生孢子梗壁厚而光滑，長(zhǎng)600-2100μm，寬12-13μm；頂囊近球形，直徑40.8-42μm；次生小梗4.2-6μm×1.8-3μm；分生孢子為球形至近球形，表面有突起，直徑2.4-3μm。
該菌種已于2006年3月7日保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(地址中國(guó)武漢武漢大學(xué))，保藏號(hào)CCTCC NOM 206021，名稱為黑曲霉xj(Aspergillus niger xj)對(duì)根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xi)的分離步驟(1)拮抗菌的分離與純化準(zhǔn)確稱取10.0g果樹根系土樣，借助無菌操作技術(shù)，將土樣加入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10min，使土樣均勻地分散為稀釋液，再吸取1m土壤稀釋液到9ml無菌水中，充分混勻，成為土壤懸液。采用混菌法接種，吸取1ml懸液于直徑為9cm的滅菌培養(yǎng)皿中，然后傾注已熔化并冷卻到45℃的雙抗馬丁氏培養(yǎng)基，充分混勻，待凝固后倒置，25℃保溫培養(yǎng)5天，挑取真培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的肉眼可見的大小不同的真菌菌落，移入馬丁氏平板上，恒溫培養(yǎng)，直至純化得到單菌落，轉(zhuǎn)移至斜面試管保存；(2)拮抗菌瓊脂柱的制備在無菌培養(yǎng)皿中倒入PDA固體培養(yǎng)基(厚1cm)，用打孔器對(duì)已冷卻的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行打孔，將瓊脂柱放置于無菌空培養(yǎng)皿中，用接種環(huán)分別取少量的拮抗菌孢子接在瓊脂柱上，26℃靜置培養(yǎng)3天；(3)拮抗菌的篩選T-37平板制備取長(zhǎng)滿根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens T-37)菌株的斜面試管一只，加入滅過菌的蒸餾水10ml，用槍輕輕吹打并充分混勻，制成細(xì)菌菌懸液，取0.1ml接種于平板培養(yǎng)基表面，用L棒均勻涂布；拮抗菌篩選將已制備好的拮抗菌瓊脂柱分別置于T-37平板上，于4℃冰箱倒扣放置12h后，30℃繼續(xù)培養(yǎng)48h，室溫下觀察結(jié)果，在瓊脂柱周圍有一株真菌產(chǎn)生較明顯的抑菌圈，這一株真菌即為本發(fā)明的黑曲霉菌株xj(Aspergillus niger xj)。
通過對(duì)抑菌試驗(yàn)來說明本發(fā)明的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)的抑制根癌農(nóng)桿菌的用途(1)發(fā)酵液與菌體提取液的制備將上述的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)按10％的接種量接入PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)基中(200ml培養(yǎng)瓶裝入40ml培養(yǎng)基)，26℃，140rpm，搖瓶培養(yǎng)9天，將發(fā)酵液與菌絲體一同轉(zhuǎn)入離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，離心10min，進(jìn)行菌液分離，再用蒸餾水重懸菌絲體(加水量為菌絲體5倍)，2000轉(zhuǎn)/分再離心10min，反復(fù)4次，分別收集上清液和菌絲體。
雙層濾紙過濾上清液，將上清液置于減壓真空干燥箱中50℃濃縮10倍，濃縮后的上清液于紫外燈下照射30分鐘，置于4℃冰箱備用。
菌絲體于減壓真空干燥箱中55℃烘至恒重，再將菌絲研磨成粉，過80目篩，加入20倍無菌水，50℃水浴30min，浸提4次，收集提取液，過濾，濃縮，紫外照射，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> (2)用無菌的圓濾紙片(直徑0.6cm)，分別吸取發(fā)酵上清液與菌體提取液，在酒精燈前略微干燥，輕輕放在T-37平板上，倒置于4℃冰箱12h后，30℃繼續(xù)培養(yǎng)48h，室溫下可分別產(chǎn)生直徑為2.4cm與3.8cm的抑菌圈。
本發(fā)明的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)來源可靠，對(duì)溫度、pH等自然環(huán)境條件的適應(yīng)范圍廣，對(duì)不良環(huán)境的耐受力強(qiáng)，能維持生態(tài)平衡，能適應(yīng)病害生態(tài)系，而且耐突變，容易培養(yǎng)和保存，抑制根癌農(nóng)桿菌效果好，在農(nóng)業(yè)方面有很大的應(yīng)用前景。該技術(shù)路線合理，可為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)提供可靠的中試數(shù)據(jù)和設(shè)計(jì)依據(jù)，實(shí)現(xiàn)液體發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)，為開發(fā)相關(guān)生物制劑奠定基礎(chǔ)。
具體實(shí)施例方式
對(duì)根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)的分離步驟(1)供試菌株根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens T-37)購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，保存于貴州大學(xué)真菌資源研究所；(2)拮抗菌的分離與純化準(zhǔn)確稱取10.0g果樹根系土樣，借助無菌操作技術(shù)，將土樣加入盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩10min，使土樣均勻地分散為稀釋液，再吸取1m土壤稀釋液到9ml無菌水中，充分混勻，成為土壤懸液。采用混菌法接種，吸取1ml懸液于直徑為9cm的滅菌培養(yǎng)皿中，然后傾注已熔化并冷卻到45℃的雙抗馬丁氏培養(yǎng)基，充分混勻，待凝固后倒置，25℃保溫培養(yǎng)5天，挑取真培養(yǎng)基中長(zhǎng)出的肉眼可見的大小不同的真菌菌落，移入馬丁氏平板上，恒溫培養(yǎng)，直至純化得到單菌落，轉(zhuǎn)移至斜面試管保存；(3)拮抗菌瓊脂柱的制備在無菌培養(yǎng)皿中倒入PDA固體培養(yǎng)基(厚1cm)，用打孔器對(duì)已冷卻的PDA培養(yǎng)基進(jìn)行打孔，將瓊脂柱放置于無菌空培養(yǎng)皿中，用接種環(huán)分別取少量的拮抗菌孢子接在瓊脂柱上，26℃靜置培養(yǎng)3天；(4)拮抗菌的篩選T-37平板制備取長(zhǎng)滿根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens T-37)菌株的斜面試管一只，加入滅過菌的蒸餾水10ml，用槍輕輕吹打并充分混勻，制成細(xì)菌菌懸液，取0.1ml接種于平板培養(yǎng)基表面，用L棒均勻涂布；拮抗菌篩選將已制備好的拮抗菌瓊脂柱分別置于T-37平板上，于4℃冰箱倒扣放置12h后，30℃繼續(xù)培養(yǎng)48h，室溫下觀察結(jié)果，在瓊脂柱周圍有一株真菌產(chǎn)生較明顯的抑菌圈，命名為xj。
拮抗菌的鑒定xi菌株在查氏(Czapck)培養(yǎng)基上，26℃，培養(yǎng)10天，菌落直徑為4.0cm，菌落表面近碳黑色，孢子頭密集著生，除菌落邊緣沒有分生孢子外，整個(gè)菌落都布滿了分生孢子結(jié)構(gòu)，菌落背面無色，不分泌色素，氣生菌絲發(fā)達(dá)，從氣生菌絲分化出的分生孢子梗由特化的足細(xì)胞長(zhǎng)出，頂端膨大成球形，表面著生兩層分生孢子小梗，次生小梗上著生成串的分生孢子。分生孢子頭為黑色，球形，放射狀，直徑72-220μm；分生孢子梗壁厚而光滑，長(zhǎng)600-2100μm，寬12-13μm；頂囊近球形，直徑40.8-42μm；次生小梗4.2-6μm×1.8-3μm；分生孢子為球形至近球形，表面有突起，直徑2.4-3μm。
根據(jù)Raper(1965)關(guān)于曲霉屬的分類標(biāo)準(zhǔn)，xi菌株的主要形態(tài)特征與他所描述的黑曲霉(Aspergillus niger V.Tieghen 1867)的標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)基本相同，因而認(rèn)為xj菌株屬于曲霉屬黑曲霉群的一株黑曲霉，記為黑曲霉xj(Aspergillus niger xj)。
通過對(duì)抑菌試驗(yàn)來說明本發(fā)明的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xi)的抑制根癌農(nóng)桿菌的用途(1)發(fā)酵液與菌體提取液的制備將上述的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xi)按10％的接種量接入PDA液體發(fā)酵培養(yǎng)基中(200ml培養(yǎng)瓶裝入40ml培養(yǎng)基)，26℃，140rpm，搖瓶培養(yǎng)9天，將發(fā)酵液與菌絲體一同轉(zhuǎn)入離心管中，2000轉(zhuǎn)/分，離心10min，進(jìn)行菌液分離，再用蒸餾水重懸菌絲體(加水量為菌絲體5倍)，2000轉(zhuǎn)/分再離心10min，反復(fù)4次，分別收集上清液和菌絲體。
雙層濾紙過濾上清液，將上清液置于減壓真空干燥箱中50℃濃縮10倍，濃縮后的上清液于紫外燈下照射30分鐘，置于4℃冰箱備用。
菌絲體于減壓真空干燥箱中55℃烘至恒重，再將菌絲研磨成粉，過80目篩，加入20倍無菌水，50℃水浴30min，浸提4次，收集提取液，過濾，濃縮，紫外照射，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br> (2)用無菌的圓濾紙片(直徑0.6cm)，分別吸取發(fā)酵上清液與菌體提取液，在酒精燈前略微干燥，輕輕放在T-37平板上，倒置于4℃冰箱12h后，30℃繼續(xù)培養(yǎng)48h，室溫下可分別產(chǎn)生直徑為2.4cm與3.8cm的抑菌圈。
權(quán)利要求
1.一種對(duì)根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)，保藏號(hào)CCTCC NOM 206021，其形態(tài)特征xj菌株在查氏培養(yǎng)基上，26℃，培養(yǎng)10天，菌落直徑為4.0cm，菌落表面近碳黑色，孢子頭密集著生，除菌落邊緣沒有分生孢子外，整個(gè)菌落都布滿了分生孢子結(jié)構(gòu)，菌落背面無色，不分泌色素，氣生菌絲發(fā)達(dá)，從氣生菌絲分化出的分生孢子梗由特化的足細(xì)胞長(zhǎng)出，頂端膨大成球形，表面著生兩層分生孢子小梗，次生小梗上著生成串的分生孢子；分生孢子頭為黑色，球形，放射狀，直徑72-220μm；分生孢子梗壁厚而光滑，長(zhǎng)600-2100μm，寬12-13μm；頂囊近球形，直徑40.8-42μm；次生小梗4.2-6μm×1.8-3μm；分生孢子為球形至近球形，表面有突起，直徑2.4-3μm。
2.如權(quán)利要求1所述的對(duì)根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)，保藏號(hào)為CCTCC NOM 206021在抑制根癌農(nóng)桿菌方面的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種對(duì)根癌農(nóng)桿菌有抑制作用的黑曲霉菌株(Aspergillus niger xj)，其形態(tài)特征xj菌株在查氏培養(yǎng)基上，26℃，培養(yǎng)10天，菌落直徑為4.0cm，菌落表面近碳黑色，孢子頭密集著生，除菌落邊緣沒有分生孢子外，整個(gè)菌落都布滿了分生孢子結(jié)構(gòu)，菌落背面無色，不分泌色素，氣生菌絲發(fā)達(dá)，從氣生菌絲分化出的分生孢子梗由特化的足細(xì)胞長(zhǎng)出，頂端膨大成球形，表面著生兩層分生孢子小梗，次生小梗上著生成串的分生孢子；分生孢子頭為黑色，球形，放射狀，直徑72－220μm；分生孢子梗壁厚而光滑，長(zhǎng)600－2100μm，寬12－13μm；頂囊近球形，直徑40.8－42μm；次生小梗4.2－6μm×1.8－3μm；分生孢子為球形至近球形，表面有突起，直徑2.4－3μm。本發(fā)明對(duì)自然環(huán)境條件的適應(yīng)范圍廣，對(duì)不良環(huán)境的耐受力強(qiáng)，容易培養(yǎng)和保存及工業(yè)化生產(chǎn)，抑制根癌農(nóng)桿菌效果好。
文檔編號(hào)A01N63/04GK1847388SQ20061005102
公開日2006年10月18日 申請(qǐng)日期2006年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日
發(fā)明者李祝, 梁宗琦, 肖洋, 周禮紅, 李穎 申請(qǐng)人:貴州大學(xué)